Microbiologie / Dr. BOUMEHIRA A. Z.

/ ENSA (2024/2025)

Nom Prénom Groupe TP Groupe/Section

GACI HANANE 5 6 /B
HANDA SABRINA 5 6 /B
GABSI SOUHA 5 6 / B
GHERBIA GHADAA 5 6 / B

TP 1. Les milieux de culture et les micro-organismes dans notre

environnement

1.1. Citer les caractéristiques chimiques, physiques et fonctionnelles des milieux de

culture que vous avez utilisés dans le TP1.

-PCA (Plate Count Agar): C'est un milieu non sélectif et riche en nutriments, utilisé en
bactériologie pour le dénombrement des bactéries aérobies. Il contient de la tryptone, de l'extrait
autolytique de levure, du glucose et de l'agar-agar bactériologique sert de support solide pour la
culture de micro-organismes, grâce à son pouvoir gélifiant et sa stabilité, du l'eau distillée et pH à
25°C . Le PCA favorise la croissance de la plupart des bactéries.

-OGA (Oxytetracycline Glucose Agar): Ce milieu est sélectif et utilisé pour la recherche et le
dénombrement des levures et moisissures. Il contient de l'extrait autolytique de levure, du
glucose, de l'oxytetracycline qui sert à inhiber la croissance des bactéries , l'agar agar
bactériologique ,eau distillée ,pH à 25°C

-Chapman (Mannitol Salt Agar): C'est un milieu sélectif et différentiel pour l'isolement plus
particulièrement les Staphylococcus .le dénombrement et la différenciation des bactéries
halophiles et plis celles qui fermentent la mannitol. Il contient de la peptone, de l'extrait de viande
de bœuf, du chlorure de sodium, du mannitol, du rouge de phénol et de l'agar agar ,eau
distillée ,pH 25°C. La forte concentration en sel inhibe la plupart des autres bactéries tandis que la
fermentation du mannitol par les Staphylocoques pathogènes entraîne un changement de couleur
du milieu.

-VRBG (gélose glucosé biliée au cristal violet et au rouge neutre): est un milieu sélectif
utilisé pour la recherche et le dénombrement des Entérobactéries. Il contient de l'extrait de
levure, de digestat enzymatique de tissus animaux , du chlorure de sodium pour l’équilibration
ioniques et pression osmotique, des sels biliaires, du glucose, du rouge neutre, du cristal violet et
de l'agar - agar ,eau distillée ,pH à25°C Les sels biliaires et le cristal violet inhibent les bactéries
Gram-positives.
Bouillon nutritif :Constitue un milieu d'utilisation générale ne présente pas d'exigences particulières .Il est
constitué d'un mélange de tryptone et d'extrait de viande qui contribue la croissance des micro -organismes et le
chlorure de sodium qui maintien la pression osmotique.
1.2. Évaluation de la présence des micro-organismes dans l’environnement

-Après l’incubation, examiner le tube de bouillon nutritif et les boîtes de Pétri.

Bouillon nutritif
Détails sur l’origine du prélèvement Prélèvement depuis la face
interne de bavette après 2
minutes de souffle
Croissance (+) ou (-)
+
Dessiner / déposer une
photo du tube
 PCA2

- Dessiner / déposer une photo des boîtes de Pétri

PCA1

VRBG
Chapman

OGA

2
 PCA1 PCA2 Chapman VRBG OGA
Détails sur Souffle pendant Souffle pendant 2 Souffle pendant 2 Souffle pendant 2 Souffle pendant 2
l’origine du 2minutes sur le milieu minutes sur le minutes sur le minutes sur le minutes sur le
prélèvement milieu a travers un milieu milieu milieu
masque
Nombre de 6 3 10 Pas de colonies 5
colonies
Détails des Les 6 colonies ont la Couleur : jaune Couleur : jaune / Couleur: 1tres
caractéristiques des même couleur qui est le Forme:arrondies Forme:arrondies grande blanche /1
colonies (forme, jaune Taille : petites Taille : petites moyenne verte et
couleur, taille,….) Forme: arrondies autre noire d’une
Taille :petites forme arrondies
/orange claire
alignée sur le
bord /orange foncé
regroupée

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1.3. Expliquer et discuter les résultats obtenus :

Après avoir exposé 5 milieux de cultures (PCA1, PCA2, Chapman ,OGA ,VRBG)après avoir souffler
pendant 2 minutes et le bouillon nutritif et les avoir laissés incuber pendant 48 heures , nous
avons observe les résultats suivants :

Le bouillon nutritif : Changement de couleur est devenue plus trouble .c’est un milieu non
sélectif donc il permet la croissance de différentes bactéries.

