LABORATOIRE D’ANALYSE

APPLICATION DE LA CHAINE HPLC EN

CONTRÔLE QUALITE

Présenté par: Dr. TEUBOUBE GILBERT

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HPLC : Les fondements

 Vue d'ensemble

- Théorie
- Équipement
- Bonnes pratiques
- Adéquation du système
- Dépannage
- Maintenance préventive

TEUBOUBE GILBERT 2
 HPLC : Théorie

• La HPLC est une technique de séparation.

• Un système HPLC consiste en une colonne
remplie de phase stationnaire solide et d'une
phase mobile liquide qui la traverse

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Théorie

 Les échantillons et les solutions étalons ainsi que

la phase mobile sont pompés sous haute pression
à travers la colonne.
 La séparation des constituants dans les solutions
se produit en fonction du temps relatif.

TEUBOUBE GILBERT
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 HPLC:Théorie
 Phase stationnaire non polaire avec une
phase mobile polaire
 Les colonnes typiques utilisées sont L1 (C18)

et L7 (C8)
 La phase mobile typique comprend un

mélange d'un tampon aqueux ou d'eau avec

un solvant organique

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement

TEUBOUBE GILBERT 6
HPLC: Equipement
Systèmes de pompage
 Distribuer la phase mobile à un débit constant
avec des fluctuations minimales
 Pression de fonctionnement maximale de 5 000
psi, 10 ml/min
 Inerte aux composants corrosifs de la phase
mobile
 Programmable pour faire varier la plage des
composants de la phase mobile - Gradient ou
mélange isocratique
 Plus courant - pompe à double piston alternatif

TEUBOUBE GILBERT 7
HPLC: Equipement
Systèmes de pompage
 Série isocratique - maintenir une composition

identique de la phase mobile tout au long de la

série – Pré-mélanger la phase mobile –
Mélanger la phase mobile avec la pompe
 Série à gradient - changer régulièrement la

composition de la phase mobile au cours de la

série chromatographique
 Gradient : utile pour des mélanges complexes

de différents facteurs de capacité, pour réduire

le temps d'analyse
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Injecteur
 Automatiquement par l'échantillonneur automatique
 Utile pour le contrôle de qualité et le tamisage à
haut débit
 Courant : boucle fixe à volume variable
 Un changement de la seringue ou la boucle peut
être nécessaire en fonction de la quantité injectée
 Il peut être nécessaire de vérifier : – la précision et
la linéarité – la contamination des échantillons – le
solvant de lavage – le remplissage minimum et
maximum de la fiole

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Injecteur
 L'échantillon doit pénétrer la colonne sous forme de
bande étroite ou bouchon
 Éviter l'excès de tubulure (longueur et diamètre) : – entre
l'injecteur et la colonne – entre la colonne et le détecteur,
et – les raccords à volume mort qui peuvent causer un
élargissement de la bande échantillon avant son entrée
dans la colonne
 L'élargissement de la bande augmente les largeurs de
pic, ce qui diminue l'efficacité de la colonne et la
résolution
 L'élargissement de la bande peut également se produire à
mesure que l'échantillon passe à travers la colonne
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Les colonnes
 Réactifs, solutions – Les colonnes chromatographiques
définissent les catégories de remplissage
 Différentes marques de colonnes dans la même
catégorie peuvent avoir un comportement différent
dans une méthode particulière. Le comportement
dépend des éléments suivants : – charge de carbone –
surface – recouvrement final (« end-capping ») – forme
des particules – taille des particules – effet des silanols
de surface, etc.
 Des variations peuvent également se produire avec
différents lots de la même marque

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Les colonnes
 Le comportement de la colonne dépend aussi de
l'utilisation antérieure.
 La ségrégation de la colonne peut être utile
 Établir une procédure de lavage/stockage
 Le journal d'utilisation peut être utile
 Quand la colonne doit-elle être jetée ?
 Nombre d'injections ?
 Changements de l'efficacité, l'étalement, etc.
 Comparer aux conditions du mélange de
test/étalon du fabricant
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Détecteur
 Spectrophotométrique – Variable
 Longueur d'onde unique
 Double longueur d'onde – Multi-longueurs

d'ondes
 Barrette de diodes
 Indice de réfraction
 Fluorométrique
 Électrochimique
 Spectrométrie de masse

