Introduction :

La qualité de l’eau joue un rôle essentiel dans de nombreux domaines, qu’il s’agisse de la
consommation humaine, de l’agriculture, de l’industrie ou encore des usages domestiques.
Pour garantir la sécurité sanitaire et la conformité aux besoins de chaque secteur, l’eau doit
répondre à des normes de qualité strictes, notamment sur le plan microbiologique. Les eaux
souterraines, issues des puits ou des sondages, représentent une ressource importante, mais
leur qualité peut varier selon leur profondeur et l’environnement qui les entoure. Dans ce
contexte, ce travail vise à comparer la qualité microbiologique des eaux de puits et de
sondage, tout en évaluant l’effet de la présence des activités industrielles sur le respect des
normes d’usage.
Prélèvement :
Le prélèvement d’échantillons d’eau doit se faire en utilisant des bouteilles stériles fournies
par le Laboratoire. Leur stérilisation se fait soit par la chaleur, à l’oxyde d’éthylène ou par les
rayons gamma. Faire le contrôle de stérilité et stérilisation à l’extérieure. Doter les flacons de
prélèvement de neutralisants ; le thiosulfate de sodium (pastilles) ou par l’EDTA (Ethylène
Diamine Tetra-Acétique). Pour la recherche de bactéries pathogènes (exemples : Salmonella,
Yersinia, Campylobacter), se procurer un contenant stérile de quatre litres. D’autres situations
peuvent exiger un volume d’échantillonnage plus important (exemples : parasites et virus).
Sur chaque bouteille, une étiquette indique la date limite d’utilisation (expiration), le numéro
de la demande d’analyse, la date de prélèvement et le numéro de prélèvement.

Analyse microbiologique
Méthode de filtration sur membrane
Principe :
La méthode de filtration sur membrane consiste à faire passer un volume d’eau à travers une
membrane filtrante de 0,45 µm, qui retient les micro-organismes présents dans l’échantillon.
Après la filtration, la membrane est déposée sur un milieu de culture approprié et incubée afin
de permettre le développement des colonies. Le nombre de colonies obtenues correspond à la
concentration microbienne de l'eau (exprimée en UFC/100 mL), ce qui permet d’évaluer sa
qualité microbiologique.

les étapes de filtration :

 Désinfecter par flambage, avant utilisation du filtre

 A l’aide une pince stérile, on pose délicatement la membrane sur la

plaque-support et on revisse le récipient supérieur pour assurer
l’étanchéité du système

 Mettre 100 ml d’eau à analyser dans le récipient supérieur, on place

la pompe à vide puis on filtre après ouverture des robinets
  A l’aide d’une pince désinfectée, on prélève la membrane et
en le placé sur le milieu spécifique dans une boite de pétrie.

 Pour éviter toute contamination possible, on flamber le

dispositif par le bec-benzène après chaque échantillon filtré.

Recherche et dénombrement des coliformes totaux,

coliformes thermotolérants et Escherichia coli

 Principe

Les coliformes présentent des colonies de coloration jaune ou orangée, à l'intérieur d'un halo
jaune visible sous la membrane. Celui-ci est provoqué par l'acidification du lactose en
présence de l'indicateur coloré, le bleu de bromothymol. Le Tergitol 7 inhibe la croissance des
microorganismes à Gram positif, limite l'envahissement par les Proteus et favorise la
récupération des coliformes. Le TTC (chlorure de 2,3,5 triphényltétrazolium) est présenté
sous forme de supplément lyophilisé. Les bactéries réduisant le TTC (incluant Proteus et
Pseudomonas) présentent des colonies rouges, dû à la formation de formazan insoluble. Les
germes qui ne fermentent pas le lactose présentent des colonies avec un fond de gélose bleu.

Le test d’oxydase permet de rechercher la présence de l’enzyme cytochrome oxydase chez

les bactéries.
Cette enzyme intervient dans la chaîne respiratoire et oxyde certains substrats.

👉 Bactéries oxydase + = possèdent le cytochrome oxydase.

👉 Bactéries oxydase – = ne possèdent pas cette enzyme.

 Technique utilisé pour Coliformes Totaux

Après la filtration, la membrane est placée sur un milieu de culture gélose lactosée au
tergitol 7 et au TTC. Lors de l’incubation pendant 24h à 37°C, les coliformes fermentent
certains sucres du milieu, entraînant la formation de colonies caractéristiques (généralement
jaunes entourées d’un halo jaune) ce qui permet leur repérage.

