République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la

Recherche Scientifique

Université Larbi Tébessi, Tébessa

Faculté des Sciences Exactes et sciences de la

Nature et la Vie

Département : Biologie Appliquée

GÉNÉTIQUE MICROBIENNE

3èME ANNÉE LICENCE

MICROBIOLOGIE

Dr. Hind FENGHOUR

2021-2022
Semestre : 5
Unité d’enseignement Méthodologique 2 (UEM2(O/P) :
Matière 2 : Génétique microbienne
Crédits : 4
Coefficient : 2
Objectifs de l’enseignement :
Connaissances préalables recommandées :
Contenu de la matière :
I– Structure et organisation du matériel génétique :
Chromosome, plasmides, matériel génétique viral.
II – mutation et mécanismes de réparation de l’ADN :
Taille de mutation, effet mutagène, agents mutagènes, mécanismes de réparation de l’ADN.
III- Recombinaison génétique et éléments génétiques transposables :
recombinaison homologue, recombinaison site spécifique, éléments génétiques transposables
et applications
IV –Transferts génétiques chez les bactéries : analyse et construction génétiques :
conjugaison, transformation, transduction et phages transducteurs, applications,
cartographie génétique.
V – Phénomène de restriction modification : système de restriction modification, enzymes
de restriction, cartographie de restriction et applications.
VI – Régulation de l’expression des gènes : régulation transcriptionnelle (exemples : E. coli,
Saccharomyces cerevisiae), régulation traductionnelle.
VII – Génétique des bactériophages : réplication du génome viral, recombinaison génétique
chez les virus, mécanismes de l’expression génétique en cascade chez les virus et maintien à
l’état prophage.
 MODULE : GENETIQUE MICROBIENNE

I. INTRODUCTION
II. Le GENOME BACTERIEN. Structure, Organisation et Réplication
III. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN
IV. RECOMBINAISON, TRANSFERTS GENETIQUES, CARTES
GENETIQUES
V. LES PLASMIDES
VI. LE PHENOMENE DE RESTRICTION MODIFICATION
* Les enzymes de restriction et la cartographie de restriction
VII. LES ELEMENTS TRANSPOSABLES
VIII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES

IX. GENETIQUE DES BACTERIOPHAGE

 Chapitre I. LE GENOME BACTERIEN GENETIQUE MICROBIENNE

I. LE GENOME BACTERIEN. Structure, Organisation et Réplication

1. INTRODUCTION
L’examen même superficiel du monde microbien montre que les bactéries sont un des groupes les
plus importants quel que soit le critère utilisé : nombre des organismes, importance écologique ou
importance pratique pour les hommes. En outre, la plus grande partie de notre compréhension en
biochimie et en biologie moléculaire vient de la recherche sur les bactéries.
Les bactéries sont des organismes microscopiques qui existent à l’état unicellulaire ou sous forme
d’agrégats de cellules. Une cellule bactérienne est capable d’assumer toutes les fonctions vitales, telle
que la croissance, la respiration (ou la fermentation), et la reproduction, indépendamment d’autres
cellules. Les bactéries sont des procaryotes, caractérisés principalement par l’absence de membrane
nucléaire. Le génome procaryote est constitué d’une grande molécule d’ADN, fortement condensée
par son association avec des protéines. Cette structure est appelée nucléoïde et elle est
fonctionnellement équivalente au noyau des eucaryotes. Les procaryotes se distinguent également des
eucaryotes par l’absence des organites spécialisés dans la réalisation de certaines fonctions cellulaires
(respiration, photosynthèse…) qui, chez les bactéries, s’effectuent au niveau des structures
membranaires internes ou associées à la membrane cytoplasmique, et l’absence des microtubules qui
est à rapprocher de l’absence de mitose ou de méiose.(1).

2. LE GENOME BACTERIEN
Le génome bactérien est constitué d’une seule molécule d’ADN circulaire. L’ADN bactérien est lié
aux membranes cellulaires, ces dernières qui semblent être impliquées dans la séparation de l’ADN
entre les cellules filles lors de la division. La taille du chromosome bactérien est entre 6.10 5 et 1,2.107
paires de bases.
2.1. Condensation et organisation
La double hélice circulaire de l’ADN bactérien est de plus enroulée en superhélice et est associé à des
protéines basiques (qui ressemblent aux histones complexées à l’ADN des eucaryotes) ayant comme
fonction d’organiser le chromosome bactérien en une structure enroulée de type chromatine .

Dr FENGHOUR
 Chapitre I. LE GENOME BACTERIEN GENETIQUE MICROBIENNE

La condensation de l’ADN est due en partie à son interaction avec des protéines de type histone,
basiques et thermostables dont la mieux caractérisée, HU, est présente à 20 000 exemplaires par
génome. Des interactions avec la membrane contribuent aussi à la condensation du chromosome.
Jacob, Brenner et Cuzin (1963) ont proposé que l’association avec la membrane permette à celle-ci de
jouer le rôle d’un fuseau mitotique qui assure la partition des chromosomes répliqués lors de la
division cellulaires. Cette hypothèse est maintenant vérifiée ; des expériences sur E. coli montrent en
effet que oriC, le site d’initiation de la réplication du chromosome est associé de façon transitoire à la
membrane plasmique, pendant un temps qui serait suffisant à l’établissement de domaines
membranaires précurseurs de la septation.

2.2. Superenroulement de l’ADN

Les deux brins de l’ADN sont enlacés sous forme d’une double hélice. L’axe de la double hélice peut
lui-même s’enrouler dans l’espace pour former une hélice d’ordre supérieur. Dans un ADN bicaténaire,
les deux brins font un tour complet l’un autour de l’autre toutes les 10 paires de bases, c'est-à-dire à
chaque tour d’hélice. L’ADN bicaténaire circulaire peut former des superhélices si les brins sont sous-
enroulés (superhélice négative) (Figure 4) ou superenroulés (superhélice positive).
L’ADN sous-enroulé a un nombre de tours inférieur à celui de l’ADN normal, tandis que le sur-
enroulé présente un plus grand nombre de tours. L’ADN du nucléoïde présente un superenroulement
négatif. Le superenroulement négatif introduit une contrainte de torsion qui favorise le relâchement et
la séparation des deux brins de la double hélice de l’ADN, alors que le superenroulement positif
surenroule cette hélice. La tension introduite par le superenroulement constitue un mode d’activation
énergétique de l’ADN, favorisant les processus qui désenlacent l’ADN, comme la réplication et la
transcription. Les bactéries possèdent des enzymes, les ADN topoisomérases, qui modifient le
superenroulement de l’ADN. Les mieux connues sont l’ADN gyrase, qui surenroule l’ADN
négativement, et l’ADN topoisomérase I qui diminue le superenroulement de l’ADN en augmentant le
taux d’enlacement de ses deux brins.(2).

Dr FENGHOUR
 Chapitre I. LE GENOME BACTERIEN GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 4. Superenroulement de
l’ADN ; Le diagramme montre que le
sous-enroulement des deux brins de
l’ADN peut résulter en la formation
d’un superenroulement négatif ( 1).

Les topoisomérases de type I coupent transitoirement un seul des deux brins de l’ADN dans la double
hélice; le brin coupé passe autour du brin intact, puis les topoisomérases I relient les deux extrémités
reconstituant la continuité de l’ADN (Figure 5). Chaque cycle réactionnel supprime une boucle de
surenroulement de l’ADN. Les topoisomérases I bactériennes n’éliminent que les superenroulements
négatifs(.2).

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 Chapitre I. LE GENOME BACTERIEN GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 5. Action de la Topoisomérase de type I d’E. coli.(2)

Les topoisomérases de la classe II coupent transitoirement les deux brins de la double hélice ce qui
permet le passage d’une région bicaténaire de la même molécule ou d’une autre molécule au travers de
la brèche, éliminant indifféremment des superenroulements négatifs ou positifs. L’ADN gyrase
bactérienne semble seule capable d’effectuer aussi la réaction inverse et d’introduire des
superenroulements négatifs dans l’ADN (Figure 6).

Figure 6. Action de l’ADN gyrase d’E. coli ; une

topoisomérase de type II. (1) L’ADN gyrase, en se liant
à l’ADN circulaire, crée des torsions (+) et (-), (2) elle
coupe ensuite l’ADN double brin et se maintient lié
d’une manière covalente aux extrémités coupées. (3)
Un changement de conformation de l’enzyme permet le
passage d’un segment d’ADN intact à travers la
coupure puis la gyrase relie l’ADN. L’ADN circulaire
reconstitué contient maintenant deux superenroulements
négatifs (3).
3. REPLICATION DU CHROMOSOME BACTERIEN :
La réplication de l’ADN est un processus extraordinairement important et complexe, dont toute vie
dépend. La réplication du chromosome bactérien commence à un seul endroit, l’origine de réplication
(oriC). La synthèse a lieu à la fourche de réplication, là où l’hélice de l’ADN est déroulée et où les
brins individualisés sont répliqués (Figure 7).

Figure 7. Micrographie électronique de la réplication de

l’ADN. La grosse flèche indique une bulle de
réplication. Remarquez les deux fourches de réplication
qui délimitent la bulle ; chacune est caractérisée par une
région plus fine, monocaténaire, sur l’une de ses deux
branches (régions indiquées par les petites flèches) (2).

Deux fourches de réplication se déplacent à partir de l’origine jusqu’elles aient copié tout le réplicon,
c'est-à-dire la portion du génome qui contient une origine et qui se réplique en une seule unité. Lorsque
les fourches de réplication se déplacent autour du cercle, on obtient une structure ayant la forme de la
lettre grecque téta (θ). Finalement, comme le chromosome bactérien est un réplicon unique, les
fourches se rencontrent de l’autre coté et deux chromosomes séparés sont libérés(.3).
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 Chapitre I. LE GENOME BACTERIEN GENETIQUE MICROBIENNE
3.1. Caractéristiques générales de la réplication de l’ADN
La réplication de I'ADN est semi-conservative ; elle consiste en la séparation des brins du chromosome
parental qui servent de matrice pour la synthèse de brins complémentaires. La réplication de l’ADN est
catalysée par des enzymes appelées ADN polymérases utilisant comme précurseurs des nucléotides
triphosphates. La réplication de I'ADN est bidirectionnelle ; A partir de l’origine de réplication, la réplication
progresse dans les deux directions autour du chromosome circulaire, impliquant deux fourches de
réplication qui avancent dans des directions opposées.
La réplication est semi-discontinue ; Les deux brins de l’ADN sont antiparallèles, et Comme les ADN
polymérases ne polymérisent les nucléotides que dans la direction 5'→3', les deux brins doivent être
synthétisés dans la direction 5'→3'. La copie du brin parental 3'→5' est donc synthétisée de façon
continue; ce nouveau brin est appelé brin avancé. À mesure que I'hélice se déroule, I'autre brin
parental (le brin dans la direction 5'→3') est copié de façon discontinue par synthèse d'une succession
de fragments de 1000 à 2000 nucléotides appelés fragments d'Okazaki; le brin qui sera formé à partir
de ces fragments est appelé brin retardé.
3.2. Mécanisme de la réplication de l’ADN chez E. coli

Figure 8 : Caractéristiques générales d’une fourche de réplication. L’ADN bicaténaire est déroulé par l'action de I'ADN
gyrase et de I'hélicase, les régions monocaténaires sont recouvertes par des protéines SSB. La primase amorce périodiquement
les synthèses sur le brin retardé. Chaque moitié de la polymérase de réplication est un holoenzyme lié à son brin matrice par
une bride mobile constituée par les sous-unités β. Derrière la fourche de réplication, I'ADN polymérase I agit sur le brin
retardé pour éliminer l’ARN des amorces et le remplacer par de I'ADN, puis I'ADN ligase relie les fragments d'Okazaki.
(3).

La réplication de l’ADN démarre au locus oriC, la protéine DnaA se lie à oriC, ceci amorce le
désenroulement de la double hélice au site d’initiation. Ce désenroulement se produit sous l’action de
la protéine DnaB possédant une activité hélicase. Les deux brins séparés par la DnaB sont maintenus à
l’état monocaténaire grâce à des protéines se liant à l’ADN simple brin dites protéines SSB (de
"single- stranded binding proteins"). Le désenroulement de la double hélice de l’ADN produit des
tensions et aboutit à la formation de superenroulements en aval des fourches de réplication(,3).

Dr FENGHOUR
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
susceptibles de bloquer leur déplacement. Cette tension mécanique est éliminée par l’action de l’ADN
gyrase. Dans chacune des fourches de réplication, la primase synthétise un ARN amorce, une amorce
pour le brin avancé et une autre pour le brin retardé. Une ADN polymérase dimérique (ADN
polymérase III) catalyse l'élongation de I'ADN à partir de l’extrémité 3’ de l’amorce d’ARN. La
synthèse des deux brins avancé et retardé a probablement lieu dans un seul complexe multiprotéique, le
réplisome. La matrice du brin retardé doit former une boucle autour du complexe, les fragments
obtenus sont appelés fragments d’Okazaki. Dès que le fragment d’Okazaki atteint une longueur
donnée, l’ADN polymérase I retire l’amorce d’ARN et synthétise de l’ADN complémentaire pour
remplir la brèche formée par l’élimination de l’ARN. Finalement, les fragments sont reliés par l’ADN
ligase qui catalyse la formation des liaisons phosphodiesters entre l’extrémité 3’OH du brin en
croissance et l’extrémité 5’ phosphate du fragment d’Okazaki.
La réplication de l’ADN s’arrête lorsque le complexe de la polymérase atteint un site de terminaison
(ter). Des protéines Tus se fixent au site ter et stoppent la réplication. Au site de terminaison, les deux
molécules d’ADN filles sont attachées l’une à l’autre par une courte région d’ADN parental non
encore répliqué. La gyrase intervient à ce stade pour décaténer les duplexes circulaires (Figure 9).

Figure 9. Réaction de décaténation catalysée par

l’ADN gyrase d’E. coli.(3).

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 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE

II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN

1. DEFINITIONS DU GENE :
Le gène a été défini par différentes manières : les généticiens ont considéré le gène comme l’unité
structurale et fonctionnelle de l’hérédité, ou encore l’entité responsable des traits phénotypiques d’un
organisme. Avec la découverte et la caractérisation de l’ADN, le gène a été défini plus précisément
comme une séquence linéaire de nucléotides ou codons avec un point précis de départ et de
terminaison. Au départ, on pensait que les gènes ne contenaient que l’information nécessaire à la
synthèse des protéines, mais il s’est avéré que certains d’entre eux codent pour de l’ARNr ou de
l’ARNt. Dès lors, un gène peut être défini comme une séquence polynucléotidique codant pour un
polypeptide, un ARNt ou un ARNr.
L’existence d’un gène est habituellement révélée par des mutations qui provoquent un phénotype
mutant caractéristique. Ces mutations sont des marqueurs génétiques.

2. TYPES DE MUTATIONS :

Les mutations peuvent modifier le phénotype d’un micro-organisme de différentes manières. Les
mutations morphologiques changent la morphologie de la colonie ou la cellule du micro-organisme.
Les mutations létales entraînent la mort de l’organisme. Les mutations conditionnelles sont exprimées
seulement dans certaines conditions de l’environnement. Ainsi, une mutation conditionnelle létale chez
E. coli ne sera pas exprimée à basse température (conditions permissives), par contre elle s’exprimera
lorsque la bactérie sera cultivée à température élevée (conditions restrictives). Les mutations
biochimiques sont celles qui modifient la biochimie de la cellule. Puisque ces mutations inactivent
fréquemment une voie biosynthétique, elles rendent le micro-organisme incapable de croître sur un
milieu dépourvu du produit final de la voie de biosynthèse. Le mutant ne peut donc croître sur un
milieu minimum ; il exige la présence de suppléments nutritifs. De tels mutants sont appelés
auxotrophes, alors que les souches poussant sur milieu minimum sont appelées prototrophes. Un
mutant résistant est un type particulier de mutant biochimique qui a acquis la résistance à un agent
pathogène, une substance chimique ou un antibiotique.
Les modifications de l’ADN (mutations) ne produisent pas forcément un phénotype mutant, Certaines
mutations touchent des régions de l’ADN qui ne remplissent aucune fonction connue, ces mutations
sont dites silencieuses. D’autres mutations, qui modifient la dernière base de certains codons ne
changent pas l’acide aminé qu’ils spécifient dans une protéine. Enfin, certaines substitutions d’acides
aminés sont sans effet sur la fonction de la protéine dans laquelle elles apparaissent.(4).
La mutation permet la variabilité génétique au sein d’une espèce, et avec le temps, l’apparition d’une
nouvelle espèce. Les mutations changent la séquence des bases dans l’ADN soit par substitution,
Dr FENGHOUR -10-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
élimination ou addition d’un seul nucléotide (mutations ponctuelles), soit par insertion, inversion ou
délétion d’une séquence d’ADN.

3. NATURE MOLECULAIRE DES MUTATIONS

3.1. Mutations ponctuelles (Figure 11.a)

3.1.1. Substitutions
 Les mutations qui substituent une base à une autre base de même type (purine → purine ou
pyrimidine → pyrimidine) sont appelées transition.
 Les substitutions de type purine → pyrimidine ou vice-versa sont des transversions.
Ces mutations peuvent résulter d’erreurs de réplication. Ces erreurs ont lieu lorsque la base purique ou
pyrimidique d’un nucléotide servant de matrice prend une forme tautomérique rare. La tautomérisation
résulte de l’équilibre chimique entre deux isomères structuraux interconvertibles. Les bases existent
habituellement sous la forme amine ou cétone. Néanmoins, elles peuvent à certains moments prendre
une forme soit imine, soit énol. Ces changements tautomériques modifient les caractéristiques des
liaisons hydrogène des bases permettant des substitutions d’une purine par une purine ou d’une
pyrimidine par une autre pyrimidine (mutation de transition). Les mutations de transversions sont plus
rares en raison des problèmes stériques que soulève l’appariement d’une purine avec une purine ou
d’une pyrimidine avec une pyrimidine.
Les substitutions des bases sont des mutations ayant les effets les moins sévères ; la substitution du
troisième nucléotide de certains codons ne change pas l’acide aminé en question (substitution
silencieuse). La substitution d’un nucléotide a souvent comme effet de remplacer le codon d’un acide
aminé par un autre codon d’un autre acide aminé (mutation faux-sens). Les substitutions qui
produisent un codon non-sens spécifiant la terminaison de la traduction provoquent la synthèse d’un
produit presque toujours inactif (mutations non-sens).
3.1.2. Délétions/Additions
Les délétions ou additions d’un nucléotide dans une séquence codante provoquent un décalage du
cadre de lecture, modifiant à la fois la composition et la longueur du produit du gène : le signal de
terminaison normal n’est plus reconnu par la machinerie de traduction (produit plus long), ou un signal
de terminaison apparaît prématurément dans le cadre de lecture décalé (produit plus court).
3.2. Délétions, insertions, inversions et duplications (Figure 11.b)(5).
L’addition ou l’élimination d’un segment d’ADN donnent naissance à des mutations beaucoup plus
prononcées. Les délétions produisent souvent des phénotypes très marqués car elles éliminent tout ou
partie d’un gène, voire plusieurs gènes ou groupes de gènes adjacents. Les délétions peuvent
également créer de nouvelles juxtapositions de séquences pouvant conférer des propriétés nouvelles
aux mutants (ex. des fusions de gènes peuvent produire des protéines multifonctionnelles
performantes, et l’apparition de séquences promoteur peut provoquer l’expression de régions du
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 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
génome qui ne sont que peu ou pas exprimés autrement). Les insertions sont, dans la plupart des cas,
le fait de séquences spécifiques des éléments comme les transposons. Quand un segment d’ADN
s’insère dans un gène, il en interrompe la séquence codante et l’inactive. Les inversions sont beaucoup
mois fréquentes, elles peuvent aussi créer des propriétés nouvelles par de nouvelles juxtapositions. Il y
en a également des duplications, qui ont touché plusieurs régions du génome bactérien au
cours de
l’évolution. Ce type de remaniement chromosomique rend une bactérie partiellement diploïde (4).
!
3.3. Mutations reverses
Les mutations reverses établissent le phénotype sauvage. Il s’agit de mutations en retour qui se
produisent au même site de mutation initiale restaurant la séquence nucléotidique de l’allèle sauvage.
Une seconde mutation à un site distinct de celui de la mutation initiale peut parfois rétablir le phénotype
sauvage, on parle ici de la suppression ou de la pseudoréversion.

Figure 11: Schéma résumant les Modifications possibles des séquences d’ADN pouvant donner une mutation(5).