Le milieu PCA1 : Après avoir souffler pendant 2 minutes sur le milieu on a observé un nombre
moyen de colonies qui est de 6 . il y a eu une contamination modéré car le milieu est généraliste
et nutritif permet la croissance de toutes les bactéries aérobies totales qui peuvent se développer
dans ce milieu . elles sont issue de la bouches et voie respiratoires supérieures sachant que la
bouche et le nez contiennent naturellement beaucoup de bactéries . l’absence de protection et le
temps de souffle est assez suffisant pour transmettre des micro organismes , depand aussi de
l’hygiene de la personne.

Le milieu PCA2 : après avoir souffler sur le milieu pendant 2 minutes a travers un masque on a
observé la réduction de nombre de colonies grâce a la bavette qui agit comme une barrière a un
rôle dans la réduction du risque de transmission empêche quelques bactéries d’être projetées sur
le milieu . la présence de 3 colonies montre que la bavette n’est pas un moyen de protection
totale et certaines bactéries peuvent encore passer
Probablement sur les cotes ou a travers le tissu si n’est pas 100% filtrant.

Le milieu OGA : après avoir souffler pendant 2 minute sur le milieu on a observé une variété de
colonies quelque soit dans la couleur ,forme , taille sachant que ce milieu est sélectif pour la
culture des levures et moisissures ,il continent l’oxytetracycline qui inhibe la croissance des
bactéries et favorise le développement des champignons ,la présence de 5 colonies fongiques
indique que l’air expiré contient des spores de champignons en présence de nutriment ont formé
des colonies visibles .l’origine soit de la bouche et les voies respiratoires ou dans
l’environnement .cette diversité montre qu’il ne s’agit pas d’un seul type de champignons mais
plusieurs espèces .la différence de taille reflètent la nature de l’espèce et la rapidité de
croissance .

Le milieu Chapman : comparé aux milieux PCA 1 et PCA 2 ,Chapman montre un nombre plus
élevé de 10 colonies ,il s’agit d’une contamination potentielle . cela explique que ce milieu sélectif
favorise la croissance des Staphylocoques et empêche les autres bactéries de pousser .En
soufflant directement sur le milieu 2 minutes sans protection fait expulser et développer un très
grand nombres de Staphylocoques .La coloration jaune indique la fermentation de mannitol cela
signifie la présences des bactéries pathogènes .il y a beaucoup de colonies car la bouche et la
peau sont naturellement riche en Staphylocoques .

Le milieu VRBG : pas de colonies sur le milieu après avoir souffler pendant 2 minutes ,absence
d’enterobactéries qui sont une famille de Gram négatif cela montre que l’air expiré par une
personne saine ne contient pas de bactéries intestinales ce qui est normal . VBRG est très sélectifs
seules les bactéries résistantes aux sels biliaires et violet de gentiane capable de fermenter le
glucose . la bactérie de la bouche ne supporte pas les agents sélectifs donc elles ne poussent
pas .

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 TP 2. Techniques d'isolement de cultures pures

2.1. Comparez la croissance des bactéries dans différents types physiques de milieux
(bouillons et boîtes de gélose). Quels pourraient être les avantages et les inconvénients
de l’utilisation de chaque type ?
Lors de l’expérience ,nous avons cultive des bactéries en utilisant 2 types de milieux :

1. Milieu liquide (bouillon nutritif) :

Avantages :
-favorisation de la culture massive et la croissance rapide et homogène des bactéries en suspension
-Parfait pour l'extraction de métabolites et produits secondaires bactériens.
-Facile à manipuler et à inoculer.
-Grâce à l'aération (soufflage), il améliore le développement de bactéries aérobies qui ont besoin
d'oxygène.
-Flexible pour la culture de bactéries préférant un environnement aqueux.

Inconvénients :
-Impossible d’isoler une souche unique.
-sans réaliser des tests supplémentaires il est difficile de déterminer la pureté de la culture.
-l’observation directe de la morphologie des colonies n'est pas permissible
-Si les conditions ne sont pas stériles la contamination est risquée, surtout par des bactéries
aérobies ou moisissures apportées par l’air soufflé.