À la fin de l’incubation, le nombre de colonies typiques est compté sur la membrane. Ce

résultat est ensuite exprimé en UFC/100 ml, reflétant la concentration de coliformes dans
l’eau et permettant d’évaluer sa conformité aux normes microbiologiques de qualité.

Ensuite on fait le test d’oxydase, Si l’oxydase est positive, cela indique généralement que les
colonies observées ne sont pas des coliformes, car ces derniers sont en principe oxydase (-).
Si l’hypothèse de coliformes est confirmée, on procède à un repiquage sur bouillon BLBVB
(Bouillon Lauryl Sulfate au Vert Brillant) afin de vérifier la production de gaz.
 Après une incubation à 37 °C pendant 24 à 48 h, la formation de gaz dans le tube Durham
confirme la présence de coliformes.
Le bouillon BLBVB contient du lactose et du vert brillant, ce dernier inhibant la plupart des
bactéries autres que les coliformes. Si du gaz apparaît, il est issu de la fermentation du
lactose par les coliformes. En revanche, l’absence de gaz indique que la souche n’est
probablement pas coliforme, car aucun gaz n’a été produit à partir du lactose.

 Technique utilisée pour Coliformes Thermotolérants

La procédure de manipulation est la même que décrite au niveau les coliformes totaux, sauf
que les boites sont incubées à 44°C pendant 24h.
Ensuite on fait le test d’oxydase, Si le test oxydase est positif, les colonies observées sur la
gélose TTC au tergitol 7 ne correspondent pas à des coliformes ; elles pourraient alors
appartenir aux genres Pseudomonas ou Aeromonas.
Lorsque l’oxydase est négative, on effectue un repiquage d’une colonie suspecte sur le milieu
BLBVB ainsi que sur un milieu tryptophane. Après une incubation de 24 h à 37 °C, la
formation de gaz dans le BLBVB indique la présence de coliformes.
De plus, si le test à réactif de Kovacs sur le milieu tryptophane est positif, cela confirme la
présence de coliformes fécaux, en particulier Escherichia coli.

 Pratiquement
Coliformes Totaux
Coliformes thermotolérants

Après filtration Après filtration

Membrane sur gélose lactosé au tergitol 7 et au TTC Membrane sur gélose lactosé au tergitol 7 et au TTC
h
Incubation à 37°C pendant 24h Incubation 44à °C pendant 24h

Test oxydase Test oxydase

Négative positive Négative positive

Repiquage sur milieu BLBVB Ne sont pas de Coliformes Repiquage sur milieu BLBVB Ne sont pas de Coliformes

Incubation à 37°C pendant 24h Incubation à 37°C pendant 24h

Repiquage sur milieu tryptophane

+ Réactif de Kovacs pour Recherche

Particulièrement des E. coli

  Résultat de recherche et dénombrement des coliformes :

Pour les coliformes Totaux :

Chercher des zones comptables

 Parfois la croissance n’est pas uniforme : repérer un

quart ou une zone où les colonies sont séparées.
 Compter les colonies dans quadrant puis multiplier :
o Nous comptons 341 colonies dans 1/4 de la
surface → estimer 341 × 4 = 1364 colonies.

Figure 1: Gélose lactosée au Tergitol

7 et au TTC pour CT ensemencée
Test d’oxydase avec l’échantillon

Le résultat de test oxydase : formation de coloration rose ou violette, ce indique présence de

l’enzyme cytochrome oxydase Oxydation (+)

Ce résultat est en contradiction avec les caractéristiques des coliformes ; donc les germes
obtenus ne sont pas des coliformes. Ils pourraient être des Bacillus.

Donc, il ne faut pas passer au test de confirmation.

Pour les coliformes fécaux :

Absence de croissance bactérienne sur la gélose lactosée au

Tergitol 7 et TTC ; par conséquent, aucun test d’oxydase ni
test de confirmation n’est réalisé. Cela indique également
l’absence de germes de type E. coli.

Figure 2: Gélose lactosée ay Tergitol 7

et au TTC pour CF ensemencée avec
Recherche et dénombrement des Streptocoques l’échantillon
fécaux :

 Principe
L’azide de sodium permet d’inhiber la croissance des microorganismes à Gram négatif. Le
TTC (chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium) est un indicateur de la croissance bactérienne.
Incolore à l’origine, il est réduit en formazan insoluble à l’intérieur de la cellule. Cette
réaction se manifeste par l’apparition de colonies de couleur rouge à marron.
Pour test de conformation, on utilisé le gélose BEA, Le milieu BEA est sélectif pour les
entérocoques grâce à la bile et à l’azide qui inhibent les autres bactéries.
Il est aussi différentiel : les entérocoques hydrolysent l’esculine, produisant une coloration
noire du milieu.

