‫ا لجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية‬

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة التعليم العالي والبحث العلمي‬

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université des Frères Mentouri Constantine ‫جامعة االخوة منتوري قسنطينة‬

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ‫كلية عاوم الطبيعة والحياة‬

Département : Biologie Animale ‫ بيولوجيا الحيوان‬: ‫قسم‬

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité : Génétique Moléculaire

Intitulé :

Proteus mirabilis au niveau CHU Constantine

Caractérisation biochimique, microbiologique
et la mutagénèse

Présenté et soutenu par : HAMDOUCHE CHAIMA Le : 19/06/2016

TABAI AMIRA

Jury d’évaluation :

Président du jury : Mme SATTA .D Professeur- UFM Constantine 1.

Rapporteur : Mme BECHKRI .S MAA- UFM Constantine 1.

Examinateur : Mme SAOUDI. M MAA- UFM Constantine 1.

Année universitaire
2015 - 2016
 REMERCIEMENTS

El hamdoulillah
Nous voudrions présenter nos remerciements et notre gratitude en premier lieu au
chef de service de laboratoire du CHU de Constantine Mr BENLABED. K pour
nous avoir accueillies dans son laboratoire et qui nous a aidées à réaliser la
grande partie de la présente étude.
Un merci particulier à Mme SAOUDI M pour son aide.
Au Mr YASSER pour son soutien dans la réalisation de la partie pratique.
Nous remercions très sincèrement Mme BECHKRI S pour nous avoir encadrées et
nous avoir suivies régulièrement pour la réalisation de ce travail et de tout ce
qu’elle a fait pour nous permettre d’atteindre ces résultats.
Un remerciement très particulier à mes chers MANEL et MOUHAMED qui nous
ont beaucoup aidés pour réaliser notre partie pratique .Nous vous remercions de
tout notre cœur.
Nos remerciements s'adressent également à tous les membres de jury : Mme
SATTA D et Mme SAOUDI M qui nous ont fait l'honneur de leur présence et
d'avoir consacré leur temps pour juger ce travail.
Ces remerciements s’adressent à tous nos enseignants du département de Biologie
animale, qui nous ont transmis le goût des études. Et toutes les personnes ayant
contribué, de près ou de loin, à la réalisation de ce travail.
*Merci* À ceux et à celles qui nous ont aidé d’une façon ou d’une autre, de près
ou de loin dans notre travail, nous les remercions du fond du cœur.

Merci à tous………..
 Dédicace
Je dédie ce travaille
♥A Ma très chère mère NADIA♥
Qui a œuvré ma réussite, de par son amour, son soutien, tous les
sacrifices et ses précieux conseils, pour toute son assistance et sa
présence dans ma vie, l’expression de mes sentiments et de mon
éternelle gratitude. Puisse Dieu le tout puissant, te préserver et
d’accorder santé, longue vie et bonheur.
♥ A Mon très cher père KAMEL♥
Qui peut être fier et trouver ici le résultat de longue années de sacrifices
et de privations pour m’aider à avancer dans la vie .Merci pour
l’éducation et le soutient permanant venu de toi .Dieu tout puissant te
farde et te procure santé
♥ Mes chères grands-parents ♥
♥ Ma chère sœur ♥
MOULOUK
♥ Mes chères fréres♥
CHAMSE ADDINE TAKIE ADDINE CHAHINE
♥ A toute ma famille : oncles, tantes, cousins et cousines ♥
♥ A mes chères ami(e)s ♥
♥ A mes chers collègues ♥
♥A oncle DJAMEL ♥
Qui m’ont aidé durant toute ma vie estudiantine, et a ceux qui m’ont
aidé près ou de loin.
 Dédicace
Je dédie ce travaille
A
♥ Mes chérs grands -parents♥
Qui m’ont soutenus
Jusqu’à la fin de mes études, qui m’ont aidée et entouré d’amour avec
fierté
Mes très chers et adorables parents
♥ Mes chères sœurs et mes frères ♥
♥ A toute ma famille : oncles, tantes, cousins et cousines ♥
♥ A mes chères ami(e)s ♥
♥ A mes chers collègues ♥
Et en fin à la personne qui m’a beaucoup aider
Pour son soutien moral et sa gentillesse sans égale, oncles Djamel.
 SOMMAIRE
Introduction ……………………………………………………………………………..……01

Chapitre I : Synthèse Bibliographique

Généralités sur Proteus Mirabilis
I.1/ Historique…………………………………………………………….………………...…03
I.2/ Classification…………..…………..……………………………………………….….…04
I.3/ Caractères bactériologiques………………………………………………………………04
I. 3-1/ Caractères morphologiques …………………………………………..……………..04
I.3-2/ Caractères culturaux………………………………………………………………….05
I. 3-3/ Caractères biochimiques………………………………………………...…………...05
I.4/ Habitat …………………………………………………………………………...………06
I.5/ La génétique …………………………………….……………………………………….06
I.6/ Pouvoir pathogène …………………...…………………………………………………. 07
I-7- Virulence et pouvoir pathogène………………………………………………………….08
I-7-1-Les facteurs de virulence ……………………………………………………….……...08

II- Les antibiotiques……………...…………………...………………………………………10

II-1- Définition ……………………………………...………………...……………………10
II-2- Classification ……………………………………….……..………………………… 10
II-3- Mode d’action ………………………………………………………..……………… .12
II-4- Les différentes familles d’antibiotiques…………………………….………………… 12
II-4-1- Les β-lactamines …………………...…………………….……………………... 12
II-4-2- Les aminosides……………………………………………………………...………. 13
II-4-3- Les Quinolones ………………………………………………………………………13
II-5- Résistance de Proteus mirabilis aux antibiotiques…………………………….………...14
II- 5-1 -Notion de la résistance bactérienne………………………………………………...14
II-5-2- Les mécanismes de résistance………………………...………………….………... 14

Chapitre II : Matériels et Méthodes

I- Matériels ……………………………………………………………………………….…..……….. 16
I-1- Lieu et durée de l’étude………………………………….………………………………..…..…..16
I-2- Echantillonnage…………………………………….…………...………………………………. 16
I-3 - Matériel utilisés …………………………………………………………………………….……17
I-4 - Milieux de culture …………………………………………………………………………..…….17
I-4-1- Milieux de culture solides ………………………………………………..………….17
I-4-2-Milieux d’identification biochimiques ………………………..……………...……....17
I.5 - Antibiotiques………..……….…………………………………………………………..17
II - Méthodes………………………………………………………………………………… 18
II-1- Type des prélèvements ……………………………………………………………….18
II-2 - Préparation des souches ……………………………………………………………....18
II-2-1- Ré-isolement ……………………………………………………………………...18
II-3- Identification microbiologiques…………………………………...…………………. .18
II-3- 1- Examen macroscopique ………………………………………………………….18
II-3- 2 -Examen microscopique …………………………………………………………..18
II-4- Identification biochimique ……………………………………………………………..20
II-4-1-Le milieu mannitol mobilité …………………………………..………………….20
II-4-2- Le milieu citrate de Simmons ……………………………………………….…...21
II-4-3 - Milieu Triple Sugar Iron (TSI) ………………………………………………..…22
III-4-4- Milieu urée indole………………………………………..…………………..… 23
II-4-5- Milieu Clark et Lubs………………………..………………………………...…..25
II-4-6- La recherche des ODC, LDC, ADH…………………………...………..………... 27
II-4-7- La recherche des enzymes………………………...…………….……………….. 29
a/ Le test d’ONPG……………..……………………………….………………..…..... 29
b/ Le test de la catalase…………..………………………………………...…………. 30
c/ Test d’oxydase…………………………...……………………...……………….… 31
II-5- Réalisation de l’antibiogramme……………………………………………………... …33
II-5-1-Principe …………………………………………..………………………………..33
II-5-2- Technique …………………………………...………..………………….……….34
II-6- Mutagénèse……………………………………………………..…………………….... 35
II-6-1 - But de l'irradiation par les rayons ultraviolets (UV) ……………………………….35
II-6-2- La techniques ……………………………………………………………………..35
II-7- La galerie biochimique après la mutagenèse ……………………………………………37
II-7-1- Méthode ……………………………..…………………………………………….38

Chapitre III : Résultats et Discussions

I- Distribution des souches Proteus mirabilis ……………………………………..…..….…..39
I-1- Selon l’origine du prélèvement …………………………………………..……….……39
 I-2- Selon le sexe ……………………………………………………………………………40
II - Les caractères culturaux…………………………………………………………..……… 40
II- 1- Examen macroscopique…………………………………………………..…….…… .40
II.2- Examen microscopique………………………………………………...……………. .41
III- Les caractères biochimiques………………………………………………………………41
III-1-Résultats de la galerie……………………………………………………………………41
III-1-1 - Le milieu mannitol mobilité ……………………………………………….…….42
III-1-2 -Le milieu citrate se Simmons…….……….…………………………………..….. 43
III-1-3- Le milieu TSI…………………….…….…………………………………….…... 43
III-1-4 -Recherche de l’activité uréasique …………………………………………….…...44
III-1-5- Milieu Clark et Lubs...………………………………………………………….… 46
III-1-6- La recherche des enzymes…………………………………………………...…..... 47
III-2-Résultats de l’antibiogramme ………..………………….…………………………..…...51
IV – Résultats de la mutagénèse ………………………………………………………………54
IV- Galerie biochimique après mutagenèse…………………………………………………...55
V- Résultats de la galerie biochimique après mutagenèse …………………………………….55
V -1- Test Mannitol-Mobilité ………………...………………………………………….…55
V -2- Test de citrate de Simmons …………………………………………………….…….56
V -3-Triple-Sugar- Iron (TSI)..…………………………………………………..……….…56
V- 4 - Test Urée-indole ……………………………………………………………….…….57
V-5- Test de catalase et d’oxydase ………………………….…………..…………….……57
V -6- Test ODC – ADH –LDC………………………………..……………………...…….57
V -7- Test VP – RM- ONPG…………………………………………..……………………58
Conclusion…………………………………………………………………………………...…60
Références bibliographiques………………………………………………………………..….61
Résume
Annexe
 Liste des abréviations
ADH : Arginine dihydrolase.
AMC : Amoxicilline + acide clavulanique.
AMX : Amoxicilline.
Ak : Amikacine.
ATB : Antibiotique.
BLSE : Bêta- lactamase à spectre Elargi ou Etendu .
C+G% : Pourcentage en guanine + cytosine du génome (anciennement coefficient de Chagraff).
C1G : Céphalosporine de 1ère génération.
C3G : Céphalosporine de 3ème génération.
C4G : Céphalosporine de 4ème génération.
CHUC : Centre hospitalo-universitaire de Constantine.
CIP : Ciprofloxacine.
CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute.
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.
CS : Colistine.
CTX : Céfotaxime.
CZ : Céfazoline.
FOX : Céfoxitime
H : heure.
H2O2 : Eau oxygénée.
H2S : Sulfure d'hydrogène.
I : Intermédiaire.
IMP : Imipénème.
LDC : Lysine décarboxylase.
LPS : lipopolysaccharide.
NA : Acide nalidixique.
NaCl : Chlorure de sodium.
O : Antigène capsulaire.
ODC : Ornithine.
ONPG : Orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside.
PLP : Protéine liant les pénicillines.
R : Résistance.
RM : Rouge de Méthyle.
S : Sensible.
SXT : Sulfaméthoxazole + Triméthoprime.
TDA : Tryptophane désaminase.
TIC : Ticarcilline.
TSI : Triple Sucre a Identifié.
VP : Voges-Proskauer.
SDS-PAGE : Poly Acrylamide Gel Electrophoresis contenant du lauryl Sulfate De Sodium
ORL : L'oto-rhino-laryngologie
PTA : protéine autotransporteur membrane
 Liste des figures
Figure 01 : Mode d’action des antibiotique……………………………………………….12
Figure 02 : Le milieu Mannitol Mobilité……………………………………………….…21
Figure 03 : Le milieu citrate de Simmons ………………………………………………...22
Figure 04 : Le milieu TSI………………………………………………………………….23
Figure 05 : Le test Urée Indol. …………………………………………………………….24
Figure 06 : Le Test TDA…………………………………………………………………...25
Figure07 : Le milieu Clark et Lubs…………………………………………….………….26
Figure 08: Test VP et Test RM…………………………………………………………….26
Figure 09: Test: ODC –LDC –ADH………………………………………………….…....28
Figure 10 : Le test ONPG. ………………………………………………….……………...30
Figure 11 : Test de catalase …………..…………………………………………………....31
Figure 12 : Test d’Oxydase……………………………………………………….………..32
Figure 13 : Les étapes de la mutagénèse d’une souche de Proteus mirabilis………………..36
Figure 14 : Test Manitol/ Mobilité - Citrate de Simmons –TSI - Urée /Indol……………..37
Figure 15: Test TD …………………………………………………….……………...…..37
Figure 16: Test ONPG…………………………………………………………………..…37
Figure 17 : Test d’oxydase…………………………………………………………………38
Figure 18 : Test de catalase……………………….……………………………………..…38
Figure 19 : Test ODC-LDC-ADH……………………….………………………………....38
Figure 20 : Test RM, VP ………………………………………………………………..….38
Figure 21 : Répartition des souches Proteus mirabilis selon l’origine du prélèvement……39
Figure 22 : Répartition globale des souches de Proteus mirabilis selon le sexe…………...40
Figure 23 : Aspect macroscopique des colonies proteus mirabilis sur gélose Hecktoene….41
Figure 24 : Aspect microscopique des colonies proteus mirabilis (G * 100)……………….41
Figure 25 : Aspect du milieu mannitol…………………………………………………….42
Figure 26 : Aspect du milieu de la Mobilité………………………………………………43
Figure 27 : Aspect du milieu citrate de Simmons………………………………………....43
Figure 28 : Aspect du milieu TSI………………………………………………………….44
Figure 29 : Aspect du milieu Urée-indol (a) pour positive et (b) pour négative………..…45
Figure 30 : Aspect du milieu TDA………………………………………………….……..46
Figure 31 : Aspect du milieu pour le test VP et RM…………………………………..…..47
Figure 32 : Aspect du milieu ODC – LDC – ADH…………………………………….….48
Figure 33 : Aspect du milieu avec le test ONPG…………………………………………..48
Figure 34 : Le Test de catalase………………………………………………………….…49
Figure 35 : le Test de l’oxydase………………………………………………………...….50
Figure 36 : Antibiogramme d’une souche Proteus mirabilis étudiée…………………..…52
Figure 37 : Pourcentage de résistance et la sensibilité de Proteus mirabilis aux β-
lactamines……………………………………………………………………………..…....53
Figure 38 : Taux de résistance et la sensibilité de Proteus mirabilis aux autres
antibiotiques………………………………………………………………………….…….54
Figure 39 : Les colonies d’une souche Proteus mirabilis après irradiation………………..55
Figure 40 : Aspect du milieu Mannitol Mobilité avec la souche mutante…………………55
Figure 41 : Aspect du milieu citrate de Simmons avec la souche mutante…………….….56
Figure 42 : Aspect du milieu TSI avec la souche mutante…………………………….…..56
Figure 43 : Aspect du milieu Urée-indol – TDA avec la souche mutante…………………57
Figure 44 : Test de catalase (b) et Oxydase (a) avec la souche mutante…………………..57
Figure 45 : Test ODC – ADH - LDC avec la souche mutante…………………………….58
Figure 46 : Test VP- RM- ONPG avec la souche mutante……………………………..…58