4. LES MUTATIONS SPONTANEES :

Les mutations spontanées apparaissent sans qu’il y ait exposition à des agents externes. Elles peuvent
résulter d’erreur dans la réplication de l’ADN (Figure 12), ou encore de l’action de transposons
(décrits plus loin).
Les mutations spontanées peuvent être ponctuelles (substitutions), elles peuvent apparaître aussi suite
au décalage du cadre de lecture causé par la délétion d’un segment d’ADN, ou encore suite à
l’insertion dans le gène de segments d’ADN (ex. transposition). Ce dernier type de mutation est le plus
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 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
fréquent chez E. coli et beaucoup d’autres bactéries.

Dr FENGHOUR -13-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 12. Un mécanisme par lequel des erreurs dans la réplication de l’ADN peuvent produire des mutations spontanées.
La réplication d’un seul brin est schématisée ; l’autre brin est répliqué normalement. L’erreur de réplication peut avoir lieu
dans les régions d’ADN contenant des séquences répétées en tandem (dans ce cas, GTC) quand une portion du brin
nouvellement synthétisé (bleu claire) forme une boucle simple brin. Ce glissement déplace le brin nouvellement synthétisé
en arrière le long du brin matrice (bleu foncé). Comme résultats, les enzymes de synthèse de l’ADN vont copier une région
du brin matrice deux fois, conduisant à l’augmentation de la langueur de l’ADN par neuf nucléotides dans cet exemple
(jaune). Le cycle suivant de réplication de l’ADN donnera naissance à une molécule d’ADN double brin normale, et une
molécule mutante contenant les nucléotides additionnels.(5).

5. MUTAGENESE (MUTATIONS INDUITES) :

Tout agent qui altère directement l’ADN, modifie sa chimie, ou interfère avec ses mécanismes de
réparation induira des mutations. Les agents mutagènes présentent une spécificité mutationnelle
caractéristique qui provient du type de modification qu’ils induisent, mais aussi de leur préférences
pour certains cites. Les mutagènes peuvent être classés selon leur mode d’action en :
5.1.1. Analogues de bases
Les analogues de bases ressemblent aux bases azotées normales et peuvent être incorporées dans la
chaîne polynucléotidique en croissance, au moment de la réplication. Après incorporation, ces
composés montrent un appariement différent de celui des bases qu’ils remplacent et peuvent provoquer
des substitutions. Parmi ces analogues de bases, le plus utilisé est le 5-bromouracile (5-BU), analogue
de la thymine. Cet analogue subit plus fréquemment que la base normale une modification
tautomérique de la forme normale cétonique en une forme énolique. Cette forme énolique établit des
ponts hydrogène comme la cytosine et appelle l’incorporation de guanine plutôt que d’adénine.
D’autres analogues de bases ont un mécanisme d’action similaire à celui du 5-BU(.5).
5.1.2. Mutagènes qui modifient les propriétés d’appariement des bases
Le mésappariement spécifique se produit lorsqu’un mutagène modifie la structure d’une base
modifiant ainsi ses propriétés d’appariement, les transitions apparaissent au cours des réplications
Dr FENGHOUR -14-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
ultérieures de l’ADN. L’oxydation par l’acide nitreux provoque la désamination de la cytosine qui
produit de l’uracile, et celle de l’adénine qui produit de l’hypoxanthine. La chaleur produit aussi la
désamination de la cytosine. Les agents alkylants modifient également les propriétés d’appariement des
bases, l’hydroxylamine par exemple hydroxyle l’azote en C-4 de la cytosine, l’amenant à s’apparier
comme la thymine. Les agents alkylant les plus couramment utilisés, à côté de l’hydroxylamine, sont
l’éthylméthane sulfonate (EMS) (Figure 13), le diméthylsulfonate (DMS), la N- méthyl-N’-nitro-N-
nitrosoguanidine (MNNG) et les nitrosamines.

Figure 13. Mutations ponctuelles induites par l’éthylméthane sulfonate (EMS). (a) L’EMS provoque l’alkylation de la
guanine au niveau de l’oxygène 6 du noyau purinique formant le O6-ethylguanine (Et-G) ayant la propriété de s’apparier à
la thymine. (b) Deux cycles de réplication de l’ADN contenant l’Et-G produisent un ADN mutant dans le quel une paire
de
bases G-C est remplacée par une paire A-T.(6).
Dr FENGHOUR -15-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
5.1.3. Agents intercalants
Les agents intercalants déforment l’ADN et provoquent l’insertion ou la délétion d’une seule paire de
nucléotides. Les acridines dont la proflavine, peuvent intercaler leurs cycles aromatiques entre les
bases de l’ADN et provoquer des glissements d’un brin d’ADN par rapport à un autre, générant ainsi
des délétions ou additions de nucléotides.
5.1.4. Mutagenèse qui créent des lésions dans l’ADN
Beaucoup de substances mutagènes comme les cancérigènes,
altèrent les bases d’une manière si importante.
Les radiations UV provoquent différents types de lésions dont la
dimérisation de pyrimidines voisines qui empêche leur appariement
avec les purines correspondantes (Figure 14). Ces dimers
constituent un obstacle à la réplication de l’ADN et sont létales s’ils
ne sont pas éliminés.
Les agents cancérogènes comme l’aflatoxine B1 et le benzopyrène
agissent après avoir été métabolisés en se fixant sur l’ADN et
constituent également des obstacles bloquant la réplication de
l’ADN.
Les radiations X induisent la formation de radicaux libres
extrêmement réactifs qui provoquent des lésions très graves dans
l’ADN, notamment des cassures simple et double brin. Le religation
des fragments d’ADN ainsi produits entraîne des de grandes Figure 14. L’irradiation par les UV
provoque un double pontage entre deux
délétions, des duplications et des inversions. Ces lésions ne sont que thymines adjacentes. La création de
liaisons covalentes entre les atomes de
très rarement réparables et sont létales lorsqu’elles touchent des carbone 5 et 6 des noyaux pyrimidiques
forme un dérivé du cyclobutane.
régions essentielles du chromosome. Les radiations UV induisent L’appariement normal de ces bases est
rompu en présence du dimère(2).
également le même type de lésion(.6).
5.1.5. Mutagenèse par des éléments génétiques transposables

Les éléments génétiques transposables sont des segments mobiles d’ADN, capables de se transposer
d’un site chromosomique à un autre, mais aussi d’un plasmide vers le chromosome ou vice-versa, sans
qu’il y ait d’homologie de séquence importante entre l’élément et le site d’insertion. L’absence de
spécificité d’insertion permet de mutagéniser pratiquement tous les gènes du chromosome bactérien.
L’incorporation d’un transposon inactive complètement la fonction du gène.

6. DETECTION ET ISOLEMENT DES MUTANTS :

Lorsqu’on veut étudier des mutants de bactéries, on doit pouvoir les détecter aisément même s’ils sont
rares, on doit également les séparer efficacement des cellules parentales et des autres mutants.
Dr FENGHOUR -16-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
De nombreux types de mutants peuvent facilement être isolés : des mutants auxotrophes, des mutants
qui ne peuvent fermenter certaines sources de carbone, des mutants qui résistent aux antibiotiques ou à
des substances toxiques tels que les métaux lourds, ou encore des mutants touchés dans un processus
cellulaire important ou vital.
6.1. Détection des mutants
Les mutations sont des événements rares (une mutation pour 107 à 1011 cellules), leur détection
nécessite des systèmes très sensibles. En induisant des mutations par un agent mutagène, on peut
augmenter la probabilité d’obtenir des changements spécifiques à une fréquence allant de 1 pour 10 3 à
1010. La détection des mutations nécessite également qu’on dispose de populations importantes, les
bactéries satisfont parfaitement à cette condition.
Les systèmes de détection chez les bactéries sont simples et directes, ces organismes haploïdes vont
exprimer tout nouvel allèle même s’il s’agit d’une mutation récessive. Deux systèmes sont utilisés pour
la détection des mutants :
6.1.1. Milieux indicateurs
La fermentation de certains hydrates de carbone modifie le pH (acidification). Certains milieux
contiennent des indicateurs colorés sensibles à de telles modifications. Ainsi, sur le milieu Mc Conkey
contenant du lactose, les colonies de cellules qui fermentent le lactose sont pourpres, les autres qui ne
le fermentent pas sont blanches.
D’autres milieux contiennent des substances très spécifiques dont l’hydrolyse libère un groupement
coloré. C’est le cas de l’X-gal, un analogue synthétique des β-galactosides. L’hydrolyse de l’X-gal par
la β-galactosidase (produit du gène lac Z) libère du 5-bromo-4-chloro-indigo d’une couleur bleue
foncée. Les colonies de type sauvage sont bleues, celles des mutants lac Z sont blanches(.6).
6.1.2. Répliques sur boite (ou sur velours)
Cette méthode permet d’analyser un nombre élevé de colonies pour la présence de mutations.
Une culture contenant des cellules sauvages et mutantes est étalée sur un milieu riche. Après
développement des colonies, une pièce de velours stérile tendu sur un support cylindrique est appliqué
à la surface de la gélose pour y prélever des cellules de chaque colonie. Il est ensuite mis en contact
avec la surface d’autres boites de milieux de compositions différentes, en gardant la même position. La
comparaison de la croissance des colonies sur les différents milieux permet le repérage et une première
caractérisation des mutants (Figure 15).

Dr FENGHOUR -17-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE

6.2. Sélection des mutants

Une sélection sera efficace si l’on connaît les conditions d’incubation permettant une croissance
appropriée du mutant.
Les mutants auxotrophes sont décelés par l’absence de croissance du mutant sur un milieu minimum
dépourvu du nutriment dont la mutation empêche la synthèse. Les mutations qui confèrent la résistance
aux antibiotiques ou à une substance toxique sont sélectionnées directement par étalement sur un
milieu contenant l’antibiotique ou la substance toxique en question. Les mutations touchant un
processus vital peuvent être facilement décelées dans les conditions d’environnement dites non-
permissives dont le phénotype résultant est la mort cellulaire. Les mutants correspondant sont produits
et conservés dans des conditions permissives, mais analysés dans des conditions non-permissives.(6).
6.3. Détection du pouvoir cancérigène (Test de Ames)
Les substances toxiques, cancérigènes sont considérées toutes comme mutagènes. L’étude de ces
agents est d’une grande importance ; les identifier dans l’environnement nous permettra de les éviter.
Le caractère mutagène de la plupart ces substances a servi de base à des tests de détection qui
exploitent la rapidité de croissance des populations bactériennes. Le test de Ames, décrit par Bruce
Ames dans les années 1970 est le plus utilisé dans ce domaine. Le test de Ames est basé sur la mesure
des taux de réversion de diverses souches de Salmonella typhimurium, chacune ayant une mutation
différente sur l’opéron de la biosynthèse de l’histidine. Ces bactéries sont donc incapables de
synthétiser l’histidine (His-), leur culture n’est donc possible que sur des milieux pourvus d’histidine.
La présence d’un agent mutagène provoque chez ces bactéries une mutation reverse (His +) qui permet

Dr FENGHOUR -18-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
aux cellules mutantes de croître sur un milieu dépourvu d’histidine. Un composé est donc considéré
mutagène s’il permet la croissance d’une souche de S. typhimurium (His-) sur un milieu sans histidine
(Figure 16). La disponibilité de diverses souches de S. typhimurium (His-), ayant des mutations
différentes sur l’opéron de synthèse de l’histidine permet de préciser le type de mutation induite.
En plus de la substance à tester, un extrait de foie de mammifères est souvent ajouté au milieu, l’extrait
hépatique permet l’activation d’agents mutagènes qui requièrent une modification pour induire leur
pouvoir cancérigène. Ce phénomène a lieu normalement lorsque les substances étrangères sont
métabolisées dans le foie. Puisque les bactéries n’ont pas ce système, on ajoute l’extrait de foie afin de
mimer les transformations ayant lieu chez les mammifères. Cette action permet de distinguer les
composés qui possèdent une action mutagène intrinsèque de ceux qui requièrent une modification(.5).

Figure 16. Test de Ames. Les bactéries His- et l’agent étudié pour son pouvoir mutagène sont mélangés dans un milieu
contenant une petite quantité d’histidine. Ce mélange (M) est ensuite étalé sur un milieu synthétique sans histidine, le tout
est incubé à 37°C pendant 48 à 72h. Les bactéries entament leur croissance qui est rapidement limitée par l’épuisement de
l’histidine du milieu. Seules continuent à croître les réverses (His +). L’effet mutagène de la substance étudiée est d’autant
plus important que le nombre de colonies développées en sa présence soit élevé, par rapport au témoin. Il est aussi
proportionnel à la concentration de l’agent mutagène.(7)
.
7. CORRECTION DES MUTATIONS ET REPARATION DE L’ADN :
Le taux des mutations chez les bactéries est déterminé par l’efficacité de la réplication de l’ADN, de la
survenue des lésions de l’ADN et de l’efficacité des mécanismes de la réparation de l’ADN
endommagé. L’ADN polymérase I d'E. coli a une fonction de relecture et une fonction de correction
Dr FENGHOUR -19-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
sur épreuve, elle serait activée lorsque l’appariement qui vient de s’effectuer n’est pas conforme. Cette
fonction est assurée par une activité exonucléase 3’ → 5’, qui fonctionne donc en sens inverse de la
direction de la synthèse.
7.1. Elimination des défauts d’appariement
Bien que les bactéries possèdent le système de correction sur épreuve assuré par les ADN polymérases,
certains mésappariements échappent à cette correction.
Les cellules bactériennes possèdent un systèmes de réparation des mésappariements qui reconnait et
répare les mauvais appariements des bases de l’ADN, ce système est appelé système de correction des
mésappariements dirigée par la séquence GATC méthylée, ou encore le système MutHLS. Mais
comment ce système peut-il distinguer le brin normal du brin muté et réparer ce dernier pour donner
des paires de bases proprement appariées?
Dans l’ADN d’E. coli, les résidus adénine dans une séquence GATC sont méthylés en position 6. Lors
de la réplication de l’ADN, les polymérases incorporent de l’adénine non-méthylée, dans une molécule
d’ADN nouvellement répliqué, seul le brin parental contient les résidus adénine méthylés. Les
adénines des séquences GATC du brin fils sont méthylées après un décalage de quelques minutes par
une Dam méthyltransférase. Durant cette période de décalage, la molécule d’ADN nouvellement
repliquée contient des séquences GATC semi-méthylées :

Brin parental
Brin fils

Une protéine appelée MutH d’E. coli qui se lie spécifiquement aux séquences semi-méthylées, est
capable de distinguer entre le brin parental méthylé et le brin fils non-méthylé. Si une erreur
d’appariement survient au voisinage d’une séquence GATC, une autre protéine, MutS, se lie au site du
mésappariement (Figure 17). La fixation de MutS provoque la fixation de MutL, une protéine de
liaison qui relie une Muts à une MutH voisine. Cette liaison croisée active une activité endonucléase
latente de MutH qui coupe spécifiquement le brin non-méthylé. Suite à cette incision initiale, le
segment du brin fils contenant la base erronée est excisé et remplacé par une séquence correcte
d’ADN.(7).
Les souches d’E. coli qui manquent des protéines MutS, MutH et MutL ont des taux de mutations
spontanées plus élevés que les cellules de type sauvage. Les souches Dam- qui ne peuvent pas
synthétiser la Dam méthyltransférase ont aussi des taux élevés de mutations spontanées. Les souches
Dam- ne peuvent pas méthyler l’adénine des séquences GATC, le système MutHLS ne peut pas
distinguer entre la matrice et le brin nouvellement synthétisé et ne peut donc pas réparer proprement
les mésappariements.
Dr FENGHOUR -20-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 17. Model de la correction des

mésappariements par le système MutHLS
d’E. coli.
Ce système de réparation intervient juste
après l’incorporation d’une base erronée,
avant que le brin nouvellement synthétisé
soit méthylé. La protéine MutH se lie
spécifiquement à une séquence GATC
semi-méthylée, MutS se lie au site du
mésappariement. La fixation simultanée de
la protéine MutL sur MutS et au voisinage
de MutH active l’activité endonucléase de
cette dernière, qui coupe alors le brin non
méthylé (brin fils) au niveau de la
séquence GATC. La partie du brin fils
contenant le mésappariement est excisée,
ceci est suivi par resynthèse de l’ADN, sa
continuité est rétablie par l’action de
l’ADN ligase, le brin
fils est ensuite méthylé(. 7)

7.2. Réversion des dommages chimiques (Réparation des lésions de l’ADN)

7.2.1. La réparation des distorsions par excision-resynthèse chez E. coli
Les cellules utilisent la réparation par excision pour réparer les régions de l’ADN contenant des bases
modifiées qui distordent localement la molécule de l’ADN. La clé de ce type de réparation est la
capacité de certaines protéines de glisser le long de la molécule d’ADN double brin cherchant les
formes irrégulières dans la double hélice. Ce système de réparation concerne les lésions affectant un
seul brin, principalement dues à la formation accidentelle de dimères C-C ou T-T. Ces dimères
entraînent une distorsion localisée de la structure hélicoïdale de l’ADN, avec la rupture à ce niveau des
liaisons hydrogène entre les deux brins de l’ADN. L’exemple le plus illustratif de ce système de
réparation est le système UvrABC d’E. coli (Figure 18)
Un complexe contenant deux molécules de la protéine UvrA et une molécule d’UvrB se forme et se lie
à l’ADN. La formation de ce complexe et sa fixation sur l’ADN nécessitent de l’ATP. Il parait que le
complexe UvrA-UvrB se lie initialement à un segment d’ADN non endommagé et se déplace le long

Dr FENGHOUR -21-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
de l’hélice de l’ADN jusqu’à ce qu’il reconnaisse une distorsion. La molécule d’ADN subit un

Dr FENGHOUR -22-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
changement de conformation ATP-dépendant au niveau de la région endommagée liée au complexe
UvrA-UvrB. Ce changement conformationnel produit une courbure dans le squelette de l’ADN. Le
dimère UvrA se dissocie, la protéine UvrC ayant une activité endonucléase se lie ensuite au site
endommagé. L’interaction de l’UvrC avec l’ADN courbé aurait créé un espace dans l’ADN permettant
aux résidus catalytiques de l’enzyme d’accéder à leur cible. La position précise du site de clivage est
déterminée par la nature de la lésion de l’ADN. Dans le cas des dimères thymine-thymine, l’UvrC
coupe l’ADN de part et d’autre de la lésion, elle hydrolyse le 8ème lien phosphodiester situé en 5’, et le
4ème au 5ème lien situé en 3’ de la lésion. Le fragment coupé est éliminé par une hélicase puis dégradé.
La brèche ainsi crée est comblée par l’action combinée de l’ADN polymérase I et l’ADN ligase.

Figure 18. Mécanisme de la

réparation par excision de l’ADN
par le système UvrABC d’E. coli.
Deux molécules de UvrA et une de
UvrB forment un complexe qui se
déplace aléatoirement le long de
l’ADN (étapes 1 et 2). Une fois le
complexe rencontre une lésion, des
changements conformationnels de
l’ADN entraîne sa dénaturation
locale et une courbure de 130°
(étape3). Le dimère UvrA se
dissocie (étape4) et une endonucléase
UvrC se lie et coupe le brin
endommagé en deux sites séparés
par 12 à 13 bases (étapes 5 et
6).Ensuite, UvrB et UvrC se
dissocient et une hélicase II déroule
la région endommagée (étape7)
libérant le fragment simple brin,
contenant la lésion, qui sera dégradé
en mononucléotides. Le vide
résultant est comblé par action de
l’ADN polymérase I et la continuité
de l’ADN est rétablie par l’ADN
ligase.(8).