 Technique d’analyse

 Filtration de l’eau
Un volume d’eau (généralement 100 ml) est filtré sur une membrane 0,45 µm pour retenir
les bactéries.

 Ensemencement sur gélose Slanetz et Bartley

La membrane est placée sur le milieu sélectif Slanetz et Bartley, spécialement conçu pour
l’isolement des streptocoques fécaux (entérocoques).
✔ Ce milieu inhibe les autres bactéries et favorise la croissance des entérocoques.

 Incubation

 Température : 36–37 °C
 Durée : 44 ± 4 h
→ Les entérocoques apparaissent en colonies rouges-brunes à bordeaux.

 Confirmation
Les colonies suspectes sont transférées sur gélose Bile-Esculine-Azide (BEA) ou testées par
hydrolyse de l’esculine :
✔ Les entérocoques donnent un noircissement du milieu.

 Dénombrement
On compte uniquement les colonies typiques et on exprime le résultat en CFU/100 ml.

 Résultat de recherche et dénombrement

Aucune croissance bactérienne n’a été observée sur la gélose sélective Slanetz et Bartley ; par
conséquent, aucun test de conformation n’a été réalisé.

Recherche des Vibrions cholériques (Vibrio cholerae)

 Principe
La détection de Vibrio cholerae combine généralement concentration de l’échantillon, mise
en enrichissement sélectif, isolement sur milieux sélectifs, puis confirmation par tests
biochimiques, sérologiques ou moléculaires. Ces méthodes permettent d’identifier la présence
d’organismes et, le cas échéant, de déterminer s’il s’agit de souches toxigènes (productrices
de choléra).

 Technique de recherche

1.Prélèvement et filtration

o Un volume d’eau est filtré sur une membrane de 0.45µm pour retenir les
bactéries présentes.
Cette étape est essentielle pour améliorer la sensibilité de la méthode, surtout si la
concentration de vibro est faible.

2. Enrichissement sélectif

o Principe : Vibrio cholerae tolère le milieu alcalin et se multiplie rapidement, ce

qui facilite son isolement ultérieur.
o La membrane filtrante est placée dans de l’eau peptonée alcaline (EPA) (pH
8.5), puis incuber à 37°C pendant 24h
o Cette étape favorise la croissance de Vibrio cholerae tout en inhibant les autres
bactéries.

3. Isolement sur milieu sélectif

a. Principe : TCBS est sélectif (inhibe les autres bactéries) et différentiel
(coloration selon la fermentation du saccharose).
b. Après enrichissement, l’échantillon est étalé sur gélose TCBS, pour séparer et
identifier visuellement les colonies suspectes de Vibrio.
c. Les colonies typiques de Vibrio cholerae apparaissent jaunes plates grâce à la
fermentation du saccharose.
4. Identification présomptive :

Les colonies jaunes caractéristiques sont choisies pour être testées plus en détail : Mobilité
polaire, examen état frais, coloration de gram, réaction d’oxydase.

5. Confirmation des isolats

a. Tests biochimiques (si oxydase positive) par macro-galerie (kligler-Hajna,
urée-indole, test d’ONPG et disque Vibrio statique O129).
6. Interprétation et dénombrement
a. Les résultats sont interprétés selon la présence, l’identité et éventuellement la
concentration de Vibrio cholerae.

 Résultat de recherche
L’enrichissement dans l’eau peptonée alcaline suivi de
l’ensemencement sur gélose TCBS n’a révélé aucune croissance
bactérienne après incubation, indiquant l’absence de Vibrio dans
l’échantillon analysé.

Figure 3: Milieu
d'enrichissement de Vibrio
ensemencée avec
l’échantillon

Figure 4: Milieu sélectif TCBS

pour Vibrio ensemencée avec
l’échantillon
Recherche des staphylocoques à coagulase positive
 Principe

Ces bactéries sont indicatrices d’une contamination fécale ou cutanée et peuvent provoquer
des intoxications alimentaires ou des infections.

La sélectivité de ce milieu est basée sur la présence de chlorure de sodium (7.5%) qui inhibe
la plupart des bactéries à Gram négatif et à Gram positif.

La différenciation est basée sur la capacité à fermenter ou non le mannitol (le seul sucre du
milieu). S'il y a fermentation, cela induit une acidification qui entraîne, à des niveaux de pH
inférieurs à 6.9, une coloration jaune du milieu en présence de rouge de phénol (indicateur de
pH).

