République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère De L’enseignement Supérieur Et De La Recherche

Scientifique
Ecole Nationale Polytechnique de
Constantine

Département de Génie des Procédés

Rapport de Mini Projet

Thème

Evaluation des activités biologiques d’une plante

médicinale

Elaboré par : Encadrée par :

LAIDOUDI Hiba Dr. BENSOUIKI Sarra

BAHOUH Insaf

Année universitaire 2023/2024

2 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Table des matières

Résumé ........................................................................................................................................... 8
Abstract .......................................................................................................................................... 9
Introduction générale ................................................................................................................. 10
CHAPITRE 1: ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ...................................................................... 11
1. Description de l’espèce Romarin ........................................................................................... 12
2. Stress oxydatif .................................................................................................................... 13
3. Méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante in vitro .................................................... 13
3.1. DPPH.............................................................................................................................. 13
3.2. ABTS .............................................................................................................................. 14
3.3. Phénanthroline................................................................................................................ 15
3.4. L’activité du pouvoir réducteur FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) . 15
CHAPITRE 2: MATERIELS ET METHODES ...................................................................... 16
1. Matériel végétale ................................................................................................................... 17
2. Liste des réactifs .................................................................................................................... 17
3. Matériels utilisés .................................................................................................................... 17
4. Macération ............................................................................................................................. 18
5. Préparation des dilutions ....................................................................................................... 19
6. Les activités antioxydantes .................................................................................................... 19
6.1. L’activité de la réduction du radical DPPH ................................................................... 19
6.2. L’activité de la réduction du radical-cation ABTS ........................................................ 21
6.3. L’activité phénanthroline ............................................................................................... 22
6.4. L’activité du pouvoir réducteur FRAP ........................................................................... 23
7. Détermination des IC50 des extraits ...................................................................................... 24
8. Détermination des A0,5........................................................................................................... 25
CHAPITRE 3: RÉSULTATS ET DISCUSSION .................................................................... 26
1. Test de DPPH ........................................................................................................................ 27
2. Test ABTS ............................................................................................................................. 29
3. Activité de phénanthroline..................................................................................................... 31
4. Activité du pouvoir réducteur (FRAP) .................................................................................. 33
Conclusion ................................................................................................................................... 35
3 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Références .................................................................................................................................... 36
4 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Liste des Figures

Figure 1 : Plante du romarin. ....................................................................................................... 12

Figure 2: Mécanisme du piégeage du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH). ........................ 14
Figure 3: Mécanisme réactionnel du test ABTS .......................................................................... 14
Figure 4: Mécanisme réactionnel du pouvoir réducteur FRAP (fluorescence recovery after
photobleaching)............................................................................................................................. 15
Figure 5 : Protocole suivi pour l’extraction du Romarin par macération en utilisant le méthanol
et l’hexane comme solvant............................................................................................................ 18
Figure 6 : Protocole suivi pour la préparation des dilutions pour évaluer les activités
antioxydantes des extraits. ............................................................................................................ 19
Figure 7 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test DPPH. ....... 20
Figure 8 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test ABTS. ....... 22
Figure 9 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test
Phénanthroline. ............................................................................................................................. 23
Figure 10 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test FRAP. ..... 24
Figure 11 : Résultats de l’étude de l’activité DPPH sur microplaque. ........................................ 27
Figure 12 : pourcentage d’inhibition de DPPH par EM, EH, BHT et BHA. ............................... 28
Figure 13 : Détermination d’IC50 de l’activité DPPH pour EM et EH. ...................................... 28
Figure 14 : Résultats de l’étude de l’activité ABTS sur microplaque. ........................................ 29
Figure 15 : Pourcentage d’inhibition de l’ABTS par EM, EH, BHA et BHT. ............................ 30
Figure 16 : Détermination d’IC50 de l’activité ABTS pour EM et EH. ...................................... 31
Figure 17 : Résultats de l’étude de l’activité phénanthroline sur microplaque. .......................... 32
Figure 18 : Détermination d’IC50 de l’activité Phénanthroline pour EM et EH. ........................ 32
Figure 19: Résultats de l’étude de l’activité FRAP sur microplaque. ......................................... 33
Figure 20 : Détermination d’IC50 de l’activité FRAP pour EH. ................................................. 34
5 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Liste des Tableaux

