TP1.

Isolement et activités PGP des bactéries symbiotiques,

endophytiques et libres du sol: Préparation d’inoculum bactérien

1. Isolement des bactéries

1.1. Isolement des bactéries symbiotiques (ou nodulaires)
Les nodules collectés (figure 2) ont été lavés avec de l'eau stérile. Leurs surfaces ont été
désinfectées avec de l'éthanol 70% et du HgCl2 0,2% suivie d’une série de lavages avec de l’eau
distillée stérile. Les nodules ont été écrasés et la suspension résultante a été striée sur le milieu
YEMA. Les boites ont été incubées dans l’étuve à 28°C pendant 7 jours. Les colonies
individualisées ont été purifiées par des repiquages répétés sur le milieu YEMA. Les isolats
ainsi purifiés sont conservés dans leurs boites, pour une courte durée (2 à 4 semaines), à 4°C.
La conservation de longue durée est réalisée dans un milieu YEM liquide en présence de 25%
glycérol à -80°C.

Figure 1. A gauche, des nodules isolés d’une plante de pois chiche. A droite, différentes
formes de nodosités.

1.2. Isolement des bactéries endophytiques

Les tissus sains des parties racinaires et aériennes sont désinfectés superficiellement par une
solution d’hypochlorite de sodium à 1% pendant 4 minutes, puis rincés plusieurs fois à l’eau
distillée stérile, ensuite séchés sur du papier filtre stérile. Les racines et les feuilles désinfectées
ont été découpées en petits fragments de 2-3 mm et déposées sur une boite de Pétri contenant
le milieu LB (figure 1). Enfin, les boites ont été incubées pendant 3-4 jours à une température
de 25°C. Les colonies apparues sur le milieu LB ont été purifiées par un repiquage successif.

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 Figure 2. Fragments de racines et de feuilles repiqués sur milieu LB.

1.3. Isolement des bactéries libres du sol

50 g de chaque sol sont prélevés et versés dans un erlenmeyer contenant 100 ml d’eau distillé
stérile. Après agitation d’une heure, ils sont mis en décantation durant une heure. Une série de
dilution (figure 3) est ensuite préparée en milieu de culture YEM.

Figure 3. Présentation schématique d’une série de dilution à partir d’une solution mère de sol.

Un volume de 100 µl de chaque dilution est déposé dans des boites du Pétri contenant le milieu
de Sperber puis étalé avec des billes en verre stériles. Les boites sont enfin incubées à 28°C
pendant une semaine (figure 4).

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Les bactéries qui ont ainsi poussées sont repiquées dans des boites contenant le milieu LB (ou
YEMA) afin d’être purifié et identifiées. Les isolats purifiés sont conservés dans leurs boites,
pour une courte durée (2 à 4 semaines) à 4°C.

Figure 4. Aspect des colonies après isolement avec une série de dix dilutions.

2. Etude des caractères morphologiques et culturaux

Objectifs: Mise en évidence des bactéries après isolement et purification par l’étude des
caractères culturaux et morphologiques.

Il faut au préalable faire :

- L’isolement et la purification des souches sur des milieux sélectifs (exp, YMA pour les
rhizobiums, LB pour les Bacillus).

La sélection est basée sur l’aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le
diamètre, l’aspect…

- Conservation des souches

Afin de pouvoir toujours disposer de souches viables, les souches isolées et purifiées sont
conservées au réfrigérateur à 4°C (pour utilisation à court terme) et à -80°C pour une
conservation longue durée.

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L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué à partir de l'isolement
après incubation. Cette étude est basée sur des observations à l’œil nu et macroscopiques
permettant de différencier les caractéristiques des souches étudiées (l’aspect de colonies
caractéristiques de chaque espèce bactérienne est un des premiers critères d’identification).

Il ne pourra être décrit convenablement qu'à partir de colonies bien isolées : les colonies sont
d'autant plus petites qu'elles sont rapprochées.

-Examen macroscopique

1- La forme des colonies : rondes, irrégulières,…etc.

