POLYMERASE CHAIN REACTION OU PCR
REACTION EN CHAINE DE LA POLYMERASE
RAPPEL SUR LA STRUCTURE DE L’ADN
QU’EST CE QUE LA PCR
COMPOSANTES D’UNE REACTION PCR
LE NECESSAIRE POUR UNE REACTION PCR
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
VERIFICATION DES PRODUITS PCR
PCR EN PHOTOS
PRECAUTiONS A PRENDRE POUR EVITER LES CONTAMINATIONS
OPTIMISATION DU PROGRAMME PCR
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
APPLICATIONS DE LA PCR
1
RAPPEL SUR LA STRUCTURE DE L’ADN
Par opposition a l’ARN, acide nucléique monocaténaire, ADN est un acide nucléique
bicaténaire composé de l’appariement de deux chaînes antiparallèles formées de
séquences de nucléotides
Les nucléotides sont constitués par un groupement phosphate, un pentose, et une base
azotée:
► Sucre de l’ADN
- Desoxyribose
► Sucre de l’ARN
- Ribose
► ADN contient 4 bases azotés:
- Deux sont des bases puriques:
Adenine ( A ), Guanine ( G )
- Deux sont des bases pyrimidiques:
Cytosine ( C ), Thymine ( T )
NB: Dans l’ARN la thymine est remplacée par l’uracile (U)
2
structure de l’uracile
RAPPEL SUR LA STRUCTURE DE L’ADN
5
Ribose Desoxyribose
Sucres des acides nucleique 4 1
3 2
Fixation du phosphate
Cytosine Thymine
5
Adenine Guanine
3
Bases azotés Structure d’un Nucleotide
RAPPEL SUR LA STRUCTURE DE L’ADN
FORMATION ET STRUCTURE D’UN BRIN D’ADN
5’
H2O
3’
Chaîne monocaténaire d’ADN
(ou ADN simple brin) 4
RAPPEL SUR LA STRUCTURE DE L’ADN
APPARIEMENT DE DEUX CHAINES ANTIPARALLELES
Les bases puriques se lie toujours aux bases pyrimidiques pour maintenir la structure
bicaténaire de l’ADN.
En effet:
Adénine ( A ) se lie à la Thymine ( T ), par deux liaisons hydrogènes.
Guanine ( G ) se lie à la Cytosine ( C ), par trois liaisons hydrogènes.
une paire de base
ossature de la double
hélice formée par le
sucre et le phosphate
Appariement de deux chaînes de nucléotides Schéma de la structure en double hélice
de l’ADN 5
antiparallèles complémentaires
QU’EST CE QUE LA PCR
PCR est une synthèse in vitro et d’une manière exponentielle,
d’une séquences ADN cible.
Elle a été inventé en 1983 par le Dr. Kary Mullis. Invention pour
laquelle il a reçu le prix Nobel de chimie en 1993.
On l’a appelé POLYMERASE car l’unique enzyme utilisée dans cette réaction est une
DNA polymérase.
On l’a appelé CHAIN, car le produit d’une première réaction devient substrat de la
deuxième réaction, et ainsi de suite.
C’est une technique très puissante et simple qui est rapidement devenue l’une des
techniques les plus utilisées en biologie moléculaire. Cette technique amplifie un
fragment spécifique d’ADN à partir d’infime quantité d’ADN source, même si l’ADN
source est d’une qualité relativement mauvaise.
6
Sur quoi se base la reaction PCR ?
Rappel: REPLICATION DE L’ADN
La réplication de l’ADN nécessite :
♦ ADN matrice qui guide la synthèse du nouveau brin
♦ Une amorce 3’OH libre
♦ Un ensemble d’une vingtaine de protéines dénommées Réplisome tel que:
-L’ADN polymérase; qui permet la polymérisation des nucléotides
selon les règles de l’appariement des bases de Watson-Crick (A = T, G = C)
-des hélicases qui se déplacent le long du DNA et en séparent les deux
brins,
-des topoisomérases qui évitent un stress topologique en éliminant les
supertours,
-des protéines (SSB) qui se fixent sur les brins de DNA séparés pour les
maintenir écartés,
-des primases qui synthétisent les amorces de RNA et des ligases qui
scellent les brins de DNA.