Tableau 1 : Classification botanique du romarin ......................................................................... 13
Tableau 2 : Pourcentage d’inhibition et la IC50 du test DPPH ................................................... 29
Tableau 3 : Pourcentage d’inhibition et la IC50 du test ABTS ................................................... 31
Tableau 4 : Absorbances et IC50 de l’activité phénanthroline .................................................... 32
Tableau 5 : Absorbances et IC50 du pouvoir réducteur par la formation du complexe Fe+2. ..... 34
6 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Liste des Abréviations

EM : Extrait du méthanol
EH : Extrait de l’hexane
DPPH : 2,2-diphényl-1-pycril-hydrazyl
ABTS : L’acide 2,2-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique)
TCA : L’acide trichloroacétique
BHT : Hydroxytoluène butylé
BHA : Hydroxyanisole butylé
IC50 : Concentration inhibitrice à 50%.
EOA : espèces oxygénées actives
FRAP: Ferric Reducing Antioxydant Power.
ABS: Absorbance
A0,5 : concentrations induisant une absorbance de 0,5
7 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Remerciements

Avant tout, nous remercions « ALLAH », le tout puissant de nous avoir

donné la santé, la force, le courage, la patience l’achèvement de ce projet.

Mme BENSOUIKI Sarra notre encadrant veillent trouver ici l’expression

de notre reconnaissance pour tous ses conseils qui ont contribués à
l’élaboration de ce projet votre patience, votre disponibilité et votre
engagement ont été des sources constantes d'inspiration pour nous. Vos
conseils avisés m'ont permis de surmonter les obstacles et d'atteindre nos
objectifs. Nous remercions vivement Dr BENSOUICI Chawki responsable de
laboratoire de biochimie au centre de Recherche en Biotechnologie, de nous
avoir accueilli et aussi les facilités et les aides qu’il nous a accordées durant la
période de notre travail et pour son enthousiasme et son art de simplicité.

Nous tenons à présenter notre sincère et vif remerciement aux membres de

jury Dr. TOUATI pour leur présence et d'avoir sacrifier leur temps pour juger
ce travail.

Merci à tous et toutes

8 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Résumé

Ce travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation des extraits de la plante Rosmarinus officinalis
appartenant à la famille des Lamiaceae. La méthode appliquée pour extraire les molécules
bioactives est la macération en utilisant le méthanol et l’hexane comme solvant. Le rendement
obtenu est de 17,25 % avec l’hexane et de 14,4 % avec le méthanol. Les activités antioxydantes
des extraits de la plante Romarin, ont été évaluées in vitro par quatre méthodes : l’inhibition du
radical libre 2,2-diphényl-1-pycril-hydrazyl (DPPH), la stabilisation du radical cationique ABTS•+,
le test phénanthroline et le pouvoir réducteur FRAP. Les résultats du test DPPH indiquent que
l’extrait d’hexane a montré une IC50 (56,28±0,81 μg/mL) significativement plus basse que celle
du méthanol (131.98±53.99 μg/mL) avec un pourcentage d’inhibition maximal égal à 79,65 ± 0,18
% une concentration de 200 µg dans le cas de l’hexane. Tandis que dans le cas du méthanol ce
pourcentage est de 79,44 ± 0,95 % pour une concentration de 400 µg. L’étude de la stabilisation
du radical cationique ABTS•+ a démontré un pourcentage d’inhibition de 91,79±0,34 % (à 200 µg)
pour l’hexane. Cependant, le pourcentage maximal est de 88,38±1,12 % (à 400 µg). Pour la
phénanthroline, l’extrait hexane exerce la meilleure activité de réduction du fer par rapport au
méthanol avec une valeur de A0,5 égales à 12,13 ±1,94μg/mL, neuf fois supérieure à celle du
méthanol (A0,5= 107,17 ±3,8μg/mL). Dans l’étude du FRAP, en comparant l’extrait d'hexane avec
les standards acide ascorbique et α-tocophérol, dont les A0,5 sont respectivement de 6,77 ± 1,15
et 34,93 ± 2,38 µg/mL, nous constatons que l'hexane a une A0,5 plus faible que l’α-tocophérol, ce
qui signifie que l'extrait de l’hexane est plus actif que l’α-tocophérol.
9 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Abstract