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Equipement
Collecte de donnée
 Enregistreurs
 Intégrateurs
 Systèmes informatisés de traitement de

données

TEUBOUBE GILBERT
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La méthode d’acquisition
- Débit (mL/min)
- Longueur(s) d’onde d’acquisition (nm)
- Volume d’injection (µL)
- Température du passeur d’échantillon (°C) (si
précisé)
- Température de la colonne (°C, si four à
colonne thermostaté)
- Durée d’acquisition du signal (min)

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC : Bonnes pratiques
Réactif
 La qualité du réactif peut être critique, en
particulier à des longueurs d'onde de
détection faibles.
 Solvants: utiliser des qualités HPLC
 Tampons: utiliser des qualités HPLC, ACS
 Eau: utiliser de l'eau qui a une faible

conductivité et une faible absorbance UV ;

Résistivité > 14 MΩ.cm [Link])

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HPLC : Bonnes pratiques

EQUIPEMENT
 Qualification de l'équipement – QI, QO, QP –
<1058> Qualification de l'instrument
analytique
 Maintenance préventive – filtres/disques frittés

de la ligne de solvant de la phase mobile, joints

de pompe, joint de rotor de l'injecteur, cellule
de détection, lampe.

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques

EQUIPEMENT
 Procédure de nettoyage – Rincer les tampons
des systèmes – Rincer avec le composant
organique de la phase mobile – Cellule du
détecteur, injecteur, disques frittés du
réservoir de phase mobile
 Vérifier l'adéquation de tous les équipements
 Verrerie – Nettoyer

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques
MAINTENANCE COLONNE
 Pour les colonnes en phase inverse, rincer
régulièrement avec un composant puissant de la
phase mobile.
 Rincer les tampons avec un mélange
aqueux/organique dans la même proportion que la
phase mobile (sans le sel de la phase aqueuse) –
stocker les colonnes dans un mélange
aqueux/organique comme du méthanol ou de
l'acétonitrile et de l'eau (1:1) ou stocker la colonne
selon les recommandations du fabricant
 Utiliser un journal de bord
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques
MAINTENANCE COLONNE
 Utiliser le chromatogramme de référence et
des conditions standard pour vérifier les
performances de la colonne
 Séparer les colonnes selon l'utilisation (phase

mobile, produit, test, etc.), si possible

 Utiliser un filtre intercalé
 Jeter la colonne avant qu'un échec

d'adéquation du système ne se produise en

cours de série

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques

observations
 Faire des observations avant et pendant
l'analyse :
 État de l'équipement : dépôt de sel autour des

raccords de la pompe, fuites, entrées du

journal de bord sur les séries précédentes
 Pression
 Référence
 Temps d'équilibrage

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques

Observations (suite)
 Temps de rétention (étalon, échantillon) par
rapport aux séries précédentes
 Adéquation du système ou injections d'essai

- forme de pointe, résolution, référence, pics

parasites, vérifier les paramètres d'intégration
 Injecter un solvant à blanc
 Vérification de l'étalon

TEUBOUBE GILBERT 22
HPLC: Bonnes pratiques

PHASE MOBILE
 Préparation de la phase mobile
 Qualité et date de péremption des réactifs
 Quantité
 En cas de pré-mélange, bien mélanger

Dégazage - barbotage d'hélium, filtration

sous vide, intercalée dans la tubulure
 Filtre
 Péremption
 Étiquette

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques
 Préparation étalon
 Lot non périmé
 Séchage ?
 Bon équilibre
 Stabilité de la solution, conditions de stockage
 Qualité du solvant
 Préparation échantillon
 Identique à la préparation étalon
 Échantillon représentatif
 Filtrer si nécessaire ; type de filtre, porosité,
vérification de filtre
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques
 Pour les systèmes avec des échantillonneurs
automatiques
 Étiqueter les fioles
 Vérifier la séquence d'injection avant de

commencer
 S'assurer que la quantité de phase mobile est

suffisante pour la durée de la série

 S'assurer que le remplissage de la fiole est

suffisant

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Bonnes pratiques

Documentation : – n° ID de l'équipement
(système/composants), – n° ID de la colonne
(numéro de série ou autre système), –
paramètres du système, – observations, –
séquence, – toutes les préparations
échantillon, étalon et de solutions – paramètres
d'intégration ou nom de fichier de la méthode
 Consignation permanente de la façon dont

les données ont été collectées et traitées

TEUBOUBE GILBERT 26
HPLC:Adéquation du système

 « … utilisée pour vérifier que le système

chromatographique est adéquat pour
l'analyse voulue ».

