III -La Chromatographie
liquide haute performance
Les diffrents type de Chromatographie Liquide
Lappareillage
La chromatographie dadsorption
La chromatographie de polarit de phase normale
La chromatographie de polarit de phase inverse
Les modes de travail
Les dtecteurs
Les domaines dapplication
La chromatographie planaire
1- Les diffrents types de CL
Solut
Phase
stationnaire
Phas
e
mobil
e
Domaines dapplication
Masse molaire leve >10 000 g/mol
Espces non polaires :
permation sur gel
Espces polaires ou ioniques :
filtration sur gel
Espces ioniques faible masse
molaire
Echange dions
Petites molcules non ioniques
Chromatographie de partage
2
2- Lappareillage
2-1- Le chromatographe
Solvants
dlution
Pompes
Injecte
ur
Dgaze
ur
Colonne
Dtecte
ur
Collect
e de
donne
s
Chaque paramtre
chromatographique doit tre
optimis pour assurer lanalyse
qualitative et quantitative
La phase mobile
La phase stationnaire
Dimension de la colonne
Le volume dinjection
Le traitement de
lchantillon
Le dbit de la phase
mobile
La temprature de la
colonne
Le dtecteur
2-2- Les solvants
Compatibilit avec le systme de dtection
Pas dabsorption aux longueurs donde de travail (dtection par absorption)
Indice de rfraction de la phase mobile diffrent de celui des soluts (dtecteur rfractomtres)
Miscibilit et solubilit des soluts
Viscosit
Une augmentation de la viscosit diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse :
diminution du nombre de plateaux thoriques
La pression en tte de colonne augmente proportionnellement la viscosit de la phase mobile
Temprature dbullition
Problme de dgazage
Puret des solvants
Alcanes transparents jusqu 190 nm mais les traces dolfines absorbent vers 250 nm
Oxygne dissout augmente la longueur donde limite de dtection
Toxicit et dangerosit
Attention aux solvants chlors et aromatiques
Force luante
Polarit
Coefficient de partage eau/octanol
4
2-3- Les problmes de dgazage et les dgazeurs
Dtrioration de la colonne
Bruit li la pompe
Problme de dtecteur
Efficacit du dgazage
Les dgazeurs
Dgazage lhlium
Dgazage sous vide
Dgazage par ultra sons
2-4- Les pompes
Assurent lcoulement de la phase mobile dans la colonne
Doivent tre trs puissantes : P = 420 bars
Viscosit des solvants
Granulomtrie de la phase stationnaire
Gnralement pompes pistons alternatifs
Petit volume interne
Pression de sortie leve (700 bars)
Dbit constant quelque soit la pression dans la colonne
Attention aux proprits physiques de remplissage des colonnes: doivent rsister de fortes pressions
Pompe isocratique
Pompe binaire: 2 pompes
Pompe quaternaire
- 1 seul solvant dlivr
- Travail en mode isocratique
Avantages
- Faible chambre de mlange
- Travail en mode gradient
- Mlange des solvants haute pression
- Gradient le plus reproductible
(dbit et composition extrme)
- Gradient le plus rapidement dlivr
Inconvnients
- Plus complexe et plus cher
- Problmes de cavitation avec certains
solvants
Avantages
- Maximum 4 solvants dlivrs
- Travail en mode gradient
- Une seule tte de pompe
- Prix plus faible
Inconvnients
- Moins performants aux conditions
extrmes
- Gradient moins prcis et
reproductible
- Ncessite un dgazage en ligne
2-5- Linjecteur
Vanne haute pression 6 voies
Injection brve pour ne pas perturber le rgime
dcoulement dans la colonne
Grande reproductibilit
2-6- La colonne
Gnralement courtes et en acier inoxydable
Longueur de 10 25 cm
Diamtre de 4 5 mm
Elles sont remplies de phase stationnaire
Billes de 5 10 m de diamtre
Phase liquide dpose sur des billes (silice)
Nombre de plateaux thoriques varie de 1000 50000
Souvent prcde dune colonne de garde
Colonne
Diamtre dc
Volume VC = VM + VS
Phase mobile (Eluant)
Viscosit
Volume VM = Vi + Vp
Vi Intergranulaire
Vp Porosit (stagnation)
Vitesse dcoulement u
Phase stationnaire
Particules de taille moyenne dp
Volume VS
9
Lois de Darcy
L K 0P
u
tm
L
P = Pe-Ps : perte de charge L : longueur de colonne
Porosit de la colonne
Permabilit spcifique de la colonne K0
K d
0
Intergranulaire
K0
Intragranulaire
Totale
Vm
T
VT
En gnral :
2
p
i3
180(1 T ) 2
d p2
Facteur de rsistance
T = i
10
2-7- Les dtecteurs - Termes gnraux et concepts
Slectivit
Un dtecteur non slectif ragit avec la solution qui passe dans la cellule. quand un compos est lu
Un dtecteur slectif ne ragit pas avec la solution mais mesure une rponse due une proprit de la
molcule de solut (i.e. UV absorbance)
Sensibilit
Plus petit signal dtectable: signal/bruit=3
