Fluorescence / Phosphorescence
Technique très sensible, la fluorescence est de plus en
plus utilisée dans de nombreux domaines:
- Détection directe d’espèces intrinsèquement
fluorescentes
- Détection et dosage à l’aide de sondes fluorescentes
(sondes à ADN, molécules neutres, ions, cytofluorimétrie,
contrôle sang , urine…), exploration de la matière telle que
l’information sur polarité, viscosité, pH
- Applications pratiques telles que capteurs optiques,
chimiques, biocapteurs, marquage des billets de banque,
lasers à colorants, peintures anti-collision (des avions) …
- Détermination des marqueurs de la qualité nutritionnelle
des aliments.
Historique:
1845 : Première observation de la fluorescence par Sir John F.W. Herschel
avec une solution de quinine qui émet de la lumière bleue à une longueur
d’onde de 450 nm.
1853 : C’est G.G. Stokes qui donna pour la première fois le nom de
fluorescence à ce phénomène.
1871 : Découverte d’autres fluorophores (fluorescéine, Rhodamine...).
1920-30 : C’est Jablonski qui développa la fluorescence. Il est considéré
comme le père de la fluorescence.
1962 : Découverte de O. Shimomura, qui a isolé une protéine GFP (Green
Fluorescent Protein) chez une méduse Aequorea victoria. (prix nobel de la
chimie en 2008). Cette protéine peut être couplée à d’autres protéines
comme marqueur, très utilisé en biologie.
La quinine Fluorescéine
Rhodamine
Qu’est-ce que la fluorescence ?
La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par diverses formes
d'excitation autres que la chaleur. " lumière froide ".
Diagramme de Jablonski
Les molécules qui fluorescent sont en majorité cycliques, rigides et
possédant des liaisons (délocalisation des électrons).
CI : Conversion Interne
CIS : Croisement Inter-Système
Diagramme de Jablonski
• La fluorescence moléculaire se produit quand une molécule,
après avoir absorbé un photon, revient à un niveau d’énergie
inférieur et donc émet un photon.
• En général il y a un décalage entre les photons de
fluorescence et les photons excitateurs
• La fluorescence qui a lieu à partir d’un état excité métastable
(durée de vie de plusieurs secondes ou plus) s’appelle la
phosphorescence
• L'état excité est énergétique et ne reste pas stable. Il va retourner à l'état
fondamental par diverses voies :
- chimiques (Isomérisation, destruction, réaction chimique,
ionisation...)
- ou physiques (collision, émission d'un photon, changement d'état
électronique ...)
La voie la plus importante est la conversion interne, qui ramène la molécule
dans l'état fondamental par perte d'énergie de vibration-rotation.
La Conversion Interne (Internal Conversion) et Collision « IC »
L'énergie absorbée est dissipée à l'environnement par saut d'énergie en
rotation ou vibration. Cette désactivation est d'autant plus facile que la
température est grande
Le Passage Inter-système (Inter Crossing System) « ISC »
Ce chemin est un peu particulier, car il nécessite un changement de spin de
l'électron promu. Une fois l'état excité atteint, la molécule peut passer d'un
état singulet S1 à une état triplet T1 . Le phénomène de phosphorescence
correspond à l’émission d’un photon de l’état T1 à l’état fondamental.
Les exciplexes sont des molécules hétéronucléaires qui ne sont stables que dans des états électroniquement excités.
Leurs homologues homonucléaires sont appelés excimères.
• 1. En absorbant des photons, les molécules arrivent souvent à
des états stables qui contiennent de l’énergie vibratoire et
rotationnelle supplémentaire.
• 2. Par relaxation, la presque totalité des molécules perdent
rapidement cette énergie supplémentaire, tombant au niveau
d’énergie correspondant au minimum d’énergie vibratoire et
rotationnelle pour leur niveau électronique (état excité
intermédiaire) sans l’émission de radiation , La fluorescence
en ligne par étapes correspond à la fluorescence produite à
partir de cet état, tombant souvent à l’état fondamental).
• 3. En plus, avec l’émission, elles ne retombent pas toutes
immédiatement à l’état fondamental.