TEUBOUBE GILBERT 27
HPLC:Adéquation du système
Système chromatographique
 Le système chromatographique comprend :
 Équipement
 Électronique
 Opérations analytiques
 Échantillons

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Adéquation du système
Échantillon : Solution étalon
Critères d'adéquation – Résolution : ≥ 1,5 entre
le chlorhydrate d'amodiaquine et le phosphate
de chloroquine – Facteur d'étalement : ≤ 1,5
pour le chlorhydrate d'amodiaquine et le
phosphate de chloroquine – Écart-type relatif :
≤ 2,0 % pour le chlorhydrate d'amodiaquine et
le phosphate de chloroquine

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Adéquation du système - Exemple
Le chromatographe liquide est équipé d'un
détecteur 240 nm et d'une colonne analytique de
8 mm x 10 cm avec un remplissage L1. Le débit
est d'environ 1,0 ml par minute. Analyser la
préparation étalon et enregistrer les réponses
maximales comme indiqué dans la Procédure : le
facteur de capacité k', n'est pas inférieur à 1,3 ;
l'efficacité de la colonne n'est pas inférieure à 8
000 plateaux théoriques ; le facteur d'étalement
n'est pas inférieur à 0,9 et pas supérieur à 2,0 ;
et l'écart-type relatif pour des injections
répétées n'est pas supérieur à 2,0 %
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Paramètres
 Résolution
 Efficacité
 Précision
 Étalement
 Facteur de rétention (ou facteur de capacité)
 Rapport signal sur bruit

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
La résolution
 Rs, assure que les composés dont l'élution

est proche sont résolus les uns des autres

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
 Résolution (Rs)
 fonction de l'efficacité de colonne (N), du

facteur de séparation et du facteur de

capacité, k
 mesure de la puissance de résolution du

système
 en général, non inférieure à 2,0

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système

Efficacité de la colonne

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Efficacité de la colonne
 Efficacité de la colonne (N)
 un seul pic d'intérêt
 mesure de la netteté de pic
 généralement ≥ 2 000 plateaux théoriques

(HPLC)

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Précision – Écart-type relatif (ETR)
 Précision - Déterminée par des injections

répétées d'une solution étalon.

 Sauf indication contraire dans la

monographie, calculer l'ETR de cinq injections

répétées si l'exigence est de 2,0 % ou moins,
six injections répétées si plus de 2,0 %

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
 Le facteur de symétrie (AS) (facteur
d'étalement), est une mesure de la symétrie
des pics. Le facteur d'étalement est 1 pour
les pics symétriques, et augmente à mesure
que l'étalement augmente

Front diffus quand As <1

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
 Facteur de rétention k (ou facteur de capacité,
k')
 mesure de l'emplacement où le pic d'intérêt est

situé par rapport au volume de vide, c.-à-d., le

temps d'élution des composants non retenus
 généralement ≥ 2

 k = (tR -t M)/ tM

tR - temps de rétention de l'analyte

tM - temps de rétention d'un composant non-
retenu

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Rapport signal sur bruit (signal-to-noise ratio
S/N
 S/N = 2H/h
 H = hauteur du pic, du sommet du pic à la référence
 La référence est extrapolée sur une distance ≥ 5 fois la largeur du pic à mi-
hauteur, (W½)

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Points pratiques
 Des injections répétées à des fins de précision
peuvent être faites avant d'injecter les
échantillons ou entre les injections d'échantillons
 L'adéquation du système doit être démontrée
tout au long de la série par l'injection d'une
préparation de contrôle appropriée, à des
intervalles appropriés.
 S'il y a un changement important de l'équipement
ou des réactifs critiques, l'adéquation doit être
réévaluée avant l'injection des échantillons

