Les vecteurs de clonage

Année universitaire 2021/2022 Dr. Ouldjaoui Ahmed

I. Vecteurs de Clonage
1. Définitions
 Vecteur est une séquence d'ADN permettant la propagation,
la sélection, la modification d'une séquence d'ADN d'intérêt. En
bref l'étude et la manipulation d'une séquence d'ADN isolée.

 Clonage
- pour amplifier et conserver une séquence d’ADN
- pour exprimer une séquence d’intérêt
- pour introduire un gène dans des cellules ou des organismes
- pour produire une protéine d’intérêt

 ADN génomique est le support physique de l'ensemble des

gènes de la cellule.

 ADN complémentaire (ADNc) est la copie en ADN des ARNm.

I. Vecteurs de Clonage
2. Utilité
● Permet de conserver une séquence d'ADN donnée.
● Permet de la multiplier pour en accroître la quantité.
● Permet de la modifier pour y introduire des mutations,
délétions.
● Permet de la réintroduire dans des cellules.

3. Principe
● Un Vecteur Circulaire
Linéaire

● Une Cellule hôte Procaryote

Eucaryote

●Un fragment d'ADN ADN génomique

d'intérêt. ADNc
4. Les caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal

Sites uniques de coupure par les

enzymes de restriction
5. Principes généraux d’utilisation d’un vecteur
1. préparation de l’insert à cloner (fragment d’ADN d’intérêt) et du vecteur
2. Intégration - ligation de l’insert dans le vecteur
3. transformation de l’hôte par le vecteur recombiné
4. sélection des hôtes recombinants
6. Obtention de l’ADN
recombinant

+ traitement
PAL
7. La ligation (ligature...)

Une enzyme, la
ligase, est capable
de lier de façon
covalente deux
molécules d’ADN
en une.
8. Différents vecteurs pour différentes utilisations
Taille maximum approximative du fragment d’ADN qui peut être
cloné dans chaque vecteur

VECTEURS HOTE INSERT (Kb)

Plasmides Bactérie 10

Phage lambda Bactérie 25

Cosmide Bactérie 45

Phage P1 Bactérie 100

BAC (bacterial artificial chromosome) Bactérie 300

YAC (yeast artificial chromosome) Levure 1000

 9. Les plasmides comme vecteurs de clonage
Molécule d’ADN de taille réduite, d'origine bactérienne
Molécule d’ADN circulaire – taille 2kb à 5kb
Peut accepter jusqu’à 10kb d’ADN exogène
Peut être considérée comme un minichromosome capable de
réplication autonome
Confère la résistance à un ou plusieurs antibiotiques = sélection
10. Les classes de plasmides
10.1. Les plasmides de première génération :
Ce sont les premiers à avoir été utilisés en génie génétique.
Ce sont des plasmides à l’état naturel, non modifiés au
laboratoire. Il s’agit des plasmides suivants :
• ColE1
• RSF 2124
• pSC 101

10.2. Les plasmides de deuxième génération :

Ce ne sont pas des plasmides naturels mais résultent de
plusieurs transformations : plasmides "artificiels".
La série la plus importante de ces plasmides est la série pBR
312 à pBR 322. Le plasmide pBR 322 est constitué de 4,4 Kb
et possède deux gènes de résistance : un pour la tétracycline
(TcR), l’autre pour l’amplicilline (ApR). il possède, en plus, 20
sites uniques pour les endonucléases de restriction dont 11
localisés sur les deux gènes de résistance.
La carte du plasmide pBR322 d’E. coli

La localisation des sites de coupure par certaines enzymes de restriction

est montrée. Ce vecteur possède deux gènes de résistance (Apr: Résistance
à l’ampicilline, Tetr: Résistance à la tétracycline).
Polylinkers de pUC8 et pUC9
pUC8 ACGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCACTG

Polylinker

pUC 9 ACGCCAAGCTTGGCTGCAGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCACTG

Polylinker

10.3. Les plasmides de troisième génération :

La famille pUC : Ont une taille qui avoisine 2,6 Kb et ayant intégré les gènes de
résistance à l’ampicilline (ApR) et lacZ. Un polylinker identique à celui du
phage M13 est associé à lacZ. Les différents pUC (de pUC8 à pUC19) ne
différent que par le nombre de nucléotides et l’emplacement du polylinker
La carte génétique d’un vecteur de type pUC dérivés de
pBR322

le site de clonage multiple (polylinker) est introduit dans le gène

lacZ, sans interrompre la fonction du gène (Primose et al.,2002).
11. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes
De type procaryotique (bactéries):
Cas d’un vecteur plasmidique:
l’ADN est introduit dans les
bactéries traitées spécialement le
plus souvent par choc thermique
ou par choc électrique. électroporateur
 11. 1. Identification des clones intéressants
Dans ce cas les bactéries transformées avec le vecteur ne possédant
pas ou possédant l’insert sont sélectionnées un criblage est nécessaire
 11. 2. Criblage des clones intéressants