Liste des tableaux

Tableau 01 : Caractères biochimiques de Proteus mirabilis………………………………….05
Tableau 02 : Origine des souches utilisées…………………………………………………..16
Tableau 03 : Indentification biochimique à l’aide de la galerie classique……………………32
Tableau 04 : Répartition des souches de Proteus mirabilis parmi les prélèvements clinique…39
Tableau 05 : Répartition globale des souches de Proteus mirabilis selon le sexe……..…....40
Tableau 06 : Couleur d’origine des milieux de la galerie biochimique…………………….42
Tableau 07 : Caractères biochimiques des souches Proteus mirabilis étudiées……….........50
Tableau 08 : Tableau présente les caractères biochimiques des souches de Proteus mirabilis
après la mutagénèse…………………………………………………………………….…...58
 Introduction

Introduction
Tout au long de l’histoire, il y a eu une bataille continuelle entre l’homme et la multitude de
micro-organismes qui causent l’infection et la maladie, en affectant une partie substantielle de
la population humaine et provoquant une morbidité et une mortalité importantes. À partir du
milieu du 20èmé siècle, des avancées majeures dans le développement des médicaments
antibactériens et autres moyens de lutter contre les infections ont aidé à renverser la tendance
en faveur de l’homme (Misra et al ., 1984).
Les entérobactéries sont largement répandues dans la nature. Elles sont à l’origine de maladies
de gravité très variables, en raison de mécanismes pathogéniques distincts. Un des exemples le
plus frappant pour illustrer ce propos est le genre Proteus qui regroupe les espèces possédant
une uréase et souvent considéré comme responsable des contaminations et/ou colonisations,
mais il est fréquemment impliqué dans les infections hospitalières et même au cours des
infections communautaires (Ohara et al., 2000).
Les Proteus sont notamment responsables d’infections urinaires et aussi d‘infections
nosocomiales où elles sont généralement associés à d’autres bactéries (Janda et Abbott .1998).
Les germes appartenant à ce genre sont des composants de la flore bactérienne normale de
l’intestin de l’homme et des animaux et elles sont retrouvés aussi à l’état saprophyte sur la peau
et les muqueuses (Manos et al., 2006). En raison de leurs habitats variés, ils ont plusieurs voies
possibles d’infections humaines.
La résistance aux antibiotiques a été de plus en plus observée pour ce genre. La diffusion de la
résistance aux céphalosporines à large spectre en raison de la production du β-lactamase à
spectre étendu (BLSE) qui est devenue une grande préoccupation depuis la découverte pour la
première fois en 1987 d’une souche Proteus mirabilis productrice de BLSE (Sturenburgy et
al.,2004). Sur l’ensemble des bactéries (toutes espèces confondues) isolées en milieu
hospitalier, 61% des souches de Proteus mirabilis sont résistantes aux β-lactamines par
production de β-lactamases à spectre élargi (Kim et Parck. 2004).
C’est dans ce contexte général que nous avons été amenées à entreprendre le présent travail qui
a pour objectifs :
- L’isolement et l’identification des souches de Proteus mirabilis.
- L’étude du profil de résistance de Proteus mirabilis.
- Une Mutagénèse de Proteus mirabilis par UV.
- Identification biochimique après la mutagénèse.
Notre mémoire est structuré de la manière suivante :
- Introduction.

1
 Introduction

-Synthèse bibliographique.
- Matériels et méthodes.
- Résultats et discussions.
- Conclusion.

2
Synthèse bibliographique
 Chapitre I Synthèse bibliographique

I -Généralités sur proteus mirabilis

I-1- Historique
Le genre Proteus a été découvert par un pathologiste allemand nommé Gustav Hauser en 1885
et qui a donné le nom à cette bactérie qui se caractérise par l'envahissement de la gélose
(Hauser, 1885) et qui est parvenu à distinguer 04 espèces génomiques. Certaines étant
clairement dénommées comme Proteus mirabilis, Proteus vulgarise, Proteus penneri, Proteus
myxofaciens (Brenner et Holmes, 1995). Le genre avait à l'origine deux espèces : Proteus
mirabilis et Proteus vulgaris, en fonction de la vitesse de leur capacité à liquéfier la gélatine.
Proteus vulgarise liquéfie la gélatine rapidement. Proteus mirabilis le fait plus lentement
(Hauser, 1892) .Ce genre de bactéries Gram négatifs, dont beaucoup causent des infections des
voies urinaires, et fréquemment isolés à partir de l'urine des patients âgés subissant un
cathétérisme à long terme chez l'homme (Warren,1991). Proteus mirabilis causent 90% de ces
infections. En raison de leurs habitats variés, elles ont plusieurs voies possibles d’infections
humaines (Liu ,2010).
En 1894, Smith Théobald a indiqué les caractéristiques de fermentation de ces deux espèces en
utilisant le glucose, le saccharose et le lactose (Smith , 1894).
En 1919, Wenner et Rettger ont étudié les caractéristiques biochimiques d'un groupe plus
important de souches de Proteus. En accord avec le travail de Hauser, toutes ces souches
produisent du sulfure d'hydrogène et ne fermentent pas le lactose .Elles fermentent le glucose,
le saccharose et le maltose (Wenner et al., 1919).
En 1983, Williams et al ont fait un rapport sur cinq patients dans une unité de chirurgie
cardiaque avec une septicémie causée soit par Proteus mirabilis, Morganella morgani, ou les
deux organismes. Aucune source de l’environnement n’a été identifiée, bien que le O
sérotypage ait confirmé une infection croisée des patients par les deux espèces (Williams.,
1983).
Au cours des 10 dernières années, il y a eu un rapport dans la littérature pour suggérer que
Proteus mirabilis peut jouer un rôle étiopathogénique dans la polyarthrite rhumatoïde. Cette
étude a montré que les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde ont des niveaux plus élevés
de Proteus urinaire que ne le font les contrôles comparables sains des deux sexes ou les
femmes avec des non-polyarthrite-rhumatoïde conditions arthritiques (Wilson., 1997).

3
 Chapitre I Synthèse bibliographique

I-2 - Classification
La classification des bactéries de genre Proteus a changé au cours du XXe siècle. Le genre
Proteus est actuellement défini comme appartenant à la famille des Enterobacteriaceae au sein
de l’ordre Entérobacteriale qui regroupe l’espèce Proteus mirabilis (Bergey’s ,1998).
Règne : Bacteria.
Embranchement : Protoebacteria.
Classe : Gamma Proteobacteria.
Ordre : Entérobacteriale.
Famille : Enterobacteriaceae.
Genre : Proteus.
Espèce : Proteus mirabilis (Bergey’s ,1998).
I-3- Caractères bactériologiques
I-3-1- Caractères morphologiques
Les bactéries appartenant à l’espèce Proteus mirabilis .Ont une morphologie des petits bacilles
à Gram négatif en forme de bâtonnet, généralement très mobiles, polymorphes, mesurant de 0,4
à 0,8 μm de diamètre sur 1,0 μm à 80 μm de longueur, très flagellé en alternance entre les
nageurs végétatives et cellules grouillantes hyper- flagellé ( Belas, 1996). Proteus mirabilis a la
capacité de s'allonger et sécréter un polysaccharide lorsqu'il est en contact avec des surfaces
solides, ce qui rend extrêmement mobiles sur des éléments tels que l'équipement médical. Elle
se caractérise par sa motilité de l'essaimage, sa capacité à fermenter le maltose et son incapacité
à fermenter le lactose (Liu, 2010).
Proteus peut afficher deux formes morphologiques et physiologiques différentes : l'une est
connue comme les cellules de nageur et l'autre comme cellules grouillantes. En suspension
aqueuse Proteus mirabilis se trouve dans l'état de la nageuse, qui est une petite cellule en forme
de tige à 2 mm de longueur. Elles contiennent 8 à 10 flagelles qui aident à leur motilité de
natation. Lors d’un contact avec une surface. Proteus mirabilis passe à l'état de Grouillant où la
cellule augmente considérablement dans la longueur pour former des filaments très flagellés
qui sont de 20 à 80 mm de longueur. Ces cellules alignées en parallèle pour former des radeaux
qui sont capables de se déplacer rapidement sur des
Surfaces en masse. Sur des surfaces semi-solides telles qu'une surface de la gélose, ils forment
des anneaux concentriques de croissance (Pearson et al., 2008).
I-3-2 - Caractères culturaux
Proteus mirabilis se développe en aéro-anaérobiose. Elle n’a pas d’exigence particulière.
Proteus mirabilis pousse bien sur milieux ordinaires (c’est une Entérobactérie) à 37°C.

4
 Chapitre I Synthèse bibliographique

- Les colonies grosses, non hémolytiques, envahissant la surface de la gélose en ondes

concentriques (cette propriété est liée à la mobilité exceptionnelle que lui confèrent
plusieurs centaines de flagelles).
- Sur BCP, les colonies sont petites, transparentes en 24 h (Maryse et Danielle,
2004).
- En bouillon, les cultures se développent en donnant souvent un voile en surface.
I-3-3- Caractères biochimiques
Proteus mirabilis présente les caractères généraux des Entérobactéries .C’est une bactérie aéro-
anaérobie facultative, fermentant le glucose avec production de gaz , H2S +, oxydase négatif,
catalase positif, possède une nitrate-réductase, Rouge de méthyle positif et Voges- proskauer
négative (peut être à la fois RM et VP positif) (Maryse et Danielle, 2004).Les caractères TDA,
ONPG. Indiquent qu’il s’agit d’un Proteus mirabilis. Elle peut utiliser l'urée, forme des films
transparents sur un milieu de croissance, utilise le citrate. Elle peut vivre dans des
environnements hautement alcalins. Ces caractères biochimiques sont facilement mis en
évidence sur les galeries miniaturisées (Maryse,2004). Les caractères biochimiques
d’identification de l’espèce sont présentés dans le tableau 01
Tableau 01 : Caractères biochimiques de Proteus mirabilis (Maryse, 2004).
Caractères biochimiques Proteus mirabilis

Glucose +

Lactose - -

Saccharose -

H2S +

Citrate -

Mannitol -

Urée +

Indole +

TDA +

VP -

5
 Chapitre I Synthèse bibliographique

RM +

ADH -

LDC -

ODC +

I-4/ Habitat
Les Proteus mirabilis sont largement répondus dans l’environnement naturel, y compris l’eau
polluée, le sol et le fumier, on les rencontre aussi dans la viande putride, des abcès. Elles sont
pour la plupart des habitants de voies urinaires de l'homme où elles est censé causer des
infections des voies urinaires associés à la formation de calculs rénaux et de la vessie, souvent
connus sous le nom des calculs vésicaux (Kelley Struble et al .,2009).
Elles sont impliquées dans la décomposition de la matière organique d’origine animale. Par
conséquent, elles sont souvent isolés de matières fécales humaines et animales (Janda et al.,
2006) .Environ un quart de la population humaine sont porteurs intestinaux de Proteus et les
patients peuvent être infectés par leurs propres flore (autoinfection) .Elles sont les hôtes
habituels de tube digestif de l’homme et des animaux. Ces infections peuvent également être
contactées par la transmission des bactéries provenant d'autres patients ou à partir d'un réservoir
commun (Holt et al., 1986). Proteus mirabilis nécessite un environnement qui a une alcalinité
élevée, qui est mesurée en termes de pH, qui doit être élevée. Un milieu approprié pour Proteus
mirabilis doit avoir un pH supérieur à 7 (frasca et al ., 2008).
I-5- Génétique
Le génome de Proteus mirabilis a été achevé le 28 Mars 2008 (Pearson et al., 2008). Il est
constitué de 24 gènes qui codent pour des composants d'un système permettant d'injecter des
protéines bactériennes dans des cellules hôtes. Ce système de type III semble être constitué par
le transfert horizontal de gènes. Est noté pour sa relativement plus faible teneur en G + C par
rapport au reste du génome (Holmes et al., 2008). La longueur totale du génome est constitué
d'un chromosome de 4.063 Mb avec une teneur en GC (G + C) de 38,88%. Ce génome est
constitué par un seul plasmide de 36289 nucléotides. Le plasmide lui-même ne contient pas de
gènes de virulence, mais il peut contenir une bactériocine et son système immunitaire (Melanie
et Pearson, 2007). L’annotation du génome est identifiée 3,685 séquences codantes et sept
locus ARNr. L'analyse de la séquence a confirmé la présence des déterminants de virulence
identifiés précédemment, ainsi que d'un régulon flagellaire 54 kb contigu et 17 types de

6
 Chapitre I Synthèse bibliographique

fimbriae. Cette information se caractérise par une souche uropathogène spécifique de Proteus
mirabilis HI4320. Elle est la première séquence complète de la bactérie à partir de plus de 75
souches connues qui ont été identifiés en utilisant une SDS-PAGE de la plupart des protéines
cellulaires d'origine humaine (Holmes et al., 2008).
Le chromosome de Proteus mirabilis est considérablement plus petit que les chromosomes des
autres entérobactéries. En outre, le génome de Proteus mirabilis possède quatre copies en
tandem du gène du métallo protéase zapE , des gènes codant pour six autotransporters putatifs,
une extension de l'opéron fimbriale atf , six gènes y compris un homologue mrpJ et des gènes
codant pour au moins cinq mécanismes d'absorption de fer et deux systèmes potentiels de type
IV de sécrétion, 16 régulateurs à deux composants (Pearson et al., 2008).
I-6- Pouvoir pathogène
Proteus mirabilis est une espèce non pathogène mais qui provoque une infection urinaires avec
une fréquence la plus élevée parmi toutes les espèces de Proteus .Elle est impliquée dans les
infections compliquées et les infections chez les patients cathétérisés pendant une longue durée
(Philips, 1955). Proteus mirabilis est plus fréquemment isolée à partir des échantillons
cliniques. Elle est l'un des principaux agents pathogènes de l'appareil urinaire humain chez les
patients hospitalisés. Ces infections urinaires peuvent donner lieu à des bactériémies hautement
mortelles et qui sont difficiles à traiter et souvent fatale. Qui peuvent être opportunistes et
causer des lésions septiques sur d'autres sites du corps (Holt et al., 1986). Dans les infections
urinaires communautaires ou nosocomiales. Proteus mirabilis grâce à son uréase puissante peut
alcaliniser les urines et être responsable de lithiases. Ces lithiases se comportent comme du
matériel étranger qui permet à l’infection de devenir chronique, entraînant ainsi une destruction
progressive du parenchyme rénal. Sur le plan des infections des voies respiratoires surtout en
milieu hospitalier peut provoquer une infection ORL et pneumopathies (Maryse et Danielle,
2004). L’incidence des infections par cet organisme est à seulement 44% des patients avec des
voies urinaires compliqués, à savoir ceux présentant des anomalies fonctionnelles ou
anatomiques ou avec une instrumentation chronique comme le cathétérisme à long terme
(Kemper et al., 1988). Ce qui rend l'infection nosocomiale la plus fréquente. Bien qu’infectant
le tractus urinaire, Proteus mirabilis a une prédilection pour les reins (Maryse et Danielle,
2004). Enfin et surtout, non seulement cette bactérie cause de la cystite et pyélonéphrite aiguë
mais la production de calculs urinaires, une caractéristique de l'infection par cet organisme
(Cover et al., 2001).

