Adéquation du dioxyde de chlore

comme traitement tertiaire des eaux

usées municipales et utilisation de l'eau
récupérée pour l'irrigation par
aspersion des jeunes laitues
Les liens d'auteur ouvrent le panneau de
superpositionLuana Tombini décol ,Francisco López- a

Gálvez ,Pilar Truchado ,Eduardo Tondo,Maria

b. b César

I. Gil ,Ana Allende

b. b.

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Points forts
 •
Le ClO 2 est un traitement adapté à l'eau d'irrigation.
 •
Le ClO 2 a réduit les niveaux d' E. coli cultivables dans l'eau et dans la laitue irriguée.
 •
Les niveaux d' E. coli viables non cultivables étaient plus élevés que ceux d'E.
coli cultivables .
 •
Le nombre de plaques pourrait conduire à une surestimation de l’efficacité du
traitement.
 •
L'irrigation avec de l'eau traitée au ClO 2 a entraîné une accumulation de chlorate dans
la culture.

Abstrait
Les eaux usées récupérées utilisées pour l’irrigation agricole doivent répondre à des
normes microbiologiques spécifiques afin de prévenir la contamination microbienne
des produits irrigués. L'objectif de cette étude était d'évaluer la pertinence du dioxyde
de chlore (ClO 2 ) pour la désinfection des eaux usées municipales traitées
secondairement et son utilisation ultérieure pour l'irrigation par aspersion dans la
production en serre de jeunes laitues. L'impact de l'eau récupérée traitée tertiairement
avec ClO 2 sur la concentration d'E. coli , la présence de bactéries pathogènes et la
 présence de chlorates comme sous-produits de désinfection a été évalué dans l'eau et
dans la laitue infantile. E. coli a été quantifié à l'aide de méthodes de placage
conventionnelles et d'une méthode PCR quantitative en temps réel (qPCR) avec
prétraitement au monoazide de propidium (PMA) pour différencier les bactéries
viables et non viables. La densité de population d' E. coli cultivable était
significativement plus faible (p < 0,05) dans l'eau récupérée, traitée tertiairement à
l'aide de ClO 2 (ClO 2 W), par rapport aux eaux usées municipales (SW) traitées
secondairement. Cependant, aucune différence significative dans les charges d'E.
coli viables mais non cultivables (VBNC) n'a été observée entre les traitements lors de
la quantification à l'aide de la méthode PMA-qPCR. Ces résultats pourraient indiquer
que le traitement de l'eau au ClO 2 n'a pas tué les bactéries mais a induit les bactéries à
entrer dans un état VBNC. La proportion d'échantillons positifs pour la présence de
bactéries pathogènes était plus faible en ClO 2 W (1/8) qu'en SW (7/8). Des comptes
d'E. coli significativement inférieurs (p < 0,05) ont été détectés dans les plantes
irriguées avec ClO 2 W par rapport à celles irriguées avec SW. Une relation entre un
nombre plus élevé d'E. coli et la présence d'agents pathogènes a été observée lorsque
des échantillons de laitue ont été analysés par PMA-qPCR ( test U de Mann-Whitney ,
p < 0,05). Les jeunes laitues irriguées avec ClO 2 W présentaient une concentration de
chlorates significativement plus élevée que les laitues irriguées avec SW. La
quantification de bactéries viables à l'aide de méthodes moléculaires suggère que
l'efficacité du ClO 2 pourrait être surestimée lorsque des méthodes conventionnelles de
quantification par placage sont utilisées. De plus, l’accumulation de chlorates dans les
tissus doit être prise en compte car elle représente un effet indésirable de ce traitement
de désinfection.
 Article précédent dans le numéro
 Prochain article en parution
Mots clés
Produits frais
Fruits et légumes
Eau agricole
Désinfection de l'eau
Agents pathogènes d'origine alimentaire
Sous-produits de désinfection
Risque chimique

