Automatisation de l'Hémogramme

NFS
 CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE

L’HEMOGRAMME englobe:
-les numérations des éléments figurés
-le dosage de l’Hémoglobine
-la mesure de l’Hématocrite
-le calculs des constantes érythrocytaires et
plaquettaires
-l’établissement de la formule leucocytaire
Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de
Na), éventuellement sang capillaire
L’Hémogramme est automatisé complètement ou
partiellement dans les laboratoires
•Numérations: GR, GB, Plaquettes.
•Valeurs et constantes:
érythrocytaires:
-Taux Hémoglobine sanguin Hb
-Hématocrite Ht
-Volume Globulaire Moyen VGM
-Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH
-Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH
-Indice de Distribution des Rouges IDR
plaquettaires:
-Thrombocrite THT
-Volume Plaquettaire Moyen VPM
Indice de Distribution Plaquettaire IDP
 leucocytaire: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine
•Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de
leucocytes: PN, PE,PB,L,M
-FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à
200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée
-FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés)
Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par
mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues

•GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies

•Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire
•GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques
  Unités
Anciennes unités Facteur x
internationales

Globules rouges 106 par mm3 106 T/L (téra, 1012)

0,621
Hémoglobine g/100 ml mmol/L

Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L

 
VGM µ3 F/L (femto,10-15)

TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15)

CCMH % ou g/100ml 0,062 mmol/L

Globules blancs 103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

Plaquettes 103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

 Homme 4,5 à 6 .106 /mm3
GR
Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm3
Homme 40 à 54 %
Hématocrite
Femme 37 à 47 %
Homme 13 à 17 g/100ml
Hémoglobine
Femme 12 à 16 g/100ml
VGM 82 à 98 fl
CCMH 32 à 36 %
TCMH > 27 pg
IDR <15 %
Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3
GB 5000 à 10 000 /mm3
Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3
Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3
Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3
Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3
Monocyte 200 à 800 /mm3
 Défaut Paramètres Excès
Erythropénie GR Polyglobulie
Hemodilution Hématocrite Hemoconcentration
Anémie Hémoglobine
Microcytose VGM (Normocytose) Macrocytose
Hypochromie CCMH*
Hypochromie TCMH (Normochromie)
IDR Anisocytose
Thrombopénie Plaquettes HyperThrombocytose
Leucopénie GB Hyperleucocytose
Polynucléose
Neutropénie Granulocyte neutrophile
neutrophile
Granulocyte éosinophile Hyperéosinophilie
Granulocyte basophile Basocytose
Lymphopénie Lymphocyte Hyperlymphocytose
Monocytopénie Monocyte Monocytose
*La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet
la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie
 Pentra 60 Horiba-ABX

Sysmex
Pentra 120 Retic Horiba-ABX XT

ACT 5DIFF
Beckman
Coulter

CELL-DYN 3700
Abbot Laboratories

Coulter HMX
CELL-DYN SMS
Beckman Coulter
Abbot Laboratories
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter

CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

 LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT
Deux principes très différents:
•La Variation d’impédance
Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe
Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue.
Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire
approchée.
•La mesure optique
Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977):
-focalisation hydrodynamique
-diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence
Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL,
cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour
les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate
ADVIA 120, Sysmex automate XT2000)
 Numération des Globules Rouges
Les paramètres calculés
• L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width)
L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la
distribution des rouges = coefficient d'anisocytose.
Double
population

50 100 200 50 100 200 50 100 200

IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 %

• Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10

• TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine.

TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10

• CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine.

CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000
 Numération des Plaquettes
Histogramme des PLT et paramètres calculés
• Le Thrombocrite
– TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de
VMP Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000
• L'IDP ou PDW
– Indice de distribution plaquettaire CV
% sur la distribution volumétrique
des PLT= coefficient d’anisocytose
plaquettaire

Grandes Plaquettes > 20 fl

Petites plaquettes, débris ? < 2 fl

 LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatisée
TROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff)
•La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA /
Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par
analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules
blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée
sur les GB, lyse qui modifie leur volume.
Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur
fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du
passage de sangs de patients sans anomalie

•La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs

principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le
repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes
atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…)
Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule
au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate:

 FL du nouveau-né
 Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de
numération
 Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF
antérieures
 Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique
 Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication
évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs
 Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur
les graphes
 Formule Leucocytaire 5 populations

•Analyse automatisée individuelle des caractéristiques cellulaires

naturelles ou modifiées d’un seul leucocyte  PERFORMANCE

•Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à 10000): 