- Allure du contour: bords lisses réguliers ou irréguliers, dentelés, déchiquetés pouvant

même présenter parfois des prolongements (tête de méduse).
- Relief: surface bombée, demi-bombée, plate.
- Centre: parfois surélève, parfois ombiliquée (en creux).
2- La taille des colonies par la mesure du diamètre : punctiformes ou de taille mesurable. La
taille d’une colonie ne peut être apprécié que si elle est suffisamment isolée (les colonies serrées
les une contre les autres n’atteignent pas leur taille maximale). Il ne faut pas tout de même
oublier que certaines bactéries donnent des colonies qui s’étalent en vieillissant. Par
conséquence, les colonies ne sont comparables quant à leur taille que dans les zones du milieu
de culture présentant une densité de culture identique.

3- La couleur de la colonie et l’opacité (opaque, translucide ou transparente…). La transparence

des colonies doit être appréciée en lumière naturelle et artificielle. Certaines colonies élaborent
des pigments ce qui représente un élément précieux d’identification.

4- L’aspect : colonie lisse (S pour smooth), rugueuse (R pour rough) ou muqueuse (M).

5- l’odeur dégagée par l’ensemble de la culture.

6- l’adhérence appréciée par raclage à l’aide de l’anse de platine.

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3. Activité PGP des bactéries.

3.1. Solubilisation du phosphate

On réalise le test de solubilisation de phosphates insolubles en mettant un volume de 5 µl
de la suspension bactérienne sur la boite de pétri contenant le milieu GY (Nautiyal, 1999) sous
hotte à flux laminaires. Les boites sont incubées à une température de 28 °C pendant 7 jours.
Les bactéries qui possèdent cette activité forment des halos de solubilisation claire au tour des
colonies (figure 5). Les diamètres de ces halos sont alors mesurés et misent à des analyses
statistiques.

Figure 5. Halos de solubilisation du phosphore

3.2. Solubilisation de potassium

On réalise le test de solubilisation de potassium en mettant un volume de 5 µl de la
suspension bactérienne sur la boite de pétri contenant le milieu modifié d’Alexandrov sous hotte
stérile. Les boites ont été incubées dans une étuve à une température de 28 °C pendant 7 jours.
La formation d’halos de solubilisation indique la présence de cette activité (figure 6).

Figure 6. Halos de solubilisation du potassium.

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3.3. Production de sidérophores
On réalise le test de production de sidérophores en mettant un volume de 50 µl de la
suspension bactérienne sur la boite de pétri contenant le milieu King B supplémenté avec le
complexe chrome azurol S [CAS/fer(III)/hexadeciltrimethyl ammonium bromide] de couleur
bleu-verdâtre comme il a été décrit par Schwyn et Neilands (1987). Les boites sont incubées à
une température de 28 °C pendant 7 jours. Les bactéries capables de produire des sidérophores
forment des halos jaune-orange (figure 7) et le diamètre de ces halos sont alors mesurés et
comparés par des analyses statistiques.

Figure 7. Halos de production des sidérophores par les bactéries PGPR.

3.4. Production de phytohormones (Acide indole Acétique)

Pour déterminer la capacité à produire l’AIA, la souche est incubée, dans 10 ml du milieu SMS
additionné de 0.5 mg/ml de tryptophane, à 28°C pendant 5 jours sous agitation orbitale. Après
centrifugation à 10000g pendant 5 minutes, 1 ml de chaque surnageant est mélangé avec 100
µl d’acide orthophosphorique 10 mM et 2 ml d’agent Salkowski. Après incubation à 25°C
pendant 30 minutes, l’absorbance est déterminée à 530 nm. La concentration d’AIA est
déterminée à partir de la courbe d'étalonnage en utilisant une solution AIA standard (figure 8).

Figure 8. Mesure de la production d’auxine par les bactéries PGPR.