1 . Introduction
La récupération et la réutilisation de l’eau pour l’irrigation en agriculture sont des
pratiques d’innovation prioritaires. La réutilisation de l'eau est désignée par la
Commission européenne (CE) comme un sujet important pour l'économie circulaire
durable, un système régénératif dans lequel l'apport de ressources et les déchets, les
émissions et les fuites d'énergie sont minimisés. Actuellement, l'eau récupérée est
principalement utilisée pour l'irrigation agricole, en particulier dans les régions semi-
arides et arides, pour surmonter la pénurie d'eau ( Becerra-Castro et al., 2015 ). La
connaissance limitée des avantages potentiels parmi les utilisateurs finaux ciblés et
l'absence d'un cadre favorable et cohérent pour la réutilisation de l'eau sont les
principales raisons qui justifient la réduction de cette pratique dans l'UE ( CE,
2017a ). Les eaux usées contiennent généralement des micro-organismes pathogènes,
dont beaucoup sont capables de survivre dans l'environnement et d'être transmis aux
humains par le biais de produits frais ( EPA, 2004 ; López-Gálvez et al.,
2016a , Steele et Odumeru, 2004 , Uyttendaele et al., 2015 ). Bien que les traitements
de valorisation puissent améliorer la qualité microbiologique de l'eau, les effluents des
stations d'épuration des eaux usées peuvent être porteurs de risques microbiologiques
et chimiques pouvant affecter la sécurité des légumes irrigués ( Pérez-Sautu et al.,
2012 ). En fait, la sécurité microbiologique de l'eau d'irrigation est l'un des facteurs les
plus importants à prendre en compte dans la production de légumes-feuilles ( Allende
et Monaghan, 2015 , Decol et al., 2017 , Uyttendaele et al., 2015 ).
Les traitements de désinfection chimique sont souvent utilisés comme traitements
tertiaires pour la valorisation des eaux usées municipales. Parmi les désinfectants
chimiques, le chlore est l’un des biocides les plus couramment utilisés pour la
désinfection des eaux usées et le traitement des eaux d’irrigation. Cependant, le chlore
est très réactif avec la matière organique et provoque la génération de sous-produits
de désinfection organo-halogénés (par exemple les trihalométhanes et les acides
haloacétiques) ( Ayyildiz et al., 2009 , Nikolaou et Lekkas, 2001 , Rodriguez et
Serodes, 2001 ). Le dioxyde de chlore (ClO 2 ) a été défini comme une alternative
potentielle au chlore pour la désinfection de l'eau agricole. Le principal avantage du
ClO 2 par rapport au chlore est la formation de moins de types et de moindres
quantités de sous-produits organo-halogénés ( López-Gálvez et al., 2010 , Van Haute
et al., 2015 , Van Haute et al., 2017 , Veschetti et al., 2003 ). Cependant, l'utilisation
de ClO 2 peut entraîner la présence d'autres SPD tels que des chlorites (ClO 2 − ) et des
chlorates (ClO 3 − ) dans l'eau traitée via des réactions de dismutation ( AHDB,
2016 ). Le ClO 2 présente une capacité d'oxydation et une capacité bactéricide plus
élevées que le chlore ( Hassenberg, Geyer, Mauerer, Praeger et Herppich,
2017 ). L'efficacité bactéricide du ClO 2 dépend de plusieurs facteurs, notamment la
dose de désinfectant, le temps de contact, la température de l'eau, le pH et la charge
organique ( Junli et al., 1997 , Ayyildiz et al., 2009 ).
L'irrigation par aspersion est le système d'irrigation le plus utilisé pour la croissance
commerciale des jeunes feuilles ( Oron, 2002 , Pachepsky et al., 2011 ). Les
législations espagnole et américaine actuelles classent l'eau récupérée sur la base de
normes microbiologiques spécifiques en différentes catégories, chacune pour des
cultures et un système d'irrigation spécifiques ( Real Decreto 1620/2007, 2007 ). Par
exemple, seule l’eau récupérée contenant moins de 2 log UFC E. coli /100 mL peut
être appliquée en contact direct avec la partie comestible de la culture par irrigation
aérienne.
La méthode d’irrigation peut influencer l’efficacité avec laquelle les agents
pathogènes présents dans l’eau d’irrigation sont transmis aux plantes. L'irrigation
goutte à goutte ou de surface peut minimiser le contact des cultures avec les
contaminants présents dans l'eau d'irrigation, par rapport à l'irrigation par aspersion,
car les parties comestibles des plantes ne sont pas en contact direct avec l'eau ( Steele
et Odumeru, 2004 ).
Sur la base de ces facteurs, le but de la présente étude était d'évaluer l'adéquation du
ClO 2 pour la réduction de la contamination microbiologique présente dans les eaux
usées traitées secondairement utilisées pour l'irrigation par aspersion des jeunes
laitues cultivées commercialement. L'effet du ClO 2 sur la concentration de
l'indicateur fécal E. coli et sur la présence des bactéries pathogènes Shiga-
toxigène Escherichia coli (STEC) et Salmonella spp. ont été évalués. Ces micro-
organismes pathogènes ont été sélectionnés comme étant les agents pathogènes
d'origine alimentaire les plus pertinents sur les légumes-feuilles ( Ahmed et al.,
2012 , Decol et al., 2017 , EFSA et ECDC, 2015 , Ferguson et al., 2012 ). De plus, la
présence potentielle de chlorates dans l'eau et dans les plantes irriguées a été évaluée.

2 . Matériels et méthodes
2.1 . Montage expérimental

Dix plants de laitue frisée de chêne rouge d'un jour obtenus auprès d'une pépinière
locale (Semilleros Jimenado SA, Torre Pacheco, Espagne) ont été cultivés dans une
serre située à côté de la station d'épuration des eaux usées (STEP) (Murcie, Espagne)
(37°47′48 ″N, 0°57′33″O). L'acquisition de données, y compris les données
climatologiques et la configuration du système d'irrigation, a été décrite dans des
études antérieures ( López-Gálvez, Allende, Pedrero-Salcedo, Alarcon et Gil,
2014 ). Dans la présente étude, deux types d’eau ont été utilisés pour le système
d’irrigation aérienne. Le premier type d’eau était l’effluent secondaire de la STEP
(SW) obtenu par le traitement des eaux usées municipales. Le traitement secondaire
consistait en des systèmes de boues activées suivis d'une coagulation-floculation pour
l'élimination des matières en suspension, des colloïdes et des matières organiques
présentes dans les eaux usées ( López-Gálvez et al., 2016b , Renault et al., 2009 ). Le
deuxième type d'eau d'irrigation était constitué d'effluents secondaires de la STEP
traités au dioxyde de chlore (ClO 2 W). Les plantes ont été cultivées sur des plateaux
avec de la tourbe comme substrat. Au total, huit plateaux de laitue contenant chacun
294 plants ont été utilisés pour chaque type d’eau d’irrigation.
Deux tests préliminaires ont été réalisés afin d'ajuster les doses de ClO 2 et les
conditions expérimentales de croissance des salades. Pour le choix des doses
optimales de désinfectant, la réduction d' E. coli dans l'eau et les effets phytotoxiques
sur les plantes ont été pris en compte. En novembre et décembre 2016, une dernière
expérience d'une durée de 21 jours a été réalisée dans les conditions optimales
précédemment établies. Dans l’expérience finale, les températures minimales et
maximales à l’intérieur de la serre étaient respectivement de 14,4 °C et 28,3 °C, avec
une moyenne de 17,2 °C. L'humidité relative (HR) dans la serre variait de 52,6 % à
91,6 % avec une moyenne de 76,8 %. La durée du jour pendant cette période était
d'environ 10 heures. La quantité totale approximative d'eau d'irrigation appliquée tout
au long de l'expérience était de 1,6 m 3 par traitement. Au cours du cycle de
croissance, les plants de laitue ont été irrigués une fois par jour pendant 5 à 15
minutes.
Au cours des expériences, la concentration d' E. coli cultivables et présumées viables ,
ainsi que la présence de bactéries pathogènes ont été évaluées dans des échantillons
d'eau et de laitue. De plus, la concentration résiduelle de ClO 2 et d'autres paramètres
physicochimiques de l'eau d'irrigation tels que le pH, la température, le potentiel
d'oxydo-réduction (ORP), l'absorbance à 254 nm (UV254) et la concentration de
chlorates (ClO 3 − ) ont été analysés.

