7.
Boîtes de Pétri
• Utilisation : Milieux solides pour l'ensemencement.
• Quantité requise :
( 3 , \text{boîtes} , \times 11 , \text{binômes} = 33 , \text{boîtes}.
Résumé des calculs
L’ensemble des besoins en matériel a été calculé avec précision pour garantir le bon
déroulement des expériences. Ce matériel inclut les supports de culture, les milieux de
dilution, ainsi que les outils nécessaires pour chaque binôme.
Date : 26/12/2024
Nom : Nombres Chabat
Titre : Analyse microbiologique - Préparation des milieux de culture
Objectif
Préparer les milieux de pré-enrichissement et d'enrichissement pour la détection de
contaminations bactériennes.
Étape 1 : Préparation des milieux de pré-enrichissement
1. Utilisation du bain d’EPT (Eau Peptonée Tamponnée) :
o Peser 10 g de l’échantillon (grande poudre).
2. Préparation des dilutions successives :
o Préparer une dilution en série de 10^-1 à 10^-5 en suivant ces étapes :
▪ Transférer 1 mL de la solution initiale dans 9 mL de diluant stérile.
▪ Répéter le processus pour chaque dilution successive (voir schéma ci-
dessous).
Schéma des dilutions successives :
• Tube 1 : 10^-1
• Tube 2 : 10^-2
• Tube 3 : 10^-3
• Tube 4 : 10^-4
• Tube 5 : 10^-5
Étape 2 : Préparation des boîtes pour ensemencement (FNAT)
1. Milieu utilisé : PCA (Plate Count Agar) :
o Préparer les boîtes de Pétri contenant le milieu PCA.
2. Ensemencement :
o Réaliser l’ensemencement des dilutions 10^-4 et 10^-5 dans les boîtes de
Pétri.
o Ajouter 9 mL de diluant dans chaque boîte, puis étaler avec une pipette stérile.
3. Incubation :
o Incuber les boîtes à 30 °C pendant 72 heures.
Étape 3 : Comptage des colonies (CF/CT)
1. Technique d’isolement :
o Réaliser un ensemencement en double couche :
▪ Étaler 0,1 mL de chaque dilution sur le milieu préparé.
▪ Recouvrir avec une fine couche d’agar fondu et tiède.
2. Milieu utilisé :
o Utiliser le milieu VRBL (Violet Red Bile Lactose Agar) pour cette étape.
Résumé des étapes importantes
1. Préparer le bain d’EPT et les dilutions.
2. Réaliser l’ensemencement des dilutions sur le milieu PCA.
3. Incuber les boîtes pour permettre la croissance bactérienne.
4. Effectuer un comptage précis des colonies sur le milieu VRBL.
Expérience microbiologique : Étude des bactéries pathogènes
Schéma et Explications des Dilutions et Incubations
1. Préparation des dilutions successives :
o Objectif : Réaliser des dilutions en série pour obtenir des concentrations
adaptées à l’ensemencement.
o Dilutions préparées :
▪ 10^-4
▪ 10^-3
o Chaque dilution est ensemencée avec 0,1 mL, suivi d’un étalement sur les
milieux de culture.
2. Incubation :
o Conditions pour CT (Comptage Total) :
▪ Température : 30-35 °C.
o Conditions pour CF (Comptage Fécal) :
▪ Température : 45 °C.
Étude des bactéries spécifiques
1. Staphylococcus aureus
• Préparation :
o Ajouter la suspension bactérienne au milieu RPF (RPF : milieu enrichi en
Ringer Peptone + tellurite de potassium).
• Ensemencement :
o Étaler 0,1 mL des dilutions sur le milieu préparé.
o Dilutions utilisées : 10^-2 et 10^-3.
2. Salmonella
• Préparation de la suspension mère :
o Placer l’échantillon dans un sac stomacher contenant le diluant adapté.
• Incubation :
o Maintenir à 37 °C pendant 24 h pour enrichissement.
3. Listeria monocytogenes
• Préparation de la suspension mère :
o Mélanger 10 g d’échantillon avec 90 mL de bouillon demi-Fraser (complété
par un supplément).
o Placer le mélange dans un sac stomacher.
• Homogénéisation :
o Réaliser l’homogénéisation à l’aide du stomacher.
• Incubation :
o Maintenir à 30 °C pendant 24 h.
Résumé des Figures Dessinées
1. Dilutions successives (10^-4 et 10^-3) :
o Tubes illustrant les étapes de dilution.
o Étapes représentées par des flèches pour montrer le transfert de solution.
2. Incubation et comptage des colonies :
o Schémas des boîtes de Pétri indiquant les conditions :
▪ CT : Comptage à 30-35 °C.
▪ CF : Comptage à 45 °C.
