La Chromatographie Liquide
à Haute Performance
Prof. Yacine BADJAH
La chromatographie liquide
C’est la première méthode chromatographique décrite
(comme méthode non instrumentale)
Comme l’échantillon n’a pas besoin d’être vaporisé
pour être analysé, pratiquement tous les composés
chimiques peuvent être étudiés par chromatographie
liquide
Le développement de l’instrumentation en
chromatographie liquide a eu lieu après la
chromatographie gazeuse à cause des difficultés à
automatiser l’opération (obtention d’un débit stable de
solvant, mise au point d’une méthode de détection
efficace et sensible des différentes classes de solutés,…)
Un peu d’histoire:
Naissance « officielle » de la chromatographie:
le 21 Mars 1903 à Varsovie
Ce jour-là, Mikhail Semenovitch TSWETT (un botaniste russe) a
présenté à un congrès de la Société Polonaise de Sciences
Naturelles une communication intitulée: « Une nouvelle classe de
phénomènes d’adsorption et leurs applications en analyse
biochimique » portant sur la purification de pigments végétaux
(chlorophylle) sur une colonne de craie
1938 : REICHSTEIN explique le principe de l'élution et de la
séparation des composés dans une colonne
1952 : l'utilité des gradients d'élution est montrée
1967 : grâce aux travaux de HUBER et HUZSMAN, le début de
la chromatographie liquide à haute vitesse, plus tard appelée à
juste titre chromatographie liquide haute performance
(CLHP)
Principe de la chromatographie liquide
Un liquide appelé phase mobile parcourt un tube appelé colonne. Cette
colonne peut contenir un support solide poreux ou non appelé phase
stationnaire
Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du
mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors
de la traversée de la colonne
De ce phénomène appelé rétention il résulte que les constituants du
mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que
leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la
colonne les uns après les autres et donc séparés
Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur
permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme
Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de
rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et
détecté) caractérise qualitativement une substance
L'amplitude de chaque pic, ou encore l'aire limitée par le pic et la ligne
de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le
mélange injecté
Principaux modes en
chromatographie liquide
Il existe plusieurs modes possibles en chromatographie
liquide à haute performance. Ils correspondent chacun à un
type précis d’interaction:
adsorption
partage
échange d’ion
exclusion par taille
Chromatographie d’adsorption
la phase stationnaire est un solide adsorbant
la rétention est due à un suite de processus
d’adsorption / désoption
Chromatographie
d’adsorption
O H
la silice et l’alumine sont les Si
phases stationnaires les plus O
utilisées
Si O
le soluté et le solvant peuvent H
être attirés par les sites O
polaires situés à la surface de
Si
la phase stationnaire
adsorbante O H
si les solutés présentent des
Groupements
interactions différentes vis-à-vis
silanols Si-OH à la
de la phase stationnaire, leur
surface de la silice
séparation est possible
Chromatographie de partage
la phase stationnaire est un liquide déposé ou
greffé sur un support solide
la rétention est basée sur le partage du soluté
entre les deux phases liquides (solubilité relative)
Chromatographie de partage
les espèces les plus retenues sont celles ayant une
plus grande affinité (solubilité) pour la phase
stationnaire, relativement à la phase mobile (éluant)
la séparation est basée sur les différences entre la
solubilité relative
Il existe deux modes en chromatographie liquide
mode « normal »: phase stationnaire polaire et phase
mobile apolaire, c’est le premier mode décrit
mode « inverse »: phase stationnaire apolaire et phase
mobile polaire, c’est le mode le plus utilisé en
chromatographie liquide
Chromatographie de partage
l’ordre d’élution des solutés peut être pratiquement inversé avec la
même colonne en utilisant les modes « normal » « inverse »
Exemple:
mode « normal » mode « inverse »
Chromatographie par échange d’ions
la phase stationnaire possède des groupements
chargés à sa surface
la rétention est basée sur les interactions
d’attraction entre les groupements chargés de la
phase stationnaire et les solutés portant une charge
opposée
Chromatographie par échange d’ions
dans ce mode on utilise en chromatographie
liquide « instrumentale » des échangeurs d’ions
faibles
ces phases stationnaires sont obtenues par
greffage de groupements chargés échangeurs d’ions
sur un support solide
les résines échangeuses d’ions classiques ne
pourraient pas résister à la pression élevée
Chromatographie par échange d’ions
Exemple de séparation: analyse des anions inorganiques
détection UV détection par conductimétrie
1- fluorure F-
2- chlorure Cl-
3- nitrite NO2-
4- bromure Br-
5- nitrate NO3-
6- phosphate PO43-
7- sulfate SO42-
Chromatographie par exclusion (SEC)
dans ce mode la séparation des solutés se fait
d’après leur dimension moléculaire
la phase stationnaire est un matériau poreux
ayant des pores de dimension bien déterminée
ce mode était appelé anciennement
chromatographie par perméation de gel (GPC)
Chromatographie par exclusion (SEC)
dans ce mode, chaque colonne peut séparer des
molécules de dimension bien déterminée
les espèces ayant une dimension importante ne
pourront pas pénétrer dans tous les pores, elles
auront un trajet plus court dans la colonne et
seront éluées en premier
ce mode est très utilisé dans la détermination des
domaines de taille et de masse des macromolécules
(polymères, protéïnes,…)
Chromatographie par exclusion (SEC)
Exemple de séparation d’un polymère présentant trois
domaines de masse. Le deuxième groupe correspond à
une plus grande distribution en masse
00
00
.0
25
.0
50
0
00
5.
Chromatographie par exclusion (SEC)
Exemple de séparation de polystyrènes étalons ayant
différentes masses moléculaires
1- 1.800.000
2- 300.000
3- 100.000
4- 35.000
5- 17.500
6- 9.000
7- 2.000
8- toluène
Le solvant en chromatographie liquide
la nature de la phase mobile éluante est le
paramètre fondamental en chromatographie liquide
à haute performance
contrairement à la chromatographie gazeuse, les
interactions entrant en jeu sont diverses:
soluté phase
stationnaire
soluté phase mobile
phase mobile phase
stationnaire
Choix du solvant en chromatographie
liquide
nous nous limiterons au cas des modes « normal »
et « inverse »
l’influence de la nature de la phase mobile est
fondamentale dans ces deux cas
première étape importante:
choix du mode à utiliser:
mode normal ou mode inverse?
