COMPTE RENDU

MICROBIOLOGIE
MEDICALE

DIAGNOSTIC D’UNE INFECTION

identificationdesbactériesetde
leursensibilitéauxantibiotiques

2ème année de Pharmacie

Groupe: N°3

Réalisé par:

Amina Hor

& Rim Moussayer

 SOMMAIRE:
• SECTION A -- INTRODUCTION
• SECTION B – BUTS DES MANIPULATIONS
• SECTION C – MATÉRIELS
• SECTION D – EXAMENS MACROSCOPIQUE ET MICROSCOPIQUE
D'UN BOUILLON DE BACTÉRIES:
• D.1 EXAMEN MACROSCOPIQUE
• D.2 EXAMEN MICROSCOPIQUE (ETAT FRAIS ET FROTTIS COLORÉ) +
identification des BAAR
• SECTION E – LES DIFFERENTS MILIEUX DE CULTURE
Gelose trypticase soja
Gélose MHF +SANG
Gélose chocolat enrichi
Gélose CLED
Gélose columbia+sang
Gélose kliglet hajna
Mac conkey
chapman
lowenstein jensen

Ensemencement des milieux gélosés.

Observation des colonies isolées.
• SECTION F – BAAR
• SECTION G – PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES
STAPHYLOCOQUES:
• G.1 TESTS D’IDENTIFICATIONS
• SECTION H – PROCEDURE D’IDENTIFICATION DES
BGNS
• H.1 ETAPES
• H.2 REALISATION D’UN FROTTIS
• H.3 TEST D’OXYDASE
• H.4 TEST DE KIGLER
• H.5 LECTURE DE LA GALLERIE
• H.6 RECAPITULATIF ET RESULTAT:

• SECTION I -- ANTIBIOGRAMME
• SECTION J – CONCLUSION
INTRODUCTIO
N
La bactériologie médicale est une branche de la biologie
médicale qui consiste en l'analyse de divers liquides
biologiques (parfois de tissus) dans le but d'isoler et/ou de
caractériser une ou des bactéries pouvant être responsables de
la pathologie suspectée à l'aide de techniques directes ou
[Link] existe un grand nombre de tests biologiques
différents pour identifier les micro-organismes (BGN/BGP PAR
EXEMPLE°). Ces tests sont faits sur des échantillons de sang,

d'urines, d'expectorations ou d'autres liquides biologiques ou

d'autres tissus. Sur cet échantillon, on peut réaliser les tests
suivants : Coloration et examen au [Link] Un
examen ou analyse bactériologique permet de rechercher et
d'identifier les bactéries en cause dans une infection avec
l’evaluation de sa résistance à des antibiotiques tout cela en
utilisant des outils simples qui permettent d’aboutir à des
résultats pouvant améliorer la prise en charge des patients.

donc la question qui se pose est:

comment peut-on identifier ces bacteries et
evaluer leurs resistances aux anti-biotiques?
 BUTS DES
MANIPULATIONS:
1. Se familiariser avec un laboratoire de microbiologie, son
équipement et son fonctionnement
2. Présentation des gros matériels (étuves, autoclave,... )
3. Présentation d'un poste de travail: matériels
4. Démonstration à partir d’un bouillon de culture contenant
un mélange de bactéries: examen macroscopique et examen
microscopique (état frais au microscope (x40), confection
d’un frottis, coloration de gram.)
5. Présentation de la coloration de Ziehl Nielsen et observation
d’un frottis déjà préparé.
6. Présentation des milieux de culture : solides, liquides et
ensemencement sur milieux gélosés
7. Démonstration observation et suivi des isolements
8. Noter l’aspect des colonies (taille, forme, couleur, hémolyse)
9. Coloration de gram sur chaque type de colonies.
10. Réalisation de tests catalase, Pastorex, coagulase.
11. Réalisation d’une suspension à partir des colonies.
12. Ensemencement d'une galerie d'identification + Kligler +
contrôle de pureté
13. Réalisation d’antibiogrammes
14. Lecture et interprétation des galeries d'identification, Kligler
et des antibiogrammes.
 MATÉRIELS:

 étuve
 pipettes
 verres
 béchers et anse
 pinces
 lames
 lamelles
 microscope optique
 Bloc de paraffine
 crayon ou marqueur
 papier absorbant
 bocal contenant de l'eau de Javel
 plaque chauffante
 colorants et fixateur (Gram)
 les différents milieux de culture utilisés lors du TP
 tubes à essai
 du plasma, H2O2, d’autres réactifs...
une galerie API 20e
 disques d'antibiotiques
 EXAMENS
MACROSCOPIQUE ET
MICROSCOPIQUE
D'UN BOUILLON DE
BACTÉRIES:
Examen macroscopique:
Cet examen est effectué à l’œil nue et se base sur quelques
caractéristiques observées comme la couleur, absence ou présence
de troubles ou on peut dire même la présence d’une odeur.