2. Milieu solide (boîte de gélose) :

Avantages :
-facilite l'identification de bactéries spécifiques due a l'isolement de colonies individuelles
-Permet l’observation directe des caractéristiques morphologiques (forme, taille, couleur) des
colonies.
-Possibilité de contenir des agents sélectifs pour cibler certaines bactéries.
-Adapté pour l’étude des tests biochimiques et des sensibilités aux antibiotiques.
Incovenients :
-Limité pour les bactéries qui nécessitent un environnement liquide ou plus riche en oxygène.
-Croissance plus lente comparant dans le bouillon.
-Demande plus de préparation (stérilisation, solidification).
-Plus coûteux .

2.2. Comment éviter la contamination de l'air lorsqu'une anse d'inoculation est utilisée
pour introduire ou prélever une colonie bactérienne depuis/vers une boîte de gélose ?
Pour éviter la contamination de l'air lors de l'utilisation d'une anse d'inoculation il est important
de suivre des pratique aseptique strictes :
-Désinfectez la zone du travail: nettoyez et désinfecter la surface de travail avant et après
l'inoculation pour réduire la présence de contaminants dans l'environnement immédiat
-Flambez l'anse d'inoculation avant et après chaque utilisation passez l'anse dans la flamme d'un
bec bunsen
-travaillez prés de la flamme effectuez l'inoculation à proximité d'un bec benzen allumé
-Mouvement rapide et fluide lorsque vous transférez des bactéries faites le rapidement
-Minimisez l'exposition ouvrez la boîte de gélose le moins possible et pour le moins de temps
possible pour réduire l'exposition à l'air ambiant.

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2.3. Résultats des isolements de cultures pures

-Après l’incubation, examiner le tube de bouillon nutritif et les boîtes de Pétri.

Bouillon nutritif
Détails sur l’origine du prélèvement Remplacement de VRBG
par la culture pure de
PCA1
Croissance (+) ou (-) +
Dessiner / déposer
une photo du tube

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- Dessiner / déposer une photo des boîtes de Pétri.

PCA1 OGA

Chapman
VRBG

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 PCA Chapman VRBG OGA
Détails sur Une culture pure dans Une culture pure dans le Une culture pure dans le ne culture pure dans le
l’origine du le milieu PCA après un milieu Chapman après milieu PCA1 après un milieu OGA après un souffle
prélèvement souffle un souffle souffle

Caractéristiques Couleur : jaune Couleur: jaune orangé Aucune colonies 2 grandes couches blanches
des colonies Forme:ponctiforme Forme :ponctiforme et jaunes
(forme, couleur, régulières, lisses et régulières, lisses. opaques, élevées.
taille,….) opaques.

2.4. Expliquer et discuter les résultats obtenus :

Après le prélèvement et l’ incubation des milieux des cultures de premier TP nous avons isolés les 5
milieux dans autres milieux il y a deux types d'isolement : liquide et solides
l'isolement solides on a choisir 4 colonies ( PCA, Chapman,VRBG,OGA)

Le milieu PCA :On observe la croissance d' une seul colonie de couleur jaune et on remarque que
dans les deux premiers quartiers les colonies ne se séparent pas, mais au troisième quartier les
bactéries commencent à se séparer. De même, au quatrième quadrant , on les voit clairement
séparés, et c'est le but de l'[Link] on s'éloigne dans le quadrant, plus on voit bien les
bactéries et sachant que ce milieu est généraliste beaucoup de bactéries se développent .

le milieu Chapman: On observe une croissance d' une seul colonie de couleur jaune orangé et
on remarque que dans les deux premiers quartiers les colonies ne se séparent pas, mais au
troisième quartier les bactéries commencent à se séparer. De même, au quatrième quadrant , on
les voit clairement séparés, et c'est le but de l'[Link] on s'éloigne dans le quadrant, plus on
voit bien les bactéries et on concluons que l'isolement est pure.

Milieu VBRG remplacé par PCA1 ; La boîte est divisée en 4 quadrants, aucun développement
bactérien visible sur ce milieu après avoir fait la technique d'isolement de culture pure en a
remplacé le milieu VRBG par PCA 1 car en a pas une culture pure dans VRBG. Ce résultat suggère
que les échantillons inoculés dans les 4 quadrants n'ont pas favorisé la croissance des bactéries
(absence ou non-viabilité des bactéries, ou ce milieu sélectif défavorable pour ces souches donc
absence de bactéries .

le milieu OGA: On observe la croissance de deux colonies, une blanche et une jaune. on
concluons que l'isolement n'est pas pure car on trouve deux différentes colonies mal réaliser
l'isolement, apparaître d'autre bactéries sachant que OGA est un milieu favorisant les
champignons. Les résultats montrent une forte contamination ou une bonne croissance fongique
dans tous les quadrants. Cela suggère que les échantillons contiennent des spores ou cellules
fongiques viables.