AmpR AmpR
TetR TetS
Clone intéressant
11. 3. Criblage – screening - des clones intéressants
Test blanc-bleu (α-complémentation)

Insertion d'un fragment d'ADN (< 10 kb) dans un vecteur de deuxième

génération (type pUC). L'inactivation insertionnelle du gène lacZ permet de
révéler facilement les colonies contenant le gène d'intérêt (sélection positive:
colonies blanche). Le milieu de sélection est supplémenté par l'ampicilline.
 12. Les phages
Virus de bactérie-infectieux : Rendement +++
• λ : 48 Kb
• Les phages et les bactéries hôtes sont généralement mutées
pour éviter le cycle de Lysogénie au profit du cycle lytique.
• Grande partie non essentielle
VECTEURS
2 Types :
• Insertion (λ zap, gt CHARON cDNA)
Faible capacité ≤ 10 Kb
• Délétion : substitution
(Charon, EMBL, DASH, FIX…)
Partie non essentielle « stuffer » est délétée et remplacée
: ≤ 25 Kb
• Sélection spi.
12.1. Les phages comme vecteurs de clonage

Phage = virus de
bactéries
12.1. Les phages comme vecteurs de clonage
12.2. Introduction de l’ADN recombinant dans les cellules
hôtes

De type
procaryotique:
Cas d’un vecteur
phagique
13. Les cosmides comme vecteurs de clonage
14. Les YACs comme vecteurs de clonage

YAC : Yeast Artificial

chromosome
15. Bacterial Artificial Chromosomes BAC

● Avantages :
– Grande capacité d'insertion
– Facilité de manipulation
(comme plasmide)
7.4kb – Hôte bactérien
– Copie unique
– Pas (peu) de réarrangement

● parA, parB and repE sont des

gènes requis pour la stabilité du
BAC.
● OriS est une origine de
réplication
● CM : gène de résistance au
chloramphénicol
 16. Applications des vecteurs
- Clonage et amplification d’une séquence d’ADN
- Création des banques d’ADN génomiques et d’ADNc
- Introduction d’un gène dans des cellules, des
plantes ou des organismes (animaux transgéniques)
- Production d’ARN
- Production de protéines codées par les gènes
insérés

Production de protéines humaines à but

thérapeutique

- Facteur VIII de la coagulation dans l’hémophilie A

- Hormone de croissance
- Insuline
 Banques d’ADN

- Banques d’ADN génomique

- Banques de cDNA
17. Principe du clonage (cas d’une banque génomique)
17.1. Banque (librairie) d’ADN génomique
Comment définir si une banque est suffisamment grande pour
espérer trouver un fragment d’intérêt?

Calcul afin de définir la probabilité de trouver une

séquence donnée dans une banque.
N=In(1-P)/In(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilité désirée
f: proportion de génome dans un seul recombinant

Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence

représentée dans une banque de fragments de 17kb
d’un génome eucaryote (3.109pb)
N= In(1-0.99)/In(1-(1,7.104/3.109))=8,1.105 colonies
 17.2. Banque d’ADNc

Le problème ici
est l’obtention
de clone dit
« full length ».
 17.3. Obtention de l’ADN de l’organisme donneur

A partir de l’ARN:
Principe de la "reverse
transcription":
17.4. Production de protéines : Utilisation de vecteur d’expression
17.5. Exemple de l’insuline
 18. Cellules hôtes
- Bactéries : E. Coli
premier hôte utilisé
nombreux vecteurs plasmidiques connus et utilisables
culture en masse dans les fermenteurs
taux d’expression élevés (plusieurs g de protéine/litre)
MAIS secrètent mal les protéines : éclatement des bactéries
-pas de modifications post-traductionnelles

- Levure saccharomyces cerevisiae

modifications post traductionnelles
MAIS pas de sécrétion, moins bon rendement

- Cellules CHO (chinese hamster ovary)

culture de masse en bioréacteurs, protéines complexes
MAIS cher et rendement plus faible
19. Transfert et clonage du gène de l’insuline
MERCI POUR VOTRE
ATTENTION