Dr FENGHOUR -23-
 Chapitre II. MUTATIONS ET MECANISMES DE REPARATION DE L’ADN GENETIQUE MICROBIENNE
7.2.2. La photoréactivation
Le système de photoréactivation des dimères de thymine est basé sur la lumière visible qui active
l’ADN photolyase qui dépolymérise les dimères cyclobutane-pyrimidine produits par la lumière
ultraviolette. L’enzyme ADN photolyase n’absorbe pas la lumière par elle-même, elle ne se fixe non
plus sur un composé qui absorberait la lumière, c’est le complexe formé par l’ADN et cette enzyme
qui, d’une façon non encore élucidée, absorbe la lumière et utilise son énergie pour cliver les liaisons
C-C des anneaux cyclobutyl.
7.2.3. Réparation par recombinaison
La réplication de l’ADN est bloquée par les photodimères ou
les adduits volumineux. S’ils n’ont pas été éliminés par
excision, la réplication reprend au-delà du site de lésion,
faisant apparaître une discontinuité dans le brin néosynthétisé.
Une recombinaison entre les deux bras de la fourche de
réplication peut compléter ce brin en y introduisant la région
équivalente provenant de l’autre brin parental. Cette région Figure 19. Réparation d’une brèche
est resynthétisée en prenant le brin néosynthétisé comme monocaténaire par recombinaison. (a)
Lésion dans l’ADN parental qui provoque
matrice (Figure 19). Ce mécanisme fait intervenir plusieurs une interruption locale de la réplication et
l’apparition d’une brèche dans le brin
protéines parmi lesquelles RecA qui apparie les séquences répliqué ; (b) L’autre brin parental est
introduit dans la brèche et ligaturé avec le
flaquant la lésion avec leur complément intact. brin néosynthétisé ; (c) La brèche crée dans
le brin parental est comblée sous l’action de
l’ADN polymérase I(. 8).
7.3. La réponse SOS

Les lésions trop importantes de l’ADN rendent les systèmes de réparation précédemment décrits
inopérants. Dans une situation pareille, la cellule utilise un système de réparation inductible dit
Système SOS pour dépasser la lésion. La réponse SOS est un processus complexe, parfois aussi appelé
réparation infidèle ou réparation mutagène parce qu’il génère des erreurs en réparant les lésions.
Les lésions importantes de l’ADN laissent de nombreuses brèches aux quelles se lie la protéine RecA
initiant l’échange des brins, en même temps, RecA détruit la protéine LexA par son activité
protéolytique, LexA étant un répresseur d’un nombre de gènes impliqués dans la réparation et la
synthèse de l’ADN. La destruction de LexA permet l’expression de ces gènes accélérant les processus
de réplication et de réparation. Parmi les gènes SOS, umu D et umu C codent pour des produits qui
permettent à la réplication de franchir l’obstacle constitué par la lésion aux prix d’une diminution de
fidélité. Parmi les gènes SOS figurent également les gènes uvr A, B, C qui codent pour l’endonucléase
du système d’excision, et rec A lui-même. Ces gènes sont déjà exprimés dans des conditions normales
mais la réponse SOS accroît encore leur expression(.6).

Dr FENGHOUR -22-
 Chapitre III. LES PLASMIDES GENETIQUE MICROBIENNE

III. LES PLASMIDES

Les plasmides sont des petites molécules d’ADN circulaires qui peuvent exister indépendamment des
chromosomes de l’hôte et sont présentes dans de nombreuses bactéries (on trouve aussi des plasmides
chez la levure et chez certains protozoaires). Les plasmides ont leur propre origine de réplication, se
répliquent de façon autonome et sont transmis aux cellules filles de manière stable. Les plasmides
portent un nombre de gènes réduit, généralement moins d’une trentaine. Leur information génétique
n’est pas essentielle pour l’hôte et les bactéries qui en sont dépourvues vivent normalement. Les
plasmides peuvent exister en une seule copie par cellule (plasmides à copie unique) comme ils peuvent
se présenter au nombre de quarante copies ou plus par cellule (plasmides à copies multiples). Un grand
nombre de propriétés intéressantes de quelques espèces bactériennes (en médecine, agriculture,
industrie et environnement) sont déterminées par les plasmides, relevons parmi ces propriétés : des
formes de virulence (production d’exotoxines, d’hémolysine, résistance aux antibiotiques,
tumorigénicité) ; formation de nodules sur les racines de légumineuses par les souches de Rhizobium
fixatrices d’azote ; production d’antibiotiques, dégradation des polluants, conjugaison bactérienne..
La présence des plasmides est facilement mise en évidence par électrophorèse sur gel d’agarose de
l’ADN extrait des bactéries. Les différentes molécules d’ADN (chromosome et plasmides éventuelles)
migrent différentiellement dans le gel d’agarose en fonction de leur taille et de leur forme ; plus l’ADN
est petit plus vite il migre.

1. STRUCTURE DES PLASMIDES

Les plasmides sont tous des molécules d’ADN bicaténaire extrachromosomique, ils sont de tailles
différentes variant entre 5.105 à 4.108 Daltons, soit environ 1/1000 à 1/20 de la taille du chromosome
bactérien (la taille du chromosome bactérien est d’environ 2,9.10 9 Daltons). Ils sont formées de
séquences de nucléotides sans homologie avec le chromosome bactérien, ce qui montre qu’ils lui sont
étrangers.
Les plasmides ont une organisation génétique modulaire, chaque module étant un segment d’ADN
comprenant un ou plusieurs gènes qui confèrent une propriété particulière au plasmide ou à la cellule
hôte. Le site rep par exemple est un site essentiel dans le plasmide, responsable de sa réplication ; le
module tra est responsable du transfert conjugatif (Facteur F) ; d’autres modules sont responsables de
la résistance aux antibiotiques ou aux métaux lourds (Facteurs R). Beaucoup de plasmides contiennent
des éléments génétiques transposables, d’autres contiennent des gènes codant pour des toxines
(Plasmides de virulence)(.7).
Certains plasmides ne confèrent aucun phénotype particulier à la cellule hôte et ne sont décelés que
lors de l’analyse de l’ADN bactérien, ces plasmides sont dits cryptiques.

Dr FENGHOUR -22-
 Chapitre III. LES PLASMIDES GENETIQUE MICROBIENNE
2. LES TYPES DE PLASMIDES

Selon les types et les propriétés de modules ou de gènes portés par les plasmides, on peut distinguer
différents types qu’on décrira les plus importants (Tableau 2):

2.1. Facteur de fertilité (facteur F)

Ce type de plasmides joue un rôle important dans la

conjugaison chez E. coli et fut le premier à être
décrit. Le facteur F est une molécule d’ADN
d’environ 100 Kpb, il porte les gènes nécessaires à
l’attachement cellulaire et à son transfert entre
souches bactériennes spécifiques au cours de la
conjugaison. L’information requise pour le transfert
du plasmide est contenue dans l’opéron tra qui
contient au moins 28 gènes. Beaucoup de ces gènes
déterminent la formation de pili sexuels qui attachent
la cellule F+ (cellule donneuse contenant un plasmide
F) à une cellule F-. Les autres produits de gènes
Figure 20. Carte génétique du plasmide F montrant
participent au transfert de l’ADN. Le facteur F la position relative des gènes codants pour les
contient également plusieurs séquences appelées fonctions du transfert (tra), d’inhibition de fertilité
(finP), origine de réplication (oriT), incompatibilité
"séquences d’insertion" qui permettent l’intégration (inc), réplication (rep), et inhibition des phages
(phi). La position des séquences d’insertion (IS2,
du plasmide dans le chromosome de la cellule hôte IS3 et γδ) est également montrée.(9).
(Figure20).

2.2. Facteurs de résistances (facteurs R)

Les facteurs ou plasmides R confèrent la résistance aux antibiotiques chez les cellules bactériennes qui
les contiennent ; ils ont des gènes qui codent pour des enzymes capables d’inactiver ou de modifier les
antibiotiques. Certains plasmides R possèdent un seul gène de résistance alors que d’autres en ont
jusqu’à huit. Souvent, les gènes de résistance sont contenus dans un transposon, il est donc possible
pour des souches bactériennes d’acquérir rapidement des plasmides à résistance multiple. De nombreux
plasmides R sont également des plasmides conjugatifs pouvant se propager dans une population
bactérienne. Les facteurs F non conjugatifs passent souvent d’une bactérie à l’autre durant une
conjugaison promue par un autre plasmide. Le transfert facile de ces facteurs R entre espèces favorise
la propagation de la résistance. Lorsqu’un patient consomme des quantités importantes d’antibiotiques,
E. coli et d’autres bactéries porteuses de facteurs R sont sélectionnées et deviennent prévalentes. Les
facteurs R peuvent
alors être transférés à des genres plus pathogènes tels que Selmonella ou Shigella entraînant des
Dr FENGHOUR -23-
 Chapitre III. LES PLASMIDES GENETIQUE MICROBIENNE
problèmes de santé publique encore plus graves(.8).

Dr FENGHOUR -24-
 Chapitre III. LES PLASMIDES GENETIQUE MICROBIENNE
2.3. Les plasmides Col
Les plasmides Col portent des gènes codant pour des bactériocines qui sont des protéines bactériennes
qui détruisent d’autres bactéries donnant aux cellules qui les hébergent un avantage compétitif.
Les bactériocines agissent uniquement contre des souches apparentées, elles tuent souvent les cellules
en formant des canaux dans la membrane plasmique, augmentant sa perméabilité. Elles peuvent
également dégrader l’ADN et l’ARN ou hydrolyser les peptidoglycanes et fragiliser la paroi cellulaire.
Manifestement, l’hôte n’est pas affecté par les bactériocines qu’il produit. Certains plasmides Col sont
conjugatifs et peuvent en plus porter des gènes de résistance.

2.4. Les plasmides de virulence

Ces plasmides peuvent porter des gènes codant pour des toxines rendant la bactérie qui les porte
pathogène. La pathogénicité de ces bactéries est accrue si elles sont résistantes aux défenses de l’hôte.

2.5. Les plasmides métaboliques

Ces plasmides portent des gènes d’enzymes qui métabolisent des substances telles que des composés
aromatiques (toluène), des pesticides (acide 2, 4-dichlorophénoxyacétique) et des sucres (lactose).
Des plasmides métaboliques portent même des gènes nécessaires à certaines souches de Rhizobium
pour induire la nodulation chez les légumineuses et effectuer la fixation d’azote(.8).

3. REPLICATION DES PLASMIDES

La réplication des plasmides est initiée au niveau d’origines fixes. Les petits plasmides ont une seule
origine de réplication, les grands ont plusieurs origines de réplication, mais la plupart d’entre eux n’en
utilisent qu’une seule.
La réplication de certains plasmides est unidirectionnelle, pour d’autres elle est bidirectionnelle. Elle
peut être assurée entièrement par les fonctions de la cellule hôte ou dépendre en partie des fonctions
plasmidiques.
La réplication des grands plasmides est synchrone avec celle du chromosome de la cellule hôte, cette
dernière qui n’en contient qu’une à deux exemplaires. Ce n’est pas le cas des petits plasmides qui se
répliquent indépendamment et sans synchronisation avec la multiplication du chromosome de la cellule
hôte, le nombre de copies est plus élevé (10 à 50).

4. TRANSFERT

Les plasmides sont transmis verticalement aux cellules filles, normalement en nombre égal au moment
de la division cellulaire. Ils sont également transmis horizontalement ; c'est-à-dire de cellule à cellule,
présentes dans le même milieu et appartenant ou non à la même espèce. Dans ce cas, le transfert se fait
selon deux mécanismes : la conjugaison et la mobilisation.

Dr FENGHOUR -25-
 Chapitre III. LES PLASMIDES GENETIQUE MICROBIENNE
4.1. La conjugaison

Certains plasmides sont conjugatifs, ce qui signifie qu’ils sont aptes à effectuer leur propre transfert
durant le processus de conjugaison entre deux cellules. Ceci implique un contact physique entre les
deux cellules, durant lequel la bactérie donatrice transfert une copie d’ADN de son plasmide à une
bactérie réceptrice.

Ce mécanisme concerne généralement les plasmides de grande taille qui sont peu nombreux et codent
en principe pour des propriétés importantes. Les plasmides conjugatifs les mieux connus sont les
facteurs F issus d’E. coli.

4.2. La mobilisation

D’autres types de plasmides sont non conjugatifs, ils sont plus petits et bien plus nombreux dans la
cellule bactérienne. Ils sont incapables d’assurer leur propre transfert qui ne peut se faire que par la
mobilisation d’un plasmide conjugatif, cohabitant dans la même cellule.

En général, la mobilisation implique l’intégration, c'est-à-dire une insertion par liaison covalente du
plasmide non conjugatif au plasmide conjugatif, donnant ainsi un ADN plasmidique hybride capable
de conjugaison. Mais dans certains cas, la mobilisation se fait sans intégration, la liaison entre les deux
plasmides est donc transitoire.

5. GROUPES D’INCOMPATIBILITE

Les transferts sont l’élément principal de la dissémination des plasmides, mais ces derniers ne sont pas
transmis au hasard. Il existe parmi eux des groupes d’incompatibilité, génétiquement contrôlés qui
induisent des transferts sélectifs. C'est-à-dire que la présence dans une bactérie de plasmides
appartenant à un groupe d’incompatibilité donné empêche l’entrée d’autres plasmides, de nature
définie et appartenant à d’autres groupes d’incompatibilité, avec lesquels ils ne peuvent coexister dans
la même cellule.

Les groupes d’incompatibilité sont nombreux (plus de 25 chez E. coli seule) et sont plus ou moins
spécifiques d’espèce. Les plasmides ubiquitaires peuvent se transférer chez une grande variété
d’espèces de bactéries à GRAM négatif (ex. groupes de plasmides P, Q et W), la dissémination
d’autres groupes de plasmides est par contre beaucoup plus restreinte(.3).

Dr FENGHOUR -26-
 Chapitre IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES GENETIQUE MICROBIENNE

IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES

1. DEFINITION ET GENERALITES
Les éléments génétiques transposables ou éléments génétiques mobiles sont des segments d’ADN qui
se déplacent dans le génome, ils ont une capacité remarquable de translocation. Ils se rencontrent chez
la plupart des organismes, des bactéries aux eucaryotes supérieurs.
Les éléments transposables jouent un rôle important dans les variations génétiques individuelles, c'est-
à-dire au niveau d’une même cellule par la redistribution des gènes et sans rapport avec le transfert
d’éléments génétiques d’une cellule à une autre.
Contrairement à d’autres mécanismes qui réorganisent l’ADN, la transposition ne requiert pas de zones
étendues d’homologie entre le transposon et son site de destination.
Les éléments transposables sont essentiellement des parasites moléculaires, qui ne semblent avoir
aucune fonction spécifique dans la biologie de leurs organismes hôtes, mais maintiennent seulement
leur propre existence. C’est pour cette raison que Francis Crick les a appelé " ADN égoïste".
Les éléments transposables diffèrent des phages, car ils n’ont pas le cycle biologique typique des virus,
et des plasmides, puisqu’ils sont incapables de se répliquer de manière autonome et d’exister
indépendamment du chromosome.
Les éléments transposables furent découverts dans les années 1940 par Barbara McClintock, au cours
de ses études de la génétique du maïs, une découverte qui lui valut le prix Nobel en 1983. Ils furent
étudiés abondamment chez les bactéries et les virus.(9).

2. GROUPES DE TRANSOSONS
Les éléments génétiques transposables bactériens se répartissent en trois groupes principaux, selon leur
structure génétique et leur mode de transposition :

2.1. Les séquences d’insertion et les transposons composites

Les éléments transposables les plus simples sont les séquences d’insertion ou éléments IS. Un élément
IS est une courte séquence d’ADN (de 750 à 1 600 pb) contenant uniquement les gènes qui assurent la
transposition, et flanquée à chaque extrémité par des séquences nucléotidiques identiques ou très
similaires appelées séquences répétées inverses ou IR (Figure 21). Chaque type d’IS a des séquences
IR qui lui sont propres. Entre les séquences IR se trouve un gène qui code pour une enzyme appelée
transposase nécessaire à la transposition. Chaque type de ces éléments d’insertion est désigné par le
préfix IS suivi d’un numéro. La transposition de ces éléments suit souvent un mécanisme conservatif.

Figure 21. Structure générale d’un

élément IS bactérien.(9).

Dr FENGHOUR -27-
 Chapitre IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES GENETIQUE MICROBIENNE
Les transposons composites contiennent, en plus des gènes de transposition, autres gènes, par exemple
des gènes de résistance aux antibiotiques ou des gènes de toxines. Les transposons composites ont
souvent une région centrale contenant les gènes supplémentaires, flanqués de part et d’autres par des
éléments IS (Figure 22). Les noms des transposons composites commencent par le préfix Tn. On
pense que les transposons composites se forment lorsque deux éléments IS s’associent avec un
segment d’ADN contenant un ou plusieurs gènes.(10).

Figure 22. Structure générale du

transposon composite Tn9 d’E. coli
(10).

2.2. Les éléments de la famille du transposon 3 (Tn3)

Les éléments transposables de la famille de Tn3 contiennent, en plus d’un gène de transposase (tnp A),
un gène de résolvase (tnp R) ; une enzyme qui effectue une recombinaison spécifique lors de la
transposition, ainsi que des gènes de résistance à des antibiotiques ou à des métaux lourds. La
transposition de ces éléments suit un model réplicatif.

2.3. Le phage Mu et autres types de prophages apparentés

La multiplication du phage Mu et autres phages apparentés se fait par transposition réplicative avec
formation d’un co-integrat intermédiaire. Plusieurs cycles de transposition produisent une centaine de
copies du génome viral. En plus des protéines codées par le phage, la transposition de Mu dépend des
fonctions réplicatives de l’hôte.(10).

3. MECANISMES DE TRANSPOSITION

Il existe deux modes de transposition : la transposition réplicative et la transposition conservative.

3.1. La transposition conservative

Ce mécanisme concerne surtout les éléments d’insertion IS ( Figure 24). L’élément est excisé et inséré
dans un autre site. L’excision est assurée par la transposase. L’ADN hôte est également coupé.
L’élément transposable s’insère au niveau du site de clivage, il est ensuite ligaturé à un brin d’ADN de
l’hôte à chaque extrémité, laissant deux séquences simple-brin qui seront remplies par la suite donnant
naissance à des séquences répétées de l’ADN de l’hôte encadrant les deux extrémités de l’élément
transposé(.8).

Dr FENGHOUR -28-
 Chapitre IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 23.
Model de la transposition conservative des
séquences IS des bactéries.
Etape1: Une transposase, codée par
l’élément IS (IS10 dans cet exemple), coupe
les deux brins de l’ADN donneur entre les
séquences répétées directes terminales et les
séquences répétées inverses excisant
l’élément IS. A un site aléatoire (séquence
cible), la transposase coupe l’ADN cible
générant des extrémités cohésives.
Etape2 : La ligature des extrémités 3’ de
l’élément IS excisé et de l’ADN cible est
également catalysée par la transposase.
Etape3: Après ligature, des vides de 9 pb
sont remplis par une ADN polymérase
cellulaire, et finalement, une ADN ligase
cellulaire forme les liaisons 3’→5’
phosphodiester entre les extrémités 3’ de
l’ADN cible et 5’ de l’élément IS. Ce
processus résulte en une duplication de la
séquence cible de part et
d’autre de l’élément IS inséré.(7).

3.2. La transposition réplicative

Dans ce type de transposition, le transposon original reste au site parental, pendant qu’une copie
répliquée s’insère dans l’ADN cible (Figure 24a). Cette transposition implique des événements
d’autoréplication et de recombinaison. L’exemple le plus connu est celui du transposon Tn3 dont les
étapes de transposition sont les suivantes :

1. Deux coupures simple brin, une sur chaque brin, éloignés de quelques bases sont pratiquées sur la
séquence de l’ADN cible. L’ADN donneur subit les mêmes coupures simples brins de part et
d’autre du transposon.

2. Chaque extrémité libre du transposon est ligaturée avec l’extrémité bordante de la séquence cible
au niveau du site d’insertion. Il y a alors formation d’une fourche de réplication à chaque extrémité
du transposon.

Dr FENGHOUR -29-
 Chapitre IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES GENETIQUE MICROBIENNE
3. Le transposon est répliqué avec formation. Après réplication, les extrémités sont ligaturées pour
former un co-integrat (structure intégrative). L’ensemble du transposon a été répliqué.

4. Une recombinaison a lieu entre les deux sites de résolution res portés par les deux copies du
transposon par action de la résolvase. Il en résulte deux molécules d’ADN portant chacun une
copie du transposon.

Figure 24. Model des deux mécanismes de transposition, (a) réplicative et (b) conservative (10).

Dr FENGHOUR -30-
 Chapitre IV. LES ELEMENTS GENETIQUES TRANSPOSABLES GENETIQUE MICROBIENNE
4. CONSEQUENCES DE LA TRANSPOSITION

Les éléments transposables produisent une variété importante d’effets :

- Effets mutagènes : Les éléments transposables peuvent s’intégrer au sein d’un gène et causer
une mutation ou entraîner un réarrangement d’ADN menant à des délétions du matériel
génétique. Ils peuvent bloquer la traduction ou la transcription parce que certains d’entre eux
portent des codons STOP ou des séquences de terminaison.

- D’autres éléments transposables portent des promoteurs qui activent des gènes près du point
d’insertion.

- Certains transposons sont situés dans des plasmides et participent dans l’insertion de ces
derniers dans le chromosome de la cellule hôte.