7
Sur quoi se base la reaction PCR ? 1- REPLICATION DE L’ADN
Brin avancé (à
Protéines SSB synthèse continue)
ADN polymérase (III)
Hélicases
Fourche
de
réplicati
on
Amorce ARN 10 à 50
Primase ribonucléotides Brin retardé (à synthèse
Fragment discontinue)
d’Okazaki
ADN
Polymérase (III)
L’amorce ARN est
remplacé par un ADN ADN Ligase soude les fragments
grâce à une autre ADN d’Okazaki entre eux
polymérase (I)
Sens de réplication 8
COMPOSANTES D’UNE REACTION PCR
ADN source: elle contient la séquence à amplifier (séquence cible)
Une paire d’amorces (primers): 2 Oligonucléotides qui délimitent la
séquence à amplifier
dNTPs: désoxyribonucléotides triphosphate, les unités constitutives de
l’ADN. ils sont au nombre de quatre: Cytosine, Guanine, Adénine et
Thiamine triphosphate.
ADN polymérase thermostable: Elle catalyse la réaction d’extension des
amorces fixées sur de la séquence cible.
Ion Magnésium (Mg2+): Un cofacteur de l’ADN polymérase.
Solution Tampon: Maintient un pH et une force ionique adéquate pour le
fonctionnement de l’enzyme.
9
LE NECESSAIRE POUR UNE REACTION PCR
1 Exemple type d’un mélange réactionnel pour une PCR d’un volume
final de 25 μl
COMPOSANTES VOLUME CONCENTRATION
FINALE
1. Eau ultra-pure stérile (pH 7.0) 20.7µL -
2. 10x Tampon PCR 2.5µL 1x
tube PCR
3. dNTPs (chaque nucléotide 0.2µL 200 µM (chaque
2
sterile
à25 mM) nucléotide)
4. Les deux amorces (25 0.4µL 0.4 µM (chaque
pmoles/µL chacun) primer)
5. ADN polymérase 0.2µL 1 Unité/25 µL
6. ADN matrice (100 ng/µL) 1.0µL 100 ng/25 µL
4 Programme PCR
3
Etapes Température Temps
Prédénaturation 94 o C facultatif
Dénaturation 94 o C 30-60 sec
Appariement 54o C 30-60 sec
Extension 72 o C 30-90 sec THERMOCYCLEUR
10
Extension finale 72 o C facultatif
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
voir vidéo très intéressante sur le site http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g
les fragments d’ADN sont chauffés à haute
température (95ºC), ce qui réduit la double
hélice d’ADN à deux chaînes simple brin
devenant ainsi accessibles aux amorces
1- Dénaturation le mélange réactionnel (mix) est refroidie
(56ºC) permettant aux amorces de s’apparier
aux régions complémentaires sur l’ADN
source (matrice). Il se forme alors une zone
2-Appariement ou double brins formée par l’amorce et l’ADN
matrice
hybridation des amorces
(Annealing)
l’ADN polymérase synthétise un brin
3- Extension par la complémentaire. l’enzyme lit l’ADN
matrice et poursuit l’élongation des
polymérase à 72oC
amorces en ajoutant les nucléotides dans
l’ordre où ils peuvent s’apparier à leurs
complémentaires sur l’ADN matrice. Et
Schéma d’un cycle PCR tout le processus se répète.
11
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
Cette opération dite
“cycle PCR” est
répétée 25 à 30 fois
dans une réaction PCR
3 2
12
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
Dénaturation
Extension
Température (ºC)
Appariement
de Amorces
un cycle PCR
Temps (min)
13
1ere copie
cycle 1
Amplification exponentielle d’une copies d’ADN
deux copies
cycle 2 21 cycles
quatre copies
cycle 3 huit copies
14
VERIFICATION DES PRODUITS PCR
A la fin de L’amplification, les produit PCR sont séparés par électrophorèse
(gel d’agarose ou polyacrylamide). Selon la quantité produite et la taille du
fragment amplifié, les produits PCR seront révélés directement par le
bromure d’éthidium, le nitrate d’argent ou par radioisotopes et
autoradiographie
Électrophorèse sur gel d’agarose des
produits PCR
MW produits PCR
15
PCR EN PHOTOS
Préparation du mix: ADN + dNTPs + Tampon + Taq +
Eau. Une fois le mix préparé, l’échantillon doit être
vortexé et centrifugé.
Les tubes sont placés dans le thermocycleur
Le thermocycleur est fermé puis programmé.
16
Différents types de thermocycleurs existent.
vérification des produits PCR par électrophorèse
sur gel d’agarose ou de polyacrylamide et leur
révélation par bromure d’éthidium, nitrate
d’argent ou autoradiographie.
17
PRECAUTIONS A PRENDRE POUR EVITER LES CONTAMINATIONS
La contamination de l’ADN peut être prévenue par:
► Séparation de l’aire d’extraction d’ADN et celui de la PCR: L’extraction d’ADN et
réalisation de la PCR (préparation du mix et réaction) devraient être exécutées dans
des zones séparées du laboratoire.