2.2 . Préparation, mesure et application du dioxyde de chlore

La société Servicios Técnicos de Canarias (STC SLU, Las Palmas de Gran Canaria,
Espagne) a fourni des réactifs et des instructions pour la préparation de la solution
stable de dioxyde de chlore AGRI DIS ® (ClO 2 ). Une solution concentrée de
ClO 2 (7000 mg/L) a été préparée chaque semaine et conservée dans un jerrycan en
plastique opaque à température ambiante. La mesure chronoampérométrique de la
concentration en ClO 2 a été réalisée à l'aide de l'équipement
ChlordioXense ® (Palintest, Gateshead, Royaume-Uni). Une solution diluée de
ClO 2 (100 à 300 mg/L de ClO 2 ) a été préparée quotidiennement juste avant de
commencer l'irrigation en utilisant la solution concentrée de ClO 2 et de l'eau du
robinet. La solution diluée de ClO 2 a été pompée directement vers les canalisations à
l'aide d'une pompe péristaltique. La longueur du tuyau et le temps de contact entre le
point d'application de ClO 2 et les arroseurs étaient respectivement d'environ 50 m et
d'environ 6 minutes. Les doses de ClO 2 appliquées ont été sélectionnées en fonction
des résultats des essais préliminaires.

2.3 . Collecte d'échantillons

L'échantillonnage de l'eau a été effectué tous les 2 à 5 jours pendant le cycle de

croissance de la laitue. L'eau d'irrigation a été échantillonnée lors de l'irrigation de la
laitue à partir des émetteurs d'arrosage situés à l'extrémité des lignes
d'irrigation. Chaque jour d'échantillonnage, trois à cinq échantillons d'eau de 2 L ont
été prélevés à l'aide de bocaux en plastique stériles. Pour l'analyse microbiologique,
afin d'éteindre le ClO 2 résiduel , 5 ml de thiosulfate de sodium (17,5 g/L) ont été ajoutés
aux échantillons de ClO 2 W. Un total de n = 74 échantillons d'eau (38 échantillons de
SW et 36 échantillons de ClO 2 W) ont été collectés au cours de huit jours
d'échantillonnage différents tout au long du cycle de croissance de la laitue. Pour
l'analyse des bactéries pathogènes, un échantillon de 10 L par traitement a été prélevé
chaque jour d'échantillonnage (n = 16). De plus, pour la mesure des chlorates, trois
échantillons (45 ml) par traitement (n = 74) ont été prélevés chaque jour
d'échantillonnage.
L'échantillonnage de la laitue a été effectué 5 fois au cours des deux dernières
semaines du cycle de croissance de la laitue. Des échantillons ont été prélevés tous les
2 à 5 jours et le dernier échantillonnage a été effectué à la fin du cycle. Chaque jour
d'échantillonnage, trois échantillons (60 g chacun) par traitement ont été prélevés de
manière aseptique et transportés au laboratoire dans des conditions réfrigérées. Un
total de n = 30 échantillons de laitue ont été collectés (15 échantillons par traitement)
au cours de cinq jours d'échantillonnage différents. Des échantillons de laitue ont
toujours été prélevés avant l'irrigation.

2.4 . Analyse d'E. coli

La quantification d'E. coli cultivables a été réalisée sur des échantillons d'eau et de
laitue. Pour les échantillons d’eau, en fonction de la concentration attendue d’E. coli ,
un étalement par coulée (1 ml) et/ou une filtration sur membrane (10 et 100 ml) ont
été utilisés. Les échantillons ont été filtrés sur des filtres à membrane de 0, 45 µm
(Sartorius, Madrid, Espagne) à l'aide d'un collecteur porte-filtre (Millipore, Madrid,
Espagne). La gélose Chromocult coliformes (Merck, Darmstadt, Allemagne) a été
utilisée pour l'incubation sur membrane et l'étalement par coulée. Les plaques ont été
incubées pendant 24 h à 37 °C avant l'interprétation des résultats. Les colonies bleu-
violet foncé ont été considérées comme positives pour E. coli . Pour les échantillons
de laitue, 25 g ont été homogénéisés dans 100 ml d'eau peptonée stérile tamponnée à
0,1% (BPW, Scharlab, Barcelone, Espagne) pour la quantification d' E. coli cultivable
. L'homogénat a été dilué en série et des aliquotes de 1 ml ont été versées sur plaque
en utilisant de la gélose coliforme Chromocult. L'incubation des plaques et
l'interprétation des résultats ont été effectuées comme expliqué précédemment pour
les échantillons d'eau.
La quantification moléculaire d' E. coli dans l'eau d'irrigation et la laitue infantile a été
réalisée suite à l'utilisation combinée de monoazide de propidium (PMA, Biotium Inc,
Hayward, Californie, États-Unis) et d'une réaction en chaîne par polymérase
quantitative (q-PCR) (PMA-qPCR) comme précédemment. décrit dans Truchado et
al. (2016) avec quelques modifications. Trois échantillons d'eau (200 ml) par
traitement (SW et ClO 2 W) et jour d'échantillonnage ont été centrifugés à 3 000 g
pendant 20 min. Dans le cas des échantillons de laitue, trois échantillons (25 g
chacun) ont été homogénéisés dans 100 ml de BPW stérile à 0,1% à l'aide d'un
Stomacher à basse vitesse pendant 1 min. L'homogénat de chaque échantillon a été
centrifugé à 3 000 g pendant 10 min. Ensuite, chaque culot obtenu a été activé avec du
PMA (20 µM) et conservé à -20 ° C jusqu'à ce que l'extraction de l'ADN soit
réalisée. Le kit de purification d'ADN et d'ARN Master Pure TM Complete
(Epicentre, Madison, USA) suivant les instructions du fabricant a été utilisé. Pour la
quantification moléculaire, les amorces et les sondes de détection des gènes de l'ARNr
23S d' E. coli ainsi que la procédure PMA-qPCR étaient identiques à celles décrites
précédemment ( Truchado et al., 2016 ). Les courbes standard ont été établies en
utilisant des concentrations connues d'ADN génomique isolé de E. coli CECT
515T. La concentration d'E. coli dans la solution mère a été vérifiée par étalement sur
PCA.