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Ajustements des conditions de fonctionnement
 La spécification de paramètres définitifs pour les tests

d'adéquation du système dans une monographie

n'exclut pas l'utilisation d'autres conditions de
fonctionnement appropriées.
 Des ajustements sont autorisés uniquement dans les

conditions suivantes :
 Des étalons appropriés sont disponibles
 Ces étalons montrent que des ajustements améliorent la

qualité de la chromatographie - les exigences

d'adéquation du système.
 Des changements au-delà des plages indiquées seraient

considérés comme une méthode alternative

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
les ajustements autorisés pour :
– le pH de la phase mobile,
– le rapport des composants de la phase mobile,
– la concentration de sels dans le tampon de la
phase mobile,
– la longueur de la colonne, la taille des
particules,
– la température,
– le débit,
– le volume d'injection, etc

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
pH du tampon de la phase mobile
 Le pH du tampon de la phase mobile peut

être modifié de ±0,2 unité

 Effet– Un pH bas peut protoner les composés

acides (silanols) – Un pH élevé peut

neutraliser les composés basiques – S'assurer
que le pH maintient l'état du médicament
(éviter pH = pKa) – Remarque : Plage de
stabilité de pH apparente pour les colonnes
en phase inverse à base de silice: 2,0 à 8,0

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Composition de la phase mobile
 Concentration de sels dans le tampon de la phase
mobile : 10 %
 Rapport des composants de la phase mobile –
Composants mineurs (≤ 50 %) : 30 % relatif et – La
variation d'un seul composant ne peut pas dépasser
10 % (valeur absolue) (relativement à la phase mobile
totale)
 Effet – Si la concentration en sels est insuffisante, des
variations de pH peuvent se produire en fonction de
l'injection – La concentration est la plus critique aux
valeurs extrêmes du pH de ce tampon – La puissance
du solvant peut augmenter ou diminuer la rétention
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Température de la colonne
 Température de la colonne : ±10 °C
 Effet – Le changement de température peut
provoquer des changements du temps de
rétention – La temp. Ambiante est relative et
doit être contrôlée – Une temp. supérieure
diminue la viscosité de la phase mobile •
Améliore l'efficacité de la colonne • Réduit la
contre-pression de la colonne • Diminue le
temps de l'analyse – Ces changements peuvent
affecter la résolution
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Taille des particules
 Ajustement autorisé : – La taille des particules

(diamètre) peut être réduite de 50 % au

maximum, mais ne peut pas être augmentée
 Effet – L'efficacité est inversement

proportionnelle à la taille des particules

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système

Changement de la taille des particules

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Longueur de la colonne
 Longueur de la colonne : ±70 %
 Effet – Le temps d'analyse est proportionnel à

la longueur de la colonne
– Isocratique : ½ Longueur = ½ tR
– Diminution similaire de la résolution
– La réduction de la taille des particules peut
aider à diminuer la perte de R

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système

Changement de longueur de la colonne

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Diamètre interne de la colonne
 Diamètre interne (D.I.) de la colonne :

–Peut être ajusté à condition que la vitesse

linéaire soit maintenue constante (voir Débit)
 Effet

– Économie de solvant
– Réduction de l'élargissement de bande (pics
plus nets)
– Augmentation de la résolution (pics plus nets

TEUBOUBE GILBERT
51
HPLC:Adéquation du système
 Débit ±50 % – En cas de changement d'ID, mettre à l'échelle
pour maintenir la vélocité du débit linéaire – De plus, le débit
mis à l'échelle peut être ajusté de ±50 %

F1 = débit indiqué dans la monographie, en ml/min

F2 = débit ajusté, en ml/min
d1 = diamètre interne de la colonne indiqué dans la
monographie ;
d2 = diamètre interne de la colonne utilisée ;
 Avantage – Un débit croissant est la meilleure façon de réduire

la durée de série – Isocratique: Débit X2 = ½ durée de série –

La résolution diminue, mais pas de façon aussi significative
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Changement de débit