PRECISION de la FL automatisée par rapport à FL microscopique

•Circulation des GB , après hémolyse des GR, individuellement, séparés,

dans un système liquide de flux laminaire: Focalisation Hydrodynamique
ou gainage cellulaire, principe de base de la technologie de CytoMétrie en
Flux (CMF)
•Apparition successive des GB indivualisés dans un ensemble de mesure,
permettant une analyse optique simultanée de plusieurs paramètres
naturels (volume cellulaire, présence de granulation, hétérogénéité du
noyau) ou modifiés (coloration, fluorescence) de la cellule.
(CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter »)
 Formule 5 Populations : critères de reconnaissance
Les automates associent divers principes technologiques permettant
l’accès à divers critères de reconnaissance
 Variation Impédance (= Volume cellulaire)
Principe Coulter pour le volume, ou mesure optique pour la taille
 Diffraction lumineuse (= taille cellulaire et Granularité)
Diffraction de la lumière par la cellule (différents angles)
 Cytochimie sélective
Coloration d’un élément de la cellule, par simple affinité
(ex:coloration des granulations éosinophiles) ou par activité
enzymatique chromogène sélective (ex: peroxydase des
granulations)
 Conductivité (opacité) Courant Radio Haute Fréquence (RF)
Structure de la cellule par un conduction courant haute fréquence
 Cytolyse
Lyse sélective de populations. Ex: tous les GB sauf PB.
(évidemment dans tous les cas de FL complète automatisée, la
lyse de GR est obligatoire
 Détermination de la formule 5 populations
Chaque société sur ses automates combine plusieurs technologies et
donc plusieurs critères de reconnaissance

 Impédance + Conductivité HF + Diffraction lumineuse

BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750

 Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique)

BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3

 Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.)

HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120
BayerDiagnostics Automates Advia70
BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff
 Diffraction lumineuse + Cytochimie (Eosino) + Cytolyse
Sysmex SF3000, XE2100

 Diffraction lumineuse multi-angulaire sans cytolyse

AbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700, 4000
Exemple d’hémogramme complet sur Pentra Horiba ABX
Exemple d’hémogramme complet sur Beckman Coulter HmX
 Réticulocytes
Nouveau bleu de méthylène
 LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES
Exemple sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX
Marquage fluorescent des ARN résiduels
Fluorochrome: Thiazole orange

Focalisation dans cellule de

mesure, d’une dilution sanguine
1/3000 dans diluant isotonique +
thiazole orange
2 informations recueillies:
- comptage et volume par
impédance (saphir)
- signal d’intensité de
fluorescence OFL émise à 530
nm, déclenché par excitation
transitoire, recueillie à 90° du
trajet optique
Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX
Réticulocytes à
fluorescence élevée

OFL Intensité Réticulocytes à

Fluorescence fluorescence moyenne

Réticulocytes à
fluorescence faible

GR matures Volume
 PATHOLOGIE LEUCOCYTAIRE
I - Polynucléoses neutrophiles
Definition:
•=> neutrophiles >7-8000/mm3
 II - Myélémies 
3- Un syndrome myéloprolifératif:
 
Definition:
présence dans le sang d'éléments immatures de la lignée granuleuse leucémie myéloide chronique
myélémie pure ou associée à une érythoblastémie