IMAGE
Résultat du TP:
L’aspect du tube contenant le bouillon est
trouble ce qui montre la présence des
espèces Bactériennes.

Examen microscopique:
est à la base de tout diagnostic bactériologique, il nécessite
l’utilisation d’un microscope optique pour observation en fond clair
Examen microscopique à l’état frais:
Matériel: lame/ lamelle/ Paraffine IMAGE
• Prélever une goutte de culture en bouillon
par pipette pasteur.
• Dépôts de la goutte au centre d’une lame de
verre.
• Recouvrir la goutte d’une lamelle couvre
objet
sans enfermer des bulles d’air.
• Luter la lame avec de la paraffine fondue.
• Observation au microscope (objectif*40).

Intérêt: noter la morphologie/ et mobilité

RESULTAT DE L’OBSERVATION
 EXAMEN MICROSCOPIQUE APRES FIXATION ET COLORATION

1. Réalisation de frottis:

A partir du bouillon

o Dépôt d’une goutte de bouillon au centre

d’une lame par un anse.
o Etalement de la goutte sur un cercle afin
d’obtenir un étalement mince.
o Sécher la lame.
o Fixation du frottis.

A Partir d’une colonie

o Dépôt d’une goutte d’eau sur lame de verre.

o Prélever un fragment de colonie par anse.
o Dissocier l’inoculum dans la goutte d’eau et
laisser sécher.
o Fixer à l’air libre.

APRES L’ETAPE DE FIXATION ON PASSE à UNE ETAPE TRES IMPORTANTE : l’etape de

coloration

2. l’etape de COLORATION:

Coloration de Gram Coloration de ziehl Neelsen (mise en

évidence des BAAR)
• Recouvrir la lame de violet de gentiane • Recouvrir la lame de Fuchsine de Ziehl.
phéniqué et laisser agir 1 min. • Chauffer jusqu’à émission de vapeurs
• Recouvrir la lame de lugol et laisser agir blanches.
1min. • Laisser froidir environ 3min.
• Répéter 2 fois le chauffage 10min.
• Décolorer avec un mélange alcool- • Recouvrir la lame d’acide sulfurique et
acétone laisser
agir 1min.
• Recouvrir la lame d’alcool à 95°et laisser
• Recouvrir la lame de fuchsine de Ziehl et agir
laisser agir 1min. 1min.
• Sécher puis observer au microscope. • Recouvrir la lame avec une solution diluée
• Entre chaque étape on rince à l’eau du de
robinet et éliminer l’excès d’eau. bleu de méthylène et laisser agir 2min.
• Apres chaque étape on rince avec l’eau du
robinet.
 RESUTATS DE TP ( apres fixation et
coloration):

apres realisation de la coloration Gram

Résultat:
Bactéries Gram + violettes
Bactéries Gram - roses

BACTERIE GRAM

après realisation de la coloration de ZIEHL NEELSEN

Résultat:
Bacilles acido alcoolo résistant apparaissant roses sur
fond bleu
 LES MILIEUX DE
CULTURES
• Gélose tropicase soja(glu-PKNaCl)

Milieu non sélectif largement utilisé

pour des bactéries non-exigeantes et
moyennement exigeantes

• Gélose de Muller Hinton (MHF) + sang (en boite de pétri)

Milieu enrichi et non sélectif utilisé comme

milieu de référence pour l’étude de la
sensibilité aux ATB

• Gélose chocolat polyviteux

Milieu enrichi et non sélectif utilisé

essentiellement pour des bactéries
exigeantes
(Haemophilus, Streptoccus...)
 • Gélose CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient)

non selectif
differentiel
bacteries non exigentes urinaires

• Gélose Columbia +5% sang de mouton (en boite de pétri)

non selectif
enrichi
bacteries tres exigentes(ex
streptocoques et pneumocoques)

• Gélose MacConkey (MCK) (en boite de pétri)

selectif aux bacteries

gram negatifs

• Gélose Chapman (en tube)

Milieu sélectif aux staphylocoques et différentiel

pour bactéries halophiles et halotolérants
• Milieu de Kligler Hajna (en tube)

Milieu permettant la recherche

simultanée de l’utilisation du
lactose/glucose (rouge du
phénol) ou de la production de
gaz/H2S

• Milieu Lowenstein Jensen

Milieu sélectif pour les BAAR

par présence du vert de
malachite (inhibiteur à spectre
large)

isolement des bacteries

• Etape importante du diagnostic
bactériologique.
• Séparation des bactéries par
dispersion à la surface d’une gélose.
• Obtention de colonies bactériennes
(amas de bactéries identiques).
• Naissance des colonies identiques
(pour isolement d’une souche pure).
• Naissance de plusieurs types de
colonies (pour un mélange de
différentes bactéries).
 Techniques d’isolement