2.5 . Détection de micro-organismes pathogènes

Pour la détection d' E. coli shiga-toxigène (STEC), d'E. coli O157:H7 et de

Salmonella spp. dans les échantillons d'eau, des échantillons de 10 L ont été filtrés en
serre à l'aide d'écouvillons de Moore modifiés (MMS), comme décrit précédemment
( Sbodio, Maeda, López-Velasco et Suslow, 2013 ). Le MMS a été transféré de
manière aseptique dans des sacs en plastique Stomacher stériles et transporté au
laboratoire dans des conditions réfrigérées. Une fois au laboratoire, 200 ml d'eau
peptonée tamponnée à 20 g/L (Scharlab, Barcelone, Espagne) ont été ajoutés aux sacs
qui ont été incubés pendant 24 h à 37 °C pour enrichissement. Après incubation, un
volume de 7 mL a été transféré dans des tubes à centrifuger de 15 mL et conservé à -
20 °C avec 30 % de glycérol jusqu'à ce que les analyses soient effectuées.
Pour les analyses des échantillons de laitue, l'homogénat décrit au paragraphe 2.3.1 a
été additionné de 125 mL de BPW (40 g/L) et homogénéisé en massant à la main les
sacs Stomacher. Ensuite, les sacs ont été incubés pendant 24 h à 37 °C pour
enrichissement, puis un volume de 7 ml a été transféré dans des tubes à centrifuger de
15 ml et conservé à -20 °C avec 30 % de glycérol jusqu'à ce que les analyses soient
effectuées.
Des aliquotes de 1 ml de chaque échantillon congelé ont été ajoutées à 9 ml de
bouillon d'enrichissement sélectif spécifique des agents pathogènes cibles. De l'eau
peptonée tamponnée modifiée (20 g/L) additionnée de pyruvate de sodium (Scharlau,
Barcelone, Espagne ; mBPWp) incubée pendant 24 h à 42 °C a été utilisée pour STEC
et E. coli O157:H7. Un bouillon de tétrathionate (TT; Scharlau) incubé pendant 24 h à
37 ° C a été utilisé pour Salmonella . La prévalence des micro-organismes pathogènes
dans les échantillons d'eau (n = 16) et de laitue (n = 30) a été réalisée à l'aide du pack
Salmonella-STEC GeneDisc dans une PCR multiplex Genedisc Cycler
(Pall ® Corporation, WA, USA) en suivant les instructions du fabricant. La
confirmation des échantillons présumés positifs a été réalisée par isolement dans des
milieux de culture sélectifs. Pour STEC, CHROMagar STEC (CHROMagar, Paris,
France) incubé pendant 24 h à 37 ° C a été utilisé. Pour E. coli O157:H7, deux
milieux de culture ont été utilisés : CT-SMAC (Scharlab, Barcelone, Espagne) et
CHROMagar O157 (CHROMagar, Paris, France), suivis d'une confirmation
supplémentaire à l'aide d'un test au latex (Oxoid, Basingstoke, Royaume-
Uni). . Pour Salmonella , la méthode IBISA (AES Chemunex, Bruz, France) a été
utilisée, suivie d'une confirmation supplémentaire par un test au latex (Oxoid,
Basingstoke, UK).

2.6 . Analyse physicochimique de l'eau d'irrigation

La température, le pH et l'ORP ont été mesurés à l'aide d'un multimètre (pH et redox
26, Crison, Barcelone, Espagne). Pour mesurer l'UV254, l'eau a été filtrée à travers
des filtres en nylon pour seringue de 0, 45 µm (Fisherbrand-Fisher Scientific,
Waltham, États-Unis), un spectrophotomètre UV-VIS (Jasco V-630, Tokyo, Japon) et
des cuvettes en quartz d'une longueur de trajet de 1 cm. (Hellma, Müllheim,
Allemagne) ont été utilisés.

2.7 . Présence de chlorates dans l'eau d'irrigation et dans la laitue

La teneur en chlorates (ClO 3 − ) dans l'eau et la laitue a été analysée par LC-MS
comme décrit dans Gil, Marín, Andujar et Allende (2016) , en utilisant un étalon
analytique de chlorate (RTC, ICS-004-100, Fluka, Sigma -Aldrich, Espagne) pour la
quantification. Les zones des pics détectés par MS ont été utilisées pour la
quantification des chlorates. Les résultats ont été exprimés en mg/L et en mg/kg pour
les échantillons d'eau et de laitue, respectivement.

2.8 . analyses statistiques

Les décomptes dérivés des analyses microbiologiques ont été transformés en log et
saisis dans une feuille de calcul Excel (Microsoft Excel, 2016). Les résultats ont été
compilés et des graphiques ont été réalisés à l'aide de Sigma Plot 11.0 Systat
Software, Inc. (Addilink Software Scientific, SL Barcelone). Les statistiques SPSS 21
(IBM, Armonk, NY, USA) ont été utilisées pour l'analyse statistique à un niveau de
signification de 5 % (p = 0,05). Le test de Kolmogorov – Smirnov et le test de Levene
ont été utilisés pour évaluer respectivement la normalité et l'égalité de
variance. Lorsque les données ne suivaient pas une distribution normale, des tests non
paramétriques étaient appliqués. Les tests Mann – Whitney U et Kruskal – Wallis ont
été utilisés pour déterminer la différence entre les données brutes des indicateurs et la
présence d'agents pathogènes. Le coefficient de corrélation de Pearson a été calculé (p
< 0,01) pour évaluer les liens entre les caractéristiques physico-chimiques des eaux
usées (SW et ClO 2 W).

3 . Résultats et discussion
3.1 . Traitement ClO 2
 Dans notre étude, la concentration initiale de ClO 2 appliquée pour le traitement des
eaux usées secondaires variait entre 3,3 et 9,2 mg/L. Ces doses initiales de
ClO 2 étaient nécessaires pour réduire les niveaux d' E. coli dans l'eau récupérée en
dessous de 2 log CFU/100 mL, qui est le seuil recommandé pour l'eau d'irrigation
dans les lignes directrices traitant des risques microbiologiques des fruits et légumes
frais lors de la production primaire ( CE , 2017b ). La figure 1 montre les niveaux
initiaux et résiduels de ClO 2 dans les échantillons de ClO 2 W prélevés les jours où
des échantillons d'eau et de laitue ont été prélevés pour analyse microbiologique et
physico-chimique. Le temps de contact entre le ClO 2 et l'eau récupérée dans le
système de distribution d'irrigation était d'environ 6 minutes. Dans tous les cas, le
ClO 2 résiduel dans les eaux usées tel que mesuré dans l'émetteur d'irrigation était
inférieur à 1 mg/L (<0,02–0,33 mg/L) pour éviter tout dommage de phytotoxicité sur
les plantes ( WEAH, 2016 ).

