TECHNIQUES

IMMUNOLOGIQUES

Francois HELLE
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES

But :
- Mise en évidence des antigènes
- Mise en évidence des anticorps
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Mise en évidence des antigènes
• Où : - dans les cellules
- dans les tissus
- dans les liquides biologiques
(sérum, LCR, urines…)

• Comment : au moyen d ’anticorps

- polyclonaux
- monoclonaux
TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES
Mise en évidence des anticorps
• Ou ? : - essentiellement dans le serum
- plus rarement dans les
autres liquides biologiques
(LCR, salive…)
• Comment ? : au moyen d ’antigènes :
- le germe lui-même
- les antigènes
- les tissus...
 TECHNIQUES IMMUNOLOGIQUES

Choix de la technique :
- Fonction de la concentration de
l’antigène ou de l ’anticorps
pg mg
- Forme de l ’antigène (soluble ou
particulaire)
- Localisation de l ’antigène ou de
l’anticorps
Production d’un anticorps
monoclonal
Anticorps monoclonaux utilisés
en thérapies anti-tumorales
 Réaction Ag-Ac
• Interaction épitope-paratope

Si l’antigène est moléculaire et soluble  complexe Ag-Ac forme un

précipité
Si l’antigène est particulaire ou cellulaire  complexe Ag-Ac forme un
agglutinat
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytométrie en flux
• 6- Divers
 PRECIPITATION

- Ag soluble + Ac correspondant
- En milieu liquide ou en milieu gelifié
- Lecture a l ’oeil nu ou avec un appareil
(nephelomètre, turbidimètre)
en moins d ’une heure a quelques
jours
- Peu sensible ( ~ mg)
 Précipitation en milieu liquide
= test de l’anneau

Influencé par: - la T°
- le pH
- force ionique
- adjuvants
 Précipitation en milieu gélifié
Gel d’agar ou d’agarose
1/Immunodiffusion double (Outcherlony)
- Double diffusion Ag et Ac en fonction de leur PM
- permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en
solution
 Méthode d’Outcherlony
PRECIPITATION

Reaction d’identite : 1-5

Reaction de non identite : 2-3 ; 4-5
Reaction d’identite partielle : 3-4
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/ATP/immu2.htm

Méthode d’Outcherlony
Puits central :
sérum de lapin
hyperimmunisé contre
la sérumalbumine
bovine (BSA)

Puits périphériques :
1 : sérum de chèvre
2 : sérum de porc
3 : sérum de lapin
4 : sérum de bœuf
5 : sérum de cheval
6 : BSA

Côté gauche Puits central :

Puits central : sérum de lapin hyperimmunisé
sérum de lapin hyperimmunisé 1 1 contre la sérumalbumine bovine
2 (BSA) et l'ovalbumine de poule
contre la sérumalbumine bovine (BSA) 6 6 2 (OVA)
Puits périphériques :
solutions de BSA : 5 3 5 3 Puits périphériques :
1 - 1 mg/mL 4 - 125 µg/mL 4 4
1 - OVA 4 - BSA
2 - 500 µg/mL 5 - 65 µg/mL 2 - MSA (souris) 5 - BSA
3 - 250 µg/mL 6 - 32,5 µg/mL 3 - MSA (souris) 6 - OVA
Précipitation en milieu gélifié
2/ Immunodiffusion radiale (méthode de
Mancini)
Technique quantitative qui permet le dosage d’un
Ag (protéine)
Immunodiffusion radiale
Précipitation en milieu gélifié
 Précipitation en milieu
gélifié(Laurell)
3/ Electro-immunodiffusion
Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en
obligeant l’Ag a migrer sous l’effet d’un champ électrique, dans
un gel contenant l’Ac. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac
soient immobiles (pI des Ig) et que l’Ag chargé négativement
migre (blocage des NH2 ; carbamylation, formylation).
 Précipitation en milieu
gélifié
4/ Immuno-électrophorèse
Cette technique renforce le pouvoir analytique des
doubles diffusions en identifiant les constituants d’un
mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilité
électrophorétique et leur spécificité antigénique.
1er temps: mélange d’Ag est soumis à un champ
électrique le long duquel les constituants se
répartissent en fonction de leur mobilité
electrophorétrique
2ème temps: un immunoserum polyspécifique diffuse
dans un sens perpendiculaire à celui de la piste
électrophorétique dont les fractions diffusent en sens
inverse.
L’exploitation des résultats est basée sur celle de la
technique d’Ouchterlony
 Immunoélectrophorèse