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC:Adéquation du système
Longueur d'onde, volume d'injection
 Longueur d'onde, détecteur UV-visible – les
écarts par rapport à la longueur d'onde spécifiée
ne sont pas autorisés – utiliser la procédure du
fabricant ou validée pour vérifier que l'erreur
maximale est de+/-3 nm.
 Volume d'injection : Peut être réduit à condition

de respecter :
– la précision acceptée et
– les limites de détection
– aucune augmentation n'est autorisée.
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Diagnostic
 Le problème peut-il être reproduit ou est-ce
une incidence d'anomalie unique ?
 Si le problème peut être reproduit, chercher un
contexte répété ; c.-à-d. quand le problème
s'est-il produit ?
 Quelque chose a-t-il été changé, ajouté ou
supprimé ?
 À quoi ressemblent les autres
chromatogrammes ? Avant et après, blancs,
étalons et échantillons ?
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Diagnostic
 Vérifier que les préparations (étalon, échantillon,
phase mobile, diluant) sont correctes
 Vérifier que tous le matériel (balance, four, HPLC,
etc.) utilisé est étalonné et fonctionne correctement
 Vérifier que la colonne correcte a été utilisée.
Vérifier l'état de la colonne.
 Vérifier que les paramètres de fonctionnement
appropriés ont été utilisés.
 Vérifier que les flacons sont dans la bonne position

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Diagnostic
 Pour isoler le problème, changer un seul

élément à la fois
 Pour isoler les problèmes de matériel, la même

colonne et les mêmes solutions peuvent être

traitées sur un autre système HPLC.
 Pour isoler les problèmes de colonne, le même

matériel et les mêmes solutions peuvent être

utilisés avec une colonne différente.

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Problèmes
 Parmi les problèmes courants :
 Dérive-référence, irrégularité des temps de

rétention des pics

 Pics parasites
 Critères d'adéquation du système non remplis
 Bruit de fond
 Pics divisés
 Étalement des pics

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Changements de la dérive de référence/du temps de rétention
Causes possibles :
 Le système n'est pas équilibré – Certaines phase

mobiles/colonnes prennent plus de temps que d'autres –

Utilisation préalable du matériel, de la colonne – Attendre que
la référence soit stable, que les temps de rétention soient
réguliers
 Fuite du système –Examiner les raccords
 Fluctuations de température – Surveiller la température –

Utiliser le contrôle de température de la colonne (méthode et

POS) – Vérifier toute présence de courant d'air ou source de
chaleur – Si un chauffage de colonne est utilisé, vérifier son
réglage et son fonctionnement
 Le système/la colonne a besoin d'être nettoyé/remplacé

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Pics parasites
Causes possibles :
 Verrerie contaminée – Isolé au niveau de l'échantillon, de

l'étalon ou du diluant?
 Lampe du détecteur – Vérifier les heures d'utilisation de la

lampe – Surveiller la sortie du détecteur sans débit de la

pompe – Installer une nouvelle lampe - le problème
disparaît-il?
 Contamination de l'injection précédente – Examiner le

contexte dans lequel le pic apparaît –Augmenter la durée

de série et injecter pour confirmer – Si la contamination
provient de l'injecteur, vérifier le solvant de lavage, vérifier
le fonctionnement de l'échantillonneur automatique – Il
peut être nécessaire d'ajouter des blancs plus puissants ou
plus fréquents entre les injections TEUBOUBE GILBERT 60
HPLC: Dépannage
Pics parasites
 Dégradation de l'échantillon – Revoir les détails de la
préparation échantillon et les informations de la stabilité
de la solution – Tous les échantillons de la série
présentent-ils des pics parasites ? – Les étalons et les
blancs sont-ils propres ? – Examiner les
chromatogrammes antérieurs pour un contexte similaire
 Bulles – Contexte ? – Pics très étroits ; comparer à la
largeur de pic des pics environnants – Vérifier le mélange
et le dégazage ainsi que la cellule du détecteur
 Colonne -Contexte ? -Blancs ? -La colonne peut être
surchargée ou contaminée à partir des séries
précédentes