Etiologies: leucémie myélo-monocytaire chronique

1- Réactionnelles: (< 10 %) thrombocythémie essentielle
sepsis sévère polyglobulie rarement
4- Une myélofibrose:
tuberculose aigue
splénomégalie myéloide: splénoM +
syndrome inflammatoire erythroblastémie++
2- Régénératives: myélofibrose aigue primitive
hémorragie aigue myélofibrose II à un envahissement médullaire
hémolyse (sans PNose):
LA lymphoblastique type L3
sortie d'aplasie, agranulocytose
myélodysplasie
corticothérapie
Hodgkin, Lymphome
facteur de croissance cancers
tuberculose
 III - Hyperéosinophilies
Definition:
Eosinophiles >350-500-800/mm3 sur pls examens successifs
Etiologies:
1) Parasitoses:
parasites à migration tissulaire=> l'Eosinophile joue un role dans les défenses contre le
parasite: Eosinophilie fluctuante en coup d'archer.
Quelle parasitose?
Europe:
ascaris, taenia, distomatose, oxyurose, larva migrans, hydatidose
Antilles:
bilharziose, anguillulose, ankylostomose
Afrique:
filariose, loase, onchocercose
 III - Hyperéosinophilies
2) Allergiques:
car les enzymes du P.Eosinophile limitent la réaction anaphyllactique
terrain atopique personnel ou familial:
asthme, rhinite, conjonctivite...
cutané: urticaire, eczéma
alimentaire...
vascularite allergique
medicaments : penicillines, sulfamides , protéines injectables (extrait de foie) vaccins , produit de
contraste iodé 
3) Cancers et Hemopathies:
Hodgkin
LMC à forme hyperEo
LAM2 Eo
LAI
Lymphomes malins (sécrétion ESF)
cancers à nécrose tumorale
 III - Hyperéosinophilies
4) Collagenoses
• vascularites : Périartérite noueuse, LED, angéites allergiques (Churg-Strauss,Wegener.......)
• LED, dermatopolymyosite, PR
• fasciites à éosinophiles (Shulman)
• sarcoïdose, oedème angioneurotique 
5) Dermatoses prurigineuses
• parasitose (gales)
• pemphigus, dermatite herpétiforme
• toxidermie
6) Causes diverses
• irradiation
• brûlure
• splénectomie
• pancréatite aigue
 Sd d'HyperEosinophilie Essentielle
definition:
Eosinophilie > 1500/mm3 pendant > 6 mois
idiopathique
  risque à complications multiviscérales graves liées à la toxicité des Eo dans les
tissus
• pulmonaire
• neurologique (neuropathie périphérique)
• myosite et fasciite
• cardiaque (Endocardite de Loëffler)
 IV - Lymphocytoses isolées
Définition :
lymphocytes > 4000/mm3 chez l’adulte
> 6000/mm3 chez l’enfant
> 11000/mm3 chez le NNé
Eliminer:
1- les fausses  hyperlymphocytoses "inversion de formule "
2 - les lymphocytes anormaux
• leucoblastes
• cellules de Sezary
• cellules lymphomateuses
• tricholeucocytes
• sd MNI
 Lymphocytoses isolées
Diagnostic étiologique: se discute selon l'âge

à chez l'enfant :à BENIGNES

• Viroses : oreillons, rougeole, rubéole, varicelle, HV Coqueluche
• Hyperlymphocytose bénigne de CARL-SMITH
• Post-vaccinale, ou réaction immuno-allergique médicamenteuse.

à chez l'adulte : Rarement bénin

aigues : Infections brucellose, typhoïde
Chroniques: allergies médicamenteuses , insuffisance surrénalienne, hypophysaire, Addison
thyréotoxicose , asplénie fonctionnelle , maladies auto-immunes , tabac (F age moyen,
HLADR7, Lympho binucléés)
à trés souvent: Hémopathies malignes+++
 leucémie lymphoide chronique
 Waldenström
 lymphome malin leucémisé :
 V- Syndromes
mononucléosiques
Définition : présence dans le sang de grandes cellules mononucléées: grands
lymphocytes activés hyperbasophiles +++ = lymphocytes T cytotoxiques contre
des:
– cellules infectées (Virus, Bactéries, Parasites)
– cellules étrangères (Reaction de rejet)
– Ag étrangers (penicilline)
Ex. : MNI : les lymphocytes B sont infectés par EBV puis lysés par les T cytotoxiques
activés
Diagnostic + : reconnaître le sd mononucléosique sur NFS - grands lymphocytes
bleutés +++  5 à 90 % , +/- hyperlymphocytose 10 à 25000/mm3
GR et plaquettes normaux
Diagnostic différentiel :
sur la NFS :
• présence de lymphoblastes (LAL)
• grands lymphocytes non basophiles
 Quelle est sa cause?
1) Causes infectieuses :
Virales
* MNI (EBV):
85 % des sd mononucléosiques: fièvre + asthénie + angine + rash
Dg : MNI test+ Paul Bunnel + IgM EBV
* CMV : 5 % asymptomatiques post-transfusionnel
*primo-infestation HIV
Parasitaires
* Toxoplasmose :
< 1 % (contact avec des chats ou viande mal cuite)
adénopathies cervicales +++ sans angine
* paludisme
Autres causes infectieuses:
Viroses diverses: (HVB, HSV, HIV, rubéole, VZV, rougeole, oreillons...)
infections à germes intracellulaires à Rickettsiose, brucellose,  typhoïde, syphilis
2) R. immunologiques:
– immuno-allergiques (péni,sulfamides)
– greffes
– maladies autoimmunes : LED