7
 Chapitre I Synthèse bibliographique

I-7- Virulence et pouvoir pathogène

Les termes pathogénicité et virulence sont souvent utilisés comme synonymes. Mais certains
auteurs font une distinction claire entre les deux .Le terme pathogénicité définit la capacité de
la bactérie à causer une maladie alors que la virulence est la mesure ou le degré de
pathogénicité (Podschun et Ullmann, 1998).
I-7-1-Les facteurs de virulence
Proteus mirabilis est une bactérie bien adaptée à l'hôte. La colonisation du tractus urinaire est
accomplie grâce à l'expression de plusieurs facteurs de virulence. Ces facteurs sont liés aux
processus d'adhésion, la toxicité, l'évasion et la motilité. De nouveaux génomes de cette
bactérie ont été séquencés (Cristiani et al.,2014), Proteus mirabilis est très virulente et contient
de nombreuses caractéristiques qui l’aide de sa pathogénicité. Elle possède un flagelle qui est
nécessaire pour la motilité et qui impliqué dans l'apparition des infections. Cette bactérie
produit également de l'uréase, qui est responsable des calculs rénaux à la suite de l'hydrolyse de
l'urée en ammoniac. En outre, l'hémolysine que la bactérie sécrète est cytotoxique pour les
cellules épithéliales des voies urinaires qui sont soumis à l'invasion par les Proteus (Misra et al
., 1984).
- Uréase
L’uréase est très importante dans la pathogenèse de Proteus mirabilis, cette enzyme est
composée de trimères en UréA, UréB, UréC (Jones et Mobley, 1998) et un co-enzyme de
nickel. Qui catalyse la formation de calculs rénaux et de la vessie (Cocker et al.,2000). Proteus
présente une activité uréase lors d’un contact avec l’urée. L’uréase provoque la décomposition
de ce dernier en ammoniac et en dioxyde de carbone (Mclean et al ., 1988). Donc l’ammoniac
augmente le pH et provoque la précipitation des minéraux dans l'urine, ce qui peut conduire à
des calculs de la vessie et du rein. Ainsi que la formation de biofilms cristallins le long d’un
cathéter (Jones et Mobley ,1991) .Cette modification du pH est importante lors de la
colonisation de Proteus de cathéter, ce qui facilite l'adhérence bactérienne (Nicholson et al.,
1991).
- IgA Protéase
Les Proteus mirabilis peuvent produire une autre enzyme extracellulaire d'immunoglobuline
sérique capable de cliver les IgA. C’est la métallo protéase de la famille de serralysin de
protéase de zinc codé par ZapA (Wassif et Cheek, 1995). Le pH alcalin est optimal pour
l’activité d’un grand nombre de ces types de protéase, ce qui est souvent présent en raison de
l’activité de l’uréase. Au cour de l’infection, ZapA est produit et actif. Ce qui provoque la
dégradation de l’IgA in vivo (Sonior et al., 1991). Il a été également montré que ZapA est

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 Chapitre I Synthèse bibliographique

muté, le nombre des bactéries récupérées est spécifiquement diminué dans l’urine et la vessie
avec une diminution d’un facteur 100 000 et 10 000 respectivement (Walker et al., 1999).
- Hémolysine
L’hémolysine est une toxine qui s’insère dans les membranes cellulaires des eucaryotes.
L'activité hémolytique est communément retrouvée chez les bacteries a Gram- et Gram +.
Proteus mirabilis présente une activité hémolytique code par les gènes hpmB et hpmA. C’est
un système de sécrétion de deux conjoints .HpmB est probablement trouvée dans la membrane
externe, elle transporte et active hpmA. HpmA se trouve dans le périplasme (Welch, 1987). La
fonction hémolytique est de former des pores dans les cellules hôtes cibles, ce qui permet au
Proteus de se propager dans les reins lors de l’infection (Cocker et al., 2000) .Ceci est
probablement médité par la capacité accrue des cellules hémolytique de cette bactérie à envahir
les tissus de l’hôte (Peebooms et Verwrij, 1984). Cette hémolysine n’est pas aussi active au
cours de l'infection in vivo ou l'activité d'autres facteurs de virulence masquent sa contribution
(Mobley et al., 1991). D’autres études ont indiqué également que les souches qui n’ont pas une
activité hémolytique sont moins virulentes (Peebooms et Verwrij, 1983).
- Agglutinine toxique
Une toxine découverte, la PTA produite par Proteus est à la fois cytotoxique et possédant la
capacité d’agglutination. La PTA est une protéine calcium dépendante qui reste à la surface de
la cellule. L’activité cytotoxique est liée au PTA quand elle est associée à une cellule. Il a été
montré que la PTA est exprimé in vivo au cour d’une infection et que les bacteries dépourvues
de PTA ont des symptômes de la maladie moins graves dans les reins. Ces données suggèrent
le rôle important de la PTA dans la pathogenèse de Proteus mirabilis (Alamuri et Mobley,
2008).
- Flagelles et essaimage
L’essaimage (ou swarning) est une alternative à la nage observée lorsque les bacteries sont
cultivées en milieu solide, ensemencées au centre d’une boite de milieu gélosé. Les bacteries se
multiplient pour donner une colonie (Rozalski et Staczek, 2009). L’essaimage est un
phénomène collectif et cordonné car une cellule isolée est capable d’essaimer à la surface d’une
gélose. L’induction de l’essaimage est déclenchée par des facteurs inhibant la rotation des
flagelles (telle que l’augmentation de la viscosité du milieu) et par la présence de signaux
extracellulaires (verstraeten et al., 2008). Les capacités à essaimer sont variables selon les
espèces et les souches. Il peut ne pas exister avec certaines souches de Proteus mirabilis qui
forme un voile continu (envahissement continu sans périodicité), soit des colonies parfaitement
circonscrites (absence totale d’envahissement) (Siloverblatt et Ofek, 1978).

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 Chapitre I Synthèse bibliographique

- Fimbriae
Les fimbriae sont des appendices de surface bactérienne pour l’adhésion. Le séquençage récent
de génome de Proteus mirabilis a révélé qu’il y a 17 opérons fimbriaux différents couvrants 5
classes différentes de fimbriae. Seuls quelques-unes d’entre eux ont été impliquées dans la
virulence. Les fimbriae sont normalement exprimés à l’inverse des flagelles (Bahrani et
Mobley. 1994). Ils sont responsables d’une hémagglutination non inhibée par le mannose. Les
fimbriae MR/P sont fréquemment synthétisées par les Proteus mirabilis (Zahao et al ., 1997).

II- Les antibiotiques

II- 1- Définition
Le mot antibiotique fut créé en 1889 par Paul Vuillemin. Les antibiotiques sont définis comme
toute substance antibactérienne d’origine biologique, synthétique et/ou semi-synthétique
obtenue par modification chimique d’une molécule de base naturelle (Lavigne, 2007). Un
antibiotique est un dérivé produit par le métabolisme de microorganismes possédant une
activité antibactérienne à faible concentration et n’ayant pas de toxicité pour l’hôte (Perronne,
1999). On distingue les activités bactériostatiques, qui inhibent la croissance microbienne, et
les activités bactéricides, qui tuent. (Prescott, 2003).
II-2/ Classification
Les antibiotiques peuvent être classés en se basant sur différents critères tels que :
Leurs origines, leurs structures et leurs mécanismes d’action. Leur spectre d’activité (Yala et al.
2001).
- Origine : élaboré par un organisme (naturel) ou produit par synthèse (synthétique ou semi-
synthétique.
- Mode d’action : paroi, membrane cytoplasmique, synthèse des protéines, synthèse des acides
nucléique.
- Spectre d’activité : liste des espèces sur lesquelles les antibiotiques sont actifs (spectre étroit
ou large).
- Nature chimique : très variable, elle est basée souvent sur une structure de base (ex : cycle β
lactame) sur laquelle il y a hémi synthèse.
La classification selon la nature chimique nous permet de classer les antibiotiques en familles
Il existe plusieurs familles d’antibiotiques. Les principales sont :
- Les béta-lactamines.
- Les macrolides.
- Les glycopeptides.

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 Chapitre I Synthèse bibliographique

- Les aminosides.
- Les tétracyclines.
- Les quinolones.
- Les sulfamides.
II-3- Mode d’action
En thérapie, les antibiotiques doivent tuer ou inhiber les micro-organismes sans détruire nos
cellules. En effet, pour pouvoir être utilisable en pratique clinique, un antibiotique doit se
caractériser par une action spécifique sur les germes visés sans perturber le fonctionnement des
cellules de l’hôte (Smaoui ,2010). Les antibiotiques agissent à l’échelon moléculaire au niveau
d’une ou de plusieurs étapes métaboliques indispensables à la vie de la bactérie (Fomba, 2006).
- Action sur la paroi bactérienne (peptidoglycane).
- Action sur la structure de la membrane cytoplasmique bactérienne.
- Action sur la synthèse protéique bactérienne.
- Action sur la synthèse de l’ADN de la bactérie.
Les modes d’action des antibiotiques sur les bacteries sont illustrées dans la figure 01.

Figure 01 : Mode d’action des antibiotiques (Fomba, 2006).

II-4- Les différentes familles d’antibiotiques
II-4-1- Les β-lactamines
- Définition
Les β-lactamines sont les antibiotiques de première ligne dans le traitement des infections
causées par les entérobactéries. Cependant, dès le début de leur utilisation de masse dans les
années 1940. Leur efficacité a été confrontée à la production d’enzymes les inactivant : les β-
lactamases (Ruppé. 2010).

11
 Chapitre I Synthèse bibliographique

- Structure et classification
La structure de base des β-lactamines est le noyau azétidinone qui contient la structure
carbonyle lactame indispensable à l’activité des molécules. Sur cette structure est fixée un cycle
penta-atomique saturé (péname), insaturé (pénème) ou hexa-atomique (céphèmes). Le noyau
azétidinone seul (β-lactamine monocyclique) peut être substitué. En fonction des substituants
de l’atome d’azote (Bryskier, 1999).Les b-lactamines sont divisées en plusieurs familles et
chaque famille donne différentes sous familles on cite :
a/ Pénicilline
- Ampicilline et Amoxicilline spectre élargi orienté sur certains bacilles à Gram négatif mais
inactivées par les pénicillinases y compris celle du staphylocoque. Inactives sur les bacilles à
Gram négatif naturellement producteurs de céphalosporinases comme certaines entérobactéries
Proteus mirabilis (Cavallo et al., 2004).
- Carboxypénicillines, Ticarcilline. Spectre élargie sur les bacilles Gram négatif comme
Pseudomonas aérogenozsa (Cavallo et al., 2004).
- l’amoxicilline + l’acide clavulanique, utilisés comme inhibiteur de β-lactamases en
association avec une autre β-lactamine (amoxicilline ou ticarcilline+acide clavulanique) et
l’acide clavulanique + ticarcilline (Cavallo et al., 2004).
b/ Les céphalosporines
-Céfazoline : est une céphalosporine de première génération (C1G). Il est hydrolysé facilement
par les βlactamases acquises. Leur spectre d’activité regroupe les cocci à Gram positif,
essentiellement les streptocoques et à quelques entérobactéries ne produisant pas de
céphalosporinase inductible (Cavallo et al., 2004).
- Céfotaxime : est une céphalosporine de troisième génération (C3G) (Jarlier et Nordmann,
2000). Les C3G se caractérisent par leur stabilité à la plupart des β-lactamases comme les
pénicillinases de type TEM ou les céphalosporinases chromosomiques des entérobactéries
(Cavallo et al., 2004).
- Mode d’action des β-lactamines
Les β-lactamines inhibent la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane (polymère majeur
spécifique de la paroi des bactéries à Gram négatif et positif). Les cibles des β-lactamines sont
des enzymes situées dans la partie externe de la membrane cytoplasmique bactérienne et
appelées PLP. Ces enzymes correspondent aux transpeptidases impliquées dans la synthèse du
peptidoglycane. La fixation des β-lactamines sur ces PLP est responsable de l’arrêt de la
synthèse du peptidoglycane (Cavallo et al., 2004).

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 Chapitre I Synthèse bibliographique

II-4-2- Les aminosides

- Définition
Ce sont des antibiotiques bactéricides de la famille des Aminoglycosides. Ils comprennent la
kanamycine, l’amikacine, la gentamycine, la nétilmycine, la tobramycine (Bryskier, 1999). Ce
sont des hétérosides naturels formés par un ou plusieurs glycosides liés à un aminocyclitol
(Yala et al., 2001).
- Mode d’action
Le spectre d'action des aminosides est large, agissant sur les bacilles Gram négatifs aérobies.
Notamment les entérobactéries et sur les bacilles à Gram positif (Listeria). Ils sont actifs sur les
staphylococcus aureus sécréteurs de pénicillinase et sur les cocci à Gram négatif. Les
aminosides perturbent la synthèse des protéines au niveau de la sous-unité 30S des ribosomes
des bactéries entrainant la destruction bactérienne (Yala et al., 2001).
II-4-3- Les quinolones
- Définition
Les quinolones sont des antibiotiques synthétiques, découvertes en 1962 par Lesher qui a isolé
l’acide nalidixique à partir d’une préparation de chloroquine destinée au traitement du
paludisme. Ces fluoroquinolones, qui sont des quinolones de deuxième génération
ciprofloxacine (Yala et al., 2001). Sont largement utilisés en médecine humaine et vétérinaire,
notamment dans le cas d’infections urinaires et respiratoires (Meradi et al., 2009).
- Mode d’action
Les fluoroquinolones malgré leur efficacité sur les bactéries à gram négatif leur utilisation doit
être raisonnée afin de contrôler l’émergence de résistance (Botto, 2003). Les fluoroquinolones
ont un spectre d’activité élargi, qui recouvre les bactéries à Gram négatif. Les quinolones
inhibent spécifiquement la synthèse d’ADN bactérien en agissant sur les topo-isomérases de
type II ainsi que la topo-isomérase IV. Elles se fixent sur la sous-unité A de la gyrase (cible
préférentielle des bactéries à Gram négatif) (Meradi et al., 2009).
II-5- Résistance de Proteus mirabilis aux antibiotiques
II-5-1 - Notion de la résistance bactérienne
Un micro-organisme est considéré résistant lorsque sa concentration minimale inhibitrice est
plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des autres souches de la même
espèce (Carl, 2009). L'efficacité de l’antibiotique dépend d'au moins trois facteurs : la quantité
d'antibiotique au contact de la cible, l'affinité de l'antibiotique pour la cible et la production
d’enzymes inactivant l'antibiotique. Ces facteurs sont responsables soit d'une résistance
naturelle et donc présents chez toutes les souches de l'espèce, soit d'une résistance acquise par

13
 Chapitre I Synthèse bibliographique

certaines souches. Suite à l'apparition de mutations chromosomiques ou à l'acquisition de

matériel génétique tels que des plasmides, des transposons ou des intégrons (Comité de
l'antibiogramme de la société Française de Microbiologie, 1997).
II-5-2- Les mécanismes de résistance
- Les b-lactamases
Les études actuelles montrent qu'il existe un certain nombre d'antibiotiques qui étaient autre
fois efficace contre Proteus mirabilis qui sont désormais inutiles en raison de longues béta
lactamases du spectre (BLSE). Ce sont des enzymes qui détruit ou inactive l’antibiotique,
traversé les plasmides et on les trouve dans la plupart des entérobactéries. Ces plasmides ont été
trouvés dans les abcès, le sang, pointes de cathéter, les poumons, le liquide péritonéal, crachats
et la culture de la gorge. Citons par l’exemple des β-lactamases produites par les
entérobactéries pour inactiver les lactamines en détruisant le lien amide sur le cycle lactame
(Farkosh et al., 2008).
- Diminution de la perméabilité
Par mutation affectant la structure des porines ou diminuant leurs synthèse par les quelles
l’antibiotique ne peut pas pénétrer dans la bactérie. Par exemple le cas de la résistance de
Pseudomonas aérogenozsa à l’imipénème causée par la perte d’une porine spécifique aux
carbapénemes (Lozniewski et Rabaud, 2010).
- Altération (ou modification) des sites de liaison
Phénomène engendré par des chromosomes ou des plasmides. Ce mécanisme de résistance
produit une baisse de l’affinité de l’antibiotique pour son site d’action comme le cas
d’altération des protéines de liaison aux pénicillines (PLP) (Jacoby et al ., 2006).
- Pompes à efflux
Expulsion rapide de l’agent hors de la cellule avant qu’il puisse agir. Un certain nombre de
bactéries possède une capacité intrinsèque de rejeter hors de la cellule la substance qui vient
d’y entrer. Cette propriété est très connue chez les bactéries à Gram négatif qui possèdent dans
leur membrane des protéines appelées pompes effluentes. Qui expulsent les antibiotiques (Lee.
2006, Jayaraman. 2009).