TEUBOUBE GILBERT
61
HPLC: Dépannage
Échec d'adéquation du système
Causes possibles :
 La colonne doit être remplacée –Traiter la colonne avec le
mélange d'essai du fabricant et comparer aux résultats
originaux – Combien d'injections ont été faites sur la
colonne? – La performance est-elle en déclin?
 La seringue de l'injecteur doit être remplacée – ETR plus
élevé que d'habitude pour les injections répétées
 Quantité de solution dans la fiole –Pour les échecs d'ETR,
vérifier la quantité de solution dans la fiole de
l'échantillonneur automatique. Un volume excessif ou trop
faible dans la fiole peut produire la variabilité de l'injection.
 Préparation de la phase mobile –Vérifier que la phase mobile
et la solution d'adéquation du système ont été correctement
préparées. Vérifier les solvants utilisés 62
TEUBOUBE GILBERT
HPLC: Dépannage
Bruit de fond
Causes possibles :
 Nettoyage du système - colonne et cuve à

circulation du détecteur – Substituer une

autre colonne ou vérifier la colonne sur un
autre système – ou présence d'air dans la
phase mobile, la pompe, le détecteur
 Fuites
 Lampe

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Pics divisés
 Causes possibles :
 Vide dans la colonne
 Blocage du disque fritté de la colonne
 Solvant, phase mobile désappariés

- Essayer une autre colonne avec le même système

et les mêmes solutions. Les pics sont-ils divisés ?
- Remplacer la colonne ou le disque fritté
- Utiliser la phase mobile comme solvant
dissolvant
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Étalement
Causes possibles :
 Solvant, phase mobile désappariés - Les pics d'élution précoces

présentent plus d'étalement -Utiliser si possible la phase mobile

comme solvant dissolvant
 Surcharge d'échantillon - La distorsion des pics augmente avec la

quantité injectée - Forme de triangle à angle droit - Réduire la

charge de l'échantillon
 Les composants réagissent avec des sites silanol actifs sur la

colonne (interactions secondaires) - Se produit entre les

composants de base chargés positivement et le silanol de surface
chargé négativement - Utiliser une phase mobile tamponnée avec
un pH < 3 (pour protoner les groupes silanol) - L'additif de phase
mobile, comme le TEA, fait concurrence aux solutés de base pour
l'interaction avec les silanols (change la colonne)

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Étalement
 Volume mort dans le système - Pics précoces montrant
plus d'étalement que les pics plus tardifs - Utiliser une
tubulure plus courte, plus étroite
 Vide ou disque fritté bloqué - La présence d'un vide n'est
pas aussi courant pour les colonnes fabriquées
aujourd'hui - Les causes incluent un fonctionnement à des
débits ou pressions très élevés, ou un pH supérieur à la
valeur recommandée - Utiliser un filtre intercalé
 Pics de coélution - Peuvent donner l'apparence d'un seul
pic à étalement - Pureté des pics - Comparer aux
chromatogrammes précédents - Changer le rapport de la
phase mobile ou la colonne pour tenter de séparer les pics

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Dépannage
Prévention des problèmes
 Respecter les POS
 Établir la documentation de manière

appropriée
 Maintenir le matériel en bon état

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Maintenance Préventive

Raisons pour le dépannage de l’équipement

 Manque de maintenance
 Manque de pièces de rechange
 Manque de connaissances
 Manque des manuels et procédures nécessaires
 Manque de financement
 Manque de ressources/temps

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Maintenance Préventive
Élaborer un programme efficace de maintenance préventive (MP)
 Éduquer et procéduraliser

–Obtenir les manuels d’utilisation

–Revoir les dossiers des prestataires de services
–Inclure les cycles de maintenance dans les procédures
–Identifier des experts de l'équipement et les utiliser comme formateurs
–Former le personnel
 Planifier et mettre en œuvre
–Identifier les pièces de rechange nécessaires et les garder en stock
–Mettre le plan en œuvre
–Créer un carnet de bord pour chaque équipement (consigner
l’utilisation, la maintenance, l'étalonnage, etc.)
–Utiliser les données des équipements de métrologie pour confirmer ou
ajuster la fréquence des activités du programme
–Vérifier soi-même et prendre des mesures correctives

TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Maintenance Préventive
 Défi financier
- Collaborer avec les fournisseurs (multi-installations vs

installation unique)
- Négocier les pièces au lieu du service dans les

contrats
- Exploiter l'Internet et les télécommunications
- Exploiter les relations avec les fournisseurs
 Ressources

