Chromatographie Liquide
Haute Performance
(CLHP – HPLC)
FGSP2
UE2.15 – Sciences Analytiques 2
2016-2017
C. Machon
[email protected]
Département Pédagogique des Sciences Physico-Chimiques et Pharmacie Galénique
PLAN
I- Principe (rappels)
II- Appareillage
II-1- Pompe – phase mobile
II-2- Injecteur
II-3- Colonne – phase stationnaire
II-4- Détecteurs
III- Modes chromatographiques
IV- Facteurs affectant la rétention
V- Exemples d’applications
I- Principe (rappels)
• Phase mobile liquide
• Phase stationnaire dans une colonne
=> Séparation basée sur la partition du soluté entre la
phase stationnaire et la phase mobile
• Pression importante
Interactions phase mobile soluté phase stationnaire
Soluté
Phase mobile Phase stationnaire
II- Appareillage
Les différents éléments d’une chaîne HPLC
Détecteur
Injecteur
Pompe
Solvants
= Eluants
Colonne
Quelques photos de chaîne HPLC
Chaîne Shimadzu
Chaîne Agilent
Chaîne Waters
II-1- Pompe – phase mobile
• Pompes
– Rôle : forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne dont
le remplissage est compact
=> Pression importante en tête de colonne
Loi de Darcy
Avec f : facteur de résistance à l’écoulement (dépend du remplissage de
la colonne)
h : viscosité de la phase (dépend des solvants)
L : longueur de la colonne
m : vitesse linéaire de la phase mobile
dp : diamètre de particules de phase stationnaire
• Phase mobile
– plusieurs solvants, pH ajusté ou non
Attention : les solvants doivent être miscibles (ex : MeOH/eau ;
ACN/eau)
– Choix des solvants selon
• les solutés à séparer car interaction phase mobile soluté, car
importance du pH si composé ionisable
• la phase stationnaire
• le détecteur (ex : solvants volatils pour la spectrométrie de
masse)
– Principaux solvants utilisés : eau, méthanol, acétonitrile,
hexane
– Débit de 0,1 à 5 ml/min
– P jusqu’à 400 bars
– Elution en mode isocratique ou en mode gradient
équilibration
• Type de pompe
– 1 voie, binaire, quaternaire
Exemple d’une pompe quaternaire
dégazeur sortie de la pompe
pompe
A D
B C
mélangeur
• Tubulures
– Avant la pompe : pas de pression
– Après la pompe : pression
• En acier
Diamètre interne (mm)
0,075 – 0,13 – 0,17
• En PEEK
II-2- Injecteur
– Injection manuelle ou automatique (passeur)
– Volume injecté : 1 à 20 µl
– Système le plus utilisé : vanne Rhéodyne®
Principe de fonctionnement d’une boucle d’injection
Echantillon
Seringue Boucle d’injection
Boucle d’injection
Poubelle
Poubelle 1
1 2
2 6
6 3
3 5
5 4
4 Eluant
Eluant
Colonne
Colonne
Chargement de la boucle Injection de la boucle
(position Load) (position Inject)
II-3- Colonne – phase stationnaire
• Colonnes
– Différentes longueurs : 30 à 250 mm
– Diamètre interne : 2,1 à 4,6 mm
– Associée ou non à une pré-colonne
• Phase stationnaire
Particule de phase stationnaire
(diamètre : 3 – 5 µm)
Pore (diamètre : 5 – 30 nm)
• Matrice : silice
– La plus utilisée
– Facilement greffable
– Mais stabilité de pH limitée (pH 2 à pH 7)
Phases stationnaires à base de silice
Différents types de greffons des phases stationnaires de silice
(mode partage)
Ligand C18
Ligand C8
Ligand type phénylhexyl
Ligand PFP (pentafluorophényl)
Ligand CN (cyanopropyl)
Choix de la phase stationnaire selon la nature des solutés à séparer
Source : document Waters
II-4- Détecteur
– Choix selon la nature des solutés : propriétés
spectrales, propriétés redox, masse moléculaire
– Principaux détecteurs :
• Spectrophotométrie UV-Vis
– À l variables
– À barrettes de diodes
• Spectrofluorimétrie
• Electrochimie
• Spectrométrie de masse
III- Modes chromatographiques
Modes chromatographiques utilisables en HPLC :
- Partage
- Interactions hydrophobes
- Échanges d’ions
- Exclusion stérique
- Chirale
- Affinité
IV – Facteurs affectant la rétention et
la séparation
• Composition de la phase mobile
• Nature de la phase stationnaire
• Caractéristiques de la colonne : longueur,
diamètre des particules
• Vitesse linéaire de la phase mobile (µ)
IV-1- Composition de la phase mobile
Force éluante des solvants
Phase normale FAIBLE Phase inverse
Hexane Eau
Toluène Méthanol
Chloroforme Isopropanol
THF Acetonitrile
Acétate d’éthyle
Éther
Éther
Acétate d’éthyle
THF
Acetonitrile Chloroforme
Isopropanol Toluène
Méthanol Hexane
FORTE
Attention dans choix des solvants : miscibilité, nature du détecteur.
IV-2- Nature de la phase stationnaire
• Taux de carbone des phases C18
Ln k
Taux de carbone
Sources : documents Agilent et Restek
IV-3- Caractéristiques de la colonne
longueur de la colonne => rétention
diamètre des particules => rétention
IV-4- Vitesse linéaire de la phase mobile
Courbe de Van Deemter
N = L/H
Hmin
µ optimale
Hmin correspond à une efficacité maximale de la colonne, pour une
vitesse de phase mobile optimale.
V – Exemples d’applications
Analyse de produits alimentaires
=> Recherche de contaminants, de produits « falsifiés »
Ex : recherche et quantification de l’histamine dans les produits de pêche
http://www.afssa.fr/Poisson/Documents/MIC-Fi-HistaminePeche.pdf
Ex : recherche et quantification de l’histamine dans les produits de pêche
http://www.afssa.fr/Poisson/Documents/MIC-Fi-HistaminePeche.pdf
Dérivation en HPLC
– Objectif : modifier la nature ou la force des
interactions soluté – phase stationnaire
– Ex : dérivation des polyamines avant analyse par
RP-HPLC
Structure de 3 polyamines
Différents agents de dérivation possible :
- Dansyl chloride
Chauffage
Milieu alcalin