14
Matériels et Méthodes
Chapitre II Matériels et Méthodes

I-Matériels
I-1- Lieu et durée de l’étude
Notre étude a été réalisée au sein du laboratoire de bactériologie du Centre Hospitalo-
Universitaire Ben Badis de Constantine. Elle s’est étalée sur une période Trois mois (du
07 Février au 07 Mai 2016). La manipulation de la mutagénèse s’est déroulée au niveau
du laboratoire de Zoologie de la faculté des sciences de la nature et de la vie de
l’université des frères Mantouri.
I-2-Echantillonnage
Durant la période de notre stage, nous avons étudié 20 souches de Proteus mirabilis
isolées à partir des prélèvements pathologiques des services du CHU de Constantine. Le
tableau 02 présente l’origine des souches utilisées selon le Sexe, l’age, la nature de
prélèvement et le service.
Tableau 02 : Origine des souches utilisées selon le sexe, âge, nature de prélevement
et le service.
N°de Référence Sexe Age Nature de Service
prélèvement prélèvement

P1 147 F / Sonde Vésicale Réanimation

P2 602 F / Pus Traitement Ambulatoire

P3 648 H / Urine /

P4 664 F 48 Urine /

P5 706 H / Pus /

P6 728 H / Pus Traitement Ambulatoire

P7 765 H / Urine Centre des brulures

P8 711 H / Pus Traitement Ambulatoire

P9 837 H / Pus /

P10 1183 F 51 ECBU Infectiologie

P11 1282 F / ECBU Medecine interne

hommes

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Chapitre II Matériels et Méthodes

P12 1295 F 30 Urine Histologie

P13 1173 H / ECBU Infectiologie

P14 1639 F / ECBU Traitement Ambulatoire

P15 1653 H 17 ECBU /

P16 1676 H / Pus Traitement Ambulatoire

P17 1946 H / ECBU /

P18 1701 F / ECBU /

P19 654 F 32 ECBU /

P20 2447 F 60 ECBU Infectiologie

F : Femme H : Homme.

I-3 - Matériel utilisés

-Microscope optique
- Pipettes Pasteur.
-Pipettes graduées.
-Tubes à essai
- Lames et lamelles, Ecouvillons.
-Lampe UV.
I-4 - Milieux de culture
I-4-1 -Milieux de culture solides
- Gélose nutritive.
- Bouillant nutritive.
- Milieu Hecktoen.
- Mueller Hinton.
I-4-2- Milieux d’identification biochimiques et métaboliques
- Milieu TSI.
- Milieu Mannitol mobilité.
- Milieu Citrate de Simmons.
- Milieu Liquide Urée Indole.
- Milieu Clark et Lubs, RM, VP.

17
Chapitre II Matériels et Méthodes

- Milieu Moeller Témoin, ODC –LDC –ADH.

I.5 - Antibiotiques
Les antibiotiques utilisés étaient :
Les antibiotiques utilisés étaient :
-Amoxicilline.
-Amoxicilline + acide clavulanique.
-Ticarcilline.
- Céfazoline.
- Céfoxitine.
-Céfotaxime.
-Imipénème.
-Gentamicine.
-Amikacine.
- Acide nalidixique.
-Ciprofloxacine.
-Triméthoprime +Sulfaméthoxazole.
-Colistine.
-Chloramphénicol.

II - Méthodes
II-1- Type des prélèvements
Les prélèvements correspondaient aux différents sites (urines, pus, sonde urinaire) .
II-2 - Préparation des souches
II-2-1- Ré-isolement
Il Consiste à faire l’ensemencement d’une seule colonie prélevée à partir d’une culture
mère contenant différents germes.
- Technique
-De la boite mère contenant plusieurs germes, on prélève une seule colonie de la souche
qu’on veut étudier en se basant sur les caractères morphologiques de notre bactérie pour
la différentier des autres.
- À l’aide d’une pipette Pasteur ou une anse de platine stérilisée, on réalise des stries en
utilisant la méthode de trois cadrons sur milieu Hecktoen (milieu sélectif pour les trois
germes).
- Incubation dans l’étuve à 37°C pendant 24 heures.

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 Chapitre II Matériels et Méthodes

- Lecture
Mettre en évidence les caractères culturaux et morphologiques des colonies comme la
couleur, l’aspect, la forme, la taille et même l’odeur.
II-3 - Identification microbiologique
L’identification des bactéries appartenant à l’espèce Proteus mirabilis est basée sur la
succession des tests qui suivent : examen macroscopique et examen microscopique,
tests biochimiques et un antibiogramme.
II-3- 1- Examen macroscopique
L’examen est appliqué principalement sur la gélose Hecktoen, basé sur la recherche de
caractéristiques suivantes : la couleur, la forme, l’aspect de surface, l’aspect des bords
de colonies, l’odeur, la fermentation du lactose. Ces caractéristiques macroscopiques de
colonies sont les plus impliquées dans la connaissance de l’espèce Proteus mirabilis.
II-3- 2 -Examen microscopique
L’examen microscopique après coloration de Gram, permet non seulement d’observer la
morphologie des cellules de Proteus mirabilis et leurs modes de regroupement, leur
mobilité. Mais aussi de différencier ces bactéries à Gram négatif et des bactéries à Gram
positif.
Un frottis est préparé à partir des colonies suspectes, en fixant sur une lame en verre une
goutte de la suspension bactérienne. Ce frottis est coloré par la méthode de Gram. La
coloration elle est effectuée en plusieurs étapes
 Protocole
- Etaler une goutte de suspension microbienne sur une lame.
- Laisser bien sécher.
- Recouvrir la lame avec du violet de Gentiane, laisser agir 1 min.
- Par-dessus ajouter le Lugol 1 min.
- Eliminer les colorants et décolorer rapidement à l’alcool 30sec.
- Rincer à l’eau pour arrêter la décoloration.
- Recouvrir la lame de Fuchsine ou safranine 1 min.
- Rincer à l’eau et laisser sécher à l’air (ou à la flamme).
- Observation à l’objectif X 100 avec l’huile à immersion.

19
Chapitre II Matériels et Méthodes

c) Principe
Après l’application du violet de gentiane et de la solution de Lugol, il se forme un
complexe coloré dans les cellules et toutes sont colorées en bleu-violet. Il existe une
différence de perméabilité à l’agent de décoloration (alcool) entre la structure des parois
des bactéries Gram+ et Gram-. Ce qui entraîne une différence dans la vitesse de
dissolution des complexes formés. Ainsi les bactéries Gram+ conservent leur coloration
violette alors que les Gram– sont complètement décolorés. La dernière étape (fuchsine)
constitue simplement une coloration de contraste afin de recolorer les bactéries Gram-
en rose-rouge pâle.
La lecture des frottis est réalisée à l’huile d’immersion au microscope optique pour
détecter la présence des germes mobiles.

II-4- Identification biochimique

- Méthodes
Après l’isolement et l’identification des caractères culturaux de Proteus mirabilis. On a
réalisé la galerie biochimique pour mettre en évidence les caractères biochimiques de
cette bactérie. Pour chaque souche, préparer d’abord la suspension en mettant une
colonie prélevée de la boite de pétrie après repiquage dans 5 ml d’eau stérile ou bien
bouillon nutritif. Cette suspension a servi à ensemencer différents milieux de culture en
tubes permettant ainsi de mettre en évidence différents caractères biochimiques .Les
milieux de culture suivants ont été utilisés :
II-4-1- Le milieu mannitol mobilité
- But
Ce milieu solide permet l’étude de la fermentation du mannitol et la mobilité de la
souche ainsi que la recherche du nitrate réductase.
- Principe
Le milieu mannitol-mobilité est utilisé pour la différenciation rapide des
Entérobactéries. Il permet de déceler la dégradation du mannitol et la mobilité de la
bactérie.
La présence d’une faible teneur d’agar (gélose semi-molle) rend possible le
déplacement des bactéries mobiles autour de la piqûre centrale. La lecture de
l’utilisation du mannitol est possible grâce à la présence d’un indicateur de pH, le rouge
de phénol. L’utilisation du mannitol acidifie le milieu qui peut ainsi être révélé par le
virage de l’indicateur de pH à sa teinte acide (jaune).

20
Chapitre II Matériels et Méthodes

- Technique d’ensemencement
- L’ensemencement se fait par piqûre centrale à l’aide d’une pipette pasteur contenant
quelques gouttes de la suspension bactérienne.
- Incuber 24 heures à 37°C.

Figure 02 : Le milieu Mannitol Mobilité.

- Lecture
-La mobilité positive : trouble homogène, formant une spirale autour de la piqûre
centrale. Déplacement des bactéries dans le milieu. Plus la bactérie est mobile plus elle
augmente et s’élargit.
-Mobilité négative : la culture bactérienne est limitée à la piqûre centrale. Pas de
déplacement des bactéries dans le milieu. Les bactéries sont probablement immobiles.
-Si le milieu jaune : Acidification du milieu révélée par un virage de l’indicateur de pH
à sa teinte acide. La bactérie fermente le mannitol donc elle est dite mannitol +.
-Si le milieu rouge : Absence d’acidification du milieu. La bactérie ne fermente pas le
mannitol, elle est dite bactéries mannitol –. (Le Minor ,1993).
II-4-2-L’utilisation de citrate de Simmons
- But
Ce milieu permet l’étude de l’utilisation du citrate (acide organique) par la bactérie
comme seule source de carbone.
- Principe
Le milieu citrate de sodium (Simmons) est utilisé pour l’identification des bacilles
Gram négatif. Il permet de rechercher l’utilisation de citrate de sodium comme seul
source de carbone. Seules les bactéries autotrophes possédant un citrate perméase
peuvent utiliser le citrate comme seule source de carbone.
- Technique
- Le milieu est présenté sous forme de gélose inclinée.

21
Chapitre II Matériels et Méthodes

- Ensemencement par des stries longitudinales le long de la pente à l’aide de la pipette

pasteur, on prend une goutte de la suspension et on la dépose sur le milieu citrate de
Simmons incliné. Mettre à l'étuve 24 heures à 37°C.

Figure 03 : Le milieu citrate de Simmons.

- Lecture
- L’utilisation du citrate de sodium se traduit par un virage de couleur du vert au bleu
qui signifie qu’il y a eu une alcalinisation du milieu et que la bactérie possède un citrate
perméase.
-Absence de culture bactérienne [Milieu inchangé (vert)] : les bactéries n’utilisent pas le
citrate comme seule source de carbone. Les bactéries ne possèdent pas de citrate
perméase elles sont dites citrate –.

II-4-3- La fermentaion des sucres ,Triple Sugar Iron (TSI)

- But
La mise en évidence rapide de la fermentation du lactose, du glucose (avec ou sans
production de gaz), du saccharose et de la production de sulfure d’hydrogène.
- Principe
Le milieu Triple-Sugar-Iron est un milieu d’identification rapide pour les
entérobactéries. Permet de mettre en évidence la fermentation du glucose (avec ou sans
dégagement gazeux), du lactose, du saccharose et la production de H2S.
- Technique d’ensemencement
- Ensemencement de culot par piquer centrale et la pente par des stries serrées à l’aide
d’une pipette pasteur contenant la suspension bactérienne
- Incuber 24 heures à 37°C.

22
 Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 04 : le milieu TSI.

- Lecture
 Fermentation de Glucose
-Si le culot est de couleur rouge orange (couleur inchangé) cela veut dire que la bactérie
n’a pas fermenté le Glucose. Elle est Glu- .
-Si la couleur du culot devient jaune. On comprend donc le Glucose a été fermenté par
la bactérie. Elle est Glu +.
 Fermentation du lactose et/ou du saccharose
-Pente inclinée rouge : lactose et saccharose non fermentés. La bactérie est Lac - / Sach-
.
-Pente inclinée jaune : lactose et/ou saccharose fermentés. La bactérie est Lac+ /Sach+.
 Production de H2S dans le culot
- Formation d’H2S , une coloration noire entre le culot et la pente ou le long de la
piqûre. Donc elle est H2S +.

II-4-4 - Milieu urée indole

- But
Ce milieu permet de mettre en évidence les caractères suivants :
-Présence d’une uréase.
-Présence d’une tryptophanase.
-Présence d’une tryptophane désaminase (TDA).
- Principe
L’indole permet la culture des germes ne présentent pas d’exigence particulière. La
recherche de la production d’indole par l’intermédiaire d’une tryptophanase qui dégrade
le tryptophane en acide indole-acétique ou en acide carboxylique. Seules les bactéries
indologènes poursuivent cette dégradation jusqu’à la formation d’indole. Selon la
réaction suivante :
CO (NH2)2 + 2H2O (NH4) 2 + CO3

23
 Chapitre II Matériels et Méthodes

Le milieu urée-tryptophane appelé improprement milieu urée-indole. C’est un milieu

complexe qui fournit un ensemble de résultats utiles pour la différenciation des
entérobactéries. Il permet de rechercher :
- L’uréase : Les entérobactéries peuvent dégrader l’urée qui est un composé organique
et qui peut servir de source d’azote unique aux bactéries possédant une uréase très
active. En présence de cette enzyme, les bactéries uréolytiques peuvent transformer
l’urée en ammoniac et en carbonate d’ammonium qui alcalinise le milieu et qui fait virer
l’indicateur coloré de pH (le rouge de phénol) du jaune au rouge en milieu basique.
- La tryptophane-désaminase TDA : La désaminase agit sur le L-tryptophane en
donnant l’acide pyruvique. Ce dernier donne avec le perchlorure de fer (FeCl 3) une
coloration brune.
- Technique
A l’aide d’une pipette Pasteur, quelques colonies sont prélevées et introduites dans un
tube contenant de l’urée-indole puis les tubes sont incubés pendant 24 heures. Un
résultat positif se traduit par le virage de couleur de la solution vers le rose violacé.