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Fig. 1 . Concentrations initiales et résiduelles de dioxyde de chlore (ClO 2 ) dans l'eau
traitée provenant de l'effluent secondaire d'une station d'épuration (ClO 2 W) utilisée
pour l'irrigation de la laitue cultivée en serre. La figure montre uniquement les
données obtenues les jours où des échantillons de laitue et d'eau ont été prélevés pour
les analyses microbiologiques et physico-chimiques.
L'absorbance à 254 nm (UV254) a été mesurée comme indicateur de la teneur en
matière organique du système de distribution d'eau d'irrigation. Les valeurs d'UV254
pour SW variaient entre 0,05 et 1,36 cm −1 . Sur la base d'études antérieures, l'ordre
croissant de réactivité de certains désinfectants couramment utilisés dans le traitement
des eaux usées contenant des matières organiques est le suivant : acide peracétique <
ClO 2 <chlore < ozone ( Hassenberg et al., 2017 , Van Haute et al., 2017 , Veschetti et
coll., 2003 ). Bien que le ClO 2 soit moins réactif avec la matière organique que le
chlore ( Rodriguez et Serodes, 2001 , Van Haute et al., 2015 ), la concentration de
ClO 2 est affectée par la présence de matière organique. Dans la présente étude, la
concentration de matière organique dans l'eau a influencé la concentration résiduelle
de ClO 2 . Par exemple, lorsque des concentrations plus faibles de matière organique
ont été observées (UV254 = 0,05 cm −1 au jour 4 et 0,08 cm −1 au jour 6), des résidus
de ClO 2 plus élevés ont été détectés (0,26 et 0,33 mg/L) ( Fig. 1 ). . Une corrélation
négative significative (p < 0,01) de −0,508 a été trouvée entre la concentration
résiduelle de ClO 2 et l'UV254. Des résultats similaires ont été décrits dans d'autres
études ( Hassenberg et al., 2017 , Praeger et al., 2016 , Tomás-Callejas et al.,
2012 , Van Haute et al., 2017 ).

3.2 . Modifications de la qualité microbiologique de l'eau d'irrigation

par le dioxyde de chlore

Dans notre étude, lorsque les échantillons SW et ClO 2 W ont été analysés par des
méthodes conventionnelles de comptage sur plaque, des différences significatives (p <
0,05) dans le nombre d' E. coli ont été observées ( Fig. 2 A). Les comptes d'E.
coli dans les échantillons SW et ClO 2 W variaient respectivement entre 2,00 et 4,76
log CFU/100 mL (IQR = 3,32 à 3,82) et entre 0,70 et 3,49 log CFU/100 mL (IQR =
1,59 à 2,18). En considérant les comptes moyens de SW et de ClO 2 W, il a été
possible de calculer une réduction moyenne de 2,21 log CFU/100 mL. Cependant,
lorsque les niveaux d'E. coli ont été quantifiés à l'aide de la méthode PMA-qPCR, la
différence moyenne dans les dénombrements d'E. coli entre SW et ClO 2 W était de
1,07 unités logarithmiques, et aucune différence significative n'a été détectée (p >
0,05) ( Fig. 2 B). Les niveaux d'E. coli dans les échantillons SW et ClO 2 W,
déterminés par PMA-qPCR, étaient respectivement de 3,17 à 6,27 log cellules/100 ml
(IQR 4,19-5,10) et de 2,71 à 5,46 log cellules/100 ml (IQR 3,66-4,54) ( Figure
2B ). En accord avec nos résultats, certaines études ont rapporté que les niveaux de
cellules E. coli quantifiés par le test PMA-qPCR dans différents échantillons d'eau tels
que l'eau potable, les eaux usées, l'eau d'irrigation et l'eau de mer étaient supérieurs à
ceux obtenus par des techniques basées sur la culture ( Gensberger et al., 2014 , Li et
al., 2014 , López-Gálvez et al., 2018a , Truchado et al., 2016 , Van Frankenhuyzen et
al., 2013 ). Le PMA est un colorant de liaison photoréactif à l'ADN, qui permet la
différenciation entre les cellules viables et mortes, évitant une surestimation des
résultats par qPCR ( Gensberger et al., 2014 , Truchado et al., 2016 ). Par conséquent,
les différences observées entre la PMA-qPCR et le nombre de plaques peuvent être
dues à la présence de bactéries viables mais non cultivables (VBNC). Les résultats
obtenus pourraient indiquer une action bactériostatique du ClO 2 , pouvant induire
l'entrée des cellules d'E. coli dans un état VBNC. Oliver, Dagher et Linden (2005) ont
rapporté que le stade VBNC peut être induit lorsque des micro-organismes sont
exposés à des désinfectants chimiques. La présence de bactéries VBNC dans les eaux
usées récupérées en raison des processus de récupération de l'eau a déjà été démontrée
( Kibbee et Örmeci, 2017 , Lin et al., 2016 , Zhang et al., 2015 ). Récemment, Kibbee
et Örmeci (2017) ont évalué les niveaux d' E. coliprésent dans les effluents d’eaux
usées secondaires après désinfection au chlore, ce qui montre qu’un nombre élevé de
VBNC E. coli survivent à la chloration. Par conséquent, l'utilisation de méthodes
conventionnelles de comptage sur plaque pourrait conduire à une surestimation de
l'efficacité des traitements de désinfection de l'eau ( Zhang et al., 2015 ). Il convient
de prendre en compte que la seule méthode de culture utilisée dans la présente étude
 pour détecter les cellules d'E. coli blessées après traitement reposait sur l'utilisation
d'un milieu de culture sélectif et une incubation de 24 h à 37 °C.