- Les transposons qui portent des gènes de résistance aux antibiotiques participent dans la
formation des bactéries résistantes en se transposant sur les plasmides de ces cellules.

- Les éléments transposables sont largement répandus dans la nature. Ils sont présents chez les
eucaryotes, les bactéries, et les archéobactéries. On a ainsi identifié des éléments transposables
chez la levure, le maïs, la drosophile et l’homme. Les éléments transposables jouent un rôle très
important dans la génération et le transfert de nouvelles combinaisons génétiques

5. REGULATION DE LA TRANSPOSITION

Tous les éléments transposables sont soumis à une ou plusieurs régulations dont la tendance générale
est de maintenir un taux de transposition peu élevé. Les mécanismes de régulation peuvent être :

- des éléments régulateurs qui forment des complexes avec la transposase et l’inactivent ;

- une synthèse d’"ARN anti-sens", complémentaires à l’extrémité 5’ de l’ARNm de la

transposase qui bloque l’initiation de la traduction par appariement avec le messager ;

- Des systèmes de méthylation dam de la bactérie ;

- En se liant u site res de résolution du co-integrat, la résolvase de Tn3 réprime la transcription

des gènes tnp A et tnp R de ce transposon.

- Des mécanismes de régulation contribuant à limiter la synthèse de la transposase(.8).

Dr FENGHOUR -31-
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE

V. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES

GENETIQUES
Le transfert du gène se réfère au mouvement de l’information génétique entre les organismes. Chez les
bactéries, trois mécanismes de transfert de gènes sont rencontrés (Figure 25) : La transformation par
laquelle une bactérie compétente incorpore de l’ADN dissout dans leur milieu ; la conjugaison qui est
un transfert direct d’ADN entre deux bactéries établissant au préalable un contact physique entre elles ;
et la transduction au cours de laquelle l’ADN est transféré par biais d’un bactériophage. Grâce à ces
transferts génétiques, la bactérie peut être l’objet de variations génétiques autres que les mutations.

Figure 25. Transferts génétiques chez les bactéries(. 11).

L’incorporation de l’ADN transféré, par recombinaison avec le génome de la bactérie réceptrice est très
souvent indispensable à l’acquisition d’un nouveau phénotype héritable. Cette recombinaison
s’effectue par des mécanismes différents, selon le mode de transfert et la nature de l’ADN.

Des informations obtenues à partir de l’étude du transfert génétique entre les micro-organismes peuvent
être appliquées à l’agriculture, à l’industrie et à la prévention et traitement des maladies infectieuses.
Elles ont permis de comprendre certains problèmes médicaux liés aux mécanismes d’augmentation de
la pathogenèse des bactéries par l’acquisition des résistances aux antibiotiques.(5).
Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
1. TRANSFERT GENETIQUE CHEZ LES BACTERIES
1.1. La transformation
1.1.1. La découverte de la transformation
La transformation a été découverte par Frederik Griffith au cours de ses expériences sur l’infection des
souris par les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae). Il en existe deux variétés : la première est
la variété S pathogène (S = Smooth) dans laquelle les bactéries sont entourées d’une capsule
polysaccharidique qui empêche leur destruction par les macrophages du sang. Cette variété donne sur
un milieu solide des colonies dont les bords sont lisses. La deuxième variété (R) est représentée par des
cellules sans capsules, non pathogènes qui donnent des colonies à bords rugueux et dentelés sur milieu
gélosé (variété R pour Rough).
Griffith constata que l’injection de pneumocoques de type S à des souris provoque leur mort après 24 à
48 heures (Figure 26 Expérience 1), et que l’injection de pneumocoques de type R, ainsi que celle de
type S inactivées (tuées par la chaleur) est inoffensive pour les souris (Expérience 2 et 3).
L’injection des bactéries R mélangées à des bactéries S tuées provoqua la mort des souris (Expérience
4). Des pneumocoques vivantes de type S fut retrouvées dans le sang de ces souris. Dans cette dernière
expérience, Griffith réalisa que les bactéries S détruites transforment les bactéries R en S, et imagina
que cette transformation est due à l’action des substances polyosidiques, ce qui se révéla par la suite
totalement faux(.10).

Dawson et Sia démontrèrent par la suite que la transformation des pneumocoques non pathogènes R en
pneumocoques pathogènes S pouvait se faire in vitro. En 1933, Halloway réalisa la transformation des

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 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
bactéries R en S par addition à la culture non pathogène d’extrait cellulaire obtenu à partir de cellules
de souche S. le facteur transformant est donc une substance contenue dans cet extrait.
1.1.2. Nature de la substance transformante
Les travaux d’Oswald Avery, Colin MacLeod et Maclyn MacCarty, en 1944 ont permis de révéler la
nature de la substance transformante. L’analyse systématique des extraits provoquant la transformation
montra qu’il contenait des acides nucléiques (ADN ou ARN). D’autre part, en détruisant l’ARN par
l’RNase, l’extrait cellulaire conservait son pouvoir transformant, tandis qu’il le perdait si l’on détruisait
l’ADN par l’DNase. Ce résultat montra donc que le facteur transformant est de l’ADN, provenant des
souches S, qui provoque immédiatement la synthèse de la capsule polysaccharidique chez les cellules
R les transformant en bactéries pathogènes S.
1.1.3. Les caractères de la transformation
La transformation naturelle est le premier modèle connu de transfert génétique. Elle correspond à la
pénétration, puis l’intégration d’un ADN nu exogène dans le chromosome de la cellule réceptrice qui
doit être physiologiquement compétente, c'est-à-dire capable de prendre de l’ADN et être transformée.
La fréquence de transformation pour des cellules très compétentes se situe aux environs de 10-3 pour la
plupart des espèces lorsqu’il y a un excès d’ADN. La compétence est un phénomène complexe qui
dépend de plusieurs conditions. Les bactéries doivent atteindre un certain stade de croissance : Par
exemple S. pneumoniae devient compétente durant la phase exponentielle lorsque la population atteint
107 à 108 cellules par ml. Lorsqu’une population devient compétente, des bactéries telles que les
pneumocoques secrètent une protéine appelée facteur de compétence qui stimule la production de 8 à
10 nouvelles protéines requises pour la transformation.
La taille de l’ADN intégré ne représente en moyen qu’une toute petite fraction du génome total (<1%).
La libération de l’ADN dans le milieu peut être par autolyse (rupture cellulaire spontanée de certaines
cellules bactériennes vieilles), ou par sécrétion (chez Neisseria). L’ADN transformant ne peut
s’exprimer phénotypiquement qu’après intégration dans l’ADN de la cellule hôte.
La fréquence de transformation augmente en fonction de la concentration de l’ADN et ceci jusqu’à
saturation (Figure 27).

Figure 27. L’efficacité transformante de l’ADN

exogène est fonction de sa concentration.
[exemple pris des souches d’E. coli sensibles à la
stréptomycines (strs) transformées en cellules
résistantes (strr)] (10).

Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
1.1.4. Les bactéries naturellement transformables
L’aptitude à la transformation a été reconnue chez des espèces autres que les pneumocoques. Jusqu’à
présent, on a mis la transformation naturelle en évidence chez un certain nombre de genres bactériens
Gram-positifs et Gram-négatifs : Streptococcus, Bacillus, Thermoactinomyces, Haemophilus,
Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Azotobacter et Pseudomonas.
1.1.5. Conditions de la transformation bactérienne
Pour que les bactéries puissent être transformables par un ADN transformant, il faut qu’elles soient
dans un état physiologique déterminé nommé compétence.
La compétence est un état particulier des bactéries qui deviennent aptes à intérioriser des fragments
d’ADN exogène, de les séquestrer sous une forme résistante à la DNase et qui ne peut être libéré par
lavage. Cette compétence est indispensable au phénomène de transformation, elle varie selon les
espèces et les conditions de culture (pH, température, équilibre ionique).
Développement de la compétence :
La compétence chez les bactéries Gram-positifs se développe lorsque la concentration d’un facteur
protéique secrété (facteur de compétence) atteint un certain seuil. Le mode d’action de ce facteur est
comparable à celui des hormones ; il se lie à des récepteurs spécifiques. Ce facteur induit la synthèse
de certaines protéines dont une autolysine qui pourrait attaquer les peptidogycanes de la paroi
bactérienne et démasquer les protéines se liant à l’ADN présentes sur la membrane plasmique.
Chez les bactéries Gram-négatifs, l’état de compétence est en relation avec la synthèse d’un activateur
protéique qui se fixe sur la paroi cellulaire. Ce facteur est excrété par la bactérie à la phase
exponentielle de croissance.(6).
1.1.6. Mécanisme de la transformation bactérienne
Une cellule compétente lie un fragment d’ADN double brin, le processus se fait au hasard puisque tous les
fragments donneurs sont en compétition entre eux. La capture de l’ADN demande de l’énergie. Un brin est
hydrolysé par une endonucléase associée à la membrane
cytoplasmique, l’autre brin est internalisé et peut alors s’aligner
sur la région homologue du génome et être intégré (Figure 28).

Figure 28. Schéma des événements conduisant à la transformation de

Streptococcus pneumoniae.
(a) développement de la compétence : (1) Les cellules produisent une
protéine soluble appelée facteur de compétence (▲) qui (2) qui se fixe
sur un site membranaire spécifique (M) induisant (3) l’expression de
certaines protéines parmi lesquelles (4) une autolysine (■) qui expose les
protéines liant l’ADN (○) et les endonucléases (●).
(b) La transformation : (1) Une longue molécule double brin d’ADN se
fixe à la surface cellulaire grâce à la protéine liant l’ADN (○), (2)
l’endonucléase (●) dégrade un des deux brins. (3) Le brin intact
s’associe à une protéine spécifique de la compétence (♦). (4) L’ADN
simple brin pénètre dans la cellule et est intégré dans le chromosome de
l’hôte (5) en lieu et place de la région homologue de l’ADN de
l’hôte(.8).
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1.1.7. La transformation artificielle
La transformation artificielle se réalise en laboratoire par des techniques variées. Parmi celles-ci, le
traitement des cellules au chlorure de calcium rend la membrane plus perméable à l’ADN. Cette
approche est couronnée de succès même avec des espèces qui ne sont pas naturellement compétentes
comme E. coli. Afin d’augmenter la fréquence de transformation, on emploie des concentrations
relativement élevées d’ADN, supérieures à celles que l’on trouve normalement dans la nature. Il est
plus aisé de transformer des bactéries avec de l’ADN plasmidique parce que les plasmides sont moins
facilement dégradés que des fragments linéaires et qu’ils peuvent se répliquer dans la cellule hôte. Il
s’agit d’une méthode courante pour introduire de l’ADN recombinant dans les cellules bactériennes.

1.2. La conjugaison
1.2.1. Découverte de la conjugaison
La conjugaison est le processus par lequel de l’ADN est
transféré de cellules donneuses à des cellules réceptrices
avec lesquelles elles sont en contact étroit. La conjugaison
bactérienne a été mise en évidence en 1946 suite à
l’expérience effectuée par Lederberg et Tatum. Ces
chercheurs mélangèrent deux souches auxotrophes d’E.
coli, incubèrent la culture pendant plusieurs heures dans
un milieu nutritif et les étalèrent sur une gélose de milieu
minimum. Afin de réduire les chances que les résultats
observés soient dues à une simple réversion, ils
employèrent des doubles et triples auxotrophes présumant
que deux ou trois réversions ne pouvaient pas avoir lieu
simultanément. Des colonies recombinantes prototrophes
apparurent sur le milieu minimum après incubation
(Figure 29). Les chromosomes des deux souches
Figure 29. Mise en évidence de la conjugaison
auxotrophes étaient donc capables de s’associer et de se bactérienne. Démonstration par Lederberg et
Tatum de la recombinaison bactérienne par
recombiner. l’usage d’auxotrophes multiples.(12)
Lederberg et Tatum n’avaient pas directement prouvé que le contact physique des cellules était
nécessaire au transfert des gènes. Ceci fut démontré par Bernard Davis (1950) qui construisit un tube
en U consistant en deux branches reliées à leur base par un filtre de verre fritté. Le filtre permet le
passage du milieu, mais pas des bactéries. Le tube en U fut rempli par des milieux nutritifs et chaque
branche fut inoculée par une souche auxotrophe différente d’E. coli (Figure 30). Au cours de
l’incubation, le milieu fut refoulé à plusieurs reprises à travers le filtre pour s’assurer qu’il y avait
échange du milieu liquide entre les deux moitiés du tube en U. Après 4 heures d’incubation, les

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bactéries furent étalées sur milieu minimum. Davis découvrit que lorsque les deux souches
auxotrophes étaient séparées l’une de l’autre par un filtre, le transfert de gènes n’avait pas lieu. Un
contact direct était donc requis pour la recombinaison que Lederberg et Tatum avaient observé.

Figure 30. L’expérience du tube en U.

L’expérience du tube en U démontra que la
recombinaison génétique au cours de la
conjugaison exigeait un contact physique
direct entre bactéries.(11).

En 1953, William Hayes démontra que le transfert de gènes observé par Lederberg et Tatum
s’effectuait dans un sens déterminé. Il existe en fait des cellules définies comme donneuses (F +) et
receveuses (F-), et le transfert de gènes n’est pas réciproque. La souche F + contient un facteur F extra-
chromosomique qui portent les gènes pour la formation des pili et pour le transfert du plasmide.
1.2.2. Facteurs plasmidiques conjugatifs
Le facteur F est le plasmide conjugatif le mieux étudié, il se trouve à raison d’une à deux copies par
cellule. Il porte des gènes pour une réplication autonome, des gènes compris dans le module tra
impliqués dans le transfert, et des gènes codant pour la synthèse des pili. Il porte également des gènes
codant pour une protéine d’exclusion qui empêche la conjugaison entre deux souches F +. Le facteur F
porte aussi un site OriT (origine de transfert) et une ou plusieurs séquences d’insertion (IS) qui
permettent l’intégration du plasmide dans le chromosome bactérien. Ces plasmides possèdent des
propriétés remarquables :
1. Le plasmide F est capable de se répliquer, ce qui lui permet de se maintenir dans une
population cellulaire en division (Figure 31a).
2. Le plasmide F porte les gènes pour la formation des pili à la surface de la cellule bactérienne.
Le pilus sexuel unit le donneur et le receveur et peut se contracter pour les rapprocher, il s’agit
d’un canal creux pour transfert d’ADN (Figure 31b).
3. Au cours d’un croisement F+x F− ou conjugaison, le facteur F de la cellule F+ se réplique par un
mécanisme de cercle roulant et une copie migre vers la cellule receveuse F− (Figure 31c). Une

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copie du plasmide F demeure toujours dans la cellule donneuse, l’autre copie est transférée à la
cellule réceptrice, cette dernière devient alors F+.

Figure 31. Propriétés du facteur de fertilité (F) d’E. coli(. 10).

4. Le contact entre deux cellules F+ est habituellement inhibé, ainsi, un plasmide F ne peut se
transférer d’une cellule F+ à une autre cellule F+.
5. Le facteur F porte des séquences d’insertion IS. La présence de ces éléments mobiles dans le
plasmide et le chromosome bactérien procure un site d’homologie permettant la recombinaison
entre les deux molécules d’ADN et par conséquence l’intégration du plasmide dans le
chromosome bactérien (Figure 32). Quand cette intégration apparaît, le plasmide F intégré, en
se transférant à une cellule réceptrice, peut entraîner le transfert du chromosome entier.

Figure 32. Intégration du facteur F dans le chromosome bactérien(8).

Dans ce dernier processus (transfert associé du facteur F et des gènes chromosomiques), les cellules
donneuses, contenant le facteur F intégré dans le chromosome, peuvent transférer des allèles
chromosomiques à d’autres souches durant le transfert du facteur F. La fréquence de recombinaison de
Dr FENGHOUR
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ces cellules est beaucoup plus importante que celle des cellules portant un plasmide F non intégré. Ce
type de cellule (portant un facteur F intégré) est appelé souche Hfr pour high frequency of
recombination (haute fréquence de recombinaison) parce qu’il possède un grand pouvoir de transfert
de gènes chromosomiques, comparé à celui des cellules F+.

6. Le facteur F intégré quitte occasionnellement le chromosome d’une cellule Hfr et revient au

cytoplasme. Durant ce processus, le plasmide emporte une portion du chromosome et forme un
plasmide F modifié appelé F’. Le plasmide F’ se comporte comme le plasmide F, il ne peut se
transférer qu’à une cellule F-. les gènes bactériens sur le plasmides F’ sont transférés avec celui-
ci, la cellule receveuse devient F’ ; c’est un mérozygote partiellement diploïde puisqu’elle a
deux jeux des gènes portés par le plasmide. De cette manière, des gènes bactériens peuvent se
répandre rapidement dans une population bactérienne. Un tel transfert de gènes bactériens est
appelé sexduction.
1.2.3. Etapes de la conjugaison bactérienne
La conjugaison bactérienne comporte deux étapes majeures : la reconnaissance du partenaire et le
transfert conjugatif. La recombinaison génétique dans la cellule réceptrice après le croisement Hfr x F -
constitue une étape supplémentaire.
a. La reconnaissance du partenaire
L’appariement entre couples de bactéries donatrices et réceptrices nécessite les pili sexuels chez les
cellules F+ ou Hfr. Chaque cellule possède 1 à 3 pili sexuels, constitués d’un assemblage cylindrique de
monomères de piline, une protéine codée par F. Les extrémités des pili reconnaissent les zones de
contact à la surface des bactéries F - et s’y fixent puis se rétractent par dépolymérisation, rapprochant
les deux bactéries. Il parait que le rôle essentiel du pilus est de rapprocher les deux cellules donatrice et
réceptrice, favorisant ainsi le contact étroit entre les deux bactéries. Les pili ne sont pas indispensables
pour transfert d’ADN, et ne constituent donc pas de ponts conjugatifs, mais rien n’exclue que la piline
membranaire soit impliquée dans la formation d’un conduit intracellulaire. Le facteur F code aussi
pour une protéine membranaire intervenant dans un mécanisme d’exclusion superficielle qui empêche
les cellules F+ de former entre elles des paires conjugantes.(9).
b. Le transfert conjugatif
Selon que le plasmide soit sous sa forme libre, intégrée ou tronquée, il existe trois types de transfert
conjugatif :
b.1. Le transfert conjugatif F + x F - :
Dans le croisement, F+ x F-, le transfert du facteur F est initié par une coupure simple brin, au niveau
d’une séquence spécifique OriT dans le plasmide F, par l’enzyme TraI. Le brin ouvert est déroulé dans
le sens 5’→3’ par une hélicase ATP-dépendante, et l’extrémité ainsi formée migre vers la cellule
réceptrice, à travers un pont cytoplasmique pendant que se déroule la réplication du brin

Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
complémentaire dans la cellule donatrice. La réplication est effectuée par la machinerie de synthèse de
l’hôte, par un mécanisme de cercle roulant, la synthèse du brin complémentaire dans la cellule
réceptrice est discontinue. La molécule linéaire qui résulte de la réplication reprend sa forme circulaire
spontanément.
b.2. Le transfert conjugatif Hfr x F - :
Lorsqu’une souche Hfr participe à la conjugaison, son chromosome commence à se répliquer au
niveau de l’origine de transfert, un brin d’ADN monocaténaire s’allonge au fur et à mesure que la
réplication progresse (réplication en cercle roulant). L’ADN simple brin est transféré à la cellule
réceptrice à travers le pilus, les gènes proches de l’origine de transfert sont transférés en premier, le
facteur F est le dernier à être transféré.
Le passage de tout le chromosome bactérien prend environ 100 minutes. Dans la plupart des cas, le
transfert de cet ADN n’est pas complet, la destruction du pont cytoplasmique avant l’achèvement du
transfert donne naissance à un diploïde partiel, la cellule réceptrice reste donc le plus souvent F-. Après
être entré dans la cellule receveuse, l’ADN transféré peut être dégradé ou incorporé dans le génome de
la bactérie F- par recombinaison (Figure 33).

Figure 33. Transfert d’un ADN

donneur simple brin par conjugaison, et
recombinaison avec le chromosome
receveur(. 3).

b.3. Le transfert conjugatif F’ x F - :

La séparation imprécise du facteur F intégré d’une souche Hfr entraîne le déplacement d’un fragment
d’ADN chromosomique, donnant naissance au facteur F’ (Figure 34b-c). Le facteur F’ est dénommé
d’après le gène qu’il porte (F’-lac pour notre exemple). Le transfert du facteur F’se fait selon un mode
identique à celui du facteur F. Si les gènes transférés par F’ s’intègrent dans le chromosome de la
Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
bactérie réceptrice, on dit qu’il y a eu une recombinaison légitime. Une cellule exconjugante contenant
un facteur F’ devient partiellement diploïde (Figure 34d).