Figure 05 : Le test Urée -Indole.

- Recherche de la tryptophane désaminase (TDA) :
L’ensemencement se fait au moyen d’une pipette pasteur par l’ajout de quelques gouttes
du réactif TDA dans le milieu urée-indole contenant la suspension bactérienne .Agiter
bien le mélange. La lecture se fait immédiatement.

24
Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 06 : Le Test TDA.

- Lecture
-Si le milieu devient rose violacé : Alcalinisation du milieu due à la dégradation de
l’urée, la bactérie possède l’uréase. Elle est uréase +.
-Si le milieu reste orangé (inchangé) : Pas d’alcalinisation du milieu, la bactérie ne
possède pas l’uréase .Elle est uréase –.
Après l’ajout de 2-3 gouttes du réactif de Kovac et sans agiter le milieu :
-S’il y’a apparition d’un anneau rouge : Présence d’indole, le tryptophane a donc été
hydrolysé. La bactérie a produit de l’indole. Elle est indole +.
-Si l’anneau reste orange : Absence d’indole, La bactérie n’a pas produit d’indole. Elle
est indole –.
Après addition de réactif TDA, la lecture comme suivant :
- Obtention d'un précipité brun foncé, présence d’acide indole pyruvique. Le
tryptophane a été désaminé. La bactérie possède le tryptophane désaminase. Elle est
TDA +.
-Absence de précipité : Absence d’acide indole pyruvique, la bactérie ne possède pas le
tryptophane désaminase. Elle est TDA –.

II-4-5- Milieu Clark et Lubs

- But
Ce milieu permet d’étudier une voie de fermentation du glucose : la voie du butanediol
et la mise en évidence des bactéries produisant des acides organiques.
- Principe
Le milieu de Clark et Lubs permet l'étude des produits de fermentation du glucose,
différenciation entre les fermentations « acides mixtes » et « butylène glycolique ».

25
Chapitre II Matériels et Méthodes

- Test RM (rouge de méthyle) : Ce test permet la mise en évidence grâce au rouge de

méthyle, de la fermentation acide mixte par acidification d'un milieu glucosé après
fermentation du glucose.
- Test VP (Voges-Proskauer) : cherche une étape intermédiaire de la transformation de
l’acide pyruvique qui consiste en la production d’acétoine qui est transformée en
alcool : le 2,3-butanédiol, c’est la réaction de VOGES-PRAUSKAUER
- Technique
Mettre quelques colonies dans le tube contenant le milieu Clark et Lubs, incubation à
37°C dans l’étuve pendant 24 heures. Après l’incubation diviser le milieu dans deux
tubes stériles
-Tube 1 : ajouter quelques gouttes de rouge de méthyle.
-Tube 2 : ajouter quelques gouttes de VP1 .Attendre quelques secondes et rajouter deux
ou trois gouttes de VP2 et mettre les deux tubes dans une position inclinée pour bien
observer le virage.

Figure07 : Le milieu Clark et Lubs.

Figure 08: Test VP et Test RM.

26
Chapitre II Matériels et Méthodes

- Lecture
1/ Le test RM
- Si les bactéries produisent des acides forts au cours de la fermentation. Le milieu reste
acide et donc en rouge. Ces bacteries sont RM+.
- Si les bactéries produisent des acides faibles, le milieu s’est acidifié puis ré-alcalinisé.
Le milieu est donc jaune. Elles sont RM- .
2/ Le test VP (Voges-Proskauer) :
-Le réactif ajouté (l’alpha naphtol) permet dans le cas d’un milieu basique et en
présence de dioxygène, d’obtenir une coloration rosé ou rouge. La bactérie est VP +.
-Si le milieu reste incolore .Elle est VP - .

II-4-6- la recherche des : ODC –LDC –ADH bactériennes

- Principe
Le diagnostic différentiel des espèces appartenant aux familles des Enterobacteriaceae,
Vibrionaceae, Pseudomonas et genres associés. Est souvent facilité par la recherche de
la lysine décarboxylase (LDC), de l'ornithine décarboxylase (ODC) et de l'arginine
dihydrolase (ADH).
- Dans un premier temps, les bactéries en anaérobiose, fermentent le glucose et donc les
milieux s’acidifient.
- dans un deuxième temps les bactéries ayant épuisées le glucose peuvent utiliser l’acide
aminé présent dans le milieu si elles possèdent les enzymes adéquats. En anaérobiose et
en milieu acide c’est la décarboxylation des acides aminés par les décarboxylases qui
est favorisée. L’amine produite ré-alcalinise le milieu ce qui a pour effet de faire viré au
violet le milieu.
Les décarboxylases et les dihydrolases sont :
La lysine décarboxylase (LDC) : Lysine LDC Cadavérine + CO₂.

L’ornithine décarboxylase (ODC) : Ornithine ODC Putricine + CO₂.

L’arginine dihydrolase (ADH) : Arginine ADH Agmatine + CO₂.

Les décarboxylases ou carboxylases, scindent les acides aminés entraînant la formation

de l'amine correspondant avec la libération de CO2. Suivant la réaction :

27
Chapitre II Matériels et Méthodes

RCHCOOH RCOCOOH+NH3
NH2 NH2 Désaminases Acide cétonique
- Technique
Le test est réalisé avec le milieu Moeller avec des colonies bien agité et réparti dans 4
tubes à hémolyse différents :
- Le premier tube constitue le témoin. Il contient essentiellement du glucose en petite
quantité et du pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH.
- Les trois autres tubes contiennent en plus du milieu témoins, un des trois acides
aminés suivants : Arginine, Lysine ou Ornithine.
- incubé à 30°C pendant 24 à 48 h.

Temoin (a) (b)

(c) (d)
Figure 09: Test ODC (c) –LDC (d) –ADH (b).
- Lecture
Pour réussir la lecture, il faut toujours s’assurer qu’il s’agit d’une Entérobactérie
(fermentation du glucose) et qu’il y a croissance dans les tubes. Si non le diagnostic sera
orienté vers une bactérie aérobie stricte (Le minor ,1993).
Après incubation la lecture comme suit :
-Coloration jaune : absence d’enzymes. ADH-, ODC-, LDC-.

28
Chapitre II Matériels et Méthodes

Une bactérie non décarboxylante utilisera les peptones du milieu et produira des acides
organiques ainsi que des bases faibles comme l'ammoniac. Le milieu deviendra jaune.
-Coloration violet : présence d’une décarboxylase. ODC+, LDC+.
-Coloration violette franche pour l’ADH, se lit ADH+.
Une bactérie décarboxylante après avoir utilisé le glucose va produire du dioxyde de
carbone et des amines. L'alcalinité des amines est importante et le virage de l'indicateur
de pH sera obtenu : le milieu restera violet.

II-4-7-La recherche des enzymes

a/ la recherche de la ß –galactosidase : Le test d’ONPG
- Principe
Le test ONPG (Ortho-Nitro-Phényl-Galactopyranoside) ou test de l’ONPG-hydrolase
est complémentaire, voir indispensable, à l’étude de la dégradation du lactose chez les
Entérobactéries. Pour que des entérobactéries dégradent le lactose, il faut qu’elle
possède deux enzymes :
- Une perméase membranaire, nécessaire à la pénétration du lactose dans la cellule.
- Une β-galactosidase permettant de dégrader la molécule de lactose en galactose et
glucose. Le test ONPG consiste à rechercher la présence de ß-galactosidase. On
utilise comme substrat, non pas le lactose, mais un autre ß-galactoside : l'ortho-nitro-
phényl-galactoside (ONPG) qui possède une structure analogue au lactose ; et qui
présente l'avantage d'être Hydrolysé en l’orthonitrophénol : ONP qui est responsable de
la coloration jaunâtre de milieu Selon la réaction suivante :
ß-galactosidase
ONPG ONP + galactose
Substrat incolore Produit jaune de couleur.

- Technique
Préparer une suspension dense d’une culture bactérienne à étudier dans un tube à essai
stérile contenant 0.5ml d’eau distillée, puis y ajouter avec une pince flambée mais
refroidie un disque ONPG. Incuber au bain marie à 37°C pendant un temps variant entre
15 à 30 minutes et jusqu’à 24h au maximum.

29
Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 10 : Le test ONPG.

- Lecture
La lecture se fait à des intervalles de temps différents : après 15mn, 30mn, 1 heure, 6
heures et 24 heures.
-Si la bactérie hydrolyse l’ONPG en ONP : la couleur du produit est jaune. On dit que la
bactérie possède la ß-galactosidase. Donc elle est ONPG +.
-S’il n Ya pas de coloration. On dit que la bactérie ne possède pas la ß-galactosidase.
Donc elle est ONPG -.

b/ Le test de la catalase
- Principe
La catalase est un enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène
(H2O2) avec dégagement d'oxygène selon la réaction suivante :
Catalase
2 H 2O 2 2 H 2O + O2

Le test consiste à mettre des bactéries en quantité suffisante en contact de peroxyde

d’hydrogène (H2O2). Si elles possèdent la catalase, elles dégradent l’ H2O2 en eau et
dioxygène visible par la formation de bulles.
- Technique
- Sur une lame propre et sèche déposer une goutte eau oxygénée à 10 volumes à l’aide
d’une pipette pasteur boutonnée.
- Observer immédiatement.

30
Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 11 : Test de Catalase.

- Lecture
Le dépôt des colonies isolées dans le milieu d’eau oxygéné à 10 volumes a révélé
l’apparition des bulls d’air dégagement gazeux de dioxygène à la surface. Ce résultat
positif indique la présence d’une catalase. La bactérie possède la catalase, elle est
catalase +.
- Pas de bulles, Elle est catalase –.

c/ Test d’oxydase
- But
Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram -. Il permet de mettre en
évidence une enzyme la phénylène diamine oxydase des bactéries à partir de leur
culture en milieu gélosé.
- Principe
Ce test permet de mettre en évidence une enzyme la phénylène diamine oxydase des
bactéries à partir de leur culture en milieu gélosé. Cette enzyme est capable d’oxyder un
réactif : le N diméthyl paraphénylène diamine en une semi-quinone colorée en rouge
violacée. Ce réactif est incolore et en présence d’enzyme, il libère un composé rose-
rouge noircissant à l’air.
- Technique
Ce test est réalisé en ajoutant un disque d’oxydase à une suspension bactérienne épaisse
en eau distillée.
Sur une lame propre, déposer un disque d’oxydase imprégné de diméthyl-
paraphényléne-diamine. Humidifier le disque avec quelques gouttes d'eau distillée
stérile. Un excès d'eau peut nuire à la lecture. À l'aide d'une anse de platine prendre une
colonie de la bactérie à identifier et la déposer sur le disque.

31
Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 12 : Test d’Oxydase.

- Lecture
Les colonies des isolats déposées sur le disque de l’oxydase révèlent l’apparition d’une
coloration rose .Ce qui indique la présence d’une oxydase. Donc La bactérie possède
l’activité oxydase, elle est oxydase+.
- Si la colonie reste incolore, la bactérie ne possède pas d’oxydase. Elle est Oxydase -.
La technique d’ensemencement de chaque milieu est présentée dans le tableau 03.

Tableau 03 : Indentification biochimique à l’aide de la galerie biochimique.

Tests Ensemencement

TSI Ensemencement de culot par piquer centrale et la pente par des

stries serrées à l’aide de la pipette pasteur, incubation à 37°c
pendant 24 h.

Utilisation de Ensemencement par des stries le long de la pente à l’aide de la

citrate pipette pasteur, incubation à 37°c pendant 24 h.

test de mannitol Ensemencement par piqure centrale à l’aide d’une pipette pasteur,
mobilité incubation à 37°c pendant 24.

Recherche de Ce milieu est inoculé avec quelques gouttes de la suspension

l’uréase et bactérienne, incubation à 37°c pendant 24 h .après incubation nous
l’indole. l’avons ajouté 2à 3 gouttes de réactifs de [Link] lecture est
immédiate.

Test TDA Faire une suspension en milieu Urée-tryptophane, Etuver le

tryptophane désaminase (TDA), après l’addition de réactif.

Test ONPG - réaliser une suspension épaisse des bactéries testées en eau
distillée.

32
Chapitre II Matériels et Méthodes

- ajouter avec une pince flambée mais refroidie un disque

imprégné d’ONPG, incuber 30 min à 37°C.

Test VP Ajouter 10 gouttes d’alpha naphtol et le même volume de soude

concentrée (ou de potasse). Incliner le tube pour permettre une
bonne oxygénation, Attendre quelques min à 1 heure.

Test RM Ensemence par l’ajout de quelques gouttes de la suspension

bactérienne, incubation à 37°c pendant 24 h. après incubation,
nous l’avons ajouté 2 à 3 gouttes de réactifs de rouge de
mé[Link] lecture est immédiate.

Test oxydase l’aide de disques prêts à l’emploi, imprégnés du réactif : N-

diméthyl paraphénylène diamine, sur lequel nous avons déposé
une colonie. La lecture du résultat était immédiate et sans
incubation.

Test de la catalase l’aide d’une pipette boutonnée une colonie est prélevée à partir de
la boite de Pétri et déposée sur une lame. Une goutte de H2O2 (10
volumes) est déversée sur cette colonie.

Décarboxylase Ensemencer le milieu de Moeller avec des colonies. Agiter (si le

ODC, LDC, ADC tube n'est pas plein le recouvrir de vaseline stérile). Fermer le tube
entièrement afin de créer une anaérobiose relative. Mettre à l'étuve
24 heures à 37°C.

II-5- Réalisation de l’antibiogramme

II-5-1-Principe
L’antibiogramme par diffusion permet de déterminer la sensibilité des bactéries à
croissance rapide vis-à-vis d’un disque d’antibiotiques. Des disques imprégnés
d’antibiotiques sont déposés à la surface d’un milieu de culture standardisé (milieu de
Mueller-Hinton) préalablement ensemencé avec une dilution calibrée de la bactérie à
tester. L’arrêt de la croissance à distance du disque se produit en présence de la
concentration minimale inhibitrice de l’antibiotique. Nous avons utilisé la technique de
diffusion en gélose. Cette méthode est basée sur le principe de correspondance entre les
valeurs critiques des CMI en mg/l et des mesures des diamètres d’inhibition.

33
Chapitre II Matériels et Méthodes

II-5-2- Technique
- Milieu de culture
On utilise un milieu non sélectif Mueller-Hinton. L’épaisseur de la gélose doit être
strictement de 4 mm, quelles que soient les dimensions et la forme de la boîte de Pétri
utilisée. Les boîtes ont été séchées à 37 °C avant leur emploi.
- Réalisation de l’inoculum bactérien
Il est impératif de travailler sur une souche pure. L’identification et l’antibiogramme
sont réalisés à partir d’une même suspension originelle. La suspension bactérienne est
obtenue en mettant une colonie bien isolée dans 10 ml d’eau distillée stérile suivie
d’une agitation.
- Ensemencement par inondation
Quelques ml de l’inoculum sont versés de façon à recouvrir entièrement la surface
gélosée. Des mouvements de rotation dans les trois axes, imprimés par la main
accélèrent le recouvrement puis à sécher pendant 15 min à l’étuve.
Application des disques Les disques d’antibiotiques en cartouches sont disponibles.
Après 15 min de séchage, les disques choisis sont posés soit à la pince flambée, soit à
l’aide d’un distributeur de disques périodiquement désinfecté. Les disques sont
appliqués à plat sans glissement en appuyant légèrement sur la surface de la gélose.
- Choix des antibiotiques
Dans notre étude, les antibiotiques utilisés sont :
- L’ampicilline, Amoxicilline-acide clavulanique, Ticarcilline, Céfoxitine,
Céfazoline, Céfotaxime, pour les β-lactamines.
- Imipenèmes pour les carbapénemes.
- Amikacine, Gentamicine pour les aminosides.
- Ciprofloxacine, Acide nalidixique pour les quinolones.
- Sulfaméthoxazole + Triméthoprime.
- Colistine.
- Chloramphénicol.
L’ensemble est déposé à l’étuve pendant 18 à 24 heures à 37 °C.
- Lecture
Après incubation on procède à la lecture des diamètres des zones d’inhibition à l’aide
d’un pied à coulisse métallique à l’extérieur de la boîte fermée.
-Le diamètre des zones d’inhibition est interprété en sensible, intermédiaire ou résistant
conformément aux recommandations du comité de l’antibiogramme de la Société
Française de Microbiologie.