Date : 27/12/2024
TP de Microbiologie
Séance 1 : Jour 3
Nom : (indiqué : "Insaf Chamou")
Objectifs :
1. Enrichissement en milieu sélectif rapide pour l'isolement de Salmonella.
2. Enrichissement pour Listeria.
Salmonella :
• Ensemencement de 0,1 mL de la suspension mère dans 10 mL de milieu RVS
(Rappaport-Vassiliadis, bouillon sélectif).
• Incubation à 43°C (durée : 18 h).
Schéma dessiné :
• Deux tubes sont représentés. L'un contient la "suspension mère", et l'autre est rempli
avec "10 mL de RVS". Une flèche relie les deux tubes, indiquant un transfert de 0,1
mL.
Listeria :
• Ensemencement de 0,1 mL de la suspension mère (préparée à partir du mélange
demi-Fraser + aliment).
• Incubation à 30°C pendant 24 h.
Schéma dessiné :
• Deux tubes sont représentés. L'un contient la "suspension mère" et l'autre est étiqueté
"10 mL Fraser + 0,1 mL de supplément Fraser".
Jour4
2. Test Gram (Observation microscopique)
• Fixation de la colonie : Réalisée sur une lame par passage à la flamme.
• Coloration Gram :
1. Cristal violet.
2. Lugol (mordant).
3. Décoloration : Mélange d’alcool/acétonique.
4. Safranine (contre-coloration).
• Lavage : Eau distillée.
• Observation microscopique :
o Résultat : Bacilles.
3. Coliformes (Fécaux et Totaux)
• Dénombrement :
o Résultat : Absence de colonies détectées.
• Repiquage :
o Transférer une colonie CF sur un milieu BHI (Bouillon Heart Infusion).
o Incubation : À 37 °C pendant 24 h.
Résumé des Figures Dessinées
1. Schéma de dilution :
o Tubes avec dilutions 10^-4 et 10^-5 illustrés.
2. Colonies repiquées sur milieu BHI :
o Une colonie est transférée dans un tube contenant le BHI (illustration avec
flèche).
Date : 27/12/2024
TP de Microbiologie
Séance 1 : Jour 5
Nom : Abdel Naimi (Chama Insaf)
Objectif :
1. Lecture du test urée-indole.
2. Lecture du test citrate.
3. Ensemencement de Salmonella et Listeria.
4. Lecture de la culture en milieu BHI.
1) Lecture du test urée-indole :
• Observation :
o Après l'incubation du milieu urée-indole pendant 24 h à 37°C, la coloration est
devenue rouge.
o Cela signifie que la bactérie est Indole+.
• Ajout de Kovac's : la réaction est immédiate, coloration rouge.
Schéma dessiné :
• Deux tubes, l'un étiqueté "Coloration Rouge", l'autre avec une flèche reliant à un
réactif nommé Kovac's.
2) Lecture du test citrate (pour la bactérie E. coli) :
• Observation :
o Pas de changement de coloration de la gélose.
o Pas de croissance bactérienne sur la gélose.
• Interprétation :
o La bactérie est Citrate-.
3) Lecture de la culture de S. aureus :
• Après ensemencement de S. aureus dans le tube de BHI :
o Après 24 h d'incubation à 37°C, le tube devient trouble.
• Interprétation :
o Cela signifie que S. aureus s'est bien développé et multiplié dans le milieu
BHI.
Titre général :
Séance sur Salmonella et Listeria
Salmonella :
• Ensemencement de Salmonella sur géloses SS et Hektoen.
• Préparation à partir du milieu RVS (bouillon).
• Incubation à 43°C.
Schéma dessiné :
Deux Petri dishes :
1. L'un marqué "gélose SS".
2. L'autre marqué "gélose Hektoen".
Ils sont reliés à un tube marqué "RVS", avec une flèche indiquant un transfert de 0,1
mL.
Listeria :
• Ensemencement de Listeria en food à partir du milieu demi-Fraser (bouillon) +
supplément Fraser.
• Incubation à 30°C pendant 48 h.
Schéma dessiné :
• Une source circulaire indiquée "en food" connectée à un tube marqué :
"Bouillon demi-Fraser + supplément Fraser (enrichissement secondaire)".
• Flèche vers une note mentionnant incubation à 30°C et 48 h.
Day 6: TP de Microbiologie
Lecture des résultats
1. Lecture des résultats d’isolement de Salmonella et Listeria :
o Salmonella :
▪ La culture a été réalisée sur les milieux SS et Hektoen.
▪ Sur SS, absence de colonies noires. En contre, apparition de colonies
incolores, suggérant probablement Shigella.
▪ Sur Hektoen, absence de colonies vertes foncées.
▪ Conclusion : Absence de Salmonella dans l’aliment.
o Listeria :
▪ La culture a été réalisée sur le milieu Oxford.
▪ Absence totale de colonies noires.
▪ Conclusion : Absence de Listeria dans l’aliment.
2. Lecture du test de coagulase par Staphylococcus aureus :
o Absence de coagulation dans le tube à hémolyse.
o Conclusion : Absence de Staphylococcus aureus dans l’aliment.
