Techniques biochimiques 5.
Méthodes électrophorétiques
1. Historique
L’origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont inspirés des études
d’Hermann Von Helmholtz menées sur l’électro-osmose. Celui-ci constate qu’il est possible, sous un champ
électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.
En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l’électrophorèse en veine
liquide «ou électrophorèse libre ». Cette technique lui a permis de séparer les protéines du sérum sanguin en
appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en « U » de section carrée afin de réaliser des
mesures optiques au travers du tube. Il a pu obtenir sur le pôle positif des protéines de charge très négative comme
l’albumine et sur le pôle négatif des protéines de charge plus positive comme les globulines.
En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant
la technique d’électrophorèse sur papier.
En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode d’analyse immuno-
électrophorétique, qui permet d’analyser des mélanges très complexes d’antigènes. Dès la première application de
cette méthode à l’analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants
indépendants, alors que l’électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d’isoler que 5 ou 6 groupes de
protéines.
En 1955, O. Smithies met au point l’électrophorèse en gel d’amidon pour la séparation de protéines sériques.
En 1957, Joachim Kohn sépare les phénotypes de l’hémoglobine en élaborant la technique d’électrophorèse sur
membrane d’acétate de cellulose.
En 1959, Raymond et Weintroub introduisent les gels de polyacrylamide, meilleure séparation de protéines par
électrophorèse (au gel d’amidon)
En 1969, Beber et Osbom introduisent l’agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les
différentes sous-unités protéiques.
En 1975 O’ Farell développe les gèles bidimensionnelle (focalisation isoelectrique, SDS-PAGE) séparation de
plus de 1000 protéines sur un même gel.
En 1984 Schwartz et Cantor développent l’électrophorèse en champ pulsé ; séparation de grosses molécules
d’ADN.
2. Principes
L’électrophorèse : est une technique de séparation, caractérisation ou purification de particules chargées par
migration différentielles sous l’action d’un champ électrique.
Applications principales : biochimie et biologie moléculaire (Séparation des protéines et des acides nucléiques).
Principe : Cette technique se repose sur ;
La migration des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) dissoutes ou en suspension dans un
solvant, sous l’effet d’un champ électrique (créé par une tension continue).
Ces particules chargées se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge.
Cation : ion chargé (+). Attiré lors de l’électrolyse par la CATHODE (ou électrode négative).
Anion : ion chargé (–). Attiré lors de l’électrolyse par l’ANODE (ou électrode positive).
Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l’électrophorèse, la vitesse de migration et la
distance parcourue par ces ions diffèrent, ce qui permet leur séparation.
3. Différents types d’électrophorèse
Selon le support électrophorétique, il existe deux types d’électrophorèse:
3. 1. Sur support liquide ou « Electrophorèse en veine liquide »
Il s’agit de la première méthode électrophorétique décrite. La solution échantillon est placée dans un tube en « U »
et recouverte d’une solution tampon de densité plus faible que celle de l’échantillon pour éviter les courants de
convection. Les électrodes sont placées dans le tube où l’on applique le champ électrique. La migration dans ce cas
s’effectue au sein d’un liquide constitué par une solution tampon de pH et de concentration convenable dont les ions
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conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce type de d’électrophorèse présente de multiples inconvénients (Appareillage
couteux, mise en œuvre longue et délicate, séparation incomplète des particules).
3. 2. Sur support poreux ou « Electrophorèse de zone»
On a différents supports d’électrophorèse de zones
- papier
- acétate de cellulose
- semi-solide (gels)
On a plusieurs types d’électrophorèse sur gel
électrophorèse sur gel d’agarose
électrophorèse en champ pulsé
électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
électrophorèse bi-dimensionnelle
Les électrophorèses peuvent aussi être réalisées en conditions dénaturantes (détergents type SDS ou urée)
Figure 1. Principe de base de l’électrophorèse sur support poreux.
Les molécules à séparer sont déposées sur un support dont chaque extrémité est en contact avec une solution tampon.
Dans chaque solution tampon se trouve une électrode. Les électrodes sont reliées à un générateur de courant.
Lorsque le générateur envoie du courant, les molécules chargées se déplacent sur le support en direction de
l’électrode de signe opposé à leur charge.
Les mobilités obtenues en ce type d’électrophorèse sont plus faibles que celles de l’électrophorèse en veine liquide.