This work is part of the valorization of extracts from the plant Rosmarinus officinalis belonging to
the Lamiaceae family. The method used to extract bioactive molecules is maceration using
methanol and hexane as solvents. The yield obtained is 17.25% with hexane and 14.4% with
methanol. The antioxidant activities of Rosemary plant extracts were evaluated in vitro by four
methods: inhibition of the free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), stabilization of the
cationic radical ABTS•+, the phenanthroline test, and the FRAP reducing power test. The results
of the DPPH test indicate that the hexane extract showed a CI50 (56.28±0.81 μg/mL) significantly
lower than that of methanol (131,98±53,99 μg/mL) with a maximal inhibition percentage equal to
79,65 ± 0,18% at a concentration of 200 µg in the case of hexane. While in the case of methanol,
this percentage is 79,44 ± ,95% for a concentration of 400 µg. The study of ABTS•+ cationic radical
stabilization demonstrated an inhibition percentage of 91,79±0,34% (at 200 µg) for hexane.
However, the maximal percentage is 88,38±1,12% (at 400 µg). For phenanthroline, the hexane
extract exhibited the best iron reduction activity compared to methanol with an A0,5 value equal
to 12,13 ±1,94 μg/mL, nine times higher than that of methanol (A0,5= 107,17 ±3,8 μg/ml). In the
FRAP study, comparing the hexane extract with the standard’s ascorbic acid and α-tocopherol,
with A0,5 values of 6,77 ± 1,15 and 34,93 ± 2,38 µg/mL respectively, we observe that hexane has
a lower A0,5 than α-tocopherol, meaning that the hexane extract is more active than α-tocopherol.
10 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Introduction générale

La quête de remèdes au sein du règne végétal date de plusieurs millénaires. Selon

l’organisation mondiale de la santé (OMS), environ 80 % de la population mondiale
contemporaine a eu recours à la médecine traditionnelle pour satisfaire ses besoins en soins de
santé primaire. Ce regain d'intérêt est principalement dû à la hausse des prix des médicaments et à
leur manque de disponibilité. De plus, la médecine traditionnelle est plus abordable et en meilleure
adéquation avec l'idéologie du patient [1].

L’Algérie, avec sa géographie variée, abrite une multitude de plantes médicinales utilisées
depuis des siècles. Ces plantes offrent un véritable potentiel thérapeutique grâce à leurs propriétés
aromatiques, anti-inflammatoires, antimicrobiennes et antioxydantes. L'intérêt pour les propriétés
antioxydantes des extraits de plantes a considérablement augmenté ces dernières années, du fait
de leur potentiel à offrir des antioxydants naturels qui joue un rôle très important dans la prévention
des maladies chroniques telles que les pathologies du cœur, le cancer, le diabète, l'hypertension, et
la maladie d'Alzheimer en combattant le stress oxydant [2,3]. Parmi ces plantes, nous pouvons
citer le Rosmarinus officinalis.

Dans le contexte de l’évaluation des activités antioxydantes Rosmarinus officinalis s’inscrit

ce travail qui a été réalisé au niveau du Centre de Recherche en Biotechnologie (CRBt).

Le travail présenté dans ce manuscrit s’articule autour de trois chapitres :

Le premier chapitre bibliographique est dédié aux généralités sur la plante à étudier, le stresse
oxydatif ainsi que les principales méthodes in vitro utilisées pour l’évaluation de l’activité
antioxydante des molécules bioactives.

Quant à la partie matériels et méthodes elle porte sur le matériels utilisés et les méthodes
appliquées pour la préparation des extraits ainsi que l’évaluation du pouvoir antioxydant des
extraits organiques issus de la plante par cinq techniques différentes.

Le troisième chapitre s’intéresse aux résultats obtenus et à leur discussion.

Ce manuscrit s’achève par une conclusion générale et perspective.

11 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

CHAPITRE 1

ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
12 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

1. Description de l’espèce Romarin

Le Romarin ou Rosmarinus Officinalis (Figure 1) est un arbrisseau de la famille des labiées

et considéré comme une plante médicinale, aromatique et condimentaire, peut atteindre jusqu’à
1,5 mètre de hauteur, il est facilement reconnaissable en toute saison à ses feuilles persistantes sans
pétiole, coriaces beaucoup plus longues que larges, aux bords légèrement enroulés, vert sombre
luisant sur le dessus, blanchâtres en dessous. La floraison du Romarin commence dès le mois de
février (ou janvier parfois) et se poursuit jusqu’au avril – mai. La couleur des fleurs varie du bleu
pâle au violet. Le calice velu à dents bordées de blanc, elles portent deux étamines ayant une petite
dent vers leur base. Comme pour la plupart des Lamiacées, le fruit est un tétrakène (de couleur
brune) [4].

Figure 1 : Plante du romarin.