• 4. Ces deux raisons donnent un spectre de fluorescence qui est
l’image-miroir du spectre d’absorption, mais décalée vers des
fréquences (énergies) moins élevées.
S1 Etat excité
S0 Etat fondamental
intensité Un spectre d’émission de
fluorescence est un histogramme
des énergies libérées par la
population de fluorophores lors
de la transition radiative vers les
différents niveaux de résonances
de l’état fondamental S0.
Longueur d’onde
Le DAPI (Di Aminido Phenyl lndol) se fixe
spécifiquement sur l'ADN.
Eclairé en lumière violette (max 372nm), il
emet une fluorescence bleue (max 456nm)
ce qui permet de détecter et quantifier
l'ADN
NB :
Lorsque la molécule excitée passe à l'état triplet, il se produit le même
phénomène de relaxation. Mais comme le changement de spin est
quantiquement improbable, la duré de vie de cet état, T1, est plus longue
que pour S1., les collisions désactivantes sont nombreuses. Ainsi il est très
difficile, voire impossible, d'observer le phénomène de phosphorescence
dans un milieu liquide. Il est généralement observé dans des gaz ou des
solides.
Un spectre d'émission de fluorescence représente le nombre de photon
émis d'une longueur d'onde donnée pour une longueur d'onde d'excitation
donnée. Le maximum de fluorescence sera obtenu à la longueur d'onde de
plus forte probabilité de transition.
Comme pour le fluorescence, le maximum de phosphorescence ne dépend
pas de la longueur d'onde d'excitation, et cette longueur d'onde est elle
même plus grande (moins énergétique) que la longueur d'onde de
fluorescence.
Phosphorescence de l'Europium (inclus dans une résine)
La fluorescence retardée
• Il est possible à partir de l'état T1 de retourner à l'état S1. Pour
cela la molécule doit gagner de l'énergie soit par collision, soit
par absorption d'un autre photon, soit par transfert d'énergie
entre deux état T1.
• La fluorescence observée apparaît alors plus tard dans le
temps après le phénomène d'absorption. Par contre c'est
exactement les même longueur d'onde qui sont émises que
pour la fluorescence spontanée.
• Il existe deux types de fluorescence retard:
- le type E observé pour l'éosine
- et le type P observé pour le Pyrène.
La fluorescence retard de type E cesse lorsque l'échantillon est
refroidi, alors que celle de type P non..
L'éosine
Colorant de couleur orange-rosé aux propriétés asséchantes et antiseptiques.
Il existe deux composés appelés par ce nom, interchangeables dans leur utilisation :
- l'éosine Y ou tetrabromofluoresceïne, dérivé tetrabromé de la fluoresceine ;
- l'éosine B en est un dérivé dibromo dinitro.
Éosine B ou rouge impérial Éosine Y ou acide bromofluorescéique
Structure du pyrène.
famille des
hydrocarbures aromatiques polyc
ycliques (HAP)
,
organisé en quatre
noyaux benzéniques fusionnés
Le pyrène (solide incolore) est utilisé industriellement dans la fabrication de
teintures, dans la synthèse de composés optiques utilisés pour leur brillance,.
Il présente une fluorescence déterminée par son environnement de solvatation.
• Un fluorochrome ou fluorophore est une substance
chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence
après excitation. Ce sont des substances composées de
plusieurs noyaux aromatiques conjugués ou encore des
molécules planes et cycliques qui possèdent une ou plusieurs
liaisons π.
Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres :
- son spectre d'absorption (de la lumière incidente)
- et son spectre d'émission de fluorescence.
Spectres d'émission et d'excitation de fluorescence.
Les spectres d'émission de fluorescence sont obtenus en étudiant les diverses
longueurs d'ondes émises par une molécule ayant absorbé un photon de longueur
d'onde donné.