Ce type utilise un support poreux stabilisant la phase liquide. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable,
homogène, poreux, inerte et imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un dérivé de cellulose, de l’amidon, de
l’agarose, du polyacrylamide (PAGE), etc.. Les fractions séparées par électrophorèse de zone migrent comme des zones
individuelles. La taille des pores pour le support en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentissement du
déplacement des grosses molécules).
6. Autres types d’électrophorèse
Il existe d’autres types d’électrophorèse: Electrophorèse bidimensionnelle, isoélectrofocalisation,
électrophorèse en champ pulsé et immunoélectrophorèse.
6. 1. Electrophorèse bidimensionnelle
C’est une méthode de séparation des protéines selon leur point isoélectrique (pHi) et leur masse moléculaire. La
séparation se fait en deux dimensions: La première dimension consiste à séparer les protéines selon leur pHi par
isoélectrofocalisation (IEF) et la deuxième dimension consiste à séparer les protéines selon leur masse moléculaire par
électrophorèse en présence de SDS.
6. 2. Isoélectrofocalisation
La focalisation électrique ou isoélectrofocalisation (IEF) est une méthode de séparation des protéines en
fonction de leurs points isoélectriques (valeur de pH à laquelle la molécule ne présente aucune charge nette).
L’IEF est pratiquée sur lame ou sur colonne, dans lesquelles un gradient de pH est préétabli. Le gradient de pH
est réalisé en imprégnant le gel avec un mélange de substances amphotères de points isoélectriques différents.
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Lorsque la différence de potentiel est appliquée, les différents ampholytes se rangent dans l’ordre de leur point
isoélectrique et réalisent un gradient de pH entre les deux électrodes. Les protéines déposées migrent vers
l’anode ou la cathode selon leur charge mais, au fur et à mesure de leur déplacement, le pH extérieur varie,
ainsi que leur propre charge: elles ne migrent plus quand leur charge nette est nulle (elles focalisent à l’endroit
où le pH est égal à leur propre point isoélectrique (Fig. 7). Les ampholytes sont des mélanges d’un certains
nombre de molécules de faible masse moléculaire, donc très mobiles, et comportant chacune plusieurs
groupements acide carboxylique et amine.
Figure 7. Gradient de pH en isoélectrofocalisation.
A, B, C, D, E, F et G sont des ampholytes de pHi croissant de pHi
A à pHi
G. Les ampholytes à pH acide migrent vers l’anode, les ampholytes à pHi basique migrent vers la cathode.
L’échantillon protéique est déposé dans un large puits au centre du gel. Les protéines migrent dans une
direction ou dans l’autre jusqu’à ce qu’elles rencontrent leur point isoélectrique, point où elles cessent de
migrer.
Dans l’IEF, le gel de polyacrylamide doit être de forte porosité pour que la taille des protéines n’influence pas
leur migration.
L’IEF est utilisée pour déterminer le point isoélectrique d’une protéine inconnue par l’utilisation des marqueurs
de point isoélectrique (standards), en traçant la droite d’étalonnage:
pHi standards = f(Rf). Il ya une relation linéaire entre le point isoélectrique des protéines et leur rapport frontal
(Fig. 8).
Figure 8. Mobilité des protéines en fonction de leur point isoélectrique.
(pnA: protéine A de pHi inconnu).
6. 3. Electrophorèse en champ pulsé
En 1984, Schwartz et Cantor, proposent une méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose dont le pouvoir
de séparation peut aller au moins jusqu’à 9 000 kb. Cette technique est utilisée lorsque l’électrophorèse en gel
d’agarose ou de polyacrylamide ne permet pas de séparer des molécules d’ADN dont la taille excède 50000
paires de bases (50 kb). Les fragments d’ADN à séparer sont soumis à l’action alternative de deux champs
électrophorétiques perpendiculaires agissant à une certaine fréquence et à une certaine valeur des champs,
judicieusement choisies en fonction de la taille des fragments à séparer. L’un des champs étire le fragment
d’ADN et lui permet de sortir du piège dans lequel il était bloqué, l’autre assure l’avancement du fragment au
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sein du gel. Grâce à cette technique, il est pratiquement possible, pour tous les organismes à petit génome,
procaryotes et eucaryotes inférieurs, de localiser très rapidement un gène quelconque. Par exemple, 16 des 17
chromosomes de la levure Saccharomyces cerevisiae peuvent être séparés par ce type d’électrophorèse. Donc,
le marqueur de tailles utilisé le plus fréquemment, servant de référence pour la taille des fragments, est l’ADN
de Saccharomyces cerevisae.