Le romarin spontané pousse sur les côtes méditerranéennes et dans le sud-ouest de l'Asie. Il se
cultive dans des endroits ensoleillés et affectionne particulièrement les sols calcaires bien drainés.
En Algérie, le romarin est l'une des sept espèces végétales couvrant plus de 50 000 hectares sur le
territoire national [5]. On le trouve principalement dans les dunes de sable des côtes. Cette plante
possède plusieurs synonymies selon les différentes régions d’Algérie :

Région de l'Est : Eklil

Région de l'Ouest : Helhal

Région du Centre : Yazir

13 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Tableau 1 : Classification botanique du romarin

Règne Plantes
Embranchement Spermaphytes
Classe Dicotyledones
Ordre Lamiales (Labiales)
Famille Lamiaceae
Genre Rosmarinus
Espèce Rosmarinus officinalis L

Le Romarin a fait l’objet de de nombreuses recherches et études qui ont démontré plusieurs
propriétés pharmacologiques, notamment ses effets anti-inflammatoires, antibactériens,
antiviraux, antifongiques antioxydants.

2. Stress oxydatif

La découverte d'espèces chimiques radicalaires présentes normalement dans l'organisme a

bouleversé notre compréhension des mécanismes biologiques. Ces radicaux libres sont produits
par divers mécanismes physiologiques car ils sont utiles à l'organisme à dose raisonnable, mais
une production excessive peut résulter de phénomènes toxiques exogènes, contraignant
l'organisme à se protéger de ces excès par différents systèmes antioxydants [6].
Le stress oxydatif est un déséquilibre entre les radicaux libres et le système antioxydant,
ce qui peut provoquer des maladies chroniques telles que le cancer, la maladie d'Alzheimer et la
maladie de Parkinson [7].
Le stress oxydatif devient anormal soit en raison d'une production accrue d'espèces oxygénées
activées, soit en raison d'une diminution de la capacité de défense antioxydante [8].

3. Méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante in vitro

3.1. DPPH
Cette méthode est basée sur la capacité des antioxydants à réduire le radical libre 2,2-
diphényl-1-pycril-hydrazyl. Le DPPH présente une coloration violette mais lorsqu’il est piégé par
des substances antioxydantes sa couleur vire au jaune. Lorsque le DPPH réagit avec un
antioxydant, un atome d’hydrogène vient se fixer sur le radical. L’intensité de la couleur jaune
formée est proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu (Figure 2). Cette
14 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

réduction peut être mesurée par UV- Visible, en suivant la diminution de l’absorbance à 517 nm
[9].

Figure 2: Mécanisme du piégeage du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH).

3.2. ABTS

Ce test est basé sur la capacité d’un antioxydant à stabiliser le radical cationique ABTS •+
de coloration vert bleu en le transformant en ABTS incolore. Le radical préformé ABTS•+ est
généré en présence des ions persulfates. En présence d’un antioxydant, La réduction de l’ABTS•+,
par transfert de proton, conduit à la décoloration de la solution et l’absorbance sera alors mesurée
par spectrométrie à 734nm (Figure 3) [10].

Figure 3: Mécanisme réactionnel du test ABTS [10].

15 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

3.3. Phénanthroline
La méthode de la phénanthroline était basée sur la réduction des ions ferriques (Fe3+) en ions
ferreux (Fe2+) par un antioxydant. Le Fe2+ formé réagissait ensuite avec la 1,10-phénanthroline
pour former un complexe rouge orangé de triphénanthroline qui absorbe à λ=510nm [11].

3.4. L’activité du pouvoir réducteur FRAP (fluorescence recovery after photobleaching)

La méthode Reducing power ou le pouvoir réducteur est décrite par Oyaizu en 1986. Elle est
basée sur la capacité d’un antioxydant à réduire le fer ferrique (Fe3+) présent dans le complexe
ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) en fer ferreux (Fe2+). L’addition du Fe3+ au produit réduit
conduit à la formation du bleu de Prusse (Fe[Fe(CN)6] - ), qui a une forte absorbance à 700nm [12].
Cette réaction est révélée par le virage de la coloration du jaune au bleu-vert (Figure 4).

Figure 4: Mécanisme réactionnel du pouvoir réducteur FRAP (fluorescence recovery after

photobleaching) [12].
16 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

CHAPITRE 2

MATERIELS ET METHODES
17 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

1. Matériel végétale
La plante de Romarin a été cueillie au mois de décembre (2023), dans les montagnes de la
wilaya de Constantine.