Bouillon nutritif : présence de croissance bactérienne dans ce milieu avec une concentration au
fond du [Link]ésence d’un bio film .

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 TP 3. Techniques de coloration bactérienne

3.1. Résultats des observations microscopiques

Coloration simple La culture liquide colonie

Dessiner ou déposer une

photo

Morphologie cellulaire Morphologie cellulaire :

Forme bactéries de forme ronde
Arrangement Forme :sphérique
Couleur Arrangement : en courtes
chaîne
Couleur : bleu/violet

Coloration Gram La culture liquide colonie

Dessiner ou déposer une

photo

Morphologie cellulaire Morphologie cellulaire :

Forme bactéries de forme ronde
Arrangement Forme :sphérique
Couleur Arrangement : en amas et
petites chaîne
Couleur : violet foncé
Réaction de gram : gram
positif

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 4. Discuter tous les résultats des trois TPs :

A travers les trois travaux pratiques réalisé ,nous avons pu comprendre t mettre en évidence
l’importance des milieux de cultures ,les techniques d’isolement et de coloration bactériennes
dans l’ étude de micro organisme a fin d’identifier selon des propriétés spécifiques.

1. Lors du premier TP ,nous avons manipule differents types de milieux de culture

(PCA,CHAPMAN , OGA, VRBG ) et le bouillon nutritif dans le bute dévaluer la présence des micro
organisme autour de nous , les résultats ont révélée une diversité microbienne importante
comme les levures et moisissures , nous avons aussi pu observer l’effet protecteur d’une bavette
qui a réduit la contamination sur PCA2 par rapport a PCA1 ce qui démontre l’importance de
l’hygiene .dans chaque milieu on a vu des caractères spécifiques : PCA a permis la croissance des
bactéries aérobies totale , VRBG n’a révélée aucune enterobacteriecr qui est ce qui est cohérent
avec une personne saine ,OGA la présence de levures et moisissures et Chapman favorise la
croissance des Staphylocoques parmi eux y a des pathogènes .

2. Isolement et purification des bactéries (TP2)

L'objectif était d'isoler et purifier les bactéries obtenues à partir des boîtes de Pétri du TP1, en
utilisant la méthode des stries alternées ("Alternate streak-plate method").
• Résultats observés sur les milieux repiqués
• PCA : Colonies petites, jaune régulières, lisses et opaques.
• OGA : 2 Colonies blanche , jaunes, opaques, élevées.
• Chapman : Colonies petites, jaunes orangé, régulières, lisses.
• VRBG : pas de colonies.
• Bouillon : Présence d’un bio-film au milieu du tube.

3. Identification macroscopique des bactéries (TP3):

Lors de cette étape, nous avons réalisé une identification macroscopique des bactéries isolées en
observant leurs caractéristiques sur les milieux de culture (taille, couleur, forme, opacité,
élévation, aspect). Cela permet d’orienter l’identification, mais pas de déterminer l’espèce exacte.
Nous avons ensuite effectué une coloration simple (milieu liquide PCA1) et une coloration de Gram
(milieu solide Chapman). L’observation microscopique a révélé des bacilles bleus en coloration
simple et des bacilles Gram positifs en coloration de Gram.
Pour aller plus loin dans l’identification, il faudrait compléter avec des tests d’orientation.
En résumé, ces travaux pratiques nous ont permis de comprendre le rôle crucial des milieux de
culture, des techniques d’isolement et de la coloration dans l’identification et l’étude des micro-
organismes. Ils ont aussi l'importance de respecter les règles d’hygiène pour éviter les
contaminations.
Ces TPs nous a permis de comprendre l'importance de l'identification des bactéries, ce qui peut
nous servir même dans la vie quotidienne. Par exemple, on a appris qu’il existe des bactéries
bénéfiques (comme celles de la flore intestinale) et des bactéries dangereuses qui causent des
maladies. Savoir que certaines bactéries sont Gram positif ou Gram négatif aide à comprendre
pourquoi certains antibiotiques fonctionnent contre certaines infections et pas d'autres. Cela nous
sensibilise aussi à l’importance de l’hygiène (lavage des mains, désinfection) pour limiter la
propagation de bactéries pathogènes. De plus, en comprenant que les bactéries peuvent former
des amas ou des chaînes, on réalise pourquoi certaines infections sont difficiles à traiter et
nécessitent des traitements ciblés.

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