1. Télécharger : Télécharger l'image haute résolution (158 Ko)

2. Télécharger : Télécharger l'image en taille réelle
Figure 2 . Boxplot représentant les comptes d'E. coli (log CFU/100 mL) de l'eau
provenant de l'effluent secondaire d'une station d'épuration des eaux usées non traitée
(SW) et traitée au ClO 2 (ClO 2 W) utilisée pour l'irrigation de la laitue cultivée en
serre. (A) Comptes obtenus par la méthode conventionnelle de comptage sur
plaque. (B) Comptes obtenus par la méthode de quantification moléculaire PMA-
qPCR. Dans un boxplot, le bas et le haut des cases représentent les quartiles (25e et
75e percentile), la ligne à l'intérieur de la case représentant la médiane. Différentes
lettres indiquent des différences significatives (p < 0,05).
Plusieurs études ont montré que différents facteurs peuvent influencer l'effet
bactéricide du ClO 2 ( Ayyildiz et al., 2009 , Junli et al., 1997 ). Parmi les plus
importants figurent la température, le pH et la présence de matière organique. La
température de l'eau peut fortement influencer la capacité d'inactivation microbienne
du ClO 2 . Barbeau, Desjardins, Mysore et Prevost (2005) ont observé que 0,25 mg/L
de ClO 2 libre suffisait pour inactiver 99 % des E. coli dans l'eau après 16 s à 30
°C. Cependant, lorsque la température de l’eau était de 5 °C, la même réduction
n’était atteinte qu’au bout de 110 s. Junli et coll. (1997) ont rapporté qu'une
augmentation de 10 °C de la température de l'eau double le pouvoir d'inactivation du
ClO 2 contre les micro-organismes. Bien que ces études aient rapporté l'influence de la
température sur la capacité d'inactivation microbiologique du ClO 2 , cette influence
n'a pas été observée dans la présente étude. Les réductions d' E. coli observées dans
les eaux usées récupérées n'ont démontré aucune corrélation avec la température de
l'eau (p > 0,01), ce qui peut être dû à la plage étroite de variation de température de
l'eau d'irrigation (15,2 à 19,3 °C) ( Tableau 1 ).
Tableau 1 . pH, température et potentiel d'oxydoréduction (ORP) d'effluents secondaires d'une
station d'épuration non traités (SW) et traités au ClO 2 (ClO 2 W) pour l'irrigation de jeunes laitues
cultivées en serre.

Jours avant la Logiciel ClO2W _ _

récolte
pH Température Redox pH Température Redox
(°C) (mV) (°C) (mV)
20 6.43 19.3 472 6.36 19.1 477
18 6.34 16.7 482 6.38 16.7 493
13 6.31 19.2 463 6.57 20,0 460
11 7h60 – – 7h75 – –
6 8.13 16,5 431 7,95 16.9 432
4 8.01 15.2 514 7,89 15.3 791
0 7.58 16.9 450 7.51 17,0 698
À l’échelle mondiale, la demande en eau devrait augmenter considérablement au
cours des prochaines décennies. Selon WWAP (2017) , plus de 70 % de l’eau
consommée dans le monde est utilisée pour l’irrigation agricole. Il existe donc un
grand potentiel d'utilisation de l'eau récupérée pour l'irrigation ( OMS, 2006 ). Pour
évaluer l'adéquation microbiologique des eaux usées municipales récupérées pour
l'irrigation agricole, les recommandations et les limites microbiologiques décrites
dans les lignes directrices et les réglementations doivent être utilisées. Par exemple,
l'Organisation mondiale de la santé ( OMS, 2006 ) recommande que les eaux usées
utilisées pour l'irrigation des cultures agricoles susceptibles d'être consommées crues
aient un niveau de coliformes fécaux ≤ 10 3 CFU/100 mL. Aux États-Unis, la Food
and Drug Administration (FDA) a établi une limite de 23 UFC/100 mL pour la
concentration d'E. coli dans l'eau d'irrigation agricole en cas de contact direct avec le
produit ( Sugano et al., 2016 ). En Italie, la limite de concentration d'E. coli dans les
eaux usées traitées utilisées pour l'irrigation agricole est de 10 CFU/100 mL ( Decreto
Ministryiale, 2003 ). La législation espagnole établit dans l'eau récupérée en contact
direct avec les produits consommés crus un maximum de 10 2 – 10 3 UFC d' E.
coli par 100 mL d'eau d'irrigation (nombre d'unités d'échantillonnage (n) = 10, valeur
seuil pour le nombre d' E. coli . coli (m) = 100 CFU/100 mL, valeur maximale (M) =
1 000 CFU/100 mL, nombre d'unités d'échantillonnage où le nombre d'E. coli peut
être compris entre m et M (c) = 3) ( Real Decreto 1620 /2007, 2007 ).
Dans la présente étude, la concentration d’E. coli était supérieure au seuil de 2 log/100
mL dans tous les échantillons SW analysés. D'autre part, grâce au traitement avec
ClO 2 , 69,4 % des échantillons de ClO 2 W (25 sur 36) étaient conformes à la
législation espagnole pour E. coli ( Real Decreto 1620/2007, 2007 ) basée sur des
plaques conventionnelles. techniques de comptage. Par conséquent, même après
traitement au ClO 2 , 30,6 % des échantillons de ClO 2 W n'étaient pas acceptables
pour être utilisés dans l'irrigation par aspersion des légumes verts à feuilles crus
consommés, conformément à la législation espagnole.