Figure 34. Origine et

réintégration du facteur F’-lac (1)

1.3. La transduction
1.3.1. Découverte de la transduction
En 1952, Lederberg et Zinder croisèrent deux souches auxotrophes de Salmonella typhimurium, phe
trp tyr met+his+ et phe+trp+tyr+ met his pour déterminer si cette espèce faisait la recombinaison
génétique par conjugaison comme E. coli. Ils obtinrent en effet des recombinants et, tel que prévu, une
souche agissait comme donatrice et l’autre comme réceptrice. Mais ils furent surpris de constater que
les gènes du donneur étaient transmis un à la fois, la fréquence d’apparition de cellules sauvages
prototrophes n’était que de 1 pour 105 cellules. Le phénomène en cause n’avait pas l’apparence d’une
conjugaison. En réalisant l’expérience du tube en U, Lederberg et Zinder observèrent l’apparition de
recombinants prototrophes. En variant la taille des pores du filtre séparant les deux bras du tube en U,
ils trouvèrent que l’agent responsable de la recombinaison avait la taille du virus P22, un phage
tempéré de Salmonella. Des expériences complémentaires ont montré que l’agent filtrant vecteur de
recombinaison était bien le phage P22. Ce type de transfert d’ADN entre cellules sans nécessité
d’établir des contacts physiques est appelé Transduction(.7).
La transduction est le transfert de l’ADN d’une cellule à une autre par un bactériophage. Ce dernier
peut exister sous forme virulente ou tempérée.

Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
Il existe deux sortes de transduction : la transduction généralisée et la transduction spécialisée.
1.3.2. La Transduction généralisée
Les phages transducteurs généralisés n’ont pas des sites d’attachement spécifiques sur le chromosome
bactérien, et peuvent donc transférer n’importe quel gène de ce chromosome.

Figure 35. Mécanisme de la transduction généralisée(3).

La transduction généralisée (Figure 35) a lieu au cours du cycle lytique d’un phage virulent ou
tempéré et transfère n’importe quelle partie du génome bactérien. Durant le stade d’assemblage,
lorsque les chromosomes viraux sont empaquetés dans les capsides protéiques, des fragments
aléatoires du chromosome bactérien partiellement dégradé sont également empaquetés par erreur.
Parce que la capside ne peut contenir qu’une quantité limitée d’ADN, ces particules ne contiendront
pas d’ADN viral. La quantité d’ADN bactérien transporté dépend principalement de la taille de la
capside. Le phage P22 de Salmonella typhimurium contient habituellement de l’ordre de 1% du
génome bactérien. Le phage P1 d’E. coli et diverses autres bactéries Gram-négatives contient de 2 à
2,5% du génome. La particule virale résultante injecte son ADN dans une autre cellule bactérienne
sans initier de cycle lytique. Ce phage est appelé particule de transduction généralisée, et constitue
simplement un transporteur d’information génétique d’une bactérie à une autre.
L’ADN injecté doit être intégré dans le chromosome de la cellule receveuse afin de préserver les gènes
transférés. L’ADN reste soue forme double-brin durant le transfert et les deux chaînes sont intégrées
dans le chromosome receveur. Des transduits abortifs sont des bactéries qui contiennent cet ADN
transduit non intégré et sont des diploïdes partiels.
Dr FENGHOUR
 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
1.3.3. La Transduction spécialisée
Ce mode de transduction est une propriété des phages tempérés, elle résulte d’une erreur dans le cycle
lysogènes de ces phages. Lorsqu’un prophage est induit et quitte le chromosome de l’hôte, l’excision
est parfois erronée. Le génome du phage résultant contient des segments du chromosome bactérien (5 à
10% du chromosome bactérien) contigus au site d’intégration.
L’exemple de transduction spécialisée le mieux connu est celui du phage λ (Figure 36).

Figure 36. Le mécanisme de transduction pour le phage λ et E. coli. Le phage λ intégré est proche des gènes gal. Lorsqu’il
s’excise normalement (en haut, à gauche), le nouveau phage est complet et ne contient aucun gène bactérien. En de rares
occasions, l’excision se fait de façon asymétrique (en haut, à droite) et les gènes gal sont alors emportés tandis que les
gènes de phage sont perdus. Il en résulte un phage λ défectif qui porte des gènes bactériens et peut les transférer à un
nouveau receveur.(10).
Le génome de λ s’insère dans le chromosome de l’hôte (sous forme de prophage) en un site spécifique
d’attachement ou att. Le site att bactériens est situé entre les gènes gal et bio sur le chromosome d’E.
coli. En conséquence, ce sont ces gènes bactériens que le phage λ transfère le plus fréquemment.
L’induction d’E. coli lysogène conduit à la lyse de cette dernière et la libération de particules virales
normales, et autres transductrices défectives. Ces dernières sont appelées λdgal parce qu’elles
contiennent les gènes du catabolisme du galactose. Ces particules ont un site d’intégration hybride non

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fonctionnel, en partie d’origine bactérienne et en partie d’origine virale. Le phage λ défectif porteur du
gène gal peut s’intégrer dans le chromosome d’une cellule réceptrice par recombinaison entre le
chromosome du phage et la bactérie lorsque les croisements ont lieu de part et d’autre du site gal. La
bactérie résultante est un trasduit stable parce que le phage intégré est incapable de se propager par lyse
de la cellule à raison de la perte de certains gènes nécessaires à sa multiplication.
Un phage λ défectif porteur de gène gal peut également s’intégrer dans le chromosome d’une cellule
réceptrice si un phage λ normal est présent dans cette même cellule. L’intégration du phage λdgal se
fera au niveau d’un site att hybride (phage/bactérie) résultant de l’intégration du phage λ normal. Le
phage normal dans cet exemple est appelé phage auxiliaire (helper) parce qu’il aide le phage défectif
à s’intégrer et à se reproduire. Ces transduits sont instables car les prophages sont inductibles et
s’excisent suite à une induction (radiation UV par exemple).(11).

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2. RECOMBINAISON GENETIQUE, MECANISMES MOLECULAIRES

La recombinaison est un processus naturel par lequel une ou plusieurs molécules d’ADN sont
réarrangées ou combinées (conduisant à des échanges entres molécules d’ADN ou remaniements à
l’intérieur d’une molécule d’ADN) pour donner une nouvelle séquence nucléotidique. Habituellement,
le matériel génétique des deux parents est combiné pour produire un chromosome recombinant, avec
un génotype nouveau différent. Il en résulte un nouvel arrangement des gènes ou de parties de gènes et
habituellement une modification phénotypique.
On distingue plusieurs modes de recombinaison selon la nature des substrats impliqués (ADN
chromosomique, phagique ou plasmidique, élément transposable) et le degré d’homologie entre les
séquences au niveau desquelles se produisent les échanges. Ces modes de recombinaison sont classés
en trois groupes qui se diffèrent par leurs mécanismes : la recombinaison générale ou homologue,
la
recombinaison spécifique de site et la recombinaison illégitime ou transposition.(8).

2.1. Recombinaison générale

La recombinaison homologue est le phénomène qu’évoque le plus souvent le terme recombinaison,
elle implique généralement un échange réciproque entre une paire de séquences d’ADN homologues.
Le processus par lequel s’effectue la recombinaison homologue est appelé recombinaison générale car
le système enzymatique qui intervient dans les échanges peut, en principe, utiliser comme substrat
toute paire de séquences d’ADN homologues. Cela peut se produire à n’importe quel endroit du le
chromosome par un mécanisme de cassure et de réunion de la chaîne d’ADN, donnant un
enjambement ou crossing over.
La recombinaison générale nécessite des étapes intermédiaires d’échange de chaînes d’ADN :
1. deux molécules d’ADN homologues subissent un enjambement, ce qui signifie que leurs
double hélices sont rompues pour former deux double hélices intactes, chacune étant
composée de parties des deux molécules d’ADN initiales.
2. Le site d’échange (c’est à dire le lieu où les deux double hélices se joignent) peut se placer
n’importe où dans les séquences nucléotidiques homologues des deux molécules d’ADN
impliquées.
3. Au niveau du site d’échange, une chaîne d’une molécule d’ADN s’apparie à la chaîne de la
seconde molécule d’ADN créant une jonction décalée appelée jonction hétéroduplex. La
région décalée peut s’étendre sur plusieurs milliers de paires de bases.
4. Aucune séquence nucléotidique n’est modifiée au niveau du site d’échange ; les évènements
de cassure et réunion se déroule de façon précise.
La recombinaison générale crée des molécules d’ADN de séquences nouvelles. Plusieurs modèles ont

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été proposés pour décrire le mécanisme par lequel ce phénomène se déroule.

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2.1.1. Modèles de recombinaison homologue
[Link]. Modèle de Holliday
Ce modèle a été proposé en 1964 par Robin Holliday. D’après ce dernier (Figure 37), la
recombinaison commence par une coupure des deux brins de même polarité appartenant à deux
molécules d’ADN différentes et à des positions homologues (Figure 37b).(5).

Figure 37. Modèle de recombinaison homologue proposé par Holliday. (Les signes + et – marquent les brins de même
polarité) (5).
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Les deux duplex se déroulent partiellement et, par un processus appelé invasion, l’extrémité libre d’un
des brins du duplex s’apparie avec la région presque complémentaire du brin resté intact dans l’autre
duplex (Figure 37c). Les bouts des brins croisés sont reliés ce qui crée une structure à brins croisés
appelée jonction de Holliday (Figure 37d). Cette jonction peut migrer (migration de branche) par
déroulement et ré-enroulement des deux brins du duplex (Figure 37e). La migration de branche
provoque un échange de brins, il se forme des régions hétéroduplex plus ou moins longues.
La structure croisée peut adopter une configuration en croix appelée structure chi (χ) ou structure de
Holliday. Le clivage de la structure de Holliday (résolution de la structure de Holliday) en deux
molécules recombinantes se fait par deux coupures monocaténaires suivies de ligatures covalentes. Les
nouvelles coupures sont introduites soit dans les brins E et W (qui avaient déjà été coupés), soit dans
les brins N et S (Figure 37f). La coupure des brins E et W donne des duplex dont l’un des deux brins
est resté intact (Figure 37g). Si les nouvelles coupures ont lieu dans les brins N et S, il se forme des
molécules d’ADN qui sont à la fois hétéroduple et recombinantes. Si les marqueurs compris dans les
régions d’ADN hétéroduplex sont en situation hétérozygote, il peuvent ségréger à la réplication
suivante, ou faire l’objet d’une correction des défauts d’appariement, donnant lieu au phénomène de
conversion génique.(9).
[Link]. Modèle de Meselson/Radding
Le modèle de recombinaison proposé par Holliday met en jeu un mécanisme strictement réciproque,
qui n’a pas pu expliquer certains profils de ségrégation observés chez certains ascomycètes. Meselson
et Radding ont proposé un modèle plus général dans lequel la première étape est un échange non
réciproque qui génère une structure asymétrique. Les événements commencent par l’incision d’un brin
d’une seule des deux molécules d’ADN (Figure 38a). L’entaille produite sert d’amorce à une réaction
de polymérisation par la Pol I, et le brin déplacé (Figure 38b) est transféré dans l’autre molécule
d’ADN (invasion, Figure 38c). Le brin transféré s’apparie avec le brin complémentaire dans l’autre
molécule d’ADN déplaçant ainsi l’autre brin (Figure 38d), ce dernier est coupé favorisant la ligature
des brins échangés et la formation d’une structure en croix (Figure 38e). Si l’échange s’arrête à ce
stade, une seule des molécules contient une région d’ADN hétéroduplex (Figure 38f) après résolution
par coupure dans le plan horizontal. La structure asymétrique peut subir une résolution dans le plan
vertical (Figure 38g), les régions qui flanquent le site d’échange sont alors en configuration
recombinante. De plus, si la branche se déplace, les deux molécules vont contenir des régions d’ADN
hétéroduplex et l’échange deviendra réciproque (Figure 38h).

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Figure 38. Modèle de recombinaison homologue proposé par Meselson et Radding (1975) (7).

[Link]. Le modèle Fox pour la recombinaison générale non réciproque

Dans la transformation bactérienne, c’est une forme non réciproque de recombinaison générale qui se
produit (Figure 39). Un fragment de matériel génétique est inséré dans le chromosome par
l’incorporation d’un simple brin avec déplacement d’un brin chromosomique et formation d’une
structure en boucle D (D-Loop). Une endonucléase coupe le brin du receveur et les brèches ainsi
formées sont remplies, la ligase intervient ensuite pour lier les extrémités libres.

Figure 39. Modèle de la recombinaison générale non réciproque proposé pour la recombinaison lors de la transformation
bactérienne.(8).
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2.1.2. Enzymes de la recombinaison générale

[Link]. Initiation de la recombinaison par le complexe RecBCD

Les protéines RecB, RecC et RecD forment un complexe enzymatique ayant une fonction à la fois
hélicase et endonucléase. Ce complexe amorce la recombinaison en se liant à l’extrémité libre d’un
duplex et en déroulant l’ADN double brin (Figure 40a).
En progressant le long du duplex, le complexe RecBCD génère localement des brins monocaténaires
qui seront clivés par son activité endonucléase (Figure 40b). La protéine SSB s’associe rapidement à
l’ADN monocaténaire au fur et à mesure de son apparition. Lors de sa progression, le complexe
RecBCD rencontre une séquence nucléotidique particulière ( 5’-GCTGGTGG-3’) appelée site chi (site χ)
qui représente le point chaud de la
recombinaison. 1009 sites χ ont été
identifiés dans le génome d’E. coli (en
moyenne d’un site tous les 4,5 Kb). Quand
le complexe RecBCD rencontre l’extrémité
3’ d’une séquence χ, il coupe le brin
d’ADN qui la contient, 4 à 6 bases en
amont de l’extrémité 3’OH (Figure 40c).
L’interaction de RecBCD avec le site χ
provoque une modification dans le
complexe qui n’exprime plus son activité
endonucléase sur le brin 3’, par contre
l’activité nucléase sur le brin 5’ est stimulée
(Figure 40d).
Reprenant son activité hélicase, RecBCD
déroule la molécule d’ADN double brin
générant une queue d’ADN simple brin
libre porteuse d’un site χ à son extrémité
3’OH. L’apparition de ce brin
monocaténaire favorise la fixation de la
RecA à la place des protéines SSB, ainsi se
forme le filament nucléoprotéique (Figure
40e) qui enclenche le processus d’invasion
et d’appariement avec une région
homologue d’une autre molécule d’ADN
bicaténaire(.9) Figure 40. Modèle de recombinaison homologue faisant
intervenir le complexe enzymatique RecBCD, un site Chi, et la
. recombinase RecA (9).
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[Link]. Invasion, appariement homologue et formation de la structure de Holliday (Protéine RecA)

Une des enzymes principales de la recombinaison générale est la protéine RecA (ou recombinase
RecA), elle catalyse la réaction d’échange des brins conduisant à la formation de la jonction de
Holliday. La protéine RecA se lie à l’ADN monocaténaire et forme avec lui un filament
nucléoprotéique, ce filament peut lier d’autres molécules d’ADN. Cette capacité à lier de multiples
brins d’ADN est la fonction caractéristique la plus remarquable de la RecA.
RecA possède deux sites de liaison à l’ADN, un site à haute affinité pour l’ADN simple brin ou site
principal (Figure 41a), et un second site se liant au duplex homologue. Lorsque le site principal lie un
ADN simple brin, le filament formé s’associe à une autre molécule d’ADN par le site secondaire ayant
une affinité à l’ADN double brin. La liaison entre le filament nucléoprotéique (RecA-ADNsb) et la
molécule d’ADN double brin est transitoire, le filament se déplace alors dans la molécule d’ADN
double brin jusqu’à ce qu’il rencontre une séquence homologue à l’ADN simple brin qu’il contient
(Figure 41b). Lorsque cette homologie est rencontrée, il se forme un ADN duplex hybride entre
l’ADN simple brin sur le site primaire et son brin complémentaire sur l’ADN double brin parcouru. Le
duplex hybridé formé déplace ensuite le brin de la molécule double brin semblable à l’ADN simple
brin porté sur le complexe RecA-ADNsb. Ce processus est à la base de l’échange des brins d’ADN
(Figure 41c).
Figure 41. Modèle de la réaction d’échange des brins catalysée par RecA.

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Figure 42. Modèle de la recombinaison homologue catalysée par RecA.(4).

L’invasion catalysée par la protéine RecA provoque la formation d’une boucle (D-Loop) qui est une
structure triplex d’ADN (Figure 42b). Le brin déplacé par l’invasion et qui constitue la boucle
s’apparie avec les bases du brin complémentaire du duplex d’origine ce qui forme la jonction de
Holliday à mesure que l’invasion se poursuit (Figure 42c).
[Link]. Migration de branche et résolution de la structure de Holliday (Protéines RuvA, RuvB et RuvC)
La structure de Holliday,
formée par l’action de la
RecA, représente un substrat
pour deux protéines RuvA et
RuvB qui catalysent la
migration de branche; ces
protéines forment un Figure 43. Action des protéines RuvA, RuvB
et RuvC dans la migration de branche et la
complexe ayant une activité résolution de la jonction de Holliday(.1).

hélicase, spécifique des jonctions de Holliday.

Un tétramère RuvA (Figure 43a) s’ajuste précisément dans le
centre de la jonction de Holliday, de part et d’autre de ce
tétramère, deux structures hexamèriques RuvB s’assemblent sur
l’hétéroduplex. L’ADN passe à travers un trou central dans
chacun des hexamères RuvB. Ces hexamères RuvB agissent
comme des moteurs et favorisent la migration de branche ; ils
provoquent le passage de l’ADN duplex à travers eux en
appliquant des forces de rotation égales et à sens opposé (flèches
circulaires). Les flèches droites montrent la direction du
mouvement de l’ADN dans ce moteur protéique (Figure 43a).

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Le mouvement de la jonction de Holliday, catalysé par le complexe RuvA-RuvB, génère des régions
d’ADN hétéroduplex. La résolution de la jonction de Holliday est catalysée par une protéine RuvC,
encore appelée résolvase C. Un dimère RuvC se lie au complexe RuvA-RuvB (Figure 43b2) et coupe
simultanément deux brins d’ADN opposés, situés à 180° l’un de l’autre (Figure 43b3), puis une ADN
ligase relie les extrémités libres (Figure 43b4) ; selon la paire des brins coupés, il en résulte un
hétéroduplex recombinant (comme dans notre exemple) ou un hétéroduplex non recombinant.
La migration de branche ne semble pas être un processus aléatoire, elle s’arrête préférentiellement à la
A G
séquence 5’- TT -3’. Cette séquence apparaît fréquemment dans le génome d’E. coli,
T C
vraisemblablement, la migration ne s’arrête pas en la première rencontre de ce motif. Une fois la
G
migration arrêtée, la résolution de la jonction de Holliday se fait par coupure entre le second T et
C
A G
de la séquence d’arrêt (5’- TT↕ -3’)
T C
[Link]. Systèmes RecE et RecF
Les mutants recB C- d’E. coli ne sont pas complètement déficients pour la recombinaison, la fréquence
de cette denière est cependant réduite de 10 à 100 fois. Il existe d’autres systèmes de recombinaison
dont l’activité, normalement peu importante, peut augmenter à la suite de mutations.
Les mutants sbc A- synthétisent l’endonucléase RecE (Exo VII) qui dégrade l’ADN bicaténaire à partir
de l’extrémité 5’. L’extrémité 3’OH monocaténaire peut servir de substrat à RecA.
Il paraît que la RecF intervient quand la RecE est inactivée. Les trois systèmes RecBCD, recE et RecF
font tous intervenir la protéine RecA, et probablement d’autres protéines (RecJ, RecO and RecQ) dont
la fonction n’est pas encore élucidée.
Les systèmes RecBCD, recE et RecF agissent de manières similaires, mais seul le complexe RecBCD
peut reconnaître des sites chi (χ) dans le génome d’ E. coli, et RecF est la seule à pouvoir induire une
recombinaison entre paires de plasmides.(9).
2.2. Recombinaison à un site spécifique
En plus des systèmes de recombinaison homologue, les bactéries, leurs phages et leurs plasmides
possèdent des systèmes qui effectuent des recombinaisons très spécialisées entre les régions d’ADN
qui ne représentent qu’une homologie limitée.
La recombinaison nécessite la présence des séquences d’ADN spécifiques à la fois dans l’ADN
bactérien et dans l’ADN du phage. De courtes séquences homologues (souvent moins de 15pb)
suffisent pour qu’une recombinaison spécifique de site ait lieu. Pour comprendre ce type de
recombinaison, nous prendrons comme modèle illustratif le système d’intégration/excision du
bactériophage λ.