► Utiliser tant que possible du matériel à usage unique: Emploi de tube et des
embouts à usage unique ainsi que des pipettes à déplacement positives pour la
manipulation d’ADN et la préparation du mélange de la réaction est recommandée
fortement.
► Autoclavage et aliquotage: Toutes les solutions, sauf les dNTPs, les amorces et
l’ADN polymérase, devrait être autoclavése. Si possible, les solutions devraient être
aliquotées en petites quantités et entreposées dans l’espace PCR désignées à ce
propos.
► Ajouter un contrôle : Une bonne pratique, est d’ajouter une réaction contrôle
sans ADN source pour confirmer l’absence de contamination.
Tubes eppendorf pipette reglables 18
embouts de pipette
OPTIMISATION DU PROGRAMME PCR
► Dénaturation complète de l’ADN source: Dans l'étape de dénaturation initiale, la
dénaturation complète de ADN source au début de la réaction PCR est essentielle. Les
dénaturations incomplètes d'ADN résulteront en l'usage inefficace de l’ADN source dans le
premier cycle de l'amplification et, par conséquent, un rendement pauvre de produit PCR.
► Température optimale d’appariement: La température d'appariement des amorces peut
être estimée comme 5°C en dessous du point de fusion (Tm) du duplex amorce-ADN
matrice. Si des produits PCR non spécifiques sont obtenus en plus du produit attendu, la
température d'appariement peut être alors optimisée en l'augmentant par des pas de 1-2°C
( Tm=4*(C+G)+2*(A+T))
► Température optimale d’élongation: Habituellement, l'étape d'extension est exécutée à
72°C et une 1-min d’extension est suffisante pour synthétiser un fragment cible aussi long
que 2 kb (kb = kilobase = 1000 bp). Quand des fragment s ADN plus grands sont ciblés, le
temps est augmenté, généralement, par 1 min pour chaque 1 kb.
► Nombre de cycle PCR: Le nombre de cycles PCR dépendra, essentiellement, du
rendement attendu en produit PCR.
► Étapes d’élongation finale: Après le dernier cycle, les échantillons sont, habituellement,
incubés à 72°C pour 5 min pour terminer la synthèse des fragments nouvellement
synthétisés.
19
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Obtenir un ADN de bonne qualité
Les méthodes traditionnelle d’extraction d’ADN utilisent:
- des détergents comme le SDS ou le CTAB (Cetyltrimethylammonium Bromide),
- des sels (NaCl...),
- des antioxydants tel que le PVP et le β-mercaptoethanol,
- des solvants comme Phénol et/ou le chloroforme pour dénaturer les protéines,
- traitement à L’ARNase pour dégrader l’ARN,
- précipitation de l’ADN par l’éthanol
- et une resuspension final de l’ADN dans un tampon.
Différents types de protocoles d’extractions ont été publiés. Leur avantage et que l’ADN
obtenue est plus pure et le rendement est élevé.
Cependant ils utilisent des réactifs toxiques, demande beaucoup de temps, et ADN peut être
dégradé par les agitations et les mélanges répétés de l’échantillon.
un extrait ADN de mauvaise qualité pourrait influencer sur l’amplification par PCR
20
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
ADN polymérase thermostable
Taq polymérase de Thermus aquaticus, qu’est un microbe pouvant vivre a 80°C
Autres ADN polymérases existe: Parc national de Yellow stone
Pfu polymérase (Pyrococcus furiosus)
Tth polymérase (Thermus thermophilus)
Dans une expérience de PCR, environ 1 unité de
l'enzyme Taq doit être utilisé pour une réaction de
25 ul.
Une concentration plus faible de l'enzyme Taq peut
causer une élongation incomplète d'amorce
ou une terminaison prématurée de la synthèse de produits PCR au cours de l'étape
d'élongation d'un cycle de PCR.
Des concentrations élevées en ADN polymérase peuvent causer l’amplification de
produits non spécifiques où l’échec total de la réaction
21
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
- Normalement, les amorces optimales ont une longueur de 15-30 nucléotides (des
amorces courtes peuvent parfois être très utiles, mais une amorce courte trouverez
beaucoup d'autres sites complémentaires qu'une amorce plus longues) en augmentant la
longueur d'amorces, on augmente également le Tm et la chance d'obtenir ainsi une
spécificité plus élevée dans votre réaction PCR.
- Un rapport AT/GC de 50:50 est optimal, mais ça ne peut être toujours faisable. Des
Amorces avec GC supérieur à AT vont avoir des Tm supérieures à celles des amorces ou AT
sont supérieurs à GC.
- Leurs Tm doivent être proches (± 5ºC comme différence): on calcule approximativement
le Tm , en utilisant la formule suivant:
Tm = 2 X AT + 4 X CG (formule de Wallace)
où AT signifie la somme des nucléotides A et T, CG est la somme des nucléotides C et G
dans l’amorce.