Premier temps: Electrophorese

Deuxieme temps:Immunodiffusion
Immunoélectrophorèse
 Précipitation en milieu
gélifié
• 5/ Immunofixation
- séparation de la solution
antigénique par électrophorèse
- Ac spécifique est déposé
- précipitation
- coloration
+ sensible et plus rapide
→ Diagnostic des Ig monoclonales
 Immunofixation
PRECIPITATION

ELECTROPHORESE IMMUNODIFFUSION
 Immunofixation

ALBUMINE

Ig normales

ALBUMINE

Ig monoclonale
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
• 6- Divers
 AGGLUTINATION

- Ag particulaire (bacteries, globules

rouges)
+
Ac correspondant
- Visible a l ’oeil nu
- Quelques minutes
- Plus sensible que la précipitation
AGGLUTINATION
 AGGLUTINATION
• Parametres de réaction:
il existe une relation entre
l’agglutinabilité et :
-le nombre de sites
antigeniques
-leur localisation
 AGGLUTINATION
• Le titre agglutinant est l’inverse de la
derniere dilution donnant une réaction
positive

Dilution au 1/4 → titre 4

Dilution au 1/8 → titre 8
….
 AGGLUTINATION ACTIVE
• Agglutination active
Elle resulte d’une union specifique entre un Ac
agglutinant et un Ag appartenant en propre a la
particule. Elle peut se faire en tubes, en
microplaques ou sur lame et peuvent etre: -
qualitatives
- quantitatives (la derniere dilution du serum ou
l’on observe encore une agglutination).
→ Serogroupages bacteriens (Salmonella, Shigella, E.
coli enterophathogenes…)
→ Groupage sanguin ABO
AGGLUTINATION ACTIVE
Quel groupes sanguins?
 AGGLUTINATION PASSIVE
• Agglutination passive
Elle est realisee entre un Ac et un Ag normalement
soluble, mais rendu particulaire par fixation sur
un support :
1. Les billes de latex ; l’Ag est fixe par simple
contact (pH 8,2)
2. Les hematies (HEMAGGLUTINATION)
l’Ag est fixe par simple contact, par traitement a
l’acide tannique, par fixation chimique
(glutaraldehyde, di-nitro chloro-benzene…) ou par
fixation immunologique (cas des Ac diriges contre
des epitopes du GR).
 AGGLUTINATION PASSIVE
• Inconvenients : - fragiles, elles s’hemolysent
en 3 semaines (utilisation d’hematies
formolees, stables plusieurs mois a 4°C)
- elles portent une mosaique
d’Ag

→ recherche du facteur rhumatoide (reaction

de Waaler Rose
→ test de grossesse, detection de l’hormone
gonadotrophine chorionique (HGC) dans
l’urine ; GR recouverte d’hormone mise en
contact des Ac anti-HGC et l’urine de la
femme suspectee d’etre enceinte.
 AGGLUTINATION PASSIVE
• Test de Coombs
 Inhibition de
l’hémagglutination passive
(IHA)
• Permet de rechercher la présence d’un Ag
dans un liquide biologique
• Ag fixé sur des hématies et mis en
présence d’un antiserum specifique
• Si l’Ag est present il se combine aux Ac
specifiques qui ne peuvent plus alors
agglutinés les particules sensibilisées
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
• 6- Divers
 METHODES UTILISANT UN
MARQUEUR
- L ’immunofluorescence
. Ag ou Ac marque avec un fluorochrome
. Lecture au microscope a fluorescence ou cytometre en flux
. Moins de 2 heures
. Tres sensible (mg/mL pg/mL)

- L ’immunoenzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent

Assay)
. Ag ou Ac marque par une enzyme
. Lecture au spectrophotometre
. Moins d ’une heure a plusieurs heures
. Tres sensible ( pg/mL)

- Radioimmunologie: avec radioisotopes (125I)

Le Western-Blot est egalement une technique immunoenzymatique

 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
 Immunofluorescence
L’immunofluorescence classique permet de
déceler une réaction Ag /Ac sur des cellules en
suspension, des frottis cellulaires, des
microorganismes ou des coupes d’organe.
1/Indirecte (IFI): « methode en deux
temps »
 Immunofluorescence
• Fluorochromes:
- FITC : dérivé de la fluorescéine (émission =
520 nm, couleur verte).
- Rhodamine et ses dérivés, utilisé en
général pour le double marquage, donne une
fluorescence rouge-orangée.