Domaine de linarit
Pente et interception
Limite de dtection et de quantification
Limite de dtection = la plus petite quantit danalyte qui peut tre dtecte (3 fois le bruit de fond)
Limite de quantification = la plus petite concentration danalyte, dans une certaine matrice, qui peut tre
mesure (10 fois le bruit de fond)
11
Dtecteur
linarit
slectivit
sensibilit
UV
moyenne
0,5 1,0 ng
Indice de rfraction
faible
1 5 g
fluorescence
grande
10 100 pg
faible
10 50 ng
grande
50 500 pg
3-4
grande
10 100 fg
Conductivit
lectrochimique
Spectromtrie de masse
12
2-7-1- Dtecteur UV-Visible
Dtecteur le plus utilis en HPLC
Rempli un nombre important de critres du dtecteur idal
Sensibilit
Linarit
Rponse pas affecte par des fluctuations de temprature
Slectif et utilisable en gradient dlution
Mesure de labsorbance : loi de Beer-Lambert
I0
A log
I
l C
Gamme de longueurs donde : 210 850 nm
180 380 nm : lampe deutrium
380 800 nm : lampe tungstne
2-7-2- Le dtecteur barrettes de diodes
Dtection une seule ou plusieurs
Acquisition dynamique du spectre
Obtenir le spectre de chaque compos
Dtection simultane 2 (puret)
Soustraction de (compensation de drive
de ligne de base)
Dconvolution des spectres
Phnomne de
co-lution de pics
Analyse de puret de pics avec un
D.A.D. ( diode array dtector ) :
dconvolution
2-7-3- Dtecteur fluorimtrique
Luminescence
Absorption dun photon : augmentation de lnergie passage de S 0 un tat singulet S1 ou S2
Perte dnergie selon diffrents processus
Luminescence (tat excit tat fondamental)
Photoluminescence lorsque la lumire est source dexcitation
Fluorescence
Energie absorbe est distribue en niveau de rotation et vibration
Retour ltat fondamental sans mission de lumire : relaxation
Puis mission dnergie
phosphorescence
Emission se fait suprieur
Lentille et miroir
focalisent et dirigent
la lumire vers le
rseau dmission
La lumire est
collecte angle
droit et focalise par
la lentille
Monochromateur
disperse la lumire
mise et la dirige
vers le
photomultiplicateur
Photocathode qui
convertit les photons
en lectrons
Lampe
Spectre entre
200 et 900 nm
Photodiode mesure le
spectre dmission
Monochromateur
rseau concave
diffracte la lumire
vers la cellule
Cellule en quartz
3- La chromatographie dadsorption
Phase stationnaire solide
Silice ou alumine
Phase mobile
Caractrise par la force luante 0 : nergie dadsorption du solvant par unit de surface
0 pour lalumine (0silice = 80% 0alumine)
ln k A 0 B
Augmentation de 0 de 0,05 unit diminue k dun facteur
compris entre 3 et 4
Solvant
Solvant
Solvant
Fluoroalcanes
-0,25
Tolune
0,29
Nitromthane
0,64
Cyclohexane
-0,2
Ether thylique
0,38
Actonitrile
0,65
n-hexane
0,01
Chloroforme
0,40
Mthanol
0,95
CCl4
0,18
Dioxane
0,56
thanol
0,88
1-chlorobutane
0,26
Tetrahydrofurane
0,57
Ethylne
glycol
1,11
Ether
isopropylique
0,28
Actate dthyle
0,58
eau
leve
Ordre dlution des composs
Paraffines
Olfines
Hydrocarbures aromatiques
Halognures, sulfures
thers
Drivs nitrs
Esters, aldhydes, ctones
Alcools, amines
Sulfones
Sulfoxydes
Amides
Acides carboxyliques
19
4- Chromatographie de partage
4-1-Gnralits
Peut tre subdivise en deux
Chromatographie liquide/liquide (applications marginales)
Phase stationnaire retenue par adsorption sur le support
Chromatographie liquide/phase greffe (majorit des applications)
Phase stationnaire lie chimiquement au support
Support : base de silice
Particules uniformes
Particules poreuses et mcaniquement stables
Particules de diamtre de 3, 5 ou 10 m
Surface entirement hydrolyse
20
Les phases stationnaires (Obtenues par raction de silanisation)
Raction dun chlorosilane (mono, di ou tri) avec les groupements silanols
Monochlorosilane fournit un matriel monomrique li la surface par une liaison
simple (liaison silyl ether)
Les phases monomriques sont trs efficaces
Celles produits avec des di- et tri-chlorosilane sont plus robustes
Les phases greffes sont trs utilises car elles changes la chimie de surface et donc
la slectivit
21
Les phases mobiles
Classes selon leur polarit:
indice de polarit de Snyder (P) base sur des mesures de solubilit
de la substance tudie dans 3 solvants
Dioxane (accepteur de proton faible moment dipolaire)
Nitromthane (accepteur de proton moment dipolaire lev)
thanol (donneur de proton moment dipolaire lev)
Solvant
Solvant
Solvant
Fluoroalcanes
<-2
Tolune
2,4
Dioxane
4,8
Cyclohexane
0,04
Ether thylique
2,8
Mthanol
5,1
n-hexane
0,1