 Technique de recherche

 Prélèvement de l’eau et filtration pour concentrer les bactéries.

 Isolement sur gélose Chapman (MSA) : sel élevé pour sélectionner les
staphylocoques, mannitol + indicateur pour différencier S. aureus.

 Identification des colonies : par coloration de Gram et test de catalase

 Confirmation par test de coagulase : confirme la présence de staphylocoques

 Interprétation des résultats selon CFU ou présence/absence.

 Résultat de recherche

Après incubation, aucune colonie n’a été observée sur le milieu sélectif pour les
staphylocoques, indiquant leur absence dans l’échantillon.

Figure 5: Gélose Chapman sélective pour les

staphylocoques, ensemencée avec l’échantillon
Recherche des Salmonelles

 Principe

La technique standard de référence pour la recherche de Salmonella spp. dans les

échantillons d'eau est la méthode de culture enrichie, détaillée dans la norme internationale
NF EN ISO 19250 :2013 (qui remplace l'ISO 19250 :2010).

Cette méthode est généralement utilisée pour détecter la présence ou l'absence de Salmonella
et est essentielle car ces bactéries sont souvent présentes en faible nombre et peuvent être
stressées dans le milieu aqueux, ce qui nécessite des étapes de relance.

 Les étapes de technique

1. Pré-enrichissement non sélectif

 Objectif : Revivifier et multiplier les Salmonella éventuellement lésées sans inhiber la

flore environnante.
 Procédure : L'échantillon d'eau est filtré (pour concentrer les bactéries) sur
membrane. Mettre la membrane dans un milieu de pré-enrichissement liquide non
sélectif, comme l'Eau Peptonnée Tamponnée (EPT), incube 24h à 37° C.

2. Enrichissement sélectif

 Objectif : Favoriser la croissance des Salmonella tout en inhibant la flore compétitrice

(autres bactéries).
 Procédure : Des aliquotes de la culture de pré-enrichissement sont transférés dans un
milieu sélectif liquide Sélénite Cystéine, incube pendant 24h à 37°C.

3. Isolement sur milieux sélectifs solides

 Objectif : Isoler les colonies suspectes de Salmonella.

 Procédure : À partir des cultures d'enrichissement (étape 2), on ensemence un milieux
sélectif solide (boîtes de Pétri) pour permettre l'apparition de colonies caractéristiques.
Le milieu utilisé est :
o Gélose SS, incubation pendant 24h à 37°C.

4. Confirmation (Identification)

 Objectif : Confirmer que les colonies suspectes sont bien des Salmonella.
 Procédure : Des colonies caractéristiques sont repiquées et soumises à :
o Tests biochimiques : Pour vérifier les propriétés métaboliques (ex : absence
d'uréase, production de H2S, etc.). Des kits d'identification commerciale
peuvent être utilisés.
  Résultat de recherche
Pour milieu pré-enrichissement :
eau peptonée tamponnée : on observe
que le flacon montre un bouillon clair,
légèrement trouble, ce qui indique une
croissance bactérienne (non sélective).
Pour milieu d’enrichissement
sélectif : Sélénite-Cystéine on
observation présence de flacon blanc en
suspension dans un bouillon clair. Ce
qu’Interprétée par le Sélénite favorise
les Salmonella, mais d’autre
entérobactéries peuvent aussi pousser et
Figure 7: Milieu de pré-
la présence de flacon indique une
enrichissement pour Salmonella
ensemencée avec l'échantillon Figure 6: Milieu croissance, donc l’enrichissement a
d'enrichissement pour fonctionné. Mais cela ne signifie pas
Salmonella ensemencée avec encore Salmonella
l'échantillon
Pour milieu d’Isolement : Gélose SS
Observation : colonies nombreuses, de couleur foncée, probablement noires ou très
sombres
Normalement :
Salmonella = colonies incolores ou légèrement opaques + centre noir (H₂S).
Shigella = colonies incolores sans noir.
📌 Notre gélose montre :
De nombreuses colonies sombres, très noires, parfois étalées.
Mais l’aspect est très irrégulier, colonies très grandes → évoque souvent Proteus ou
autres H₂S+ très envahissants.
Figure 8: Gélose SS, sélective Sur SS, Salmonella forme des colonies plus petites, bien délimitées, pas aussi étalées.
pour Salmonella ensemencée
avec l'échantillon ➡️Interprétation probable : absence de colonies caractéristiques de Salmonella.
Présence probable d’H₂S+ envahissants (ex : Proteus, Citrobacter).