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 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE
Les systèmes d’intégration/excision du bactériophage lambda
En 1962, Campbell a proposé un modèle de recombinaison qui rend compte des diverses données
génétiques de l’intégration du génome du bactériophage λ dans celui de E. coli qui induit la lysogénie.
Ce modèle est basé sur la recombinaison entre des sites d’intégration uniques (séquences att) du
chromosome bactérien (attB ou BOB’) et du bactériophage (attP ou POP’). La région O désigne la
séquence commune de 15 nucléotides.
Des sites hybrides attL (BOP’ à gauche) et attR (POB’ à droite) se forment au moment de
l’intégration (Figure 35).

Figure 35. Intégration du génome du

bactériophage λ dans l’ADN chromosomique
d’E. coli. (2).

Le site attB contient 25 pb dont la séquence cœur O de 15 pb où s’effectue l’échange. Le site attP est
plus long (240 pb) et plus complexe, il contient, en plus d’un site O (situé au centre), plusieurs autres
séquences disposées de façon asymétrique.
L’intégration est réalisée grâce à une enzyme virale, la λ intégrase, et à une protéine cellulaire, la IHF
(facteur d’intégration de l’hôte). L’intégrase se lie spécifiquement aux sites O, elle possède d’autres
sites de liaison sur le site attP. Il s’agit d’une topoisomérase de type I qui coupe et religature un brin
d’ADN à la fois au niveau du site O. L’intégration ne peut se poursuivre qu’après interaction des
séquences qui flaquent le cœur O du site attP avec plusieurs molécules d’intégrase et du facteur IHF
formant une structure appelée intasome, qui donnerait à l’ADN phagique la topologie requise pour la
recombinaison. L’excision du phage se fait par recombinaison spécifique entre les deux sites att
hybrides qui ont été produits par l’intégration. En plus de l’intégrase et du facteur IHF, l’excision
requière Xis (excisionase),
une autre protéine qui lie l’ADN au niveau de séquences présentes dans un des sites att hybrides et qui

active la recombinaison spécifique entre ces sites(.2).

2.3. Les éléments génétiques mobiles (déjà évoqués dans le chapitre IV)

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 ChapitreV. TRANSFERTS GENETIQUES, RECOMBINAISON, CARTES GENETIQUES GENETIQUE MICROBIENNE

3. LA CARTOGRAPHIE DU GENOME
La cartographie d’un génome est la localisation des gènes dans ce génome. Parmi les principaux outils de
la cartographie génétique chez les bactéries figure la conjugaison.
La conjugaison Hfr est fréquemment utilisée pour déterminer la localisation relative des gènes bactériens.
Cette technique découle du fait que, durant la conjugaison, le chromosome linéaire passe d’un donneur
à un receveur avec une vitesse constante.

Figure 36. Expérience du croisement

interrompu chez E. coli.
Les cellules F- résistantes à la streptomycine
(strr) sont croisées avec des cellules Hfr strs
(sensibles à la streptomycine). Les cellules F-
ont un nombre de mutations (indiquées par les
marqueurs génétiques azi, ton, lac et gal) qui
les empêchent de mener des étapes
métaboliques spécifiques, alors que les cellules
Hfr en sont capables. Après début de la
conjugaison entre les deux souches, des
échantillons sont prélevés à différents temps et
sont soumis à des agitations fortes pour
interrompre la conjugaison entre les cellules,
ces dernières sont ensuite étalées sur milieu
contenant de la streptomycine. L’antibiotique
tue les cellules Hfr, seules les cellules F- vont
survivre et seront ensuite étalées sur des
milieux de sélection pour tester leur sensibilité
au phage T1 (ton) et à l’azoture (azi), et leur
capacité de croître sur galactose (gal) ou
lactose (lac) comme seule source de carbone.
(a) Fréquence d’apparition des marqueurs
génétiques azir, tonr, lac+ et gal+, parmi
les recombinants en fonction de la durée
de conjugaison.
(b) Transfert ordonné du chromosome Hfr au
cours de la conjugaison.(3).

Dans l’expérience du croisement interrompu (Figure 36), le canal de conjugaison est brisé et le croisement
Hfr x F- est arrêté à intervalles de temps réguliers après le début de la conjugaison, en soumettant les
cultures à une agitation vigoureuse. L’ordre de la chronologie du transfert de gènes peut être déterminé
parce qu’il reflète l’ordre des gènes dans le chromosome bactérien, la détermination des temps de
pénétration permet d’établir une carte génétique divisée en minutes (Figure 37).

Figure 37. Carte génétique obtenue par cartographie de la figure 36 (4).

Dr FENGHOUR
 ChapitreVIII. GENETIQUE DES BACTERIOPHAGES GENETIQUE MICROBIENNE
Il n’est pas possible d’établir la carte d’E. coli à partir d’une seule souche Hfr à cause de la trop grande
taille de ce génome ; le transfert du chromosome ralentie progressivement . Dès lors, différentes
souches Hfr ayant intégré un plasmide F à différents sites et orientations, doivent être utilisées et leurs
cartes doivent être superposées. Cette approche a permis de prouver la circularité du chromosome d’E.
coli (Figure 38).

Figure 38. Circularité du chromosome d’E. coli.

(a) Par utilisation de différentes souches Hfr (H, 1, 2, 3, 312) contenant le facteur F inséré dans le chromosome à
différents points et positions, l’expérience du croisement interrompu montre la circularité du chromosome.
(b) L’ordre linéaire des marqueurs du transfert de chaque souche Hfr indique l’origine et la direction de ce transfert(. 5).

En plus de préciser l’ordre des gènes, les cartes génétiques procurent des informations utiles. On
observe par exemple un regroupement considérable de gènes dans E. coli (Figure 39). Dans la région
entre 80 et 86 minutes, il y a beaucoup de gènes, alors que relativement peu de marqueurs génétiques
sont trouvés dans la région de 33 minutes. Les zones apparemment dépourvues de gènes peuvent bien
contenir des gènes non identifiés, mais peut être leur fonction n’est-elle pas principalement de coder de
l’information génétique. Selon une hypothèse, la région de 33 minutes est impliquée dans
l’attachement du
chromosome d’E. coli à la membrane plasmique durant la réplication et la division cellulaire(.9).

Dr FENGHOUR 57
 ChapitreVI. PHENOMENES DE RESTRICTION MODIFICATION GENETIQUE MICROBIENNE

IV. PHENOMENES DE RESTRICTION ET MODIFICATION

1. ENZYMES DE RESTRICTION
Les enzymes de restriction (ou endonucléases de restriction) sont des enzymes bactériennes qui
protègent normalement l’ADN de l’hôte en détruisant l’ADN de phages après sa pénétration.
Les cellules protègent leur propre ADN des enzymes de restriction en méthylant des nucléotides aux
sites que ces enzymes reconnaissent. Un ADN étranger n’est pas méthylé aux mêmes sites et le plus
souvent, il est clivé par les enzymes de restriction de l’hôte qu’il a envahi.

1.1. Types d'endonucléases de restriction

On classe les enzymes de restriction en trois types, I, II et III. Les enzymes de type I et III requièrent
de l’ATP pour hydrolyser l’ADN non méthylé et peuvent catalyser la méthylation spécifique de
certaines bases de l’ADN de l’hôte (le plus souvent dans la séquence de reconnaissance). Les
endonucléases de restriction de type I clivent l’ADN étranger de façon aléatoire, loin du site de
reconnaissance, ceux de type III coupent l’ADN dans ces sites, ou à leur proximité.
Les enzymes de restriction de type II sont largement utilisés pour le clonage et le séquençage des
molécules d’ADN. Leur activité catalytique n’exige pas d’ATP et elles ne modifient pas l’ADN par
méthylation ou par d’autres moyens. Elles coupent l’ADN à l’intérieur de la séquence qu’elles
reconnaissent spécifiquement, ou à son voisinage immédiat. Ces séquences de reconnaissance ont le
plus souvent de quatre à huit nucléotides et un axe binaire de symétrie. Par exemple, l’enzyme de
restriction EcoRI isolée de E. coli reconnaît spécifiquement une séquence GAATTC et coupe l’ADN
entre G et A dans cette séquence (Figure 40). Cette séquence est un palindrome ayant un axe de
symétrie d’ordre deux : la séquence lue dans le sens 5’→3’ est la même pour les deux brins. Le clivage
de cette séquence entre G et A produit des fragments dans lesquels les extrémités 5’ portent un
prolongement monocaténaire, ces extrémités simple brin très complémentaires sont connues sous le
nom de bouts cohésifs ou collants(.4).

Dr FENGHOUR
57
 ChapitreVI. PHENOMENES DE RESTRICTION MODIFICATION GENETIQUE MICROBIENNE
D’autres enzymes, comme BalI, coupe la séquence reconnue au niveau de son axe de symétrie, ce qui
produit des extrémités non cohésives dites à bouts francs.
Il y a plusieurs centaines d’enzymes de restriction qui reconnaissent de nombreuses séquences
spécifiques différentes (Tableau 3). Le nom de chaque enzyme de restriction commence par trois

lettres indiquant la bactérie qui la produit(.6).

Tableau 3. Quelques endonucléases de restriction de type II et leur sequen ce de reconnaissance
Source microbienne Enzyme* Séquence reconnue (↓) Extrémités formées
Arthrobacter luteus AluI AG↓CT Franche
Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G↓GATCC Cohésive
Escherichia coli EcoRI G↓AATTC Cohésive
#
Haemophilus gallinarum HgaI GACGC+5↓
Haemophilus influenzae
Cohésive HindIII A↓AGCTT
Haemophilus parahaemolyticus HphI GGTGA+8↓ #

Nocardia otitiscaviaruns NotI GC↓GGCCGC Cohésive

Staphylococcus aureus 3A Sau3AI ↓GATC Cohésive
Serratia marcesens SmaI CCC↓GGG Franche
Thermus aquaticus TaqI T↓CGA Cohésive
*
Les enzymes sont désignées par trois lettres indiquant les souches bactériennes desquelles elles proviennent ; les chiffres
romains indiquent l’ordre de découverte de l’enzyme dans une souche donnée (par exemple, AluI était la première enzyme
de restriction à être isolée de Arthrobacter luteus).
Les séquences reconnues sont écrites 5’→3’ (un seul brin est montré), le site de clivage est indiqué par une flèche. Les
enzymes produisant des bouts francs coupent les deux brins de l’ADN au site indiqué ; celles produisant des bouts cohésifs
effectuent des coupures décalées entre les mêmes nucléotides sur chacun des brins de l’ADN (figure 40).
#
Les sites de clivage de HphI and HgaI se situent à quelques nucléotides de la séquence reconnue. HgaI coupe à 5
nucléotides du coté 3’ de la séquence GACGC d’un brin, et à 10 nucléotides du coté 5’ de la séquence complémentaire
GTGCG de l’autre brin d’ADN. HphI coupe à 8 nucléotides du coté 3’ de la séquence GGTGA du premier brin, et à 7
nucléotides du coté 5’ de la séquence complémentaire CCACT de l’autre brin.

Cas des isoschizomères

Les isoschizomères (du grec «iso»: égal, et «skhizein»: fendre) sont des enzymes de restriction qui
proviennent de sources bactériennes différentes, (et qui portent donc des noms différents). Ils ont des
constantes physiques différentes, mais ils coupent l’ADN au niveau d’un même site de restriction. Par
exemple, MboI et Sau3A reconnaissent la même séquence de quatre nucléotides, 5’-GATC-3’. La
séquence est clivée sur les deux brins à la même position, du coté 5’ de G.
BamHI n’est pas un isoschizomère de MboI et Sau3A, mais il reconnaît la séquence hexanucléotidique
GGATCC. IL clive entre les deux G, produisant des extrémités 5’ cohésives qui peuvent s’apparier
avec les fragments produits par MboI et Sau3A. On dit que BamHI et MboI (ou son isoschizomère
Sau3A) sont des enzymes compatibles car, bien que ne reconnaissant pas le même site de restriction,
ils génèrent des fragments à extrémités cohésives complémentaires.

Dr FENGHOUR
58
 ChapitreVI. PHENOMENES DE RESTRICTION MODIFICATION GENETIQUE MICROBIENNE
1.2. mécanismes réactionnels des endonucléases de restriction
La réaction fondamentale catalysée par les endonucléases de restriction est l’hydrolyse de la liaison
phosphodiester du squelette de l’ADN. La liaison entre l’atome d’oxygène 3’ et l’atome de phosphore
est spécifiquement rompue. Les produits de cette réaction sont des brins d’ADN avec des groupes 3’-
OH et 5’-phosphate libres. Cette réaction est initiée par une attaque nucléophilique sur l’atome de
phosphore. On considère deux types de mécanismes, dans le premier, l’endonucléase cliverait l’ADN
en passant par un intermédiaire covalent en utilisant un nucléophile covalent (Nu), dans le deuxième
mécanisme, le clivage se fait par hydrolyse directe.
Mécanisme 1. (intermédiaire covalent)

Mécanisme 2. (hydrolyse directe)

Dans le premier mécanisme, un nucléophile dans l’enzyme attaque le groupement phosphate pour
former un intermédiaire covalent. La prochaine étape est l’hydrolyse de cet intermédiaire et la
libération du produit final. Dans le deuxième mécanisme, une molécule d’eau activée attaque
directement l’atome phosphore.
Les endonucléases, comme toute autre enzyme agissant sur des substrats contenant du phosphore,
requière le Mg2+, ou autre cations divalents similaires, pour leur activité. Ce métal est indispensable
pour la catalyse, l’ion magnésium tient une molécule d’eau en une position qui lui permet d’attaquer le
groupement phosphate et effectuer l’hydrolyse.
Les séquences reconnues par les endonucléases de restriction sont, en majorité, des séquences répétées
inverses (palindromes). Cet arrangement de nucléotides donne à ces séquences là une structure
tridimensionnelle symétrique (Figure 41). Les enzymes de restriction montrent une symétrie
correspondante pour faciliter la reconnaissance(.7).

Dr FENGHOUR
59
 ChapitreVI. PHENOMENES DE RESTRICTION MODIFICATION GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 41. Structure du site de reconnaissance de l’endonucléase EcoRV. (A) séquence du site de reconnaissance qui
représente une symétrie par rapport à un axe. (B) la répétition inverse dans la séquence reconnue par EcoRV fournie à
l’ADN une structure tridimensionnelle avec un axe de symétrie d’ordre deux(.8).

2. CARTES DE RESTRICTION
Les enzymes de restriction constituent un outil très intéressant permettant de
dresser des cartes de molécules d’ADN de plusieurs milliers de paires de bases.
Ces enzymes n’agissent que sur leurs sites spécifiques et produisent une série de
fragments individuellement distincts. Les fragments de restriction forment une
collection particulière de morceaux d’ADN de différentes tailles qu’il est possible
de séparer par électrophorèse (Figure 42).
La taille des fragments produits par digestion avec une enzyme déterminée
correspond exactement à la distance qui sépare les sites spécifiques de cette
enzyme. L’analyse par électrophorèse en gel d’agarose ou de polyacrylamide de
fragments produits par plusieurs enzymes, utilisées séparément ou de façon
combinée, permet de déterminer l’ordre des fragments dans la molécule Figure 42.
Electrophorèse des
originale (Figure 43). fragments de
restriction(9).

L’établissement d’une carte de restriction est une étape préalable indispensable de la détermination de
la séquence nucléotidique d’une région d’un génome, à fortiori de celle d’un génome en entier.

Dr FENGHOUR
60
 ChapitreVI. PHENOMENES DE RESTRICTION MODIFICATION GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 43. Carte de restriction d’un AND déduite d’une électrophorèse des fragments obtenus après digestion par des
enzymes de restriction.(5).
Dans cet exemple, une première digestion par l’enzyme 1 montre qu’il y a deux sites de restriction pour cette enzyme, mais
rien ne montre l’ordre des fragments produits dans la molécule de 17 Kb digérée. Une digestion combinée par les enzymes
1 et 2 donne les segments de 6 et 8 Kb intacts, le segment de 3 Kb est clivé, ceci montre que l’enzyme 2 clive un des
fragments produits par l’enzyme 1. Si le fragment de 3 Kb était situé à l’extrémité de la séquence étudiée, la digestion par
l’enzyme 2 seule donnerait des fragments de 1 et 2 Kb. Puisque ce n’est pas le cas, des trois fragments produits par
l’enzyme 2, le fragment de 3 Kb doit se situer au milieu. Le site de restriction de l’enzyme 2 (RE2) est plus proche de
fragment de 6 Kb qu’au fragment de 8 Kb, comme ça on peut avoir deux fragments de 7 et 10 Kb après digestion par
l’enzyme 2.

Dr FENGHOUR
61
ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
V. RÉGULATION DE L’EXPRESSION DES GÈNES
Les micro-organismes sont capables de contrôler l’expression de leurs gènes. Le contrôle de
l’expression des gènes permet essentiellement à la cellule d’ajuster ses synthèses en fonction des
besoins nutritionnels, face à un environnement changeant, de façon à assumer la croissance et la
division cellulaire. Cette régulation génétique sert à conserver l’énergie et les matières premières, à
maintenir un équilibre entre les quantités des diverses protéines cellulaires et à adapter la cellule aux
modifications à long terme de l’environnement.
Le contrôle du métabolisme bactérien se fait tant au niveau des activités des produits des gènes
qu’à celui de leur synthèse. Le contrôle de l’activité des enzymes permet un ajustement rapide des
activités métaboliques en réponse aux fluctuations des pools intracellulaires des sucres, d’acides
aminés ou de nucléotides.
Certaines enzyme dont la production par des gènes est régulée par d’autres gènes, ne sont
synthétisées que lorsque leurs substrats sont présents dans la cellule : ces enzymes et les systèmes
auxquels elles appartiennent sont dits inductibles. D’autres enzymes dont la production par des gènes
est aussi régulée par d’autres gènes, ne sont synthétisées que lorsque leurs produit final est absent, et
sont dites répressibles. Les enzymes inductibles, sont généralement impliquées dans le métabolisme
d’un composé qui sert de source d’énergie comme le lactose, le galactose et l’arabinose, alors que les
enzymes répressibles sont généralement impliquées dans la synthèse de quelque produit de fin de
chaîne métabolique, comme le tryptophane, l’histidine ou l’arginine(.5).
Enfin, certaines enzymes sont produites par des gènes qui ne sont pas régulés. Elles sont donc
produites continuellement, que leur substrat soit présent ou pas. Ces enzymes et les systèmes auxquels
elles appartiennent sont dits constitutifs. Les enzymes constitutives sont généralement celles dont la
cellule a continuellement besoin, comme celles du métabolisme du glucose. Celles qui sont inductibles
ou répressibles, c’est à dire qui sont produites par des gènes régulés, ne sont requises qu’à certains
stades du cycle cellulaire, et au cours de son histoire la cellule a développé les mécanismes requis pour
les produire seulement lorsque nécessaire.
1. REGULATION AU NIVEAU DE LA TRANSCRIPTION
1.1. Le modèle de l’opéron
Chez les bactéries, les gènes codant pour les enzymes d’une voie métabolique particulière sont souvent
regroupés, adjacents les uns aux autres, formant un segment continu sur le chromosome. Ces
ensembles ainsi que les séquences régulatrices qui contrôlent leur transcription sont appelés opérons.
Ce type d’organisation permet l’expression coordonnée de tous les gènes de l’opéron par leur
transcription dans un ARNm polycistronique codant pour toutes les enzymes de la voie métabolique
concernée (Un ARNm polycistronique est un ARNm qui code pour plusieurs protéines, un cistron est
une région d’ADN qui représente une protéine ; c’est l’équivalent d’un gène).

62
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
Dr FENGHOUR

63
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
Une séquence régulatrice en amont de cette unité détermine si l’opéron sera ou non transcrit. Cette
séquence est appelée l’opérateur (Figure 44). L’opérateur est voisin du promoteur. L’interaction
d’une protéine régulatrice avec l’opérateur contrôle la transcription de l’opéron en favorisant ou en
empêchant l’accès de l’ARN polymérase au promoteur. L’induction active la transcription ; la répression
la prévient.

Figure 44. Organisation générale des opérons(.1).