Spectre d'excitation de l'Antracène Spectre d'émission de l'Antracène
Les spectres d'excitation de fluorescence sont obtenus en observant à une longueur
d'onde l'intensité émise en fonction de la longueur d'onde incidente. Comme la
longueur d'onde émise est proportionnelle au nombre de photon absorbés, les
spectres d'excitation sont très proches des spectre d'absorption. Généralement les
deux spectre sont symétriques par rapport à la transition comme le montre l'exemple
ci dessous dans le cas de l'antracène.
Spectre d'émission et d'excitation de l'Antracène
Caractéristiques de la fluorescence
-Longueur d’onde d’émission (maximum du
spectre): em
-Rendement quantique de fluorescence:
-Coefficient d’extinction ou absorbance
spécifique:
-L’intensité de fluorescence ou brillance: If
- Temps de vie de fluorescence:
Une partie seulement de l’énergie absorbée peut être émise sous forme
de rayonnement
Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission
La détection d’une espèce fluorescente est d’autant plus facile que le
déplacement de stokes est grand
• Comment utiliser l'intensité de fluorescence en chimie analytique ?
Le rendement quantique de fluorescence est défini comme étant le
nombre de photon émis à une longueur d'onde sur le nombre de
photon absorbé par la molécule .
IF= *IA
soit :
Dans le cas d'une solution diluée nous avons la simplification qui donne:
Le rendements quantique peut varier en fonction de l’environnement
des fluorochromes: concentration, polarité, pH…
Coefficient d’extinction ou absorbance spécifique
-Reflète la probabilité d’absorption d’une molécule.
-Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des
colorants
-Plusest grand, Plus intense sera la fluorescence à
intensité lumineuse incidente égale
Valeur comprise entre 5000 et 250 000 cm-1.M-1
Exemple: pour la fluorescéine à 488 nm,= 80 000 cm-1.M-1
Intensité de fluorescence ou brillance
• La brillance est proportionnelle à et
- L’excitation d’un fluorophore à 3 longueurs d’ondes ne change pas le profil
d’émission correspondant
- Par contre, l’intensité d’émission est proportionnelle à l’intensité de l’excitation
Temps de vie de fluorescence
-Durée pendant laquelle un fluorophore demeure dans
un état excité.
-De l’ordre de la nanoseconde pour la plupart des
fluorochromes.
-Plus ce temps sera court, meilleure sera la sensibilité
du fluorochrome.
- Varie en fonction de l’environnement: milieu, pH…
f = f .N
Durée de vie du singulet excité le plus bas = tau: la constante de temps de
déclin de fluo, f
N , constante de temps intrinsèque de l’état excité
Durée de vie à l'état excité :
c'est la durée caractéristique pendant laquelle la molécule reste à l'état excité avant
de retourner à l’état fondamental . Cette durée est assimilable à la demi-vie de
l'état excité.
C’est un indicateur du temps dont on dispose pour enregistrer les modifications de
l’état des molécules ou de leur interaction avec l’environnement immédiat
(mesure par la fluorimétrie résolue en temps) de l’ordre de la nanoseconde
Différents facteurs environnementaux susceptibles
d’influencer la fluorescence
La fluorescence est augmentée par la présence de groupes électro-donneurs et
diminuée par les groupes électro-attracteurs.
Effet de la température sur la fluorescence
Quand la température diminue, l’intensité de fluorescence augmente
Diminution du quenching dynamique, on diminue la probabilité de collision
entre les molécules
la fluorescence est moins forte lorsque la fluorescéine est chauffée : la
température altère bien la fluorescence.
Influence de la polarité du solvant sur la fluorescence
1 Toluène
2 Chloroforme
3 Acétonitrile
4 Éthanol
5 Méthanol
6 Eau
Quand la polarité augmente, em augmente
Influence du pH sur la fluorescence
La protonation ou la déprotonation de groupes fonctionnels modifie
profondément de nombreux fluorophores
La solution de gauche est la solution aqueuse, celle de droite est diluée dans le
jus de citron.