2. Liste des réactifs

• Méthanol • Persulfate de Potassium K2S2O8 • Phosphate buffer
• Hexane • TCA • Phenanthroline
• DPPH • Potassium Ferricyanide K3Fe(CN)6 • BHT
• ABTS • Chlorure ferrique FeCl3 • BHA

3. Matériels utilisés
18 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

4. Macération
La préparation des extraits à partir du Romarin a été réalisée par macération. 70 g de la
plante ont été macérés dans un mélange hydro-alcoolique Méthanol/Eau (70 :30 (v/v)) pendant 48
heures à température ambiante et à l’abri de la lumière. L’extrait obtenu a été filtré sous vide, puis
concentré sous pression réduite à 65°C à l’aide d’un évaporateur rotatif. L’extrait brut
hydrométhanolique (EM) est ainsi obtenu. De plus, un extrait hexanique (EH) a été préparé de la
même manière en utilisant de l'hexane pur comme solvant. EH a ensuite été concentré sous
pression réduite à 69 °C (Figure 5).

Figure 5 : Protocole suivi pour l’extraction du Romarin par macération en utilisant le méthanol et
l’hexane comme solvant.

Les rendements de l’extraction ont été déterminés à partir du rapport de la masse de l’extrait sur
la masse de plante sèche utilisée

ME
%𝑅 = × 100
MP
19 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

R : rendement
ME : masse de l’extrait (g)
MP : masse initiale de la plante (g)

5. Préparation des dilutions

Une solution mère de 4 mg de chaque extrait est maintenue dans un Eppendorf avec 1 mL
de méthanol. Chaque Eppendorf contient 500 µL de méthanol avec 1 µL de la solution précédente
(Figure 6).

Figure 6 : Protocole suivi pour la préparation des dilutions pour évaluer les activités antioxydantes des
extraits.

6. Les activités antioxydantes

6.1. L’activité de la réduction du radical DPPH
L'activité anti-radicalaire libre a été déterminée par spectrophotométrie par le dosage du
DPPH selon la méthode décrite par Blois et al [13].
20 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

6.1.1. Préparation de DPPH

4 mg de DPPH ont été dissous dans un volume de 100 mL de méthanol. Ensuite, la solution est
conservée à 20°C, à l’abri de lumière. L’absorbance de la solution préparée à 517 nm est de 0,5.

6.1.2. Mode opératoire de l’activité DPPH

Sur une microplaque de 96 puits, nous avons disposé dans chaque puit 160 µL de DPPH
avec 40 µL de chaque extrait à différente concentration. Le témoin comporte 40 µL du méthanol
et 160 µL de DPPH. La microplaque a été maintenu à température ambiante et à l’abri de la lumière
pendant 30 min. L’analyse a été reproduite trois fois. Une lecture à une longueur d’onde de 517
nm a été effectuée (Figure 7). Le BHT, le BHA et α-Tocopherol ont été utilisés comme standards
antioxydants. Les résultats sont rapportés sous forme de moyenne de pourcentage d'inhibition avec
les déviations standard. Le pourcentage de l’activité antiradicalaire du DPPH a été calculé par la
formule suivante :

𝑨𝑩𝑺𝑪𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍𝒆 − 𝑨𝑩𝑺𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒊𝒕
%𝐷𝑃𝑃𝐻 = × 𝟏𝟎𝟎
𝑨𝑩𝑺𝑪𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍𝒆

Figure 7 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test DPPH.
21 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

6.2. L’activité de la réduction du radical-cation ABTS

Le pouvoir réducteur du radical-cation ABTS à été déterminé selon la méthode de Re et al
[14].

6.2.1. Génération du radical ABTS•+

Le radical cationique ABTS•+ a été généré en mélangeant la solution de l’ABTS à 7 mM
(19,2 mg d’ABTS dans 5 mL d’H2O) avec la solution du persulfate de potassium à 2,45 mM (3,3
mg de K2S2O8 dans 5 ml H2O). Le mélange a été mis à l’abri de la lumière pendant 16 h. Avant
utilisation, l’absorbance de la solution ainsi obtenue a été ajustée à 7,00 ± 0,02 à 734 nm en utilisant
de l'eau.