L’électrophorèse peut être en des conditions non dénaturantes ou en des conditions dénaturantes (SDS-
PAGE).
5. 1. Electrophorèse en des conditions non dénaturantes
Les molécules sont séparées dans leur état le plus proche possible de leur état natif. La vitesse de
migration dépend de la charge native de la molécule et de sa structure tridimensionnelle.
5. 2. Electrophorèse en des conditions dénaturantes
Les molécules sont soumises à un traitement dénaturant avant la séparation électrophorétique,
détruisant la structure tridimensionnelle native. La séparation est donc en fonction de la masse moléculaire. Les
agents de dénaturation sont le SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) et le -mercaptoéthanol qui réduit les ponts
disulfures des protéines. Le SDS (Fig. 1) est un dénaturant doux et un surfactant, il agit sur les protéines de
plusieurs façons:
Si la protéine est oligomérique, ses sous unités sont séparées les unes des autres.
Il se fixe sur les protéines, les tapissant de charge négative (Fig. 2). Les protéines transformées en
manopolyanions, possèdent toutes la même mobilité électrophorétique. La charge négative globale
permet la migration vers l’anode, mais les molécules sont séparées uniquement en fonction de leur
masse moléculaire.
Figure 2. Structure chimique du SDS.
Figure 2. Action du SDS sur les protéines.
A) Appareillage d’électrophorèse
L’appareillage usuel est constitué de (Fig. 3):
Un générateur du courant continu stabilisé relié aux électrodes de la cuve. Ce courant crée un champ
électrique qui va permettre de faire migrer les molécules.
Une cuve d’électrophorèse fermée (horizontale ou verticale) et éventuellement thermostatée
comportant deux compartiments. Chaque compartiment est rempli du tampon de migration.
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Des accessoires comme le support d’électrophorèse, les plaques de verre pour couler le gel et les
peignes pour creuser des puits dans le gel, dans lesquels les composés à analyser seront déposés.
Figure 3. Appareillage d’électrophorèse.
B) Mode opératoire
Il consiste à:
Préparer le gel de concentration et le gel de séparation.
Couler le gel de séparation entre des plaques de verre fixées sur un support suivi par le gel de
concentration.
Déposer un peigne entre ces plaques.
Retirer le peigne après polymérisation du gel (formation des puits).
Déposer l’échantillon et les marqueurs de masse moléculaire dans les puits.
Placer les plaques de verre contenant le gel polymérisé dans une cuve d’électrophorèse.
Remplir la cuve avec le tampon de migration.
Mettre en marche le générateur de courant.
Enlever le gel à partir des plaques à la fin de la migration.
Colorer puis décolorer le gel.
Analyser le gel.
Préparation du gel
Elle consiste à préparer deux gels: un gel de séparation dont les pores sont sérés et un gel de concentration
dont les pores sont lâches.
Le gel de polyacrylamide est une macromolécule réticulée utilisée comme support d’électrophorèse. C’est
un copolymère d’acrylamide qui forme des chaînes et de NN’-méthylène bis-acrylamide qui assure le potage
entre les chaînes de polyacrylamide (Fig. 4). La polymérisation de l’acrylamide nécessite la présence de deux
catalyseurs: Le TEMED (N, N, N’, N’-tétraméthyléthylène diamine: TMEDA) et le persulfate d’ammonium
[(NH4)2S2O8] qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière. La porosité du gel varie en
fonction du taux de l’acrylamide, de bis-acrylamide, du TEMED (Fig. 5) et du persulfate d’ammonium. Plus
que le pourcentage d’acrylamide est élevé, plus que la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau
sont serrées. Par conséquence, plus le pourcentage d’acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses
peuvent migrer (Tab. 1). Donc, plus que la masse moléculaire du composé est élevée, plus que la migration est
lente.
Tableau 1. Pourcentage d’acrylamide en fonction de la taille des protéines à séparer.
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Figure 4. Formation du gel de polyacrylamide.
Figure 5. Structure chimique du TEMED.
