Rpublique Algrienne Dmocratique et
Populaire
Ministre d l'Enseignement Suprieur et de
Recherche
Scientifique
HAMMA LAKHDHER ' Universit
Facult des sciences de la nature et de vie
Matire : Ingnierie
molculaire
1re
master
biochimie
protinesappliqu
e
Expos
Production
de
sur
Nivea
:u
recombinent comme
humain dans pichia pastoris
Prsent
:par
REHOUMA
DalalSOLTANE Teber-ZBDI Marwa -
Plan du
travails
Introduction
Dfinition de Systme d'expression de pichia pastoris
les avantages et inconvnient de pichia pastoris
Lapplication et les phnotype de pichia pastoris
Paramtres oprationnelles
Prparation de l inoculum Et support de croissance
Les phases de La fermentation
Objectif
Est d'atteindre des rendements
levs de fermentation dans des
processus qui se prolongent
pour jours au lieu des semaines
ncessaires
-1
Introduction
systme d'expression correspond l'organisme que est utilises
Quelleest
dfinition
de P.P le
? et
leur d'expression
pour exprimer
la la
protine
,on tudie
systme
?caractristique
htrologues
de levure
gnral et le
d'expression de
?Quelle
est lesenphnotypes
desystme
P.P
Quelle
est les phases
de systmes
fermentation
? Et les
P. pastoris
en particulier
. Cette
volutifs
et rentables
? paramtres de cette opration
.de fabrication du protines thrapeutiques de humain
Dfinition-2
unicellulaire mthylotrophique
utilise le mthanol comme source de carbone
promoteur trs forts AOX 1
Pichia Pastoris
Les avantages du systme et les inconvnient - 3
Facilit la purification
de protines d'intrt.
Le systme est un
.productif et rentable
Comportant des
squences de
signal qui facilit
.vecteur intgrative la scrtion de
modifications post protines
htrologues
. traductionnelles
Vecteur dexpression
MAIS
Il y a des inconvnients pour cette systme
voie de glycosylation native et limite dans
.P. pastoris , il ralise par un seul tape
La dernire tape de transfre de l'acide sialique dtre
difficile ,car une source d'acide sialique endogne est
.inconnue pour les levures
La prsence des enzymes du protases , qui
dgrad les protines htrologues instable
L'utilisation de souches htes dficientes en protases
telles contribue attnuer une telle dgradation
enzymatique
Lapplication et les phnotype de pichia pastoris - 4
Lapplication
production de produit
pour l'industrie
biopharmaceutique
et
encoure les enzymes
industriels pour un
.effet thrapeutique
les phnotypes
Les souches de P.P varient, selon leur capacit
:utilis le mthanol il y a 3 phnotype
+Mut
MutS
-Mut
phnotype a des gnes de AOX1 et AOX2 fonctionnelle et se
dveloppe sur le mthanol , les taux de croissance de mthanol
plus rapide le taux de production de protines htrologue ,
plus rapide
MutS
L'utilisation du mthanol lent , il contient un gne AOX1
perturb; le mtabolisme du mthanol dpend uniquement du
gne AOX2 transcriptionnelle plus faible, ce qui entrane des
taux de croissance plus lente
-Mut
phnotype possde deux gnes Aox perturbs et par consquent,
.ne peuvent pas mtaboliser le mthanol
Les exemples des souches
La souche
KM71, un
driv de
GS115
le gne chromosomique AOX1 est largement
supprim et remplac par le S. cerevisiae, le
gne ARG4 rsultant en fonction du gne
AOX2 beaucoup plus faible
La souche
MC100-3
est dficiente pour les deux AOX1 et AOX2 et
ne peut pas se dvelopper sur le mthanol
Les souches
SMD1168 et
SMD1165
sont dficients, respectivement, dans la
protase A, et la protase B
Les paramtres de fermentation - 5
Temprature T
mthanol
glycrol
Soit
kcal / g de 2,6
substrat
consomm / heure
kcal / g de substrat 4,5
consomm / heure
Alimentation en oxygne
Les taux de
consommation d'oxygne
pour le glycrol
Les taux de
consommation d'oxygne
pour le mthanol
mM O2 / g de 13
substrat
.consomm / heure
mM O2 / g de 35
substrat
.consomm / heure
PH
L'hydroxyde d'ammonium
est utilis pour contrler le
pH et sert galement de
.source d'azote
glycrol
0.1 5.0
mthanol
25
Prparation de l inoculum et support de croissance - 6
L'inoculum initial de(5 10% du
volume de culture initial) il compos
glycrol minimal
(MGY) qui contient
un atome d'azote de
levure base
moyenne (YNB)
de glycrol 1%
et biotine
OU
de de glycrol
minimal tamponn
(BMGY) qui
contient
peptone et
l'extrait de
levure
la prparation du milieu de culture
Le milieu de culture de fermentation prfr
est constitu d'un milieu de sels de base (BS)
contenant 4% de glycrol complts avec
une solution d'oligo-lment
BS est strilis
par la chaleur
dans le
. fermenteur
Oligo-lment
strilis par
filtration avant
de l'utiliser
Phase
1
la culture par lots deglycrol pour la cration
] [.de biomasse
Le O2 dessous (DO) estcontrle par GFRCla
Q initiale de glycrol
.dans le fermenteur
La demende en O2fortement
Phase
2
Transition de glycrol lacroissance P.P par du
mthanol le taux de DO est
faible
La rgulation de DO encascade doit tre chang la
fin de la phase 1 le taux
dO2
Phase
3
Mut
Taux- dalimentation
(3.5ml / h/L)
Maximiser les
niveaux dexpression
de protines
Cette souches trs sensibles des
[ ] de mthanol et si DO tre
dsactivs
dO2 en
prsence
dexcs de
mthanol
Mut
S
La
consommat
ion dO2
est trs
.lent
L de
formaldhyde
(la mort
cellulaire )
La mme que
Mut
DO ne peut
pas utilis
Mut
Ncessite une source de
carbone alternatif-glycrol
.ou sorbitol
MERCI