3.3 . Caractéristiques microbiologiques d'une jeune laitue irriguée avec

de l'eau récupérée désinfectée au dioxyde de chlore

Le nombre d'E. coli cultivables dans les jeunes laitues irriguées avec SW et ClO 2 W
variait respectivement entre <0,70 et 2,90 log CFU/g (IQR 0,69-1,30) et entre <0,70
et 1,40 log CFU/g (IQR 0,69-0,69), tout au long de la période d'échantillonnage ( Fig.
3 A). Des différences significatives (p < 0,05) dans le nombre d'E. coli cultivables ont
été observées entre les jeunes laitues irriguées avec du SW et du ClO 2 W. Ces
différences pourraient s'expliquer par la contamination microbienne plus élevée du
SW qui a provoqué une contamination plus élevée sur toute la période de
croissance. Des résultats similaires ont été démontrés par Makkaew, Miller, Cromar et
Fallowfield (2016) et Amahmid, Asmama et Bouhoum (1999) en étudiant l'influence
de différents niveaux de contamination par E. coli présents dans les bassins de
stabilisation des eaux usées en Australie-Méridionale et la rétention d' E. coli par
rapport aux autres types de laitues. Dans notre étude, nous avons utilisé la variété Red
Oak Leaf, dont la morphologie/topographie pourrait avoir contribué à la rétention
d' E. coli .
1. Télécharger : Télécharger l'image haute résolution (117 Ko)
2. Télécharger : Télécharger l'image en taille réelle
Figure 3 . Boxplot représentant les décomptes d'E. coli (log UFC/g) de jeunes laitues
irriguées avec de l'eau provenant de l'effluent secondaire d'une station d'épuration non
traitée (SW) et traitée au ClO 2 (ClO 2 W) et cultivées en serre. (A) Comptes obtenus par
la méthode conventionnelle de comptage sur plaque. (B) Comptes obtenus par la
méthode de quantification moléculaire PMA-qPCR. Dans un boxplot, le bas et le haut
des cases représentent les quartiles (25e et 75e percentile), la ligne à l'intérieur de la
case représentant la médiane. Différentes lettres indiquent des différences
significatives (p < 0,05).
Les dénombrements d'E. coli utilisant la PMA-qPCR ont donné des comptes dans la
laitue irriguée SW et ClO 2 W de 2,17 à 3,83 log cellules/g (IQR 2,83 à 3,25) et de
2,18 à 3,31 log cellules/g (IQR 2,55 à 2,98), respectivement ( Fig. .3B ). L'analyse
PMA-qPCR a abouti à des comptes logarithmiques d'environ 2 unités logarithmiques
supérieurs à ceux des mêmes échantillons analysés par la méthode de placage, en
accord avec les résultats précédents ( Truchado et al., 2016 ). Comme mentionné
précédemment pour les échantillons d’eau, les différences observées entre les
méthodes de comptage sur plaque et PMA-qPCR pourraient être dues à la présence de
VBNC E. coli par le biocide et au stress induit par les conditions
environnementales. La phyllosphère est un habitat hostile pour les micro-organismes
en raison du manque de nutriments, des changements de température et de l'exposition
au rayonnement solaire, qui peuvent induire l'état VBNC de la bactérie ( Wilson &
Lindow, 2000 ). Ce phénomène doit être considéré avec prudence car les bactéries
peuvent persister de longues périodes dans cet état et elles pourraient conserver leur
potentiel virulent ( Dinu & Bach, 2011 ).

3.4 . Corrélation entre les niveaux d'E. coli et la présence/absence

d'agents pathogènes

La présence d'agents pathogènes a été détectée par PCR multiplex dans 9 échantillons
sur 16 de tous les échantillons d'eau d'irrigation (56,2 %). Parmi les échantillons
positifs, 8 échantillons ont été confirmés par des tests sur milieux sélectifs et
d’agglutination au latex. Sept sur huit correspondaient à SW (1 Salmonella et 6
STEC) alors qu'un seul échantillon de ClO 2 W était positif à STEC. Pour les
échantillons de laitue, la présence d'agents pathogènes a été détectée dans 4
échantillons sur 33 (13,33%), par une PCR multiplex. Seul un échantillon de laitue
irrigué avec SW a été confirmé pour la présence de STEC à l'aide de tests sur milieux
sélectifs et d'agglutination au latex. E. coli O157:H7 n'a été confirmé dans aucun
échantillon d'eau ou de laitue ( Tableau 2 ).
Tableau 2 . Présence et absence de micro-organismes pathogènes dans des échantillons d'eau et de
laitues irriguées avec des effluents secondaires d'une station d'épuration non traités (SW) et traités
au ClO 2 (ClO 2 W) pour l'irrigation lors d'une culture en serre.

Type d'échantillons Salmonelle STEC E. coli O157:H7

Eau Génédisc® _ Confirmé Génédisc® _ Confirmé Génédisc® _ Confirmé
Logiciel 5/8 1/5 7/8 6/7 6/8 0/6
ClO2W _ _ 1/8 0/1 1/8 1/1 1/8 0/1
Laitue Génédisc® _ Confirmé Génédisc® _ Confirmé Génédisc® _ Confirmé
 Type d'échantillons Salmonelle STEC E. coli O157:H7
Logiciel 2/15 0/2 2/15 1/2 1/15 0/1
ClO2W _ _ 2/15 0/2 1/15 0/1 1/15 0/1
La figure 4 montre la relation entre les niveaux d'E. coli dénombrés à l'aide des
méthodes de numération sur plaque et de PMA-qPCR et la présence/absence de
bactéries pathogènes dans les échantillons d'eau d'irrigation. Pour les deux méthodes
de quantification (numération sur plaque et PMA-qPCR), les échantillons positifs
pour les bactéries pathogènes présentaient des taux d'E. coli significativement plus
élevés que les échantillons négatifs pour la présence de bactéries pathogènes ( test
U de Mann-Whitney , p < 0,05) ( Fig. 4 B). . La seule exception concernait le SW,
où E. coli était dénombré à l'aide de méthodes d'étalement conventionnelles, ce qui
pourrait être dû aux niveaux élevés d' E. coli trouvés dans les échantillons positifs et
négatifs pour les bactéries pathogènes. Corroborant ces résultats, Ferguson et
al. (2012) et Truchado et al. (2016) ont indiqué que les techniques moléculaires sont
des techniques appropriées pour prédire la présence potentielle de bactéries
pathogènes dans les eaux souterraines et dans les eaux de récupération secondaire,
respectivement.

1. Télécharger : Télécharger l'image haute résolution (151 Ko)

2. Télécharger : Télécharger l'image en taille réelle
Figure 4 . Boxplot représentant le nombre d'E. coli (log UFC/100 mL) dans le sous-
ensemble d'échantillons d'eau avec absence ou présence d'agents pathogènes dans
l'eau provenant de l'effluent secondaire d'une usine de traitement des eaux usées non
traité (SW) et traité au ClO 2 (ClO 2 W ) utilisé pour l'irrigation de la laitue cultivée en
serre. (A) Comptes d’E. coli obtenus par la méthode conventionnelle de comptage sur
plaque. (B) Nombre d’ E. coli obtenu par la méthode de quantification PMA-
qPCR. Dans un boxplot, le bas et le haut des cases représentent les quartiles (25e et
75e percentile), la ligne à l'intérieur de la case représentant la médiane. Différentes
lettres indiquent des différences significatives (p < 0,05).
D'autres études ont également trouvé une corrélation entre les niveaux d'E. coli et la
présence de STEC et de Salmonella en milieu agricole ( Ceuppens et al.,
2014 , Holvoet et al., 2014 , López-Gálvez et al., 2014 , Park et al., 2014 ; Truchado,
Hernandez, Gil, Ivanek et Allende, 2018 ). Ces résultats soutiennent l'hypothèse selon
laquelle E. coli est un bon indicateur microbien de la contamination fécale et de
l'association avec des pathogènes entériques.