Les Inhibiteurs
Phénomènes d’inhibition : tout processus qui amène une décroissance
de la fluorescence (Quenching)
Diminution de fluorescence , perte de linéarité absorbance /
intensité de fluorescence à fortes concentrations, on peut avoir :
Effet filtre: absorption de la fluorescence émise par la solution (réabsorption
interne)
Effet excimère: excimères formés par collision du fluorophore à l’état excité
et d’une molécule du même type non excitée
Inhibition statique : formation d’un complexe entre la molécule fluorescente
et une espèce inhibitrice diminution de fluorescence (intensité)
Inhibition dynamique : Collision entre la molécule fluorescente et des
molécules inhibitrices diminution de la fluorescence (à la fois (pendant la
durée de vie de l’état excité) intensité et demi-vie)
Photoblanchiment : (n’est pas du quenching): phénomène de dégradation
photoinduite du chromophore. Réactions photochimiques en particulier venant
de l’oxygène avec les radicaux libres. Perte de la fluorescence du
fluorochrome . Peut être mis à profit pour mesurer la mobilité moléculaire.
Quenching de la fluorescence
Le quenching de la florescence est une diminution du
rendement quantique d’un fluorochrome par les
conditions environnementales comme la force ionique,
le pH, l’effet des solvants ou la présence d’autres
fluorochromes qui réduisent l’efficacité d’émission.
Le quenching correspond à une relaxation non-
radiative des électrons excités vers l’état fondamental.
-Le quenching dynamique, c’est à dire que le fluorophore est
désactivé en subissant un contact avec une autre molecule
(quencheur)
-Le quenching statique, c’est à dire que le fluorophore établit un
complexe stable et non fluorescent avec une deuxieme molecule.
La formation du complexe a lieu à l’état fondamental
Rque:
La fluorescence dans les milieux dilués est proportionnelle à la
concentration pour une longueur d'onde d'émission et
d'excitation données, un I0 donné et une concentration c
donnée.
La difficulté est la mesure de I0 et donc de .
Dans la majeure partie des cas, les unités sont des unités
arbitraire(u.a) permettant après un étalonnage de faire des
analyses précises puisque l'intensité mesurée en
fluorescence est proportionnelle à l'intensité incidente I0.
Plus la source est d'intensité forte (type LASER) plus la
mesure pourra se faire pour des concentrations faibles.
Techniques et appareillages
Il existe deux manières d'observer les phénomènes de ré-émission d'un photon :
1) En bombardant l'échantillon de manière continu, par un flux de photon de
longueur d'onde connue et en comparant l'intensité émise en fonction de l'intensité
absorbée
2) En envoyant pendant un temps donné un faisceau de lumière et en observant les
photons ré-émis en fonction du temps
Dans le premier cas c'est une étude des états stationnaires car l'état excité est sans
cesse renouvelé.
Dans le deuxième cas c'est une étude du temps de vie de l'état excité lui-même qui
est observé.
Les deux méthodes donnent chacune des informations complémentaire sur l'étude
des états excités électroniques.
L'étude des temps de vie
La décroissance de la fluorescence dépend principalement de deux paramètres :
- Le rendement quantique de fluorescence
- le temps de vie de l'état excité
La source d'excitation peut être une lampe Xénon pulsée pouvant atteindre la
milliseconde mais généralement c'est une source LASER monochromatique qui
permet d'avoir un signal beaucoup plus intense.
La détection des photons peut se faire par un photo multiplicateur, ou un compteur
de photon.
Schéma de la décroissance de fluorescence en fonction du temps.
L'étude des états stationnaires
• L'étude des états stationnaire par contre, n'arrête pas l'excitation des
molécules. Ce qui est observée c'est l'émission pour une excitation
constante donnée « spectroscopie de fluorescence ».
• Une source d'excitation produit le rayonnement incident, qui est diffracté
(prisme, réseau,...) et dirigé vers l'échantillon. Ce dernier absorbe le
rayonnement et réemet dans différentes longueur d'onde. On observe alors
les longueurs d'onde émises. La méthode continue ne permet pas
d'atteindre le temps de vie d'un état excité, mais permet de calculer le
rendement quantique d'une molécule avec précision.