Le gel de séparation permet la séparation de la solution à analyser. La densité typique de ce gel peut être
6, 8, 10, 12, ou 15%. Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des composés. Le gel de concentration
est coulé en haut du gel de séparation et sa densité est de l’ordre de 5%. Il permet une entrée homogène de
l’échantillon dans le gel de séparation.
Préparation de l’échantillon: L’échantillon est soumis à l’action de plusieurs composés:
Le mercaptoéthanol: Composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines oligomériques en
rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous unités des
protéines sont donc dissociées.
Le SDS: Composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaînes de protéines tout en leur
conférant une charge négative.
Le sucrose ou le glycérol: Qui donnent une densité à l’échantillon permettant ainsi à ce dernier d’être
déposé facilement au fond des puits.
Le bleu de bromophénol: Est également utilisé comme marqueur coloré afin de vérifier le bon
déroulement d’une électrophorèse sur gel de polyacrylamide ou en gel d’agarose.
En conséquence, les protéines sont dénaturées (elles ont perdu leur structure tridimensionnelle) et n’ont
plus de ponts disulfures (elles sont sous une forme monomérique).
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Les marqueurs de masse moléculaire: La détermination de la masse moléculaire des protéines inconnues
nécessite l’utilisation des protéines standards de masse moléculaire connue.
Le tampon de migration: Il contient des électrolytes qui sont responsables du transport du courant
électrique. Si la concentration de ces électrolytes est faible, la totalité du courant est transportée par le soluté et
une faible proportion est transportée par les électrolytes, ce qui entraine la migration des protéines et donc leur
séparation. Le tampon d’électrophorèse est constitué de glycine qui joue le rôle de conducteur de courant.
La coloration: Une fois la migration électrophorétique terminée, le gel est démoulé, séché puis plongé dans
un colorant. Les protéines sont révélées par une coloration spécifique (par exemple avec le bleu de Coomassie).
La décoloration: Une succession de bains dans la solution de décoloration permet d’éliminer la coloration
du fond de façon à faire apparaître les bandes correspondant aux diverses protéines séparées. Les protéines sont
fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol et de l’acide acétique.
C) Applications
L’électrophorèse est utilisée pour vérifier la pureté d’une fraction chromatographique et pour déterminer la
masse moléculaire d’une protéine inconnue à l’aide des protéines standards.
Détermination de la masse moléculaire
Le fait que le SDS rende négatives les protéines permet de les séparer en fonction de leur taille (masse
moléculaire) et non pas en fonction de leurs charges. Il existe une relation de linéarité entre le logarithme de la
masse moléculaire et le déplacement électrophorétique (Rf) au sein du gel. Cette technique est utilisée pour
déterminer la masse moléculaire d’une protéine inconnue.
Dans les mêmes conditions, on soumet la protéine à analyser à une électrophorèse, la connaissance de son
déplacement (Rf) et l’extrapolation de ce Rf sur la droite: Log M = f (Rf), permettent la détermination de sa
masse moléculaire (Fig. 6).
Figure 6. Mobilité des protéines en fonction du logarithme de leur masse moléculaire. (pnA: protéine A de
masse moléculaire inconnue).
A l’aide de marqueurs protéiques (protéines pures de masse moléculaire connue) (Tab. 2) on trace la droite
d’étalonnage Log M=f (Rf). Le rapport frontal (Rf) représente le rapport de la distance parcourue par la
protéine sur la distance parcourue par le front de migration (Fm).
Tableau 2. La masse moléculaire et les rapports frontaux de quelques protéines standards.
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6. 4. Immunoélectrophorèse
Cette technique permet de séparer les composés par électrophorèse et de les détecter par réaction
immunologique par formation d’arc de précipitation entre antigène et anticorps. Les précipités peuvent être
facilement visualisés sur un gel. Donc, c’est une méthode qui associe l’électrophorèse de protéines (Ag) à une
immuno-diffusion contre des Ac spécifiques.
Les antigènes sont séparés en électrophorèse de zones sur une lame de gel d’agar tamponné à pH variable
de 8.2 à 8.6 est percée de deux puits au centre. Les fractions protéiques particulièrement mobiles du sérum
(sérum-albumine, 1 lipoprotéine, 1 antitrypsine, haptoglobine, transférrine, lipoprotéine, etc.) migrent vers
l’anode à pH 8.2-8.6, comme sur l’acétate de cellulose (sens 1) (Fig. 9). Par contre, les fractions les moins
mobiles comme les IgG sont entrainées vers la cathode par le courant d’électro-endosmose. Elles migrent donc
en apparence vers la cathode bien que chargées négativement (sens 2) (Fig. 9).