34
Chapitre II Matériels et Méthodes

Comparer ces résultats aux valeurs critiques et les Classées dans l’une des catégories :
Sensible : les souches S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès
thérapeutique est acceptable. On doit s’attendre à un effet thérapeutique dans le cas d’un
traitement à dose habituelle par voie générale.
Résistante : les souches R sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité
d’échec thérapeutique. On ne peut s’attendre à un effet thérapeutique quel que soit le
traitement.
Intermédiaire : les souches I sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est
imprévisible. Elles forment un ensemble hétérogène pour lequel la seule valeur de la
CMI n’est pas prédictive.

II-6- Mutagénèse
II-6-1 - But de l'irradiation par les rayons UltraViolets (UV)
Les rayons ultraviolets appelés couramment UV, sont un rayonnement
électromagnétique de même nature que la lumière visible mais dont les longueurs
d'onde sont inférieures et donc non perceptible par l'œil. Cette expérience permet
d'illustrer clairement les effets néfastes des UV sur la multiplication des souches
Proteus mirabilis.
II-6-2- La technique
On prélève une colonie de Proteus mirabilis à l’aide d’une pipette pasteur fermée et
stérilisée et on la dépose dans 5ml de bouillon nutritif puis l’incuber dans l’étuve à 37°C
pendant 24 heures Figure 13 (a).
- La dilution
-On prépare 05 tubes à essai stériles, on met dans chacun 9ml de l’eau distillé Figure 13
(b).
- à l’aide d’une pipette graduée de 5 ml. Prendre 1ml de la suspension bactérienne et la
verser dans le premier tube. Agiter délicatement pour homogénéiser la suspension.
-Prendre 1ml de la suspension de tube 1 et la mettre dans le deuxième tube, agiter.
-Reprendre 1ml de la suspension du deuxième tube el la renverser dans le troisième
tube, agiter.
-Reprendre 1ml de la suspension du troisième tube el la renverser dans le 4 éme tube,
agiter.
-Reprendre 1ml de la suspension du quatrième tube el la renverser dans le 5 éme tube,
agiter.

35
Chapitre II Matériels et Méthodes

- L’étalement
-A l’aide d’une pipete Pasteur. On prend une goutte de la suspension du 5eme tube diluée
et on réalise l’étalement à l’aide d’un râteau stérile sur la boite qui contient la GN (la
boite Témoin).
- On refaire les même étapes pour ensemencée les 4 autres boites pour l’irradiation
- L’irradiation
-Allumer la lampe UV (UVsl , 25/ long wave ) .
- Mettre une boîte sous les UV. Enlever le couvercle. Enlever vos mains de dessous les
UV et déclencher le chronomètre Figure 13 (c).
- Après 10 secondes, remettre le couvercle et enlever la première boîte des UV.
- On marque 10 secondes sur le dos de la boîte.
- N’exposer pas la boîte à une trop forte intensité de lumière visible après la
mutagenèse afin d’éviter la photoréversion Figure 13 (d).
- Refaire la même étape en exposant les autres boîtes pendant 30, 50, 90 secondes
respectivement. Marquer les durées d’exposition aux UV aux dos des boîtes.
- La première boîte ne sera pas exposée aux UV (marquer 0 seconde au dos de celle-ci).
Il s’agit du témoin de l’expérience.
- Incuber les boites à l’envers pendant 24 H à 37°C (ou éventuellement).
- la lecture selon le nombre de colonies dans chaque boite.

(a) (b)

36
Chapitre II Matériels et Méthodes

(c ) (d)
Figure 13 : Les étapes de la mutagénèse d’une souche de Proteus mirabilis.

II-7- La galerie biochimique après la mutagenèse

II-7-1- Méthode
-Refaire la galerie biochimique en suivant le même protocole précédant pour chaque
milieu.

(a) (b) (c) (d)

Figure 14 : Test Manitol/ Mobilité (a) - Citrate de Simmons (b) –TSI (c)- Urée
/Indole (d).

Figure 15: Test TDA. Figure 16: Test ONPG.

37
Chapitre II Matériels et Méthodes

Figure 17: Test d’oxydase. Figure 18: Test de catalase.

(a) (b) (c) (d)

Figure 19: Test ODC (b) –LDC (c) –ADH (d) .

(a) (b)
Figure 20: Test RM (a), VP (b).

38
Résultats et Discussions
Chapitre III Résultats et Discutions

I - Distribution des souches de Proteus mirabilis

Durant la période d’étude, 20 souches de Proteus mirabilis ont été colligés :
I-1- Selon l’origine du prélèvement
Les résultats illustrés ci-dessous montrent que tous les souches étudies sont des souches
hospitalières.
Tableau 04 : Répartition des souches de Proteus mirabilis selon les prélèvements
. Cliniques.
Prélèvement Nombre de Pourcentage (%)
souches isolées

Urine 12 60%

Pus 7 35%

Sonde vésical 1 5%

Totale 20 100%

60%

35% Urine
s
Pus

Figure 21 : Répartition des souches Proteus mirabilis selon l’origine du

prélèvement.

Nous avons remarqué que parmi les souches de Proteus mirabilis étudiés dans les
différents sites pathologiques : 60% proviennent des prélèvements d’urine. Elle est
suivie par les prélèvements de pus avec 35% des cas et 5% ont été diagnostiquées dans
service de réanimation a partie de sonde vésicale. Ces valeurs correspondent aux
rapports de la littérature, où les prélèvements urinaires sont toujours dominants.

39
Chapitre III Résultats et Discutions

I.2/ Selon le sexe

Tableau 05 : Répartition globale des souches de Proteus mirabilis selon le sexe.
Sexe Effectif Pourcentage (%)

Femme 9 45%

Homme 11 55%

Totale 20 100%

Figure 22 : Répartition globale des souches de Proteus mirabilis selon le sexe.

Parmi les 20 souches isolées, 09 de sexe féminin présentaient un pourcentage de 45% et

11 de sexe masculin présentaient un pourcentage de 55%. Donc On peut remarquer une
dominance des souches isolées chez les hommes par rapport à celle des femmes.

II - Les caractères culturaux

II-1- Examen macroscopique
Les résultats de ré-isolement des 20 souches étudiées (après incubation à l’étuve
pendant 24 heures à 37°C), montrent l’apparition des souches de Proteus mirabilis sur
milieu en Hécktoen présentant les caractères morphologiques suivants : de petites
colonies rondes, transparentes avec un centre noir envahissantes. Montrant des vagues
successives avec une odeur désagréable. Ces caractères culturaux correspondent au
Proteus mirabilis.

40
Chapitre III Résultats et Discutions

Figure 23 : Aspect macroscopique des colonies de Proteus mirabilis sur gélose

Hecktoen.
II-2- Examen microscopique
L’examen microscopique nous a permis l’identification de la pureté des souches. Et La
coloration de Gram, réalisée à partir des colonies apparues. Montre la présence de
bactéries Gram négatif. Elles se présentent sous la forme de bacille droit ou
diplobacilles colorées en rose. Ce sont les caractères morphologiques Proteus mirabilis
sous microscope optique.

Figure 24 : Aspect microscopique des colonies de Proteus mirabilis (G * 100).

III- Les caractères biochimiques

III-1-Résultats de la galerie
La mini galerie biochimique nous a permis d’identifier quelques caractères
biochimiques de Proteus mirabilis. Le tableau 06 montre la couleur des milieux de
culture avant la manipulation par les souches. Les figures montrent les résultats de la
galerie biochimique d’une souche Proteus mirabilis.

41
Chapitre III Résultats et Discutions

Tableau 06 : Couleur d’origine des milieux de la galerie biochimique.

Citrate de TSI Mannitol Urée TDA RM VP ODC-LDC-
Simmons mobilité indole ADH

Vert Rouge Rouge Orange Jaune rouge rosé ou Violet

orange rouge

III-1-1-Le milieu mannitol mobilité

 Fermentation du mannitol
Les résultats obtenus montrent que parmi les 20 souches étudiées ,19 souches sont
incapables de fermenter le mannitol et de l’utiliser comme source de carbone et
d’énergie donc elles sont mannitol (-) figure 25 (b). Ces résultats sont incompatibles
avec ceux obtenus par les travaux de Meziane. 2012. Sauf une seule souche qui
représente un résultat positif pour l’utilisation du mannitol figure 25 (a).

(a) (b)
Figure 25 : Aspect du milieu mannitol.
 La mobilité
D’après notre étude. Nous avons obtenu des résultats positifs concernant le test de
mobilité avec toutes les souches qui sont diffusées à partir de la ligne verticale
d’ensemencement en créant un trouble, figure 26. Ces résultats sont en parfait accord
avec ceux décrits par Meziani. 2012.

42
Chapitre III Résultats et Discutions

Figure 26 : Aspect du milieu de Mobilité.

III-1-2-Le milieu Citrate de Simmons
Après 24 h d’incubation .On a remarquées qu’il n’y a pas une alcanisation du milieu, la
couleur du milieu reste verte. C’est ce qui ont été observé pour toutes les souches,
figure 27 .Donc elles sont citrate (-), elles sont dépourvus de citrate perméase et par
conséquent cette bactérie est incapable d’utilisé le citrate comme seule source de
carbone, notant que ce dernier est le premier composé du cycle de Krebs. Nos résultats
sont non convenables à celle observé par Meziani. 2012.

Figure 27 : Aspect du milieu Citrate de Simmons.

III-1-3- Le milieu TSI

C’est un milieu coulé en pente et en culot, au niveau du quelle nous avons recherché 4
caractères :
-La fermentation du Glucose sur le culot qui se traduit par virage au jaune.
-La fermentation du saccharose et Lactose sur la pente également qui se matérialise par
virage au rouge.
-La présence de gaz qui se matérialise par le décollement du culot et/ou la présence de
bulles d’air.
- La production de H2S qui se traduit par une coloration noire.

43
Chapitre III Résultats et Discutions

Après l’incubation. On a remarqué pour toutes les souches, il y a eu une acidification

dans la pente et le culot d’où le virage du rouge de phénol au jaune avec présence des
bulles d’air. La fragmentation du Glu est due à la production de gaz (hydrogène, CO 2)
résultant des fermentations sucrées et la production de sulfure d'hydrogène. Qui se
manifeste dans le culot par l’apparition d’une coloration noire (noircissement) de
sulfure de fer qui est due à la réduction du thiosulfate en présence de citrate ferrique de
noircissement, donc ces souches sont : lactose et saccharose (-), glucose (+), gaz (+),
H2S(+). Alors que pour une seule souche, il y a eu une acidification que dans la pente,
avec présence des bulles d’air et absence de noircissement donc la souche est lactose et
saccharose (+), glucose (-), gaz (+), H2S (-).
Les résultats obtenus montre que l’espèce Proteus mirabilis a fermenté le glucose avec
production de gaz et H2S, mais elle n’a pas fermenté ni le lactose ni le saccharose. Nous
avons donc trouvé le même profil biochimique concernant la gélose TSI comme signalé
par Delarras en 2007.

Glu +/ H2s +/Gaz + H2S - H2s --

Lac / Sacch
Figure 28 : Aspect du milieu TSI.

III-1-4 -Recherche de l’activité uréasique

 Uréase
La production d’uréase se matérialise par un changement de la coloration orange vert le
rose, du fait de l’alcalinisation du milieu. En utilisant le milieu Urée-Indole pour
rechercher cette enzyme .Nous avons obtenu les résultats suivant : La plupart des
souches étaient urée (+) car il y a eu une alcalinisation du milieu d’où le virage de
couleur de l’orange vers le rose, donc l’urée est transformé en carbonate d’ammonium.
Ce résultat indique la présence d’une activité uréasique très intense chez les souches. Ce
qui confirme leur appartenance à l’espèce Proteus mirabilis. Alors que seules 2 souches

44
Chapitre III Résultats et Discutions

(P12 - P14) étaient urée (-) car il n y’a pas eu un virage de couleur. Cela s’explique par
l’absence de l’enzyme de l’uréase chez les 2 souches.

(a) (b)
Figure 29 : Aspect du milieu Urée-indol, (a) pour positive et (b) pour négative.

 Recherche de la production d’indole

Notre étude nous a permis de distinguer des souches qui ont donné une réaction positive
avec le test indole après l’ajout de réactif Kovacs. Formation d’un anneau rouge en
surface. Par contre, ce n’était pas le cas pour les autres souches étudiées. (Le Minor
1993).
L’indole est obtenu de la dégradation du tryptophane, grâce à une enzyme bactérienne «
la tryptophanase ». L’indole est apolaire, donc soluble dans les solvants organiques et
réagit fortement en milieu acide avec le dimethyl-amino-4-benzaldéhyde contenus dans
le réactif de Kovacs et forme un anneau rouge, ce qui est le cas pour plupart des souches
et non pas pour le reste des souches (P7-P8-P11-P12-P18) qui ont dépourvus de la
tryptophanase. Les résultats obtenus sont en conformité avec ceux de Souna en 2011 et
Meziane en 2012.
 Recherche du tryptophane désaminase (TDA)
Après l’addition du réactif TDA. On a remarqué l’apparition d’une coloration brun
foncé pour toutes les souches. Ce qui montre que la bactérie Proteus mirabilis est TDA
(+) figure 30.
La tryptophane-désaminase agit sur le L-tryptophane en donnant l’acide pyruvique. Ce
dernier donne avec le perchlorure de fer (FeCl3) une coloration brune. Cette réaction a
été constaté pour la souche Proteus mirabilis ce qui prouve que cette dernière possède
une tryptophane-désaminase. Les résultats obtenus du test TDA avec souches sont
compatibles avec ceux de Souna en 2011.

45
Chapitre III Résultats et Discutions

Figure 30 : Aspect du milieu TDA, Test positive.