3.5 . Présence de chlorates dans l'eau récupérée traitée au dioxyde de

chlore et dans la laitue irriguée

Le ClO 2 a été récemment utilisé comme alternative au chlore car il ne conduit pas à la
formation de SPD chlorés après réaction avec la matière organique. Cependant, des
ions chlorite et chlorate (ClO 2 − , ClO 3 − ) peuvent se former en raison de réactions de
dismutation, et ce sont les principaux SPD du ClO 2 qui peuvent présenter un risque
important pour la santé humaine.
Lorsque des échantillons d'eau d'irrigation ont été analysés pour détecter la présence
de ClO 3 − , SW a montré des niveaux très faibles (0,00 à 0,01 mg/L), tandis que la
concentration en ClO 2 W variait entre 1,44 et 5,94 mg/L ( Fig. 5 ). Dans d'autres
études, des concentrations plus faibles de chlorates ont été détectées dans l'eau
d'irrigation traitée avec des désinfectants ( López-Gálvez et al., 2018a , López-Gálvez
et al., 2018b , Nitsopoulos et al., 2014 ). Cependant, dans ces études, on a utilisé de
l’eau de bien meilleure qualité microbiologique et physico-chimique et, par
conséquent, une concentration de désinfectant plus faible était nécessaire pour le
traitement. Dans notre étude, en raison des caractéristiques de l'eau traitée, une
concentration initiale élevée de ClO 2 était nécessaire pour obtenir la réduction
microbiologique souhaitée ( Fig. 1 ). La concentration de ClO 3 − a montré une
corrélation positive significative (p < 0,01) de 0,65 avec la concentration initiale de
ClO 2 .
1. Télécharger : Télécharger l'image haute résolution (163 Ko)
2. Télécharger : Télécharger l'image en taille réelle
Figure 5 . Concentration de chlorate dans des échantillons d'eau (mg/L) et de jeunes
laitues (mg/kg) irrigués avec des effluents secondaires d'une station d'épuration non
traités (SW) et traités au ClO 2 (ClO 2 W) pour l'irrigation lors d'une culture en serre.
Selon Korn, Andrews et Escobar (2002) , une concentration plus faible de ClO 2 et des
niveaux plus faibles de matière organique peuvent réduire la présence de chlorates
dans l'eau traitée. Dans la présente étude, la quantité élevée de matière organique
présente dans l’eau a influencé la concentration de chlorate en raison de la capacité de
désinfection plus élevée requise.
Dans les jeunes laitues irriguées avec du ClO 2 W, la concentration de ClO 3 − variait
entre 1,13 et 8,49 mg/kg ( Fig. 5 ). Ces niveaux sont bien supérieurs à la limite
maximale de résidus de chlorate autorisée dans l'Union européenne dans les
aliments (0,01 mg/kg ; CE, 2005 ), bien que ces niveaux soient actuellement en cours
de révision ( CE, 2014 ). Dans une étude précédente de notre groupe ( López-Gálvez
et al., 2018a ), des concentrations plus faibles de chlorate ont été détectées dans des
pousses d'épinards cultivées en plein champ et irriguées par irrigation aérienne avec
de l'eau de surface traitée au ClO 2 . Cependant, des concentrations de désinfectant
beaucoup plus faibles ont été utilisées par rapport à la présente étude, entraînant une
concentration de chlorate plus faible dans l’eau d’irrigation et dans les
cultures. D'autres études réalisées avec de l'eau d'irrigation traitée avec des
désinfectants à base de chlore ont rapporté une concentration de chlorate plus faible
dans la culture par rapport à notre étude, probablement en raison des concentrations
plus faibles de désinfectants appliqués ( López-Gálvez et al., 2018b , Nitsopoulos et
al., 2014 ). .

4 . Conclusions
Le traitement au ClO 2 a réduit la concentration cultivable d'E. coli et la prévalence de
bactéries pathogènes dans l'eau utilisée pour l'irrigation. Cependant, lorsque les
bactéries viables ont été dénombrées par des techniques moléculaires combinées à
l'utilisation de PMA, aucune différence significative n'a été observée entre l' eau non
traitée et l'eau traitée au ClO 2 , indiquant une action bactériostatique potentielle du ClO 2 , qui peut induire l'entrée
de cellules d'E. coli dans l'eau. un état VBNC. Les jeunes laitues irriguées avec de
l'eau traitée au ClO 2 présentaient des concentrations d' E. coli cultivables plus faibles que les plantes
irriguées avec l'effluent secondaire non traité de la STEP. Cependant, comme dans le
cas des échantillons d’eau, les différences entre les traitements n’étaient pas
significatives lorsque le dénombrement d’ E. coli était réalisé par PMA-qPCR. La
détection d'agents pathogènes dans la laitue était presque nulle et, par conséquent,
l'effet potentiel du ClO 2 sur l'apparition d'agents pathogènes dans les plants de laitue
n'a pas pu être détecté. Les résultats obtenus suggèrent que l'utilisation de méthodes
de comptage sur plaque pour estimer l'efficacité des méthodes de désinfection pourrait
conduire à une surestimation des réductions microbiennes. Dans tous les cas,
l'accumulation de chlorates dans la culture suite au traitement au ClO 2 a dépassé les
limites maximales recommandées de chlorates (0,01 mg/kg), rendant ce traitement
impropre à être appliqué dans les conditions évaluées dans la présente étude.

Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du Center for Produce Safety
Grant Agreement (projets 2015-374 et 2017-01 ) et du MINECO (projets AGL2013-
48529-R et AGL2016-75878-R ). Le soutien apporté par la Fundación
Séneca ( 19900/GERM/15 ) et le CNPq/MCTI avec le projet PVE 313835/2013-6 est
très apprécié. P. Truchado est titulaire d'un contrat de constitution Juan de la Cierva
du MINECO ( IJCI-2014-20932 ).

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