Applications:
-Auto-immunité : détection des Ac
antinucléaire, anti-organites ou Ac spécifiques
d’organe.
-Microbiologie : bactériologie, virologie
(cinétique de multiplication de virus, détection de
virus responsable d’infection respiratoire)…
Immunofluorescence

ANCA
 Immunofluorescence
2/ Directe
• Moins sensible
• Méthode en « un temps », l’Ag est
recherché directement par l’Ac
spécifique marqué.
→Recherche des dépôts d’Ig ou de
complément dans les tissus.
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique (ELISA)
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
 ELISA
• Permet de doser n’importe quel antigene
pour lequel on dispose d’Ac specifiques
• Tres grande sensibilité
IMMUNOENZYMOLOGIE (ELISA)
1/Principe
Elles reposent sur l’utilisation d’une
enzyme pour déceler les complexes
immuns. Les techniques ELISA sont
très utilisées en :
-recherche
fondamentale et appliquée
(reconnaissance des épitopes
protéiques, des haptènes)
- analyse médicale, pour
le dosage de nombreuses substances
(Ag, Ac, hormones, marqueurs
tumoraux, médicaments…)

2/Phase solide et fixation

Par adsorption passive sur du verre, du
plastique, du polystyrène, latex… sous
forme de billes, de plaques, de tubes,
de microplaques…
 ELISA
3/ Enzyme
Agent chimique utilisé pour coupler une enzyme
à un Ag ou un Ac

En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par

spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie.
 ELISA

• Dosage des antigenes:

1/Par competition: Vis à vis d’Ac présents en
quantité limitée, et fixés sur un support, il y a
compétition entre l’Ag à doser et l’Ag marqué (de
même spécificité) ajouté en quantité définie dans le
même temps.
 ELISA
2/ Méthode en sandwich
S’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques
ou non). 100 fois plus sensible que la methode par
competition
 ELISA
• Dosage des anticorps:
- Indirecte avec Ag marqué

- Indirecte avec Ac secondaire marqué

 ELISA
• Applications:

 Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones

(insuline, glucacon…), médicaments, enzymes
(énolase, lipase…), les facteurs rhumatoïdes,
vitamines, IgE…

 Diagnostic sérologique : parasitaire,

bactériologique par titrage d’anticorps ( Brucella,
Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,rubéole,
hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…)

 Maladies auto-immunes : recherche et dosage des

FR, des Ac anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3…
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
Radioimmunologie (RIA : Radio
Immuno Assay)
Méthodes utilisant un marqueur
- Ag ou Ac marqué par un isotope
- De moins en moins utilisée
(déchets radioactifs, agrément)
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
• 6- Divers
 WESTERN-BLOT
• Appelé également immuno-empreinte ou immuno-transfert,
immunoblot
• Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse
et la grande sensibilité de l’immunodétection, ce qui en fait un outil
performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac.
• Permet de détecter une protéine spécifique dans un échantillon
donné
• Origine du nom:jeu de mots à partir du Southern Blot
• Différentes étapes:

– A/ Préparation des échantillons

– B/ Electrophorèse sur gel
Séparation des Ag par SDS-PAGE
Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire
ou des protéines recombinantes dénaturées et
chargées négativement, migrent dans un gel
d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %)
sous l’action d’un champ électrique. Elles sont
séparées en fonction de leur PM
 WESTERN-BLOT
C. Le transfert des protéines sur
membrane
Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane
de nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique .

