2.

Formation de l’image en microscopie optique

2. Formation de l’image en microscopie optique

Quelques rappels

Optique géométrique

Formation de l’image

Phénomène de

fluorescence
 Quelques rappels
Optique géométrique
On considère l’aspect corpusculaire de la lumière uniquement.
Les rayons lumineux sont rectilignes.

Exemple: Définition d’une lentille convergente

Les rayons parallèles à l’axe optique coupent celui au point

focal F’ de la lentille. Les rayons passant par le centre de la
lentille ne sont pas déviés.
 Quelques rappels
Image d’un objet par une
lentille convergente
3 cas sont à considérer:
considérer objet situé sur F, avant F ou après F
1er cas:
Foyer image

Axe optique F’
F Image inversée et
Foyer objet
agrandie
Lentille
convergente

Plus l’objet sera proche du foyer objet de la lentille plus l’image

sera grande
 Quelques rappels
Image d’un objet par une
lentille convergente
3 cas sont à considérer:
considérer objet situé sur F, avant F ou après F
2eme cas:

Pas de formation d’image. L’image est jeter à l’infini.

 Quelques rappels
Image d’un objet par une
lentille convergente
3 cas sont à considérer:
considérer objet situé sur F, avant F ou après F
3eme cas:

Plus l’objet sera proche du foyer objet de la lentille, plus

l’image sera grande.
 Quelques rappels
Indice de réfraction
Indice de réfraction d’un milieu → densité optique du milieu
C : célérité de la lumière dans le vide
n = c/v n≥1 V : vitesse de la lumière dans le milieu
traversé
En microscopie à contraste de phase, de légères différences d’indice de
réfraction et de densité cellulaire se transforment en des différences
d’intensité lumineuse observables. ( Excellent moyen pour observer des
cellules vivantes)
Réfraction
Déviation de la direction de propagation du rayon lors d’un
changement de milieu
Le faisceau incident va être
dévié i1
selon la loi de Snell-Descartes. i2
n1.sini1 = n2.sini2
 Quelques rappels
Réfraction
Angle limite et réflexion totale
Rayon à l’interface des 2 milieux
i2 =90° → sini1=n2/n1
i1
i1= angle limite de réfraction

Angle incidence > angle limite

→ pas de réfraction,
phénomène de réflexion totale.
 Quelques rappels
Notion d’Interférences
2 ondes se rencontrant dans un même point de l’espace et
ayant la même direction de propagation vont pouvoir se
composer.
L’onde résultante dépend de la
différence de marche δ.

Interférences constructives :
δ=nb pair λ les amplitudes s’ajoutent

δ=nb pair λ/2 Interférences destructives : les

amplitudes s’annulent

λ/2 < δ < λ → Interférences partiellement

 Quelques rappels
Notion de diffraction
Changement de direction après rencontre d’un obstacle ou
d’une petite ouverture.

Principe de Huygens-Fresnel
Chaque point d’ une onde peut
être considéré comme la source
d ’une nouvelle petite ond e
(ondelette)

Fentes d’Young (1802)

Interférences entre les ondelettes
→ f ig u r e d e d i f f r a c t i o n d e
diffraction
 Quelques rappels
Notion de diffusion
Déviation du faisceau lumineux dans de multiples directions
selon la taille des particules par rapport à la longueur d’onde
incidente
Diffusion Diffusion
élastique inélastique
Pas de changement de fréquence Changement de fréquence
(Diffusion Rayleigh, Mie) (Effet Raman)
Si νdiff < ν0 : diffusion
Stokes
Augmentation de la longueur
d’onde
Si νdiff > ν0 : diffusion anti-
Stokes
Diminution de la longueur d’onde
 Quelques rappels
Qu’est ce que la fluorescence ?
La f luorescence est une émission lumineuse provoquée par
diverses formes d'excitation.
 Chaleur → Thermoluminescence
 Réaction chimique → Chimiluminescence
 Champ électrique →
Electroluminescence
o Réaction enzymatique Bioluminescence Fluorescence
État excité : quelques
nanosecondes
 Photons Photoluminescence
Phosphorescence
État excité : quelques secondes
Passage à un état intermédiaire (état triplet)
Habituellement en microscopie par f lu orescence, les échantillons sont
contrastés par un colorant. Cette coloration permet d’obtenir une image de
l’objet résultante de la lumière fluorescente émise par le spécimen.
 Quelques rappels
Diagramme de Jablonski
Représente les différents niveaux d’énergie d’une molécule

1 - Absorption
Absorption de l’énergie d’un photon (10-15s)

2 - Conversion interne
Relaxation vibrationnelle (10-12-10-10s)

3 - Retour à l’état fondamental

Émission d’un photon…
Ou phénomènes non radiatifs
(transfert d’énergie,…)
Phénomènes radiatifs
Phénomènes non radiatifs (pas d’émission de photon)
États vibrationnels
 Le microscope
optique

 Produire une image agrandie de l’objet

 Séparer les détails de l’objet

 Rendre les détails visibles par l’oeil ou le

capteur
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique

Les deux lentilles sont solidaires d’un même tube

 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique

Δ: intervalle optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Principe optique du microscope
optique
 Le microscope
optique
Calcul du grossissement
Par définition:  '