1.2. Induction et répression, régulations négatives et positives

A. OPERON LACTOSE, EXEMPLE D’ENZYMES INDUCTIBLES

Si on cultive des colibacilles (E. coli par exemple) sur un milieu contenant du glucose, les colibacilles
se multiplient sans aucun problème. Si maintenant on supprime le glucose et que l’on mette les
bactéries sur milieu contenant du lactose (β-galactosido-glucose) au lieu du glucose, elles ne poussent
plus, c’est comme si elles sont incapables d’utiliser le lactose. Après un certain temps, la croissance
reprend. Les bactéries peuvent maintenant utiliser le lactose (pour libérer le glucose) grâce à une β-
galactosidase qu’elles synthétisent à cet effet (Figure 45).

Figure 45. Métabolisme du lactose par la β-galactosidase(2).

1. Structure de l’opéron lac

Le gène de la β-galactosidase (LacZ) fait partie de l’opéron Lac qui comprend 2 autres gènes de
structure (LacY) et (LacA) qui codent respectivement pour la β-galactoside perméase (responsable de
l’entrée du lactose dans la cellule) et la thiogalactoside transacétylase qui n’est pas nécessaire au
métabolisme du lactose, et qui acétyle les β-galactosides non métabolisables. Un seul opérateur (O) et
un seul promoteur
(P) contrôlent l’ensemble de cette unité de transcription ( Lac Z, LacY et Lac A) (Figure 46). Le gène

Dr FENGHOUR
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 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
régulateur (I) situé à l’extrémité de l’opéron lac code pour une protéine qui joue le rôle de répresseur.
Ce répresseur peut inactiver l’opéron lac en se liant à son opérateur(.6).

Dr FENGHOUR
65
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 46. Structure de l’opéron lac.

2. Régulation négative et positive de l’opéron lac(3).

La synthèse des trois enzymes (la β-galactosidase, la β-galactoside perméase et la thiogalactoside
transacétylase), chez E. coli, est rapidement induite si ces bactéries sont placées dans un milieu
contenant le lactose comme seule source d’énergie. Cette synthèse est réprimée si l’on place les
bactéries dans un milieu dépourvu de lactose.
Le gène lac I code pour une protéine, le répresseur lac, qui se lie à l’opérateur et inactive l’opéron lac,
empêchant ainsi la synthèse des enzymes qui métabolisent le lactose. Pour que l’opéron lac soit activé
et que les gènes lac Z, lacY et lac A soient transcrits, il faut que soit présent un métabolite spécifique
appelé inducteur (ici du lactose) qui inactive le répresseur et permet la transcription des trois gènes de
structure (Lac Z, LacY et Lac A) (Figure 47).

Figure 47. Régulation de la

transcription de l’opéron lac par un
répresseur lac (régulation négative).

Certains analogues de substrats peuvent induire la synthèse d’enzymes, bien que ces enzymes soient
incapables de les métaboliser. Ces analogues de substrats sont des inducteurs gratuits. Divers
thiogalactosides comme l’IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside, Figure 48) sont d’excellents
inducteurs gratuits de la synthèse de la β-galactosidase chez E. coli.

Figure 48. Structure de l’IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)(4).

Dr FENGHOUR
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 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
La régulation de l’opéron lactose par Lac I est une régulation négative, c'est-à-dire que les gènes de
l’opéron lac sont transcrits sauf si la transcription est bloquée par le produit du gène lac I. Le
répresseur lac est une protéine tétramérique, elle a deux sites de liaison, un pour l’inducteur, l’autre
pour l’ADN. En l’absence de l’inducteur, le répresseur lac bloque l’expression des gènes lac ; il se lie
à l’ADN du site O (opérateur lac) en amont des gènes de structure lac, avec pour conséquence la
répression de la transcription par l’ARN polymérase à partir du promoteur plac.
La dérépression de l’opéron lac s’effectue quand un inducteur se fixe sur le répresseur lac. Il s’en suit
un changement de conformation dans la protéine, ce qui abaisse l’affinité du répresseur pour le site
opérateur, le complexe répresseur-inducteur se dissocie de l’ADN, et l’ARN polymérase peut alors se
lier au promoteur et transcrire les gènes structuraux (Figure 47).
Le modèle de la régulation négative explique la régulation spécifique de l’opéron lactose, mais pas sa
répression par le glucose qui est en fait une régulation générale, appelée régulation catabolique ou
régulation positive.
En présence d’un mélange glucose + lactose, la bactérie choisie de métaboliser d’abord le glucose,
puis quand le glucose s’épuise, elle utilisera le lactose. Ici, en présence du de glucose, l’utilisation du
lactose est réprimée. Ce phénomène est connu sous le nom de répression catabolique(.7).
Dans la régulation positive, le fonctionnement de l’opéron lac est soumis à une régulation par la
protéine activatrice du catabolisme (CAP), et par l’AMPc (adénosine 3’-5’ monophosphate cyclique)
ainsi que par le répresseur protéique Lac I. Le promoteur lac possède un site CAP sur lequel
l’activateur CAP doit se fixer avant que l’ARN polymérase ne puisse s’attacher au promoteur et
commencer la transcription. La protéine CAP n’est capable de se fixer sur le promoteur lac que
lorsqu’elle est complexée à l’AMPc. La concentration de l’AMPc est régulée par le glucose. Le
transport du glucose dans la cellule s’accompagne d’une inactivation de l’adénylate cyclase d’E.
coli, ce qui aboutit à la diminution de la concentration de l’AMPc. L’action de CAP en tant que
régulateur positif est dépendante de l’AMPc. CAP, qui est encore désigné CRP (pour cAMP receptor
protein) est un dimère constitué de deux chaînes polypeptidiques identiques. Chaque sous unité
contient un site de liaison à l’ADN et un autre pour l’AMPc. Le complexe CAP-(AMPc)2 se lie à
la région comprise entre -72 et -52 de l’opéron lac et entraîne la formation du complexe fermé
ARN polymérase-plac. L’ARN polymérase et le complexe CAP-(AMPc)2, seuls, ont une affinité
relativement faible pour leurs sites de liaison sur plac, cependant, l’interaction entre la protéine CAP et
la sous unité α de l’ARN polymérase forme un complexe protéine- protéine ayant une affinité plus
élevé et forme un complexe plus stable avec la région plac (Figure 49). La figure 50 résume les
différents mécanismes qui régulent l’expression des gènes de l’opéron lactose.

Dr FENGHOUR
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 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 49. Liaison coopérative de l’ARN polymérase et du complexe AMPc-CAP sur le promoteur de l’opéron lac(.5).

Figure 50. Contrôle négatif et positif de la transcription de l’opéron lac par le répresseur lac et l’AMPc-CAP
respectivement(. 6).
(a) En absence du lactose, il n’y a pas formation d’ARNm des gènes lac à cause de la liaison du répresseur lac sur
l’opérateur empêchant la transcription. (b) En présence de glucose et de lactose, ce dernier se lie sur le répresseur
entraînant des changements de conformation qui préviennent la liaison du répresseur à l’opérateur. Toutefois, l’AMPc est
en très faible quantité à cause de la présence du glucose, ainsi, le complexe AMPc-CAP n’est pas formé et en conséquence,
la fixation de l’ARN polymérase sur le promoteur est peu efficace et seule une faible quantité d’ARNm est synthétisée.
(c) En présence de lactose et absence de glucose, une transcription maximale des gènes lac survient. Le répresseur lac ne
peut pas se lier à l’opérateur, et la concentration de l’AMPc augmente ce qui favorise la formation du complexe AMPc-
Dr FENGHOUR
68
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
CAP

Dr FENGHOUR
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 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
et la fixation simultanée de ce complexe sur le site CAP de l’opéron lac et sur l’ARN polymérase. La transcription dans ce
cas est multipliée par un facteur 50.

Dr FENGHOUR
70
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
3. Les découvertes qui ont aboutit à l’énoncé du modèle de l’opéron lac
L’énoncé du modèle de l’opéron (par Jacob et Monod, 1961) pour expliquer le contrôle de la voie de
dégradation du lactose chez E. coli, constitue une étape décisive de l’étude de la régulation de
l’expression des gènes. La compréhension des mécanismes de cette régulation est devenue possible
grâce à des analyses par mutations.
Après isolement des premiers mutants de régulation qui synthétisent la β-galactosidase de manière
constitutive, la découverte que des analogues non métabolisés du lactose peuvent induire le système
(les inducteurs gratuits) et que de bons substrats pour la β-galactosidase peuvent n’être que de faibles
inducteurs montrait que l’activité enzymatique et la cible de l’induction étaient des entités distinctes.
Ceci permettait d’écarter l’idée que l’induction consistait en l’adaptation d’un précurseur de la β-
galactosidase déjà présent dans la cellule favorisant la théorie d’une expression sélective des gènes lac
en présence d’inducteur. Des mesures d’incorporation de précurseurs radioactifs des protéines a ensuite
confirmé que l’induction implique une synthèse nouvelle d’enzyme. Cette dernière expérience, réalisée
35
par Monod, consistait à un marquage radioactif (par S) des protéines d’E. coli, puis transfert des
bactéries marquées dans un milieu non-radioactif et ajout de l’inducteur. La β-galactosidase néoformée
était non-radioactive et devait avoir été synthétisée après l’addition de l’inducteur.
Les mutations dans lac I avaient un effet pléiotrope (action en trans) sur l’expression des gènes lac Z et
de lac Y. L’expérience de Jacob et Monod (1958) (Figure 51) montrait dans des exconjuguants
mérodiploïdes, l’existence de signaux régulateurs diffusibles. Elle conduisait à postuler que l’inducteur
agissait en inactivant un répresseur (inhibiteur) de la synthèse des enzymes du système lactose.

Figure 51. Démonstration

expérimentale de l’action en
trans du gène lac+. Les régions
hachurées de l’ADN indiquent
les gènes et régions de contrôle
qui portent des mutations.
(a)Les cellules portant des
mutations lac I- produisent un
répresseur inactif, ceci résulte
en une expression continuelle
des gènes lacZ et lacY
(production continue de la β-
galactosidase et de perméase).
(b) Si l’on introduit à ces cellules
(I – O + Z + Y +) un plasmide F
portant le gène lacI + sauvage, les
cellules transformées produisent
un répresseur actif qui peut se lier
aux deux opérateurs lac (sur le
chromosome et sur le plasmide).
Le résultat est une répression de
l’expression des gènes de la β-
galactosidase et de la perméase
en absence de l’inducteur
(- IPTG).(7).

Dr FENGHOUR
71
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
Des expériences complémentaires dans des mérodiploïdes contenant des F’lac permettaient ensuite de
distinguer un site opérateur (O), où le répresseur du système lac se fixe pour bloquer l’expression des
gènes, du gène lac I qui code pour ce répresseur. Des mutations dans ces deux loci provoquent une
synthèse constitutive des enzymes de dégradation du lactose, mais les mutations dans l’opérateur
(mutants Oc ou mutants opérateurs constitutifs) sont cis-dominantes (Figure 52) alors que les
mutations dans le gène du répresseur, qui code pour une molécule diffusible, sont trans-récessives.

Figure 52. Démonstration expérimentale de l’action en

cis des mutations Oc.
Des cellules d’E. coli contenant deux copies de
l’opéron lac sont schématisées. Dans ces cellules,
l’opéron lac, sur le chromosome bactérien, porte une
mutation Oc sur son opérateur et une autre mutation sur
le gène lacZ (lacZ - ) qui conduit à la production d’une
β-galactosidase inactive. L’opéron lac sur le plasmide F
est de type sauvage (O +Z +Y +).
(a) En absence d’inducteur (-IPTG), les cellules produisent
continuellement une perméase fonctionnelle mais une
β-galactosidase inactive. Ces résultats indiquent que
les mutations Oc affectent seulement les gènes sur la
même molécule d’ADN (opéron lac du chromosome).
Si la mutation Oc agissait en trans, l’expression du
lacZ+ du plasmide aurait donné une β- galactosidase
active.
(b) En présence d’inducteur (+IPTG), les deux activités
perméase et β-galactosidase sont observées ; la
transcription du gène lacZ+ du plasmide a donné une β-
galactosidase fonctionnelle(. 8).

Pour renforcer leur modèle du contrôle de l’expression des gènes lac par un répresseur (modèle basé
sur des études génétiques en utilisant des souches mutantes d’E. coli), Jacob et Monod réalisaient une
expérience biochimique qui a confirmé le rôle du l’inducteur dans l’augmentation de la synthèse de
l’ARNm à partir des gènes lac (Figure 52).

Figure 52. Démonstration biochimique de

l’augmentation de la transcription des gènes de l’opéron
lac en présence d’inducteur.
Des cellules d’E. coli poussant sur milieu riche en
glucose sont prélevées juste avant, et après addition de
l’IPTG à des intervalles de temps différents. De l’uridine
radioactif [3H] est ajouté immédiatement aux cellules
après chaque prélèvement. Après 20 secondes, les
cellules sont lysées et leur ARN est isolé. Chaque
échantillon d’ARN est incubé avec une membrane sur
laquelle est fixé un ADN lac en excès. Après hybridation,
la radioactivité retenue sur la membrane est mesurée.
Une représentation graphique du pourcentage d’ARN[3H]
hybridé en fonction du temps après addition d’IPTG
montre que le taux de synthèse de l’ARNm augmente
rapidement après addition de l’inducteur, atteignant un
maximum vers la deuxième minute.(9).
Dr FENGHOUR
72
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
B. L’OPERON TRYPTOPHANE
a. La répression
Les gènes de structure de l’opéron trp chez E. coli codent pour une séquence guide (trpL pour leader)
et cinq polypeptides trpE, D, C, B et A (Figure 53).

Figure 53. L’opéron trp chez E. coli.(6)

Ces cinq peptides se répartissent dans la constitution des trois enzymes qui participent à la synthèse du
tryptophane à partir du chorismate. L’expression de l’opéron tryptophane est sous le contrôle du
répresseur Trp codé par le gène trpR très éloigné de l’opéron trp. Quand il y a suffisamment de
tryptophane, le répresseur Trp lie deux tryptophanes et s’associe à l’opérateur trpO inclus dans la
séquence du promoteur trp. La présence du répresseur empêche la liaison de l’ARN polymérase sur le
site promoteur et donc la transcription de l’opéron trp (le tryptophane agit comme un co-répresseur en
activant le répresseur Trp le rendant capable de se fixer sur l’opérateur). Lorsque le tryptophane
devient limitant, la répression est
levée ; en absence de tryptophane, le
répresseur Trp n’a plus d’affinité
pour le site opérateur. La régulation
de l’expression des gènes de
l’opéron trp par ce répresseur est
donc une autorégulation, c'est-à-
dire une régulation de l’expression
d’un gène par le produit de ce gène. Figure 54. Activation du répresseur Trp après liaison de deux tryptophanes(6).

Dr FENGHOUR
73
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
b. L’atténuation
En plus de la répression, l’opéron trp est soumis à une régulation par une atténuation de la
transcription. L’atténuation, à la différence de la répression qui s’exerce à l’initiation de la
transcription, régule la transcription après qu’elle a commencé.
Entre l’opérateur et le premier gène de structure de l’opéron, le gène trpE se trouve une séquence
guide (ou leader) qui contrôle la continuation de la transcription après fixation de l’ARN polymérase
sur le promoteur. La séquence guide contient un atténuateur et une séquence qui code pour un peptide
guide. L’atténuateur est un site de terminaison contenant un petit segment riche en GC suivi d’une
séquence de huit uridines (Figure 55a). Les régions numérotés de 1 à 4 ont des séquences
nucléotidiques complémentaires et peuvent s’apparier entre elles pour former des structures en épingle
à cheveux. En l’absence de ribosome, les régions 1 et 2 s’apparient et forment des épingles à cheveux,
les régions 3 et 4 en forment un autre à proximité de la séquence poly-U. Cette deuxième structure
suivie de la séquence poly-U terminera la transcription. Si la région 1 ne peut s’apparier avec la région
2, cette dernière peut s’apparier avec la région 3. En conséquence, la région 4 reste monocaténaire et
ne peut servir de terminateur de la transcription. Il est important de constater que la séquence encodant
le peptide guide contient deux codons adjacents déterminant le tryptophane. La cellule ne peut donc
fabriquer le peptide
complet qu’en présence d’une quantité suffisante de tryptophane(.12).
Le comportement du ribosome au cours de la traduction de l’ARNm régule l’activité de l’ARN
polymérase pendant la transcription de la séquence guide. Ce processus est possible parce que la
traduction et la transcription sont étroitement couplées. En l’absence de répresseur actif, l’ARN
polymérase se fixe sur le promoteur et se déplace le long de la séquence guide en synthétisant
l’ARNm. S’il n’y a pas de traduction de l’ARNm après le début de la copie de la séquence guide par
l’ARN polymérase, les régions 3 et 4 forment une épingle à cheveux et la transcription s’arrête avant
que la polymérase n’atteigne le gène trpE. En présence de tryptophane (Figure 55b), il y a
suffisamment de tryptophanyl-ARNt pour la synthèse protéique. Par conséquent, le ribosome
synthétisera le peptide guide et continuera à se déplacer le long de l’ARNm jusqu’à ce qu’il atteigne
un codon d’arrêt UGA placé entre la région 1 et 2. Le ribosome s’arrête sur ce codon et masque
suffisamment la région 2 pour l’empêcher de s’apparier correctement avec la région 3. Les régions 3 et
4 forment une épingle à cheveux et l’ARN polymérase s’arrête au niveau de l’atténuateur comme si
aucune traduction ne s’était déroulée. Si le tryptophane fait défaut, le ribosome s’arrête au niveau des
deux codons tryptophane adjacents à séquence du peptide guide et empêchera l’appariement des
régions 1 et 2, car les codons tryptophane sont situés dans la région 1. Si cela se produit pendant que
l’ARN polymérase est occupée à transcrire la séquence guide, les régions 1 et 3 s’associent avant que
la région 4 ne soit synthétisée. Par conséquent, la région 4 restera monocaténaire et l’épingle à cheveux

Dr FENGHOUR
74
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
terminatrice ne se forme pas. Donc, en l’absence de tryptophane, l’ARN polymérase poursuit son
chemin et transcrit les gènes de l’opéron tryptophane.

Figure 55. Mécanisme de l’atténuation de la transcription de l’opéron trp.(6).

2. REGULATIONS POST-TRANSCRIPTIONNELLES

L’expression des gènes peut être régulée au niveau de la traduction des ARNm en protéines par les
ribosomes. Les cibles de ces régulations sont très variées : l’attachement des ribosomes à l’ARNm, le
relargage des ribosomes, l’instabilité programmée d’ARNm ou de parties d’ARNm ….
2.1. Contrôle de la traduction
2.1.1. Régulation de l’initiation de la traduction. Régulation de la synthèse des protéines
ribosomiques
Les ribosomes d’E. coli contiennent plus de cinquante protéines différentes et trois sortes d’ARNr. Les
gènes des protéines ribosomiques sont groupés en treize opérons différents. Un contrôle s’exerce sur la
transcription de ces opérons, dans lequel des sous unités ribosomiques pourraient être impliquées.
Cependant, la synthèse des protéines ribosomiques fait aussi l’objet d’une autorégulation négative. Une
protéine de chaque opéron peut se fixer à une séquence régulatrice sur l’ARNm et empêcher
l’initiation de la traduction par les ribosomes. Le facteur décisif est la quantité d’ARNr disponible pour
l’assemblage des ribosomes.
Dr FENGHOUR
75
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE
2.1.2. Atténuation de la traduction
La traduction déjà initiée peut faire l’objet d’une régulation. La terminaison normale de la traduction
au niveau des codons stop nécessite l’intervention de facteurs qui aident au relargage de la chaîne
polypeptidique. Le facteur de relargage RF-2 intervient dans la terminaison de la traduction au niveau
des codons UAA et UGA. La séquence codante de son propre gène contient un codon UGA en 26 ème
position (RF-2 contient 315 résidus d’acides aminés). Si RF-2 est abondant dans la cellule, il contribue
à catalyser le relargage du polypeptide naissant à cette position, produisant un polypeptide "atténué".
Si RF-2 est peu abondant, le ribosome change de cadre de lecture en sautant un nucléotide et complète
la synthèse de la protéine RF-2.
2.2. Contrôle de l’expression d’un gène depuis un site situé en aval. Rétrorégulation
Les mécanismes de régulation représentés jusqu’ici agissent initialement sur l’initiation des processus
d’expression génique ou sur leur terminaison précoce. Il existe cependant des régulations post-
transcriptionnelles qui s’exercent à des sites situés en aval (du côté 3’) des gènes concernés. Un
exemple de régulation de ce type se rencontre chez le bactériophage lambda, où elle contribue à
renforcer le choix du développement lytique. Dans le cycle lytique, xis et int (qui codent
respectivement pour l’excisionase et l’intégrase du bactériophage lambda) sont transcrits à partir de pL
(Figure 56). La synthèse d’intégrase est contre-productive, puisqu’elle risque de provoquer des
intégrations inutiles du génome du phage. La destruction préférentielle de l’ARNm int par
rétrorégulation assure une production excessive d’excisionase (Xis) par rapport à l’intégrase (Int).
L’ARN polymérase qui transcrit xis et int à partir de pL est modifiée par la fixation du facteur d’anti-
terminaison N, et elle franchit le terminateur de int pour transcrire la séquence sib, 260 pb en amont de
int. La séquence sib peut adopter une structure en épingle à cheveux caractéristique des sites d’attaque
de la ribonucléase III (RNase III) d’E. coli. La RNase III et d’autres nucléases de l’hôte dégradent
l’ARNm de 3’ vers 5’ et détruisent la partie int avant la partie xis, assurant ainsi la production de Xis
en large excès par rapport à Int.(11).
Lors de l’établissement de la lysogénie, par contre, Int est requise, mais pas Xis. Une protéine CII
active l’initiation de la transcription à pint (Figure 56). Comme pint se trouve dans xis, le messager
produit ne code que pour Int, et ne comporte pas sib puisque la polymérase n’a pas été modifiée par N
et qu’elle arrête la transcription au terminateur de int.
Dans le cas de l’induction d’une bactérie lysogène, l’excision du prophage requiert à la fois Xis et Int,
et l’ARNm transcrit à partir de pL est stable parce que l’intégration a séparé physiquement sib de int
(Figure 56).