Pour Milieu Kligler-Hajna : on observe que le milieu est

jaune en surface et en fond = fermentation du glucose et du
lactose, et production d’H2S (point/noircissement visibles) et pas
de rouge (absence d’alcalinisation).
Interprétation : Salmonella= Acide/Alcalin (jaune en bas, rouge en
haut) ce qui contre ce résultat qu’indique que le milieu totalement
jaune= fermente lactose.
Pour Milieu Urée-Indole : On observe couleur jaune/orange
Figure 9: Milieu Uréase négative.
Figure 10: Milieu urée-
Kligler-Hajna pour indole pour
conformation de
Salmonella est uréase négative, donc cela ne l’exclut pas, mais
conformation de c’est cohérent.
Salmonella Salmonella
Mais comme les autres tests sont négatives ce test ne change
d’après l’ensemble des résultats : aucune étape de conformation n’indique la présence de
Salmonella.
après pré-enrichissement (eau peptonée tamponnée) et enrichissement sélectif (Sélénite-
Cystéine), l’ensemencement sur gélose SS n’a révélé aucune colonie typique de Salmonella.
Les testes de confirmation (Kligler-Hajna et Urée-indole) ont montré des profils
incompatibles avec Salmonella. L’échantillon est donc déclaré négatif pour Salmonella.

Interprétation et comparaison :
 Interprétation des résultats d’analyse d’eau de sondage
 Coliformes totaux élevés : 1364 UFC/100ml
Une charge élevée de CT indique une contamination d’origine environnementale (sol, biofilm,
eau stagnante, matériel non désinfecté). Cela reflète une eau de qualité insuffisante d’un point
de vue hygiénique, même si ces germes ne sont pas forcément pathogènes. L’eau
présente une contamination générale importante.

 Absence de coliformes fécaux (CF=0)

L’absence de coliformes fécaux signifie absence de contamination d’origine fécale récente.
Aucun risque lié aux entérobactéries strictement fécales (Ex : E. coli thermotolérants)
L’eau n’est pas contaminée par des rejets d’origine humaine ou animale.

 Absence des streptocoques fécaux

Les streptocoques fécaux sont de bons indicateurs car plus résistants, donc confirme l’absence
de contamination fécale. Contamination fécale improbable.
 Absence de Staphylocoques pathogènes
Aucun Staphylococcus à coagulase positive détecté. Cela exclut une contamination par
manipulation humaine ou cutanée non hygiénique.

 Absence de Vibrio
L’absence de Vibrio (notamment cholerae) indique aucun risque hydrique lié à Vibrio

 Absence de Salmonella
Le test négatif montre qu’il n’y a pas de contamination par des Salmonelles

L’eau de sondage est microbiologiquement non conforme en raison du

niveau élevé de coliformes totaux, bien qu’elle ne présente pas de contamination
fécale ni de microorganismes pathogènes. Elle est donc considérée comme une
eau de mauvaise qualité hygiénique, mais sans risque fécale direct.
  Comparaison entre les échantillons analysées
Nous avons comparé la qualité de trois échantillons d’eau différents : un échantillon d’eau de
sondage (notre échantillon), un échantillon d’eau de puits et un échantillon d’eau prélevé dans
une zone industrielle.

Paramètre Eau de sondage Eau de puits Eau zone

industrielle
Coliformes totaux 1364 UFC/100mL Présente Présente
(élevé)
Coliformes fécaux 0 Présente 0
Streptocoques 0 0 0
fécaux
Vibrio 0 0 0
Staphylocoques 0 Présente Présente
Salmonella 0 0 0

Le tableau montre que les trois eaux présentent une contamination microbiologique, mais
avec des origines et des intensités différents.
L’eau de sondage contient une grande quantité de coliformes totaux, ce qui indique une
pollution générale, mais l’absence de coliformes fécaux et d’autre germes pathogènes suggère
qu’il ne s’agit pas d’une contamination d’origine fécale.
L’eau de puits est la plus préoccupante : la présence de coliformes fécaux et de
staphylocoques révèle une contamination probablement liée à des rejets domestiques ou
animaux, ce qui augmente le risque sanitaire.
Pour l’eau de la zone industrielle, on observe des coliformes totaux et des staphylocoques, ce
qui indique une pollution environnementale ou industrielle, mais sans source fécale directe.
Globalement, l’eau de puits présente le risque microbiologique le plus élevé, tandis que l’eau
de sondage et celle de la zone industrielle montrent uniquement une pollution non fécale.