Figure 9. Lame d’immunoélectrophorèse.
L’antisérum spécifique est déposé dans une rigole découpée parallèlement à la direction de la migration
électrophorétique (Fig. 10). La plaque est placée en chambre humide pendant 24 à 48 heures. Après cette
période, les arcs de précipitation apparaissent.
Figure 10. Immunoélectrophorèse d’un sérum.
Cette technique est une méthode analytique qui permet de dénombrer une trentaine de protéines dans le sérum
humain.
L’exploitation de la plaque est faite visuellement:
Par observation directe sur fond noir, ou à la loupe éclairante.
Par photographie et agrandissement.
Par coloration après lavage et séchage.
L’interprétation des résultats nécessite la comparaison de l’échantillon à analyser et un sérum normal. La
comparaison porte sur:
La position électrophorétique des arcs.
Leur forme et leur épaisseur.
Leur netteté.
Remarque:
Un arc épais, plus long et plus près de la rigole indique un accroissement de la teneur en cette protéine.
Un arc plus fin, plus court et plus éloigné de la rigole indique l’inverse.
Un arc flou qui indique un mauvais rapport stoechiométrique Ag-Ac, près de la rigole, signifie une
augmentation de l’antigène; éloigné de la rigole, une diminution.
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3. Facteurs influençant la mobilité électrophorétique
Plusieurs facteurs peuvent influencer la mobilité électrophorétique.
3. 1. Nature de la molécule
La taille et la charge de la molécule influencent le processus électrophorétique. En effet, les petites
molécules migrent facilement mais leur mobilité dépend des autres substances dissoutes susceptibles de les
solvater et de diminuer leur vitesse. De même, la charge des molécules influence directement leur mobilité. La
charge est fonction du pH pour les molécules ionisables, de la force ionique et de la formation éventuelle de
complexes. Le signe de la charge détermine le sens de migration et sa vitesse.
4. 2. Composition ionique du tampon d’électrophorèse
La présence d’ions étant nécessaire au passage du courant, un compromis est obtenu avec une force
ionique comprise entre 0.05 et 1 mol/l. Le pH influe sur l’ionisation des acides faibles et bases faibles, pour
lesquels il s’avère nécessaire de travailler dans un milieu tamponné.
A pH et force ionique identiques, deux tampons de nature différente ne produisent pas toujours des
mobilités électrophorétiques identiques. Certaines substances ajoutées au tampon de migration modifient aussi
les comportements électrophorétiques. Ainsi:
La présence d’EDTA ou d’acide citrique favorise par complexation la séparation de certains ions
minéraux.
Les ions boratés forment avec les sucres des complexes chargés rendant ainsi possible leur séparation.
L’addition d’urée modifie le comportement électrophorétique des macromolécules par rupture de
liaisons hydrogène.
4. 3. Support
Certains supports possèdent des propriétés adsorbantes et peuvent fixer les molécules de solvants ou de
solutés. Il en résulte un ralentissement de la migration entrainant un élargissement des zones sur
l’électrophorégramme. Ces propriétés adsorbantes sont liées à la présence de certains groupements fonctionnels
comme les hydroxyles.
4. 4. Champ électrique
Il représente la chute de potentiel par unité de longueur entre deux électrodes séparées par une distance.
Le champ électrique est fourni par un générateur de courant continu. Le support de ce champ est constitué par
un tampon de pH dont les ions conduisent le courant d’un pôle à un autre. Ce support peut être liquide: on parle
alors d’électrophorèse en veine liquide. Dans une large majorité des cas, on utilise un support poreux
stabilisant la phase liquide: on parle alors d’électrophorèse sur support ou d’électrophorèse de zones. Le
mélange à séparer est déposé sur un support poreux imprégné de tampon. Ce support peut être du papier, un
dérivé de cellulose, de l’amidon, de l’agarose, du polyacrylamide, etc. Le support doit être homogène et inerte.
Les particules à séparer peuvent être de nature et de taille très différentes: des composés organiques ou
minéraux, de la taille d’une cellule ou de celle d’un ion. Cette méthode est souvent utilisée pour séparer des
acides nucléiques, des petits peptides ou des protéines.
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