Dr FENGHOUR
76
 ChapitreVII. REGULATION DE L’EXPRESSION DES GENES GENETIQUE MICROBIENNE

Figure 56. Rétrorégulation de int. (a) Développement lytique. Xis et int sont exprimés à partir de pL par un complexe de
transcription qui a fixé le facteur d’anti-terminaison N. le complexe franchit le terminateur situé en aval de int et transcrit
sib qui est un site d’attaque de l’ARNm par la RNase III. (b) Développement lysogénique. int est transcrit à partir de pint
par une polymérase qui n’a pas fixé de facteur d’anti-terminaison et qui termine la transcription au terminateur de int, sans
transcrit sib. (c) Induction d’un prophage. int et xis sont transcrits à partir de pL, mais sib a été séparé physiquement de
int par la
recombinaison entre att P et le chromosome bactérien (en noir)(.6).

2.3. Régulation par des ARN antisens

Certaines molécules régulatrices sont des ARN. Dans des systèmes biologiques très divers, la fonction
d’un ARN peut être inhibée par son interaction avec un ARN complémentaire. Comme ce dernier est
nécessairement transcrit dans le sens opposé de l’ARN qu’il inhibe, on l’appelle ARN antisens.
La réplication du plasmide ColE1 est contrôlée par un ARN antisens (ARNI). L’ARNI s’hybride avec
le précurseur de l’ARN qui sert d’amorce à la réplication (ARNII), l’empêchant ainsi de s’hybrider
avec l’ADN plasmidique. Le contrôle de la réplication de certains autres plasmides par des ARN
antisens s’effectue au niveau de la traduction des ARNm des protéines de réplication(.10)
Chez E. coli, la protéine réceptrice de l’AMPc, CRP, qui active l’expression de plusieurs opérons
cataboliques (soumis à la répression catabolique) régule sa propre synthèse en activant l’initiation de la
transcription d’un ARN antisens tic, complémentaire de l’extrémité 5’ du messager crp avec laquelle il
s’hybride pour bloquer la poursuite de la transcription.

Dr FENGHOUR
77
Génétique Microbienne

VII. Bactériophages

7.1. Historique
Il est bien difficile de ne pas considérer l'œuvre de Pasteur comme un lieu entre la notation
historique de virus et la découverte ultérieure de leurs caractères particuliers. En effet si un certain
nombre de maladies à virus des plantes étaient connues depuis fort longtemps, et certains de leurs
caractères spécifiques précocement décrits, ce n'est qu'après les découvertes de Pasteur
qu'Iwanowski fut capable, en 1892, d'apporter la preuve certaine qu'une maladie du tabac était due
à un agent infectieux ultra filtrable. En réalité, ce n'était que la suite logique des observations
antérieures de Mayer et lui donna en 1886 le nom de «mosaique du tabac».
En 1998, Beyerinck conclut que la mosaïque du tabac était pas due à une toxine ou un micro-
organisme classique, mais a une substance particulière soluble, capable de se multiplier dans des
cellules vivantes. Une nouvelle étape fut franchie grâce à Edward Twort en 1915 et Flix d'Herelle en à
1917, qui rapportèrent indépendamment l'isolation d'entité filtrable capable de détruire les cultures
bactériennes et de produire des petites zones claires sur le tapis bactérien. Twort contamina une
colonie normale pour voir cette dernière devenir à son tour translucide et liquide et cela en touchant
les colonies transparentes avec une spatule stérile puis une colonie normale. D'Herrelle observa un
phénomène analogue sur des cultures de Shigella provenant d'un malade de dysenterie. Il interpréta
la disparition des bactéries comme le résultat de la multiplication de virus auquel il donna le nom de
bactériophages.(11).
7-2. Définition

Les bactériophages connus aussi sous le nom de phage, sont des parasitaires obligatoires
intracellulaires, qui infectent les cellules bactériennes. Leur définition rejoint celle de tous les autres
virus, elle est résumée en 1953, selon Woff qui donna une définition, de la particule virale ou virion
qui est maintenant universellement adoptés, il régla pratiquement tous les problèmes :
Le virion ne procède qu'un seul type d'acide nucléique : soit de l' ARN., soit de l' ADN.
1) Le virion se produit à partir de son seul acide nucléique alors que les autres êtres se
reproduisent à partir de la somme de leurs constituants.
2) Le virion est incapable de croître et de subir des divisions binaires.
3) Le virion n'a aucune information génétique concernant les enzymes du métabolisme
intermédiaire (susceptibles de produire de l'énergie).
4) La multiplication des virions implique l'utilisation des structures de la cellule hôte, et
spécialement de ses ribosomes.
7.3. Classification des bactériophages
Pendant très longtemps, les virus n'ont été identifiés que par les symptômes des maladies qui
provoquaient. En 1939 Burnett proposa que les virus soient classés selon les anomalies
morphologiques et cytologiques dont ils étaient responsables.
Le système proposé était évidemment critiquable, mais on ne savait encore que peu de choses sur
les virions, alors que l'on possédait déjà beaucoup de données sur les manifestations cliniques qu'ils
provoquaient. C'est Bawden qui suggéra ultérieurement en 1941 que toute classification soit fondée
sur les propriétés des virions et non sur les manifestations de leur pouvoir pathogène. En 1962,
Lwoff, Horne et Tournier ont proposé un système dans lequel le monde des virus était considéré
dans son ensemble, et où ils s'étaient efforcés de ne retenir comme critères distinctifs que ceux qui

51
Génétique Microbienne

concernaient le virion et lui seul, car en 1953 les travaux de Lwoff ont permis de faire disparaître la
division basée sur la spécificité de l'hôte.
Quatre critères essentiels sont retenus:
- La nature des matériels génétiques (ADN ou ARN) ;
- le type de symétrie suivant lequel le virus est construit (hélicoïdale, icosaèdrale, combiné) ;
- le caractère nu ou enveloppé de la nucléo capside ;
- les données quantitatives concernant le virion a symétrie icosaèdrale, longueur et épaisseur des
nucléo capside pour les virus a symétrie hélicoïdale.
7.4. Structures du bactériophage
Depuis les surprenantes images de bactériophages "en forme de têtards" observées au microscope
électronique par les premiers expérimentateurs (Ruska, en 1941Lurai Delburck et Anderson en 1941),
le développement considérable des recherches sur la structure des bactériophages a conduit à la
description de nombreuses variétés morphologiques et à l'élaboration d'une véritable anatomie
ultrastructurale de ces virus (figure 46).
Actuellement en peut réunir les bactériophages en trois grands groupes morphologiques :
- cubique.
- Filamenteux.
- Mixte.
Le phage lambda (λ ) par exemple et un virus à structure mixte. Le diamètre de la tête et de 100 mm.
Les virions sont constitués par 12 protéines structurales localisées dans l'enveloppe (P9, P10 et P13),
Peplomers (P3 et P6), nucléocapside (P8 et P5), complexe polymérase (P1, P2, P4 et 97) et une
protéine non structurale P12. Les protéines constituent environ 70% du poids de la particule (. 12).

Structure du Bactériophage Ø6

52
Génétique Microbienne

Structure du Bactériophage lambda

Figure 46: Différentes structures de Bactériophages (A) cubique (B) Filamenteux (C) Mixte(12).

7.5. Cycle de multiplication du bactériophage

L'infection de la cellule hôte par un bactériophage présente deux aspects (fig. 47):
Le bactériophage se reproduit aux dépens de la bactérie, et la détruit: c'est l'infection lytique.
Les bactériophages qui lysent ainsi toutes les bactéries qu'ils infectent sont appelés des
bactériophages virulents.
L'acide nucléique injecté par le phage, au lieu de se répliquer d'une façon autonome, il s'attache au
chromosome bactérien. Il se comporte comme un gène bactérien et se réplique en parfaite
harmonie avec le génome. Pour bien marquer ces caractères on lui donne le nom de prophage. Ces
bactéries qui survivent à l'infection sont dites Lysogènes parce qu'elles sont capables dans certaines
circonstances, de se lyser en libérant des virions. Ces genres de bactériophages sont appelés des
bactériophages tempérés.
7.5.1. Le cycle de vie de lambda (λ)
Quels que soient les types de virus, leur cycle de multiplication comprend plusieurs étapes
communes. Les étapes du cycle de vie du phage λ sont les suivants:
[Link] L'adsorption du phage λ
L'identification de la bactérie hôte par le phage s'effectue par l’adsorption de ce dernier à une
structure spécifique sur la surface de la cellule. λ se fixe sur une protéine de la membrane externe
appelée: Lam B via une protéine qui réside dans l'extrémité de la queue phagique, La protéine J.

53
Génétique Microbienne

[Link] L'injection de l'ADN λ

D'abord, λ se fixe sur la protéine Lam B, cette fixation est réversible. Puis le phage subit un
changement de sorte que cette fixation soit irréversible. La nature de ce changement est inconnue
mais nécessite l'attachement de la tête phagique à la queue. Quand l'ADN λ sort de la tête pour être
injecté, c'est l'extrémité droite qui sort en première. En plus de Lam B, λ utilise aussi une protéine
membranaire interne PstM pour atteindre l'entré du cytoplasme.
Comment l'ADN traverse t-il physiquement le peptidoglycane et le périplasme et arrive à la protéine
PstM? Cela est inconnu.

Figure 47: Cycle de vie d'un bactériophage tempéré (Ex: phage lambda (λ)) (6).

[Link] Protection du génome λ dans le cytoplasme

Dans le cytoplasme bactérien, la molécule d'ADN est sujette à la dégradation par les exonucléases,
qui ont besoin d'une extrémité libre d'ADN pour le digérer. Or, l'ADN récemment injecté est
circularisé pour qu'il ne soit pas dégradé.
Le site cos situé de part et d'autre des extrémités du génome λ est une séquence de 12 pb coupée
asymétriquement. Quand l'ADN est assemblé, le site cos ainsi coupé aura une séquence de 12 pb
nécessaire à la circularisation. Une fois l'ADN λ est injecté dans le cytoplasme, les sites cos coupés
sur les deux extrémités du génome linaire s'hybrident. L'enzyme DNA ligase de l'hôte colle les bouts
des sites cos de manière covalente rendant la molécule circulaire. L'enzyme bactérien DNA gyrase,
surenroule la molécule λ qui sera ainsi protégée des exonucléases.

54
Génétique Microbienne

[Link]. Que se passe-t-il au Génome λ Après sa stabilisation ?

Le génome λ Contient 6 promoteurs majeurs nommés comme suit :
PL : promoteur vers la gauche.
PR : promoteur vers la droite.
PRM : promoteur pour le maintien du répresseur.
PRE : promoteur pour l'établissement du
répresseur. PI : promoteur d'intégration.
PR' : promoteur par la droite secondaire. (fig 48).

Après la circularisation et le surenroulement du génome, la transcription commence à partir de PL et

[Link] gènes précoces sont d'abord transcrits et les produits de gènes sont des protéines nécessaires
pour favoriser le développement ultérieur du phage(. 7).
L'ARN polymérase d'[Link] interagit avec PL pour donner lieu à une transcription d'ARN m court qu'est
traduit en une protéine N. Celle-ci interagit, d'une part avec PR pour donner lieu à la protéine Cro.

Figure 48: Organisation génétique du génome λ (7).

La protéine N est capable d'étendre la transcription jusqu'à ce que l'ARN polymérase rencontre une
séquence dans l'ADN qui lui ordonne de s'arrêter. Pour cette raison, elle est appelée : "protéine anti-
terminaison". Cette dernière permet à l'ADN polymérase de se transcrire à travers les signaux de
terminaisons en T1 et T2 conduisant à la synthèse de plus longs ARN m.
Les plus longs transcrits à partir de P R codent pour les protéines O, P et C II, est une petite quantité
d'une autre protéine anti-terminaison, la protéine Q. À partir de P L. et CII, les protéines de
recombinaison Gam et Red, en plus d'une petite quantité de Xit et Int sont synthétisées. N bloque,
55
Génétique Microbienne

par sa fixation, l'ARN polymérase après une séquence de paires de bases spécifiques, localisée en
amont du site terminaison en deux transcriptions, cette séquence est appelé nut pour (N utilization).
D'autres protéines d'[Link] contribuent au blocage de la terminaison. Ces protéines ont été nommées
Nus pour (N utilization substances) (fig:49).
À ce point, les facteurs nécessaires pour la décision lytique, lysogénique, sont déjà synthétisés. Pour
la voie lysogénique, on a besoin de C II et CIII par contre pour la voie lytique de Cro et O. O et P sont
utilisés pour la réplication d'ADN phagique.

[Link] λ et la décision lytique-lysogenique

La décision dépend sur la quantité de deux protéines phagiques nommée C I (C-un) et Cro. Ces
dernières synthétisées respectivement à partir de P RE ou PRM et à partir de PR, et aussi sur leur
fixation sur des régions de contrôle de leur promoteur. Elles se fixent sur le même opérateur.
λ contient deux opérateurs qui fixent Cro et C 1, le premier nommé OR qui chevauche avec les
promoteurs PRM et PR et joue un rôle majeur dans la décision lytique - lysogénique, l'autre nommée
O1, situé derrière le promoteur PL, et ne prend pas part à cette décision. (fig:50).

Figure 49: Evénements transcriptionnels ayant lieu après l'infection par le phage λ (8).

a) Transcription à partir de PL et PR.

b) La synthèse des protéines régulatrice.
c) Décision: ''lytique - lysogénique'' du phage.

56
Génétique Microbienne

Le répresseur C1 se lie à OR1 avec une affinité dix fois supérieure qu'avec OR2 ou OR3.
Quand C1 se fixe à OR, il stimule le promoteur PRM et la production du Cro. Ceci conduit à une voie
lysogénique.
Cro se lie également à OR1, OR2, OR3 mais dans un ordre inverse du répresseur C1. Cro se lie en
premier sur OR3 puis à OR2 et finalement avec une concentration élevée à O R1. Quand Cro est fixée à
OR il inhibe le promoteur PRM et la production de C1, ce qui conduit à un cycle lytique.
La protéine majeure impliquée dans ce passage est une autre protéine phagique nommée C II .Le
gène CII est localisé juste à droite du gène Cro. Quand λ infecte la cellule, la transcription commence
systématiquement à partir de PL et PR en utilisant les protéines de l'hôte. La transcription à partir de
PR conduit à la production de deux protéines Cro et C II. Si CII est active, elle conduira à une
production de C1 et l'Intégrase nécessaires à la lysogénie. Si elle est inactive la protéine Cro
réprimera PRM prévenant l'expression de C1 et conduit à une croissance lytique (fig:51).

CI conduit à la lysogénie
CII au développement lytique

La régulation à partir de PRM et PR

Production du répresseur CI

Voie lysogénique

Voie lytique

Figure 50 : transcriptions qui conduisent à prendre une décision lytique ou lysoginique . O R est

composé de trois séquences de 17 paires de bases OR1, OR2, OR3 (.9).

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Génétique Microbienne

(a)

(b)

Figure 51: La protéine CII facteur majeur de la décision cycle lytique ou lysogénique (7).

a) La décision lytique - lysogénique du phage λ.

La protéine CII est instable. Elle est dégradée par la protéase bactérienne, Hfla. Lorsque les cellules
croissent dans un milieu riche en nutriments, la quantité d'Hfla est élevée dans les cellules, menant à
la dégradation de CII et donc à une multiplication à travers un cycle lytique. C II est aussi stabilisée par
une protéine phagique CIII. Elle est produite à partir de PL quand le phage infecte la cellule.
C'est ainsi que CII est utilisée pour contrôler le devenir de la cellule, par conséquent l'impact de la
décision lytique ou lysogénique sur cette dernière.
[Link] La voie lysogénique de λ
Si C2 prédomine C1 sera produit initialement à partir du promoteur P RE et éventuellement par le
promoteur PRM. C1 active PRM assurant ainsi la continuité de sa synthèse, et active aussi le promoteur
P1, ce qui conduit à la production de l'Intégrase.(7).
La recombinaison d'ADN λ à lieu à un site spécifique sur le chromosome phagique nommée attP et
sur le chromosome bactérien nommée attB, situé entre les deux gène β-gal (β-galctosidase) et Bio
(Biotine, vitH), elle nécessite l'Integrase et IHF (facteur d'intégration de l'hôte) codée par l'hôte.
Une fois dans le chromosome, L'ADN phagique est fixé par les sites hybrides att nommée attL et
attR. L'excision du prophage à partir du chromosome bactérien exige: Int, IHF, en plus d'une
troisième protéine Cis (fig:52).
Quand l'ADN λ est recombiné dans le chromosome, il est répliqué et transmis à travers les
générations de manière stable aux cellules filles comme une partie de leurs chromosomes. Il se
trouve dans un état quiescent à l'exception de la production continue de C I à partir de PRM.
L'expression des gènes retardés codés pour la fonction du cycle lytique et bloquée par l'action du
répresseur CI. La fixation de ce dernier sur la séquence d'opérateur OR et OL bloque la transcription à

58
Génétique Microbienne

partir de PL et de PR. Puisque PR est bloqué, la protéine λ Q n'est pas synthétisée et la transcription
des gènes retardés n'aura pas lieu.

Figure 52: Les sites de recombinaison entre le phage λ et [Link].(7)

[Link] La voie lytique de λ:

Si la protéine Q s'accumule et atteint un certain seuil l'ARN polymérase continuera sa transcription à
partir du troisième promoteur localisé devant le gène Q. Ceci étend la transcription aux gènes tardifs
localisés en aval du gène Q. Ces gènes codent pour les protéines nécessaires à l'achèvement de
l'infection lytique y compris : les protéines de la tête, la queue, et celle de la lyse (fig:53).

Figure 53: Initiation du cycle lytique du phage λ Par la protéine Q(.6).

[Link] La réplication d'ADN durant la voie lytique :

Après que l'ADN λ infectant a été converti en une molécule cellulaire double brins, il se réplique à
partir d'une origine spécifique utilisant les deux protéines phagique O et P, et les protéines
bactériennes. La réplication progresse d'une manière bidirectionnelle comme pour les chromosomes
d'[Link], elle produit les molécules qui ressemblent à la lettre grecque thêta (θ), nommé la réplication
thêta (fig. 54).
Le cycle lytique du phage change en un deuxième mode de réplication : la réplication en cercle
rouleront d'ADN. Cette dernière commence quand une endonclease phagique, coupe un brin de la
molécule d'ADN double brin circulaire, le bras clivé et nommé brin positive, son extrémité '5' se
détache du brin négatif intact. L'ADN polymérase incorpore les désoxyribonucleotides à l'extrémité
3'-OH du brin positif coupé en utilisant le brin négatif comme matrice. Cela produit de nouveaux
brins positifs à travers un processus continu d'élongation. Ces brins sont utilisés à leur tour comme

59
Génétique Microbienne

matrice pour synthétiser de nouveaux brins négatifs(. 11)

La réplication en cercle roulant produit les molécules d'ADN longues contenant de multiples génome
phagique appelés : Concatémères.

Figure 54:La réplication de l'ADN λ (7).

60
 Génétique Microbienne

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