G 

Où α’ est l’angle sous lequel on voit l’image à travers
l’instrument

f2
A1 B 1
tan   
' '

f2
 Le microscope
optique
Calcul du grossissement
 '

Par définition: G 

Où α’ est l’angle sous lequel on voit l’image à travers
l’instrument

Δ
f1

A1 B 1 
 
1

AB f1 Grandissement de l’objectif
 Le microscope
optique
Calcul du grossissement
 '

Par définition: G 

Où α’ est l’angle sous lequel on voit l’image à travers
l’instrument A B
tan   
' ' 1 1

f2
  AB
 
'

A1 B 1  f1  f 2
 
1

AB f1
Grandissement de l’objectif
α est l’angle sous lequel on voit l’objet à l’œil nu à la
distance minimum de vision distincte (dm = 25 cm)
AB
tan   
dm
 Le microscope
optique
Calcul du grossissement

 '

G 

  AB AB
 
'

f1  f 2 dm

Finalement:
dm
G 
f1  f 2
Le grossissement ne dépend que des caractéristique du
microscope
Les principaux éléments du microscope optique
Les principaux éléments du microscope optique
Les principaux éléments du microscope optique
Source lumineuse

La première source utilisée

était le soleil. Maintenant, la
lam pe halogè ne e t le s
f ilaments de tungstène ont
remplacé la source naturelle,
offrant plus de puissance,
une intensité plus constante
et indépendante des nuages
 Les principaux éléments du microscope optique
Diaphragme de champ
Le diaphragme de champ permet
d’op t i m i se r l a t a i l l e de
l’illumination à la taille du champ
d’observation.

Son ouverture modif ie l’intensité

lumineuse mais pas la résolution
du système.
 Les principaux éléments du microscope optique
Le condenseur et le diaphragme d’ouverture
C’est principalement une lentille
servant à concentrer la lumière de
la source sur l’échantillon. Son
rôle est essentiel pour la qualité
de s im age s, not am m e nt le
contraste et la résolution.

NA: Numerical Aperture

(ouverture numérique)

NA 1.2 NA 0.6 NA 0.3 NA

 Les principaux éléments du microscope optique
L’Objectif
L’obje ct if e st le cœur du m icroscope ,
l’élément essentiel. Il peut se résumer à
une sim ple le nt ille à for t pouvoir
grossissant. C’est lui qui détermine la
résolut ion opt ique du m icroscope. Un
objectif de 60X donne un grossissement de
60 fois.
Les principaux éléments du microscope optique
L’Objectif
Pupille
arrière

Série de
lentilles
conjuguées

Lentille
collectrice
 Distance de travail
Distance entre objectif et objet
 Profondeur de champ
Épaisseur de l’échantillon dans laquelle
mise au point réalisable

 Ouverture numérique
Les principaux éléments du microscope optique
Ouverture numérique: NA
NA = La caractéristique essentielle pour la résolution de l’objectif

NA  n sin 

α : demi angle du cône de lumière récupéré par

l’objectif
n : indice de réfraction du milieu

Profondeur de champ et distance de

travail diminuent lorsque NA
augmente
Les principaux éléments du microscope optique
Résolution
Distance minimale entre deux points de même intensité séparables.
En effet, si l’on considère que l’objet étudié est constitué d’un
ensemble de points lumineux, chaque point forme une f ig ure de
diffraction (tache d’Airy) dans le plan image.

a) Image d’un point, b) et c) Image de deux points rapprochés


Critère de Rayleigh : d  0 , 61 
NA
λ est la longueur d’onde et NA l’ouverture numérique de l’objectif (
valeur toujours inscrite sur l’objectif).
Les principaux éléments du microscope optique
Résolution et ouverture numérique


d  0 , 61 
NA

NA=0.7 NA=1.25 NA=1.4

Plus NA importante, plus la tâche d’Airy sera étroite et meilleure sera la
résolution
 Aberrations optiques

Les images formées par un système optique, même aussi simple

qu’une lentille, comportent dans la réalité des défauts. Ces défauts
sont appelés aberrations.
 Aberrations optiques
Aberration chromatique
 L’aberration chromatique provient du fait que des rayons lumineux
de longueurs d’onde différentes ne sont pas focalisés au même
point de l’axe optique. Elle produit une image f lo ue aux contours
irisés. Des franges colorées apparaissent autour des éléments de
l’image. La correction de ce défaut implique un accolement de
lentille.
L’origine de l’aberration chromatique est la dispersion de la lumière:
l’indice de réfraction « n » d’un milieu varie avec la longueur d’onde λ de
la radiation utilisée.
B
n ()  A 

2

Distance focale d’une lentille:

1  1 1 
 ( n  1)   
 
f R
 1 R 2 

Comme n b  n r  f b  f r Exemple
 Aberrations optiques
Aberration sphérique
 L’aberration sphérique est due à une focalisation des rayons
lumineux à une distance différente de la lentille suivant la distance
entre le centre de la lentille et le point du rayon sur cette dernière.
Ceci implique que le plan image n’est pas bien défini.