Si les amorces sont incompatibles en termes de Tm, l'amplification sera moins efficace ou
ne fonctionnera pas: l'amorce avec le Tm supérieur s’appariera de manière inadéquate à
basse température; et l'amorce avec le Tm inférieur ne fonctionnera pas à des
températures plus élevées.
La différence de Tm, préférablement, inferieur à 2 °C 22
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
Amorce gauche (sens) et amorce droite (antisens)
S é q u e n c e c ib le
5' 3'
S é q u e n c e id e n tiq u e A m o r c e d r o ite (a n tise n s) 3 ' 5'
à la s é q u e n c e 5 -3 ' c o m p lé m e n t in v e rs e
d e l a s é q u e n c e 5 '- 3 '
5' 3 ' A m o rce g a u ch e (sen s)
3' 5'
5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT ||| Déterminer le Tm réel de l’amorce
5’-CGACGGACGA GCG-3’ écrite en rouge
23
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
Si la séquence est complètement ou partiellement connue, on se sert de logiciel
qui facilite la tâche pour l’expérimentateur dans la recherche des bonnes amorces:
Primer3: recherche d’amorces optimales
Netprimer: Vérifier la qualité des amorces sélectionneés par
l’expérimentateur
PerlPrimer: recherche d’amorce, leur qualité et leur spécificité.
24
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
Amorces déduites des séquences en amont et en aval
>gi|154154|gb|M90846.1|STYINVA Salmonella typhimurium InvA (invA)
GATATTGCCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCGTACTATTGAAAAGCTGTCTTAATTTAATATTA
ACAGGATACCTATAGTGCTGCTTTCTCTACTTAACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGT
ACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCA
CTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAA
CGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGTCGTCTTAT
CTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCG
GTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGTG
Amorce gauche
TCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTT
GAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCCGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTT
5’-TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
TACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTG
TGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACTCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCCCTGTCTAC
TTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCC
GGTTTTATCGTGACCCGCGTAAATGGCGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGA
ACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCACT
GCCGGTTTTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGT Amorce droite
AGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTCAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGT
TAGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG 5’-CCGCCAATAAAGTTCACAAA-3’
CCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGC
GTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGAGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTA
ATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGT
CGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAA
GAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGG
CGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACT
GGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTT
TTGCAGCGTTTGTTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAGTTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGT
GGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTGGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTG
TCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGC
AAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGG
ATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGA
TGTCCGTCGATTTATTAAGAAAATGATTGAAGGTCGTTTTCCGGATCTGGAGGTTTTATCTTTCGGTGAG
ATAGCAGATAGCAAGTCAGTGAATGTTATAAAAACAATATAAGGGCTTAATTAAGGAAAAGATCTATGCA
ACATTT 25
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
- le côté 3´ des amorces doit contenir, si possible, un G ou un C.
5’-TGATACATCGCCGTCGTCGT |||
5’-CGACGGACGA GCG-3’
- les deux amorces ne doivent pas être complémentaires pour éviter leur
appariement ou la formation des structures en épingles à cheveux qui peuvent
réduire la performances de votre PCR de manière significative.
26
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
27
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Désigner de bon Amorces (Primer disign):
Légende
****** cible
>>>>>> amorce gauche
<<<<<< amorce droite
28
OPTIMISATION DU MELANGE REACTIONNEL
Rôle du Magnésium
Le Mg2+ est un élément essentiel pour le bon fonctionnement de l’ADN
polymérase. Il doit être optimisé pour chaque couple d’amorce-ADN cible
Parce que les ions Mg2+ forme des complexes avec des dNTP, amorces, ADN matrice
et EDTA la concentration optimale de MgCl2 doit être optimiser pour chaque
expérience.
Trop peu d’ions Mg2+ se traduit par un faible rendement du produit de PCR,
Trop d’ions Mg2+ peut augmenter le rendement des produits non spécifiques.
La plage de concentration recommandée de MgCl2 est de 1 à 3 mM, dans les
conditions standard de réaction spécifiées.
dNTPs.
La concentration de chaque dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) dans le mélange
réactionnel est généralement de 200 μM. Ces concentrations doivent être vérifiées
comme étant égales, car des différence dans leur concentration peut produire des
mésincorporations. 29
Table 1. Composition du milieu réactionnel
30
Table 3. Thermal cycler conditions
31
APPLICATIONS DE LA PCR
Clonage des gènes
Diagnostique génétique (détection de mutation...)
Test de paternité
Mutagenèse dirigée (recherche de rôle d’une protéine)
Différence quantitative dans l’expression des gènes
Médecine légale
Control de qualité dans différentes industries...
32
33
34