III-1-5- Le milieu Clark et Lubs

Ce milieu permet d’étudier la voie de fermentation du glucose et la production
d’acétoïne, de dyacétyl et de butanediol.
 Rouge de méthyle (RM) : Il permet de détecter la production d’acides plus ou
moins forts et plus ou moins volatiles au cours de la fermentation.
 La réaction de Voges Proskauer (VP) : s’est fait sur le milieu Clark et Lubs permet
de détecter la production d’acétoïne, de dyacétyl et de butanediol par une réaction
colorée à partir de la fermentation du glucose.
Nos résultats montrent que toutes les souches étaient VP négatif car après ajouts des
réactifs VP1 et VP2, il n’y a pas eu de réaction (pas de coloration) figure 31 (a).
Concernant le test RM. Les souches sont RM positifs car le milieu est devenu rouge
après l’addition du réactif de rouge de méthyle, figure 31 (b). Donc l’espèce de Proteus
mirabilis fermente le glucose en produisant de nombreux acides organiques plus ou
moins forts par la voie des fermentations acides mixtes. Cette distinction des deux voies
peut justifier une règle parfois contestable mais fréquemment vérifiée. Les bactéries VP
+ sont toujours RM -, les bactéries RM + sont VP -. D’après notre étude. Nos résultats
sont en parfait accord avec ceux décrits par les auteurs Denis et al. 2007.

46
Chapitre III Résultats et Discutions

(a) (b)
Figure 31 : Aspect du milieu pour le test VP(a) et RM(b).

III-1-6- La recherche des enzymes

 La recherche des Décarboxylase ODC, LDC, ADH
Les enzymes décarboxylases (LDC, ODC) et décarboxylase, dihydrolase (ADH)
utilisées dans la galerie biochimique réalisée pour l’identification des souches
bactériennes isolées, présentent toutes un intérêt taxonomique. Pour la recherche de ces
enzymes, nous avons utilisé les milieux de Moeller, contenant l’acide aminé étudié (soit
la lysine soit l’ornithine, soit l’arginine) du glucose et un indicateur coloré c’est le
bromocrésol pourpre. La réaction s’effectue en deux temps lorsque le glucose est
fermenté. Il y a virage au jaune du bromocrésol pourpre, lorsque l’acide aminé est
décarboxylé. Il y a une réalcanisation du milieu qui vire au violet.
Après avoir effectué les tests et l’incubation, Nous avons obtenu les résultats suivants :
Le milieu de Moeller, Témoin reste obligatoirement Jaune, figure 32 (a).
- ODC : couleur violet, figure 32 (b).
- LDC – ADH : couleur jaune, figure 32 (c).
- LDC – ADH : couleur violet, figure 32 (d).

47
Chapitre III Résultats et Discutions

Temoin+ ODC+ LDC - / ADH- LDC+ / ADH+

(a) (b) (c) (d)
Figure 32 : Aspect du milieu ODC – LDC – ADH.
- Le test ODC : Les souches présentent une réaction positive car le milieu reste
violet. Veut dire que toutes les souches douées d’une décarboxylase pour
l’acides aminé (ODC+), figure 32 (b).
- Le test ADH- LDC : Les souches dans les milieux de Moeller ADH et LDC ont
changé de couleurs et sont devenus jaunes, donc sont négatifs car les milieux
sont devenus acides, il aurait fallu avoir une ré-alcalinisation, figure 32 (c).
Donc toutes les souches sont décarboxylase (-). Par contre une seule souche qui
donne un résultat négative pour LDC-ADH, la couleur reste violet.
 Le test d’ONPG :
Toutes les souches Proteus mirabilis ont donné un résultat négatif avec le test ONPG
c'est-à-dire le milieu restait incolore ONPG (-).

Figure 33 : Aspect du milieu avec le test ONPG.

48
Chapitre III Résultats et Discutions

Un test ONPG positif montre que l’organisme qui est testé contient les enzymes
nécessaires à la fermentation du lactose et peut donc être classé comme un lactose
fermenteur. Dans notre étude, nous avons observé le caractère lactose (-) chez les
souches Proteus mirabilis qui sont incapables de scinder le lactose en glucose et
galactose et libérer l’orthonitrophénol soluble qui donne la coloration jaune, figure 33.
La réaction ne peut être possible qu’en présence d’une autre enzyme intracellulaire la β-
galactosidase, également intracellulaire, la β-galactoside perméase qui assure la
pénétration du lactose dans la cellule bactérienne et par conséquent sa fermentation. En
comparant nos résultats avec ces données, nous pouvons déduire que nos résultats
obtenus avec le test ONPG chez Proteus mirabilis sont corrects. Dans notre travail, la
souche de Proteus mirabilis est ONPG (-), ces résultats sont vérifiés par ceux notés par
Denis et al. 2007.
 Le Test de la catalase
Après avoir effectué le test catalase. Toutes les souches que nous avons analysées sont
des catalases positives, dont la présence de la catalase se matérialise par la production
de bulles d’air, figure 34. Ces résultats sont confirmés par Khan et al. 2011 qui
montrent que les Entérobactéries que nous avons analysées sont des catalases positives.

Figure 34 : Test de catalase.

 Le test de l’oxydase
Ce test est essentiel pour orienter l'identification des bacilles Gram négatif. Est un bon
contrôle pour les bactéries appartenant à la famille des Enterobacteriaceae, car elles sont
toutes oxydases négatives. La réaction positive s’est traduite par l’apparition d’une
coloration violette pour les Gram - à l’endroit où la colonie a été déposée soit
immédiatement, soit quelques secondes après. Si la bactérie possède l'enzyme

49
Chapitre III Résultats et Discutions

respiratoire, appelée le cytochrome oxydase (dernière enzyme de la chaîne), elle peut

faire la réaction suivante :
Cytochrome oxydase
PDA PDA PDA
(forme réduite incolore) (chromogène forme rouge violacée)

En réalisant ce test, nous avons obtenu des résultats conformes à ceux rapportés par
Delarras, 2007 qui prouvent que nos souches Proteus mirabilis sont oxydase négatives
et elles ne possèdent pas l’enzyme respiratoire, figure 35. En comparant nos résultats
avec ceux rapportés par Le Minor en 1989. Nous pouvons dire que notre identification
par rapport à ce caractère biochimique a été excellente, nous avons trouvé presque les
mêmes résultats.

Figure 35 : Test de l’oxydase.

D’une manière générale, d’après notre étude et la série de tests biochimiques que nous
avons réalisés, nos résultats montrent qu’ils sont dans la majorité des cas stables et
intéressants pour l’identification bactérienne. Après l’incubation, les résultats finaux de
la galerie biochimique classique sont présentés dans le tableau 07.

Tableau 07 : Caractères biochimiques des souches Proteus mirabilis étudiées.

Glu lac Sacc Urée Indole citrate Mannitol Mobilite Gaz H2S

P1 - + + + + - - + + +

P2 + - - + + - + + + +

50
Chapitre III Résultats et Discutions

P3 + - - + + - - + + +

P4 + - - + + - - + - -

P5 + - - + + - - + - +

P7 + - - + - - - + + +

P8 + - - + - - - + + +

P9 + - - + + - - + + +

P10 + - - + + - - + + +

P11 + - - + - - - + + +

P12 + - - - - - - + + +

P13 + + + + + - - + - +

P14 + - - - + - - + + +

P15 + - - + + - - + + +

P16 + - - + + - - + + +

P17 + - - + + - - + + +

P18 + - - + + - - + + +

P19 + - - + + - - + + +

P20 + - - + + - - + + +

Test TDA RM VP ONPG catalase oxydase ODC LDC ADH

Proteus + + - - + - + - -

+ : Positif - : Négatif

51
Chapitre III Résultats et Discutions

III-2-Résultats de l’antibiogramme
Comme nous l’avons mentionné précédemment, chaque souche identifiée a été soumise
à un antibiogramme afin de déterminer la sensibilité aux différentes bactéries. Pour
rappel les 14 molécules d’antibiotiques appartenant à des familles différentes dont les β-
lactamines, les aminosides, les quinolones, et la colistine, un phénicole : le
chloramphénicol et les sulfamides. Les résultats de la mesure du diamètre des zones
d’inhibition basée sur la standardisation CLSI (Clinical and Laboratory Standards
Institute) pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques sont repris au tableau
(Annexe05).
Cette étude a été effectuée sur un collectif de 20 souches de bacilles à Gram négatif
proteus [Link] apparait dans nos résultats que les souches montrent une résistance
et une sensibilité aux plusieurs antibiotiques actuellement utilisés dans les traitements.

Figure 36 : Antibiogramme d’une souche Proteus mirabilis étudiée.

Selon la figure chez Proteus, on rapporte généralement une diminution des taux de
résistance aux antibiotiques : Ampicilline (75%), Ticarcilline (70%), Amoxicilline +
acide clavulanique (60%), Colistine (55%), Céfazoline (50%) ,Triméthoprime /
Sulfaméthoxale (45%), Chloramphénicol (35%), acide nalidixique (30%), Amikacine
(30%), céfoxitine (20%), Gentamicine (20%), Ciprofloxacine (10%) et Céfotaxime
(5%) Imipinem (5 %).
A partir des résultats obtenus, toutes les souches étudiées ont montré une résistance
élevée à tous les antibiotiques de la famille B-lactamines testés. L'AMP et la TIC
présentent une bonne activité sur les souches de Proteus mirabilis avec une résistance
totale 70% - 75% respectivement .Elle est due à une résistance naturelle des souches à
cet antibiotique. En revanche nos résultats s’éloignent de ceux motionnés par France et

52
Chapitre III Résultats et Discutions

Mahamat en 2006 notant un pourcentage de 59% pour l’AMP et 48% pour TIC suivi
par L’association Amoxicilline-Acide clavulanique (AMC) qui présente un taux de
résistance de 60% .
Concernant la Céfazoline (CZ) et le Céfotaxime (FOX) présentent des taux de résistance
respectivement de 50% et 20% mais la Céfotaxime beaucoup plus faible que
Céfazoline.
À l’exception de l’Imipinèm (IMP) et la Cefoxitine (CTX). Les souches présentent une
très faible résistance avec un taux de 5%. Donc une excellente activité est enregistrée
pour ces derniers .Ces résultats indiquant clairement que CTX et IMP sont les
molécules les plus efficaces sur les souches étudiées. Elle est due à sa sensibilité
naturelle pour ces molécules, ceci se conforme avec d’autre donnée en 2006 par Avril.
Selon Kassama, la majorité des Entérobactéries étaient sensibles à l’imipénème
indiquant sa place en premier choix dans le traitement des infections sévères à bactéries
multi résistantes. Nos résultats sont relativement très proches de ceux mentionnés par
Kassama et al en 2013.

Souches
%

Figure 37 : Pourcentage de résistance et la sensibilité de Proteus mirabilis aux β-

lactamines.

En ce qui concerne les Aminoglycosides. On remarque que le taux le plus important a

été observé pour CS et SXT qui restent toujours moins actif sur la bactérie avec un taux
de 55 % et 45% respectivement. Suivi de l'Amikacin et l’Acide nalidixique (quinolone
de 1ere génération) sont toutefois moins efficaces avec 30% de souches résistantes. Nos

53
Chapitre III Résultats et Discutions

résultats sont identiques que celles de Pearson et Dance. Proteus mirabilis a une
résistance naturelle à colistine (spécificité de l’espèce mirabilis) (Pearson et al., 1987).
Un point très important a été remarquée vis-à-vis de la Gentamicine. Soit 20%, en
tenant compte que cette molécule est moins active sur les espèces de Proteus (Cattoir,
2006). Donc une sensibilité totale est enregistrée pour ce dernier Alors qu’une activité
plus faible a été observée vis-à-vis du Ciprofloxacine avec un taux de 20%. Nos
résultats non conforme aux travaux de Danielle Clave et Kassama en 2013. Qui
rapportent des taux de résistance plus éleveés pour les quinolones de 100% (Danielle
Clave ,2013).

Figure 38 : Taux de résistance et la sensibilité de Proteus mirabilis aux autres

antibiotiques.

IV – Résultats de la mutagénèse
Après l’exposition des souches aux UV et après incubation à l’étuve pendant 24 heures
à 37°C. Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure 38.
En comparent les boites irradiées avec la boite témoin. Après 24h d’incubation et
observation des boites on remarque que la boite irradiée pendant 20 secondes contient
des colonies de Proteus mirabilis avec un nombre réduit paraport au nombre sur la boite
témoin. Alors que la boite irradiée pendant 40 secondes contient un nombre plus réduit
que la dernière à chaque fois on expose la boite aux UV. Donc les UV ont un effet létal
sur la survie des bactéries .A chaque qu’on augmente le temps d’exposition on
obtiendra un nombre limité de colonies. On peut dire donc que les souches Proteus

54
Chapitre III Résultats et Discutions

mirabilis sont plus sensibles aux UV et que leur survie après irradiation dépend du
temps d’exposition aux rayons.

La boite Temoin La boite irradiée après 20s

.
La boite irradiée après 40s La boite irradiée après 60s

Figure 39 : Les colonies d’une souche Proteus mirabilis après irradiation.

V- Résultats de la galerie biochimique après mutagenèse

On a réalisé cette étape pour voir les caractères biochimiques sur 5 souches Proteus
mirabilis étudiées après la mutagénèse. Nous n’avons pas grand-chose à signaler sauf
qu’il y a des souches qui gardent leurs caractères biochimiques Par contre qu’il y a des
souches qui changent leurs caractères à cause des UV. Dans ce cas on peut dire qu’il y a
des mutations au niveau des gènes responsable de chaque caractère.
V -1- Test Mannitol-Mobilité
Nos résultat montrent que toutes les souches (S1, S2, S3, S4, S5) gardent leur pouvoir
de mobilité et leurs incapacité de fermenter lé mannitol .Donc elles sont Mobilité + /
mannitol –.

55
Chapitre III Résultats et Discutions

Figure 40 : Aspect du milieu Mannitol Mobilité avec la souche mutante.

V -2- Test de Citrate de Simmons

Un résultat positif se manifeste par une alcalinisation du milieu qui devient bleu, c’est le
cas d’une seule souche S1. Cette souche a utilisé le citrate comme seule source de
carbone d’où le virage du vert au bleu figure 40 (b). Alors que les souches S2, S3, S4,
S5 ne provoquent aucun changement de couleur .Elles sont Citrate -, figure 40 (a).

(a) (b)
Figure 41 : Aspect du milieu citrate de Simmons avec la souche mutante.

V -3-Triple-Sugar- Iron (TSI)

Nos résultats montrent que toutes les souches de la mutagénèse dégradent le glucose
mais ni le saccharose ni le lactose ne sont dégradés. Cette activité se manifeste par un
changement de couleur de culot et la pente vers le Jaune sans dégagement du gaz.
Tandis que les souches S1, S3 et S5 produisent l’H2S. Alors que S2, S4 devienus H2S-
et lac -/ Sacch-.
Remarque : Au cours de notre étude, nous avons trouvé que les souches Proteus
mirabilis que nous avons analysées avant la mutagénèse ne fermentent ni le lactose ni le
saccharose. Mais elles fermentent le glucose avec production de gaz et de l’H2S .Tandis
que parmi ces souches et après la mutagénèse on distingue des souches qui ont devenus

56
Chapitre III Résultats et Discutions

Lac- / Sacch – / H2S - et gardent le même caractère pour la fermentation du Glu et la

production Gaz.

Figure 42 : Aspect du milieu TSI avec la souche mutante.

V-4- Test Urée-indole

L’hydrolyse de l’urée est décelée par virage de couleur du milieu (orange vert rose).Une
alcalinisation du milieu qui est observée chez les 5 souches testées S1, S3, S4 et S5,
figure 43 (a).Donc elles sont Uréase + .Concernant le test TDA, toutes les souches sont
TDA+ figure 43 (c).