Tetrahydrofurane
4,0
Actonitrile
5,8
1-chlorobutane
1,0
Chloroforme
4,1
Nitromthane
6,0
CCl4
1,6
Ethanol
4,3
Ethylne glycol
6,9
Ether isopropylique
2,4
Actate dthyle
4,4
eau
10,2
22
4-2- Chromatographie polarit de phase normale (NP)
Dfinition: la chromatographie en phase normale utilise une phase stationnaire plus
polaire que la phase mobile
Phase stationnaire: silice greffe cyano, diol et amino
Phase mobile: hexane, chloroforme, ethylactate
Les analytes polaires sont retenus plus longtemps dans la colonne que les composs moins
polaires
Le groupe le plus polaire guide la rtention
CH3 : les moins retenus
Aromatiques : rtention plus
forte du fait des lectrons
Halognes : moment dipolaire
Ether
Nitro
Ester
Aldhyde
Ctone
Alcool : liaisons
hydrogne
Amine
Amides
Acides
la polarit du solvant augmente dans le sens de la flche
PHASE
NORMALE
adsorbant
polaire et
trs
polaire
la polarit
de
l'chantill
on
augmente
Optimisation de la phase mobile
Diffrents solvants peuvent modifier la slectivit
Utilisation de nomographe
Exemple
lution par 92% n-pentane 8% methylactate
Faible slectivit
Dure correcte
Remplacement par
62% n-pentane 38% methylnechloride
24
4-3- Chromatographie polarit de phase inverse (RP)
Dfinition : la chromatographie en phase inverse utilise une phase
stationnaire moins polaire que la phase mobile
Phase stationnaire est hydrophobe et lie chimiquement un support de
silice: octadecylsilyl (C18), octylsilyl (C8) et C4
Phase mobile: eau, actonitrile, mthanol, THF, tampons
la polarit du solvant augmente dans le sens de la flche
PHASE
INVERSE
adsorbant
peu polaire
la polarit
de
l'chantillon
augmente
25
Leau est le solvant le plus faible car il est le plus polaire
- repousse les analytes hydrophobes vers la phase stationnaire
- les temps danalyse sont longs
Le modificateur est moins polaire que leau
- lanalyte est moins repouss vers la phase stationnaire
- temps de rtention plus faible
Plus on ajoute de modificateur plus les temps de rtention sont courts
Changer le modificateur change la slectivit et la rtention (changement de polarit)
Changer le modificateur change la slectivit et la rtention
(changement de polarit)
Utilisation dun nomographe
Permet de slectionner un autre solvant
Pour une dure dlution peu prs identique( isoluotropique)
Pour une slectivit diffrente
28
Rtention en chromatographie de phase inverse
Le caractre hydrophobe est le premier indicateur dune rtention
le caractre hydrophobe sexprime par log P (partition entre eau octanol)
plus log P est grand plus le compos est hydrophobe
Lordre dlution est gouvern par la solubilit et le nombre datome de carbone
moins le compos est soluble, plus la rtention est grande
la rtention augmente avec le nombre datomes de carbone
les composs ramifis sont lus plus rapidement que leurs isomres linaires
les insaturations diminuent la rtention
Lordre gnral dlution est:
les espces ioniques sont lus avec les volumes vides
acides forts
acides faibles
bases faibles
diples permanents
diples induits
aliphatiques
Rtention croissante
Solubilit dans leau croissante
29
5- Les modes de travail
Mode isocratique
la composition de la phase mobile reste
inchange
Certains problmes peuvent survenir
grande diversit de polarit des analytes
temps dlution long
mauvaise sensibilit pour les composs
trs retenus car les pics sont larges
possibilit de rtention irrversibles
conduisant des contaminations
Mode gradient dlution
la composition de la phase mobile change au
cours de lanalyse
la composition initiale est choisie pour
sparer les composs les plus rapidement
lus
la force dlution est augmente pour luer
les composs avec une slectivit optimum
la composition finale est choisie pour luer
lensemble des composs dignes dintrt
il est possible daugment la force luante
pour liminer les composs trs retenus
pouvant conduire des contaminations
30
Phase normale
( LC-NP)
Phase inverse
(LC-RP)
Gradient
dlution
Polarit croissante de lluant
Polarit dcroissante de lluant
Exemple
Hexane
+ proportion croissante
dactate dthyle
Eau
+ proportion croissante
dactonitrile
Ordre dlution Les soluts les moins polaires
sont les plus rapides
Les soluts les plus polaires sont
les plus rapides
6- Optimisation
Lefficacit a une grande influence sur la rsolution
Les paramtres ayant une influence sur lefficacit sont
Longueur de la colonne (doubler la longueur double N)
Taille des particules d
P
1)
Volume vides
u
(
cm
.