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3.5. Production d'acide cyanhydrique (HCN)
Tous les isolats ont été sélectionnés pour la production de cyanure d’hydrogène en adoptant la
méthode de Feigl et Anger (1966). Les bactéries sont striées sur des boites de LB et de YEMA.
Le papier est placé dans le haut de la boite. Les boites étaient scellées et incubées à 28°C
pendant 4 jours. Un changement de couleur du papier de Feigl-Anger indique la production de
HCN (figure 9). L’intensité de la couleur bleue obtenu indique la puissance de production de
HCN qui est estimé comme faible (+), modérée (++) ou forte (+++). On prépare un milieu non
inoculé présentant le contrôle négatif.

Figure 9. A, Pas de coloration de papier donc pas de production de HCN. B, Papier Feigl-
Anger coloré en bleu indiquant la production de HCN.

3.6. Inoculation et fixation symbiotique d’azote atmosphérique

L’inoculation des plantes est nécessaire dans les sols pauvres en azote. Le but de l’inoculation
est d’examiner l’apport des bactéries sur la croissance et le rendement de la plante inoculée,
d’une part, et d’évaluer le taux de fixation symbiotique d’azote atmosphérique, d’autre part.

a/ Germination des graines

Les graines homogènes de pois chiches sont désinfectées par trempage dans l’éthanol absolu
pendant 10 secondes puis dans le Hgcl2 0.2% durant 2 minutes. Les graines sont par la suite
lavées plusieurs fois dans l’eau distillée stérile. Après imbibition pendant 4h, les graines sont
mises à germer dans des boites de Pétri contenant l’agar 9‰, à 25°C et dans l’obscurité, pendent
3 jours (figure 6).

Figure 10. Graines de pois chiche désinfectées et prêtes pour germer.

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b/ Dispositif de culture

Des graines de pois chiche désinfectées et pré-germées sont transférées dans des pots en
plastique (de 500 ml ou1 litre) contenant un support inerte stérile (perlite, gravier, sable).
L’irrigation des plantes est faite par une solution nutritive stérile (dépourvue d’azote) d’une
manière occasionnelle. Un témoin positif, non inoculé mais recevant une solution nutritive
contenant l’azote minérale et un témoin négatif, non inoculé mais recevant une solution
nutritive dépourvue d’azote minérale sont ajouté (figure 7).

c/ Préparation de l’inoculum
Les souches à inoculer ont été cultivées en mettant en culture une colonie bien individualisée
dans un volume de 20 ml de milieu YEM, en agitation, à 28°C et pendant trois jours.

d/ Inoculation
Au stade d’apparition de nouvelles feuilles, l’inoculation des plantes de pois chiche est
effectuée avec 1 ml de la suspension bactérienne.

Figure 11. Système de culture des plantes de pois chiche, en pots et sous serre.

e/ Analyses
e.1. Biomasse aérienne végétale et nodulation

Au stade floraison, les plantes sont récoltées, les parties aériennes des plantes sont coupées, les
racines sont récupérées et le nombre de nodules est déterminé. Les parties aériennes ainsi que
les racines sont mis à sécher à l’étuve à 80°C pendant 48 heures. Les poids secs sont ensuite
mesurés.

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e.2. Analyse statistique des donnés

Les résultats sont soumis à une analyse de variance et comparaison des moyennes par le test
"multi-range" de Duncan (STATISTICA).

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 TP2. Recherche de mycorhize: Préparation d’inoculum fongique

1. Estimation du nombre de spores dans le sol

100 g de sol est mis dans des flacons contenant 200 ml d’eau distillée. Après agitation et
décantation, le surnageant contenant les spores est tamisé sur une série de tamis, mis l’un sur
l’autre, de 500 à 50µm de diamètre de pore. Le contenu du chaque tamis est ensuite recueilli
dans des flacons numérotés. Un volume de 1 ml de la suspension de sol obtenue est alors déposé
dans une boite de pétri en plastique puis observée sous la loupe binoculaire. Le nombre de
spores obtenus est alors déterminé.

2. Evaluation du taux de mycorhization

2.1. Echantillonnage des racines

Lors du prélèvement, seules les racines très fines, susceptibles d’être mycorhizées et plus
facilement observables au microscope, sont prélevées. Chaque échantillon de racine est noté et
numéroté. Dans la mesure du possible, au moins trois échantillons sont prélevés sur chaque site.