(a) (c)
Figure 43 : Aspect du milieu Urée-indol- TDA avec la souche mutante.

V-5- Test de catalase et d’oxydase

Toutes les souches ont données une réaction négative avec le test de catalase et
l’oxydase. Donc elles sont catalase +, figure 44(b). Oxydase -, figure 44 (a).

57
Chapitre III Résultats et Discutions

(a) (b)
Figure 44 : Test de catalase (b) et Oxydase (a) avec la souche mutante.

V -6- Test ODC – ADH –LDC

Nos résultats montrent que toutes les souches présentent une réaction positive .Toutes
les souches sont donc pourvues d’une décarboxylase pour les trois acides aminés
(ADH+, LDC+, ODC+), figure 45. Donc elles sont décarboxylase (+).

Temoin ODC LDC ADH

Figure 45 : Test ODC – ADH - LDC avec la souche mutante.

V -7- Test VP – RM- ONPG

1/ Tests VP : Toutes les souches testées sont VP-, figure 46 (a).
2/ Réaction RM : Toutes les souches présentent une réaction RM+ veut dire que le
milieu après incubation devient rouge, figure 46 (b).
3/ Test ONPG : Toutes les souches testées sont ONPG -, figure 46 (c).

58
Chapitre III Résultats et Discutions

(a) (b) (c)

Figure 46 : Test VP (a)- RM(b)- ONPG(c) avec la souche mutante.
D’après notre étude et les tests biochimiques que nous avons réalisés après la
mutagénése, nos résultats finaux sont présentés dans le tableau 08.
Tableau 08 : Les caractères biochimiques des souches de Proteus mirabilis après la
mutagénése.
Tests S1 S2 S3 S4 S5

Glu + + + + +

TSI Lac/sacch - - - - -

Gaz + + + + +

H2S + - + - +

Mannitol Mannitol - - - - -

Mobilite Mobilite + + + + +

Citrate de + - - - -
Simmons

Urée Indole Urée + + + + +

Indol - - - - -

TDA + + + + +

Clark et VP - - - - -
Lubs
RM + + + + +

59
Chapitre III Résultats et Discutions

Milieu ODC + + + + +
Moeller
ADH + + + + +

LDC + + + + +

Oxydase - - - - -

Catalase - - - - -

ONPG - - - - -

La mutagenèse par UV a révélé la sensibilité des souches étudiées. D’après nos

résultats, les caractères biochimiques des souches mutées sont presque les même ceux
les souches avant la mutagénèse sauf les tests suivants : ADH et LDC, l’utilisation de
Citrate de simmonc et la production de H2S.

60
Conclusion
Proteus mirabilis est le deuxième germe responsable d'infections
urinaires par ordre de fréquence après Escherichia Coli .C’est une bactérie que l'on retrouve
dans l'eau et couramment dans le tractus intestinal humain. Aujourd’hui elle est l’une des
causes responsable d’infections nosocomiales sévères et difficiles à traiter. Proteus mirabilis
peuvent être généralement présents chez les individus en bonne santé dans le cadre de la
muqueuse normale. La bactérie devient un problème important surtout chez les personnes qui
ont des systèmes immunitaires vulnérables et sont en danger de transmission nosocomiale,
tels que les patients hospitalisés (Farkosh et al., 2008).
Le travail est effectué sur 20 souches du Proteus mirabilis isolées à partir de déffirent produits
pathologique au CHU du Constantine. Le pourcentage d’isolement de l’espèce à partir des
prélèvements urinaires est plus importante soit 60% de pourcentage. Dans notre étude, nous
avons essayé de confirmer ou d’infirmer les caractères morphologiques et biochimiques des
isolats qui confirment leurs appartenances à l’espèce Proteus mirabilis. Qui après l’isolement
et l’identification, Proteus mirabilis a montré une morphologie d’un bacille à Gram négatif,
très généralement mobile. Les caractères biochimiques suivants : Glu+, Lac/Sacch - , Urée /
Indole+ , H2S /Gaz + , Mobilité + , Mannitol - , et oxydase -, catalase +, , VP- , RM+
,Citrate - , ONPG - , ODC + , LDC - , ADH - .
Notre travail qui a fait appel la techniques de l’antibiogramme de Proteus mirabilis, d’établir
leur profil de résistance/sensibilité vis à vis des antibiotiques couramment utilisés et montre
qu'il existe un certain nombre d'antibiotiques qui ont été une fois efficace contre Proteus
mirabilis. Un grand nombre de ces souches ont présenté un fort taux de résistance à une ou
plusieurs familles d’antibiotiques en particulier les β-lactamines, les aminosides, et les
quinolones. Par ailleurs l’imipénème, le cefoxitine et la colistine restent les molécules les plus
actives sur Proteus mirabilis.
Cette étude avait aussi pour objectif de comparer l’effet des rayons UV chez Proteus
mirabilis. Après détection des mutants, toutes les souches mutantes sont capables de se
développer sur un milieu GN. Elles ont été caractérisées phénotypiquement par des tests
biochimiques. Les mutants ainsi isolés possèdent presque les mêmes caractères que ceux
avant la mutagénèse.
Références bibliographiques
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67
Annexe
 Annexe

Annexe 01 : Composition des différents milieux.

 Hecktoéne :

Milieu sélectif pour l’isolement des bactéries à Gram négatif

Composition (grammes/litre)

Peptone.........................................12

Extrait de levure............................3

NaCl...................................... .......5

Sels biliaires.................................9

Thiosulfate de sodium.................5

Citrate de fer ammoniacal..........1,5

Lactose.........................................12

Salicine.........................................2

Saccharose...................................12

BBT.........................................0,002

Fuchsine acide.............................0,1

Agar…….....................................14

pH final = 7,5

 Muller Hinton :

Milieu relativement riche, mais qui reste un milieu de base qui permet la culture des bactéries
non exigeantes.

Composition (grammes/litre)

Infusion de viande de bœuf….300 mL

Peptone de caséine...................17,5
 Annexe

Amidon de maïs…… ………..1,5

Agar…….................................17 g

pH final = 7,4

 Gélose nutritive :

Extrait de viande……………………………………………………………………………01g.

Extrait de levure…………………………………………………………………………….02g.

Peptone……………………………………………………………………………………...05g.

Chlorure de sodium…………………………………………………………………………05g.

Agar…………………………………………………………………………………………15g.

pH = 7,4

 Citrate de Simmons :

Composition (grammes/litre)

Sulfate de Mg..............................0,2

Phosphate monoammoniaqué.........1

Phosphate bipotassique...................1

Citrate de sodium..........................2

NaCl................................................5

BBT...........................................0,08

Agar...............................................15

pH=6,8

 TSI :

Composition (grammes/litre)

Peptone…....................................15,0 g
 Annexe

Extrait de viande….......................3,0 g

Extrait de levure…………………3,0 g

Peptone pepsique de viande……..5,0 g

Glucose…………………………...1,0 g

Lactose……………………………10,0 g

Saccharos…………………………10,0 g

Rouge de phénol…………………..0,024 g

Chlorure de sodium……………….5, 0 g

Sulfate de fer II (Pasteur)…………0,2 g

Thiosulfate de sodium…………….0,3 g

Agar……………………………….11,0 g

pH = 7,5

 Mannitol mobilité :

Composition (grammes/litre)

Peptone trypsique de viande……..20

Mannitol…………………………2

RP 1%........................................4mL

Nitrate K…………………………1

Agar………………………………4

PH = 7, 6 -7, 8

 Urée indole :

Composition (grammes/litre)

Tryptophane..................................3
 Annexe

Urée..............................................20

KH2PO4..........................................1

K2HPO4..........................................1

NaCl................................................5

Alcool à 95°.............................10 mL

Rouge de phénol....................2,5 mL

 Milieu ClarK-Lubs :

Peptone tripsique de viande ………........ 5g

Phosphate bipotassique pur en poudre….. 5g

D (+) glucose …………………………....6g

Eau distillée …………………………….. 1l ml

PH = 7.5

 LDC

Extrait de levure………………………….…….03g.

L-lysine (monochlorhydrate)……………….….05g.

Glucose………………………….………...…...01g.

Bromocrésol pourpre………………..…………...0,16mg.

Éthanol…………………………....…………….01ml.

Chlorure de sodium………………………….……05g.

pH = 6,8

 ODC

Extrait de levure…………………………………03g.

L-ornithine (monochlorhydrate)…………………05g.
 Annexe

Glucose…………………………………………...01g.

Bromocrésol pourpre……………………………...0,16mg.

Éthanol…………………………………………….01ml.

Chlorure de sodium……...…………………………05g.

pH = 6,8

 ADH

Extrait de levure………………………………….…03g.

L-arginine (monochlorhydrate)………………………05g.

Glucose………….…………………………………...01g.

Bromocrésol pourpre………………………………...0,16mg.

Éthanol…………………….………………………….01ml.

Chlorure de sodium……………………………………05g.

pH = 6,8 .
 Annexe

Annexe 02 : Photographies des résultats de repiquage des souches sur héktoén

 Annexe

Annexe 03 : Résultats de l’antibiogramme des souches étudiées.

P2 P1 P8
6

P1 P3 P5

P4 P7 P18
 Annexe

P1 P6 P16
3

P17 P20
 Annexe

Annexe 04 : Référence pour la lecture de l’antibiogramme.

 Annexe

Annexe 06 : Résultats de la galerie biochimique des souches étudiées.

 Annexe

Annexe 05: Résultats obtenus de l’antibiogramme pour les 20 souches de Proteus

mirabilis étudiées.

A AM TIC CZ FOX CTX IMP GN AK N CIP SXT CS C

MP C A

P1 22 24 28 24 24 30 24 22 22 22 30 26 <6 6
S S S S S S R
S S S S S S R

P2 nd 23 29 nd 25 30 19 20 22 R 9 R Nd 20
S S S S
S S S S S

P3 nd R S nd 11 14 17 R R 20 35 R Nd R
S
S S S S

P4 Nd 9 R nd 20 27 22 7 20 20 31 20 Nd 20
S S S S
S S S S S S

P5 <6 <6 <6 R 17 11 20 <6 <6 <6 <6 <6 R R

R R R R R R
R R S S S

P6 S 23 30 S 23 25 23 22 21 R 12 R R 17
S S S S S
S S S S

P7 nd 8 18 R 12 15 17 R R 19 40 R nd R
S S S
S S S S

P8 R R R R R S S S R S S S R S

P9 R R R R R S S S S S S R R R

P10 R R R R S S S 18 19 19 27 23 R nd

S S S S S
 Annexe

P11 R 24 24 23 26 30 26 20 22 R I R R R

S S S S S S S S

P12 R R R R 28 30 30 23 26 20 30 19 R 19

S S S S S S S S S

P13 R R R I 26 30 28 23 24 25 30 30 R nd

S S S S S S S S

P14 R R R R 28 30 26 22 22 24 30 26 R nd

S S S S S S S S

R : résistante , S : sensible .

I : Intermédiaire , nd : non identifié .

 Annexe

Matériel utilisés
- Etuve, Hôte.
- Autoclave, Bain marie.
-Bec benzène, Anse de platine.
- Distributeurs d’antibiotiques
- Agitateur, pH mètre, Vortex.
- L’eau distillée, L’eau oxygénée
-Ethanol, NAOH, Alcool.
-Violet de Gentiane, La Fushine, Lugol.
- L’huile a immersion.
- Disques d’ATB, Disques d’oxydase, Disques ONPG.
 ‫ملخص‬
‫‪ Proteus mirabilis‬هي بكتيريا معوية تتسبب في االلتهابات البولية‪,‬وتعتبر من أهم الكائنات الدقيقة التي تنتقل‬
‫عن طريق عدوى المستشفيات واألمراض المعدية االنتهازية ‪.‬‬
‫خالل فترة التربص الذي قمنا به على مستوى المستشفى الجامعي ابن باديس قسنطينة ما بين شهر مارس و شهر مايو ‪6102‬‬
‫‪ ,‬قمنا بدراسة ‪ 61‬ساللة من‪ ,Proteus mirabilis‬وجدنا أن ‪ 21 %‬من السالالت تم عزلها من البول‪.‬‬
‫تهدف هذه الدراسة إلى معرفة الخصائص المورفولوجية و البيوكيميائية ل ‪ Proteus mirabilis‬و حساسيتها لمختلف‬
‫المضادات الحيوية التالية ‪ :‬بيتا الكتامين ‪,‬أمينوزيد‪,‬فلوروكينولون‪,‬أمينوغليكوزيد‪,‬سولفاميد‪,‬عن طريق أقراص المضادات‬
‫الحيوية ‪ .‬وحسب النتائج المتحصل عليها وجدنا أن ‪ Proteus mirabilis‬تقاوم أغلبية المضادات الحيوية‪.‬‬
‫إن إحداث طفرات باألشعة فوق البنفسجية يؤدي إلى حساسية السالالت ومنه تراجع معدل نموها‪,‬مع تغير بعض خصائصها‬
‫البيوكيميائية‪.‬‬

‫الكلمات المفتاحية‪, Proteus mirabilis :‬خصائص مورفولوجية‪,‬خصائص بيوكميائية‪,‬مضادات حيوية‪,‬إحداث طفرات‪.‬‬

Abstract
Proteus mirabilis is an entericbacterium that is part of the urinary species .It is currently
involved in nosocomial infections and opportunistic infectious diseases .Proteus mirabilis of
strains were isolated between March and May 2016 from different fields of CHU of
Constantine. We gatters 20 more high strains.
This study was undertaken in the aim to identify Proteus mirabilis goals by morphological
characterization and biochemical tests .The study of sensibility under different β- lactam
antibiotics including aminosides, fluoroquinolones, aminoglycosides, and a sulfamide by the
method of discs of antibiotic (susceptibility).They are resistant to the majority of antibiotics
The mutagenesis by UV revealed the sensibility and the death of exposing strains in UV has a
duration language .Biochemical characters of the mutated strains are nearly the same those
strains before the mutagenesis.

Keywords: Proteus mirabilis, Identification, Morphologists characters, Biochimical

characteristics, Resistance, Antibiotics, Mutagenesis.
Résumé
Proteus mirabilis est une entérobactérie qui fait partie des espèces urinaires. Elle est
actuellement impliquée dans les infections nosocomiales et dans les pathologies infectieuses
opportunistes. Des Souches de Proteus mirabilis ont été isolées, entre Mars et Mai 2016, à
partir des différents services au niveau du CHU de Constantine. Nous avons colligé 20
souches de Proteus mirabilis dont 60% au niveau des urines avec un taux le plus élevé.
Cette étude a pour objectifs l’identification de Proteus mirabilis par la caractérisation
morphologiques, les tests biochimiques. Par l’étude des tests de sensibilité aux antibiotiques
différents dont β-lactamines, aminosides , fluoroquinolones , aminoglycosides et un
sulfamide par la méthode des disques d’antibiotiques (Antibiogramme) et par la mutagénèse.
Elles sont résistantes à la majorité des antibiotiques utilisés.
La mutagenèse par UV a révélé la sensibilité et la mort des souches en exposant à l’UV à une
longue durée. Les caractères biochimique des souches mutées sont presque les même ceux des
souches avant la mutagénèse.

Mots clés : Proteus mirabilis, identification, caractères morphologiques, caractères

biochimiques, résistance, antibiotiques, mutagénèse.