Les techniques d’isolement varient en fonction de

l’objectif (identification ou dénombrement)
mais se font toujours en milieu gélosé (en tube ou
en boite de pétri)
- L’isolement repose sur l’épuisement de l’inoculum
(produit pathologique ou culture) sur la
surface de la gélose, et se fait selon 2 techniques
•  Isolement à la surface d’une gélose incliné dans
un tube
•  Isolement à la surface d’une gélose en boite de
pétri

EN CADRANT par epuisement en sapin

resultats de l’isolement

• taille:
• forme:
• surface:
• couleur:
 l’IDENTIFICATION
BACTERIENNE
POUR LES BACTERIES GRAM NEGATIF

Après observation en microscope optique à la coloration de Gram on

observe la présence de bacilles Gram – Afin de s’assurer nous avons
procéder par ensemencement sur milieu gélosé (Mac Conkey) en
l’incubant dans un étuve à 37° pendant 24h en attendant la culture des
bactéries.
 Test d’oxydase:
Basé sur la recherche de l’enzyme
cytochrome oxydase chez la souche
étudiée.
Test positif: formation d’une
coloration violette (Entérobactéries)
Test négatif: formation d’une
coloration rose(reste incolore)

 Test de Kligler

Mise en évidence des caractères

biochimiques:
• Coloration jaune de la pente
= fermentation du lactose
• Coloration jaune en profondeur du
tube = fermentation du glucose
• Formation des bulles d’air et
éclatement de la gélose = production
de gaz
• Apparition de taches noirâtres =
production de sulfure d’hydrogène
H2S
  Galerier d’identification API

Méthode d’ensemencement de la gallérie:

Il est important de reconnaitre les signes indicateurs de méthode
d’ensemencement sur le nom de chaque réactif .
- Réactifs soulignés : à recouvrir en huile de paraffine
- Réactifs encadrés: remplir de la suspension le tube jusqu’à la cupule
- Réactifs sans aucun signe: remplir uniquement le puit de la suspension

Préparation de l’inoculum
- Utilisation du tube présenté par la société savante et le remplir d’eau
physiologique jusqu’à l’indication recommandée .
- Prélèvement d’une colonie de la souche préparée par un écouvillon
- Décharger l’écouvillon dans le tube où se trouve l’eau physiologique
Ajout de réactifs catalyseurs de certaines réactions:

Lecture de la Gallérie:
1) Séparation des puits 3 à 3:

2) Comparaison des résultats obtenus à des résultats négatifs:

3) Attribution de code à la souche étudiée:

 pour les bacteries gram positif
En 1er lieu on procède à une vérification
en réalisant un frottis fixé et coloré par
la coloration Gram. Microscope optique
indique la présence uniquement des
➢Test de Catalase: bactéries Gram + de coloration violette.

La catalase accélère Confirmation de

la résultat par :
décomposition du ➢Test de Coaguloase: ➢Test de Pastorex:
peroxyde
d’hydrogène (H2O2) Enzyme qui provoque la Test d’agglutination
en eau et coagulation rapide sur des
oxygène. du plasma en lames pour la détection
2 H2O2 2 H2O+O2 convertissant le simultanée:
Détection de fibrinogène en fibrine ce • Facteur d’affinité
présence de la qui permet pour le
catalase de différencier les fibrinogène.
chez la bactérie souches • La protéine A et des
permet de staphylocoques aureus polysaccarides
différencier entre des capsulaires de
staphylococcus staphylocoques à staphylococcus aureus.
catalase positif et coagulase –
staphylococcus
catalase négatif.

RESULTATS :
Anti-Biogramme
La détermination de la sensibilité d’une bactérie a
divers ATB (composés chimiques élabores par un
micro-organisme ou produit par synthèse) est d’une
grande importance en microbiologie. Permet
l’élaboration des milieux d’isolement sélectifs, le
contrôle d’une infection par chimio thérapeutique et
en plus elle peut être utilisée comme approche dans
la caractérisation et l’identification bactérienne.

Les tests de sensibilité aux antibiotiques :

L’antibiogramme par la méthode de diffusion Cette méthode
est une application de la diffusion en gélose qui aura été
préalablement ensemencée avec la bactérie à étudier, un
support contenant les antibiotiques (à différentes
concentrations) à tester sera déposé par dessus .Le diamètre
de l’auréole dépend de la vitesse de diffusion de
l’antibiotique dans la gélose. L’activité de chaque
antibiotique sera appréciée, par le diamètre de l’auréole
d’inhibition provoqué autour du disque.
interpretation
conclusion