Université Ferhat Abass-SETIF Département de microbiologie
Techniques expérimentale
3eme Année LMD Microbiologie
Présenté par : Boussoualim N.
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Présentation générale du module
But:
› Apprendre les différentes techniques utilisées sur une bactérie
1 Introduction: généralitées
1. Partie 1: les techniques utilisées pour caractériser une bactérie
2
Les méthodes d’identification des bactéries
La sensibilité aux antibiotiques
2. Partie 2: les techniques utilisées pour obtenir une enzyme ou une protéine a partir d’une
bactérie
Les méthodes d’homogénéisation ou d’extraction
3
Les méthodes de séparation
Les méthodes de purification
Les méthodes spectrophotométriques
Les méthodes d’analyse
Le séquençage des protéines
Filtration
La filtration est une méthode de séparation
permettant de séparer les constituants d'un
mélange qui possède une phase liquide et une
phase solide a travers une membrane filtrante.
filtration
Principe
La filtration est un tamisage c.à.d. une séparation
d’après le diamètre des particules solides.
la filtration est souvent accompagnée de 2
phénomènes, qui sont :
Adsorption Le colmatage
Le colmatage
le colmatage [action de boucher, fermer un
orifice]
le colmatage modifie totalement la porosité et
ralentie la filtration.
Adsorption
La matière filtrante possède une certaine charge
électrique. Ainsi, certains produits peuvent
être retenue bien que leur dimensions
permettent leur passage à travers les pores du
filtre.
Matériels de filtration
Inerte chimiquement et physiquement vis-à-vis
du liquide à filtrer ;
Insoluble et ne subit aucun changement d’état
physique (gonflement, rétrécissement,
distorsion).
Rétrécissement: diminution
Distorsion: du
déformation
diamètre
Matériels de filtration
Les entonnoirs Les Filtres
Les entonnoirs
Les entonnoirs Filtres
ordinaires
spéciaux Filtres de surface
En profendeur
Les Filtres en profondeur
(épaisseur ou épais) Constitués de:
substances fibreuses substances agglomérées
(assemblées)
papier, amiante, cellulose, verre fritté, sable, charbon
coton, fibre de verre
Filtres de surface (membrane).
Les plus utilisées sont les membranes Millipores.
Ce sont des feuilles très minces constituées de
polymère de cellulose comportant un très grand
nombre de pores.
Les dimensions de ces pores varient selon les
filtres de (0.025-8 µm)
Les entonnoirs
Les entonnoirs sont des instruments de forme
coniques destinés à recevoir un matériel filtrant.
On distingue deux types :
Les entonnoirs ordinaires
en verre, porcelaine ou en polycarbonate
Les entonnoirs spéciaux
peuvent être en verre ou en
porcelaine
avec une plaque de fond
percée de trous, sur laquelle
on dépose une rondelle de
papier filtre
Entonnoir en verre Entonnoir en porcelaine
Les entonnoirs spéciaux
les entonnoirs de BUCHNER les entonnoirs de HIRSCH
Pour filtrer des quantités assez Pour filtrer de petites quantités de solide.
importantes de solide
Méthodes de filtration au
laboratoire
1. filtration Par gravité
2. filtration sous vide
3. filtration sous pression
Filtration par gravité
On utilise dans cette méthode :
1. un filtre
2. un entonnoir pour recevoir le filtre
3. un erlenmeyer pour récupérer le filtrat.
un filtre
un entonnoir
un erlenmeyer
Ces filtres généralement sont en papier, coniques
ou plissés, à travers lequel le liquide s’écoule
sous l’action de son propre poids.
Les filtres papier sont classés par porosité:
Les filtres lents les filtres rapides
retiennent les très fines particules retiennent les très grandes particules
la filtration est longue la filtration est rapide
Filtration par gravité
Pour cette méthode, 2 éléments sont nécessaires :
la forme de l’entonnoir doit favoriser
l’écoulement du liquide à travers le filtre.
(l’importance de la forme de l’entonnoir)
L’angle d’ouverture de l’entonnoir doit être
voisine de 60°.
Filtration par gravité
Filtration par gravité
les inconvénients de cette méthode:
Filtration assez lente
Difficulté de récupération de la phase solide
isolée
Séparation incomplète: le solide retient une
quantité non négligeable de liquide.
filtration sous vide
pour accélérer la filtration. on provoque une
dépression crée par une pompe à vide sous le
filtre.
Pour réaliser une filtration sous vide, on utilise:
1. une fiole à vide fermement maintenue par une
pince.
2. un joint conique en caoutchouc qui collera un
entonnoir spécial à la fiole.
3. Une pompe a vide
filtration sous vide
filtration sous vide
filtration sous pression
Les filtres millipore
ultrafiltration
Il s'agit d'une membrane avec une porosité
tellement faible qu'elle peut retenir les protéines
et les acides nucléiques.
Ces filtres de surface peuvent avoir des pores
petites que 25 nm qui peuvent retenir la plupart
des protéines.
Matériel d’ultrafiltration
Vivaspin MWCO 3000
Mode d’utilisation
L'ultrafiltration permet de:
1. concentrer des solutions de macromolécules
2. éliminer la plupart des contaminants de petite
masse moléculaire (sel, glucide…)
Les avantages de l'ultrafiltration
sur la dialyse est:
qu'elle permet d'éliminer une grande proportion
des petites molécules contaminantes.
Il ya pas le problème d’équilibre
l'ultrafiltration ne cause pas de dilution de la
solution à dialyser
L’ultrafiltration est très rapide.(1/2 heure)
La différence entre la dialyse et
l’ultrafiltration
Ultrafiltration Dialyse
Élimine la totalité petites Élimine la plus part des petites
molécules( sels, glucide..) molécules( sels, glucide..)
pas de problème d’équilibre Problème d’équilibre (changer le
tampon souvent)
Concentre l’échantillon Cause la dilution de l’échantillon
Rapide(max ½ heure) Lente( max 48h)
Très couteuse (tube de vivaspin=50euro) N’est pas couteuse
FIN