D/ Blocage ou saturation de la
membrane
 WESTERN-BLOT
E/Détection
anticorps primaire et secondaire couplé à une
enzyme le plus souvent
-par colorimètrie
-par chimiluminescence (la +sensible)
-par autoradiographie
-par fluorescence
WESTERN-BLOT
La révélation immunologique
WESTERN BLOT VIH
 TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
• 1- Précipitation
• 2- Agglutination
• 3- Utilisant un marqueur:
-Immunofluorescence
-Immunoenzymatique
-Radioimmunologie (RIA)
• 4- Western-blot
• 5- Cytometrie en flux
• 6- Divers
 Cytométrie en flux
• Définition: étude précise de cellules isolées
entraînes par un flux liquide
• Permet une caractérisation qualitative et
quantitative des cellules
• Utilisation de fluorochromes (FITC,rhodamine)
 Cytométrie en flux
• Principe:
Les cellules sont canalisées par centrage hydrodynamique
(passage une a une) dans une veine liquide
traversée par un faisceau laser

Les cellules émettent des signaux lumineux, reflets de
propriétés optiques intrinsèques ou induites des cellules

Les signaux sont sépares (par des filtres optiques), collectes
(par des photomultiplicateurs) puis amplifies

Numérisation des signaux, traitement et stockage
informatique des données representees sous forme
d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2
paramètres)
 Cytométrie en flux

Méthode utilisant un marqueur

Cytométrie en flux
Cytométrie en flux
 Cytométrie en flux
• Applications de la CMF:

• Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules

souches
hématopoiétiques
• Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri
cellulaire et de gène rapporteur)
• Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon)
• Tri de chromosome (création de banques)
• Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des
souches pures d’algues unicellulaires par ex)
• Dénombrement de lymphocytes B, de lymphocytes T
CD4+, CD8+… réalisée en diagnostic médical
 Mesure de l’avidité des IgG

Définition: force de
liaison entre des Ag
et les Ac
correspondants
Intérêt: aide a dater
une infection
Interprétation:
Mesure de l’index d’avidité
 ELISPOT (« Enzyme-linked
immunospot »)
• 1. Principe:
Détecter et dénombrer les cellules T actives chez un patient,
en détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).
A l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B
En 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des
lymphocytes T

• 2. La coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT

Test diagnostique de la tuberculose infection

latente+++ (QuantiFERON-TB®)
ELISPOT
 Evaluation d’une méthode
• La « sensibilité analytique » est la plus petite quantité de
substance d'un échantillon qui peut être mesurée correctement par une
technique.
• La « sensibilité diagnostique » est le pourcentage de personnes
atteintes d'une maladie donnée qui sont identifiées par la technique comme
porteur de cette maladie.

Sensibilité=[Vrais positifs (VP)/[VP+ Faux négatifs

(FN) ] ]

• La « spécificité analytique » se rapporte à la capacité d'une

technique de mesurer un organisme ou une substance particulière, plutôt
que d'autres, dans un échantillon
• La « spécificité diagnostique » est le pourcentage de personnes
qui n'ont pas une maladie donnée et qui sont identifiés par la technique
comme non porteur de cette maladie.

Spécificité=[ Vrais négatifs (VN)/ [ VN+ Faux Positifs

(FP) ] ]
 Evaluation d’une méthode
• La valeur prédictive positive (VPP) d’un test diagnostique
désigne la probabilité d'avoir une certaine maladie si on
présente un test positif.
VPP= [ VP/[VP+FP]]

• La valeur predictive négative (VPN) d’un test diagnostique

désigne la probabilité ne pas avoir une certaine maladie si on
ne présente un test négatif
VPN= [ VN/[VN+FN]]

• La valeur globale (VG) d’un test diagnostique indique la

proportion de résultats exacts donnés par ce test parmi
l’ensemble de tous les résultats du test

VG= [VP+VN/ [VP+VN+FP+FN] ]

 Exercice
Vous souhaitez évalué un nouveau test de dépistage du
cancer du poumon. Ce test dose un marqueur par
technique « ELISA sandwich ».
L’échantillon étudié porte sur 400 patients suivis dans un
service de pneumologie. Vous savez qu’il a été
diagnostiqué auparavant 50 cancers dans cet
échantillon.
Le test est appliqué à l’ensemble de l’échantillon: 200 non
malades ont eu un test négatif et 40 malades ont eu un
test positif
Calculer la sensibilité, spécificité, VPP, VPN et
la valeur globale du test