2.2. Lavage des racines

L’expérience montre que plus les échantillons sont propres plus l’évaluation est rapide et
précise. Pour cela les racines sont débarrassées des particules de terre au moyen d’un rinçage
abondant à l’eau courante dans une passoire. Ensuite, seules les petites racines relativement
claires et peu sclérifiées seront sélectionnées.

2.3 Eclaircissement et coloration des mycorhizes

Les racines sont systématiquement éclaircies et colorées avant toute observation
microscopique. La technique d’éclaircissement et de coloration de Phillips et Heymann (1970)
est souvent utilisée lorsqu’on a affaire à des endomycorhizes à vésicules et arbuscules. Elle est
rapide et fonctionne pour un grand nombre de plantes-hôtes. Les racines sont placées dans des
piluliers contenant une solution de KOH à 10%, puis misent dans une étuve à 90°C pendant 1
heure. Les racines sont ensuite abondamment rincées sous l’eau courante, égouttées et remises

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dans les piluliers ou elles sont recouvertes avec le bleu de trypan. Les piluliers sont placés à
l’étuve à 90°C pendant 15 minutes. Les racines sont ensuite rincées abondamment et conservées
dans de l’eau distillée avant le montage.

2.4 Montage
On prélève des segments de racines de quelques centimètres choisis au hasard. Pour la
quantification des endomycorhizes, un examen par plan de 30 segments racinaires d’une
longueur de 2 à 3 cm. Ces segments sont montés parallèlement par groupes de 10 dans l’huile
de paraffine entre lame et lamelle (figure 1).

Figure 1. Montage des racines colorées entre lame et lamelle

pour l’observation microscopique.

2.5. Observation microscopique

Les lames sont observées au microscope, chaque fragment étant soigneusement vérifié sur toute
sa longueur, au grossissement 100 (figure 2).

Figure 2. Observation microscopiques du mycélium endomycorhizien, des vésicules et

arbuscules.

2.6. Le système de notation des mycorhizes

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Plusieurs systèmes de notation sont utilisés pour évaluer l’importance de l’infection
mycorhizienne. Le système le plus simple consiste à noter (+) les fragments pourvus de
mycorhizes et (-) ceux qui en sont dépourvus. Cette notation ne tient pas compte de l’intensité
de la mycrohization par plant. Des cotes de 0 à 5 sont également employées dont chacune
représentant une classe de pourcentage de mycorhization. Le système appliqué repose sur
l’appréciation globale de 30 fragments racinaires. Une note de classe comprise entre 0 et 5
correspondant à l’estimation de la proportion de cortex colonisée par le symbiote mycorhizien
est attribuée à chacun des fragments racinaires observés (figure 3). La présence des arbuscules
et des vésicules est notée simultanément en indiquant leur classe de fréquence (A1 à A3). La
note globale de mycrohization est obtenue en faisant la moyenne sur le nombre de plants
observés (figure 4).

Figure 3. Notation de l’infection par les endomycorhizes à arbuscules et vésicules.

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 Figure 4. Fiche de notation utilisée pour mesurer la mycorhization des espèces utilisées.

3. Paramètres d’évaluations
3.1. Le pourcentage de racines mycorhizées
Ce paramètre est noté aussi fréquence de mycorhization F% = (nombre de fragments
mycorhizés / nombre total des fragments)*100. C’est le paramètre le plus utilisé.

3.2. Intensité globale de la mycorhization

M% = (95n5 + 70n4 + 30n3 + 5n2 + n1) / nombre total de fragments. Dans cette formule, n5
représente le nombre de fragments mycorhizés noté 5, n4 représente le nombre de fragments
mycorhizés noté 4. C’est le paramètre qui traduit le mieux le degré de mycorhization

3.3. Intensité de mycorhization des fragments mycorhizés

Ce paramètre est calculé comme suit: m% = M ×100/ F

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