-Responsabilité partagée
-Formations croisées
-Développement personnel
-Programme de formation efficace
TEUBOUBE GILBERT
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HPLC: Maintenance Préventive
Problèmes courants
 Variations de pression –Cause : Vérifier les vannes, les
joints/pistons de pompe, le dégazage ou la présence de fuites
dans le système –Mesure corrective : Nettoyer ou remplacer les
pièces impliquées ; s’assurer que le dégazeur fonctionne
comme prévu
 Pression de retour élevée –Cause : Obstruction dans le système
(filtre en ligne, tubulures, cuve à circulation, colonne) –Mesures
correctives : Isoler systématiquement le système pour
déterminer la cause de la pression de retour. Remplacer/réparer
selon les besoins.
 Reproductibilité des pics inadéquate –Cause : Problème de la
seringue d’échantillon, des joints de l'injecteur, de l’aiguille, de
la vanne à gradient, de la colonne, des raccords ou du détecteur
–Mesures correctives : Diverses
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HPLC: Maintenance Préventive
 Connaître l’équipement
-Utiliser une phase mobile filtrée
-Savoir ce qui circule dans les lignes de la pompe
-Vérifier les performances de la colonne
-Rincer le système et la colonne avant
l’utilisation
-Documenter les activités dans les carnets
d’utilisation et carnets de bord de la colonne
- Utiliser les méthodes d’arrêt/ralentissement
progressif

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HPLC: Maintenance Préventive
 Le jour d'utilisation
- Adéquation du système
- Inspecter visuellement pour la présence de

fuites, etc.
- Selon la série précédente, la série en cours

peut rincer le système

 Tous les 3 mois

-Inspecter les pompes et les joints de pompe

-Noter l'énergie de la lampe

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HPLC: Maintenance Préventive
 Tous les 6 mois
-Remplacer les joints de la pompe
-Noter l'énergie de la lampe ; remplacer le cas

échéant
- Contrôler les débits de la pompe
- Vérifier l'exactitude de longueur d'onde
 Annuellement

-MP et requalification

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HPLC: Maintenance Préventive
Bonnes Habitudes
 « La meilleure défense est une bonne attaque »
 Avoir conscience des signes de l’équipement pouvant être

indicatifs :
–Fuites de la pompe
–Accumulation de sel
–Bruit
 Se servir des carnets d’utilisation et carnets de bord de la colonne
 Exécuter les méthodes de nettoyage et de ralentissement

progressif/arrêt
 Conserver des dossiers à jour
 Consulter les vidéos du fabricant pour les guides et le dépannage
 Dispenser une formation de recyclage

TEUBOUBE GILBERT 75
REGLES PRATIQUES

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Choix de la colonne
1. Identification de la colonne pour analyser le produit
 (cf. protocole)
 Installation
- Avant de raccorder la colonne, s’assurer que les tubulures
du système HPLC sont bien purgées de toute phase
mobile préalablement utilisée. Cela permet d’éviter
d’envoyer vers la colonne HPLC, la phase mobile
potentiellement incompatible avec la colonne ou son
solvant de stockage.
- Vérifier le sens du débit sur la colonne (indiqué sur la
colonne par une flèche ou sens des écritures).

TEUBOUBE GILBERT 77
Conditionnement du système

 Conditionner la colonne pendant 30 min ou plus

afin d’obtenir une ligne de base convenable. Une fois
la colonne conditionnée, les standards préparés en
double sont injectés et le facteur de similarité est
calculé (compris entre 0.98 et 1.02)

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Traitement de la réponse

intégration du signal
 Les paramètres d’intégration proposés par chaque
logiciel sont utilisés pour déterminer les aires des
pics d’intérêt.

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Analyse qualitative
 Identification
L’identification est positive lorsque le temps de
rétention de l’essai est identique à celui du témoin

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Analyse quantitative
Quantification de la réponse
 Utiliser les formules appropriées pour calculer la
teneur du principe actif dans l’essai ou les teneurs
des impuretés

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Résultats
Effectuer la validation du résultat d’analyse
 S’assurer que tous les critères de validation d’une
analyse sont bien remplis avant de statuer sur le
résultat final d’analyse.

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Nettoyage de la colonne

 La colonne doit être rincée à l’eau HPLC grade dès

la fin de l’analyse. La majorité des colonnes utilisées
étant des phases inverses (C18, C8) les colonnes
doivent être stockées dans un mélange de 50%
d’acétonitrile ou méthanol et 50% d’eau.

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Merci

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