s
opt
min
p
Dbit
3 d
0,5
d p ( m)
32
La slectivit a une grande influence sur la
rsolution
Les paramtres ayant une influence sur la
slectivit sont
La phase mobile
La temprature
La phase stationnaire
Le meilleur moyen de modifier la rtention est de
changer la force du solvant
une augmentation de 10% du modificateur
diminue k dun facteur 2 ou 3
Le gain maximal de la rsolution est quand k est
compris entre 1 et 5
Exercice dapplication :
Les facteurs de rtentions de 2 soluts sur une colonne C18 (L = 15 cm ; dC = 4,6 mm; = 70% )
sont respectivement 0,96 et 1,07 ;
La phase mobile est un mlange H2O/MeOH 40/60 ; Le temps mort est tm = 2,3 min
On dcide de doubler la longueur de colonne en conservant le mme dbit ;
A ) Dterminer :
- Le volume mort de la colonne
- Les temps de rtention et le temps mort du systme
- Les facteurs de rtention
dc2
V'm
4
..L'
avec L' 2.L
( 4,6.10 3 )2
donc Vm' 2.Vm 2
x0,15x0,70 3,5.10 6 m3 3,5.mL
4
t'm
V'm 2Vm
2.tm 4,6. min
D
D
k' k car k K
donc
VS
VM
or K ne dpend que de la temprature
VS et VM augmentent dans les mmes proportions
t'R 1 t'm (1 k1 ) 4,6x(1 0,96) 9. min
t'R 2 t'm (1 k2 ) 4,6x(1 1,07 ) 9,5. min
1
1
k
R
x
N
x
x
S
2
A
N
S
R
'SA
N
'A
2
N
2
A
N
21,4
x
R
S
B ) Comment vont voluer les paramtres suivant :
- La slectivit
- Lefficacit
- La rsolution
k'2 k2
'
k'1
k1
N'
L' 2L
2N
H' H
donc sans effet sur la slectivit
la longueur est double mais la hauteur reste constante
car le dbit est constant
En utilisant la relation dapproximation pour la rsolution
or k et sont constants
On peut donc crire RS sous la forme
Augmentation de RS de 41 %
7- La chromatographie de surface ou planaire
Elle peut se faire
Sur papier
Sur couche mince (plaque daluminium ou de verre sur laquelle est
dpose la phase stationnaire)
Elle exploite les phnomnes:
Dadsorption
De partage
Dchange dions
La phase stationnaire
Silice, alumine, cellulose
Plus un compos est polaire plus il sera fortement adsorb
La phase mobile
Solvants plus ou moins polaires purs ou en mlange
Plus lluant est polaire plus les composs se dplacent rapidement
36
CCM (Chromatographie sur Couche Mince)
Principe: adsorption
La phase stationnaire solide est fixe sur un support adsorbant inerte.
La phase mobile, non miscible avec la phase stationnaire, migre par capillarit.
Rvlation
UV
Diiode, permanganate, ou autres ractifs chimiques spcifiques
Rapport frontal Rf
Rf
H
hi
h
distance parcourue par le solut
i
distance parcourue par le solvant H
Rsolution R
Efficacit N
R 2
(toujours 1)
h2 h1
2 1
h
N 16 i
i
37