• De nos jours avec les barrettes de diode et cellule CCD il est possible d'observer
l'ensemble des longueurs d'onde émise après une excitation
NB: Le CCD (Charge-Coupled Device, ou dispositif à transfert de charge) composant électronique photosensible
servant à convertir un rayonnement électromagnétique(UV, visible ou IR) en un signal électrique.
• Fluorimètre
Le fluorimètre est un spectromètre de luminescence polyvalent, contrôlé par ordinateur.
Il est équipé d’une source xénon pulsée et est capable de mesurer la fluorescence et
la phosphorescence ou la chimiluminescence et la bioluminescence.
La photoluminescence est un phénomène radiatif consécutif à une excitation
lumineuse (photons de lumière visible ou ultraviolette).
La chimiluminescence est un phénomène radiatif consécutif à une réaction
chimique (chimiluminescence vraie) ou enzymatique (bioluminescence).
Principe de fonctionnement d’un fluorimètre:
le monochromateur d'excitation découpe une bande étroite de longueurs
d'onde dans le spectre continu de la lampe. Cette lumière, focalisée sur
l'échantillon, porte les molécules dans un état électronique excité.
La lumière émise lors du retour a l'équilibre est analysée a l'aide du
monochromateur d'émission (spectre d'émission : longueur d'onde
d'excitation constante, longueur d'onde d'émission variable). Son
intensité permet de remonter à la concentration du chromophore.
Les déplacements et déformations du spectre d'émission dans différents
milieux caractérisent leur interaction avec l'environnement.
Intérêt : détection avec une grande sensibilité (la limite inférieure de
détection est l'ordre de 10-9 - 10-12 M)
Applications : Suivi et dosage sensible, simple et non-destructif de
composes organiques dans tout milieu transparent (solutions, films,...) et
sous conditions dans les milieux non-transparents - Suivi de sondes
fluorescentes dans les milieux d'intérêt biologique
Avantages de la fluorescence par rapport à l’absorption
1. le détecteur est mis en général à 90° par rapport au
flux incident, ce qui évite l’interférence causée par
le flux incident.
2. Au lieu de calculer la diminution de l’intensité de la
radiation, on mesure des photons émis par les
molécules fluorescentes. Il est plus facile de
mesurer un signal directement plutôt que de
déterminer la différence entre deux signaux qui
peut être petite par rapport à eux. Cela permet une
meilleure précision.
3. La loi reliant intensité avec concentration est linéaire
au lieu d’être logarithmique.
Désavantages de la fluorescence comparée à l’absorption
1. Cette méthode est utilisable seulement pour déterminer les
molécules fluorescentes. Les composés aromatiques sont
presque les seuls composés en solution liquide qui
fluorescent.
2. La relation de proportionnalité entre IF et la concentration est
seulement applicable dans une région de concentrations
faibles.
3. Les rendements (intensités) obtenus sont très faibles.
Applications
• On utilise divers fluorochromes en fonction des applications: -
Leur emploi à la technique du séquençage a permis
d'automatiser et de mettre au point les séquenceurs de gènes
modernes.
- L'utilisation de la fluorescence en couplage avec une
machine à PCR (thermocycleur) est un développement récent.
On appelle ces machines "appareil de PCR en temps réel".
- Les fluorochromes sont utilisés dans plusieurs
marquages immunologiques : cytométrie en flux,
immunofluorescence.
PCR: Réaction en chaine par polymérase méthode de biologie moléculaire d'amplification d'ADN in vitro
La cytométrie en flux (CMF): technique permettant de faire défiler des particules,
molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en
les caractérisant.
isothiocyanate de fluorescéine (FITC : fluorescein isothiocyanate)
FITC: dérivé de la fluorescéine
utilisée dans un large spectre
d'applications comme
la cytométrie en flux.
Le FITC possède un pic d'excitation et d'émission à 495 nm et 521 nm respectivement
Le Texas Red est le dérivé chlorure de sulfonyle de la sulforhodamine 101.
C'est un colorant fluorescent rouge-violet utilisé en histologie pour colorer certaines
cellules
La fluorescence du Texas Red est à 615 nm et son pic d'absoption maximale est à
589 nm ce qui fait qu'il est plus violet que rouge