6.2.2. Mode opératoire de l’activité ABTS

Dans une microplaque de 96 puits 160 µL de la solution d’ABTS•+ ont été ajouté à 40 µL
de chaque extrait. Des puits témoins ont été préparés en remplaçant la substance à tester par le
méthanol. L’analyse est reproduite trois fois. Les absorbances ont été mesurées à 734 nm après 10
min dans l’obscurité (Figure 8). Le BHT et le BHA ont été utilisés comme standards antioxydants.
Les résultats sont exprimés en moyenne de pourcentage d’inhibition ± les écart-types. Pour
déterminer le pourcentage d'inhibition, l'équation suivante a été appliquée :

𝑨𝑩𝑺𝑪𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍𝒆 −𝑨𝑩𝑺𝒆𝒙𝒕𝒓𝒂𝒊𝒕
%𝐴𝐵𝑇𝑆 = × 𝟏𝟎𝟎
𝑨𝑩𝑺𝑪𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍𝒆
22 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Figure 8 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test ABTS.

6.3. L’activité phénanthroline

L’activité phénanthroline des EM et EH a été évaluée selon la méthode de Szydlowska et al.
[15].

6.3.1. Préparation de la solution phénanthroline 0,5 %

0,05 g de 1,10-phenanthroline ont été dissous dans 10 mL de méthanol

6.3.2. Préparation de la solution FeCl3 0,2 %

0,02 g de FeCl3 ont été dissous dans 10 mL de l’eau.

6.3.3. Mode opératoire de l’activité

10 µL d’extrait ont été mélangés avec 30 µL de phénanthroline (0,5 %), 50 µL de FeCl 3
(0,2%) et 110 µL de méthanol. Par la suite, la microplaque a été incubée pendant 20 min à 30°C.
le témoin a été préparé en remplaçant le mélange les 10 µL de l’extrait par 10 µL de méthanol.
Chaque essai a été répété trois fois. La lecture a été réalisée à 510 nm (Figure 9). Les résultats sont
exprimés en moyenne de A0,5 ± les écart-types et comparés à ceux des BHA et BHT.
23 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Figure 9 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test Phénanthroline.

6.4. L’activité du pouvoir réducteur FRAP

La méthode Reducing power ou le pouvoir réducteur a été réalisée selon la technique décrite par
Oyaizu en 1986 [16].

6.4.1. Préparation de la solution K3Fe(CN)6 à 1%

1 g de K3Fe(CN)6 dans 100 mL d’eau.

6.4.2. Préparation de la solution TCA à 10%

1 g de TCA dans 10 ml H2O.

6.4.3. Préparation de la solution FeCl3 à 0.1%

0,1 g de FeCl3 dans 100 mL d’eau.

Ces trois solutions ont été conservées à l’abri de la lumière.

24 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

6.4.4. Mode opératoire

Un mélange de 10 μL d’extrait, 40 μL de solution tampon phosphate (pH 6,6) et 50 μL de
K3Fe(CN)6 (1%) est incubé à 50 °C pendant 20 min. Ensuite, on y ajoute 50 μL de TCA (10%),
40 μL d’eau et 10 μL de FeCl3 (0,1%). Le témoin est préparé en remplaçant la même quantité
d’extrait par du méthanol. Chaque mesure a été réalisée en triplicate. La lecture a été effectuée à
700 nm (Figure 10). Les concentrations induisant une absorbance de 0,5 (A0,50) des extraits sont
déterminées et comparées à celle d’acide ascorbique et α-Tocopherol.

Figure 10 : Protocole suivi pour l’évaluation d de l’activité antioxydante par le test FRAP.

7. Détermination des IC50 des extraits

La IC50 (Concentration inhibitrice à 50 %) permet de calculer la concentration de
l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % du radical libre. Elle est calculée graphiquement
par la régression linéaire des graphes tracés représentant le pourcentage d’inhibition en fonction
de différentes concentrations des fractions utilisées. La IC50 est inversement lié à la capacité
antioxydante d'un composé. Plus la valeur de la IC50 est basse, plus l'activité antioxydante d'un
composé est grande [17].

L’équation de la courbe linéaire est sous la forme 𝑦 = 𝑎𝑋 + 𝑏. Elle correspond à l’équation

25 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

50 % = IC50 × C + b

Donc,
Y−b
𝐼𝐶50 =
𝑎

8. Détermination des A0,5

La A0,5 (Concentration correspondant à 0,50 d’absorbance) permet de calculer la
concentration de l’échantillon testé nécessaire pour induire une absorbance de 0,5 du radical libre.
Elle est calculée graphiquement par la régression linéaire des graphes tracés représentant
l’absorbance de l’échantillon en fonction de la concentration testée. La ABS0,5 est inversement lié
à la capacité antioxydante d'un composé. Plus la valeur de la ABS0,5 est basse, plus l'activité
antioxydante d'un composé est grande [18].

L’équation de la courbe linéaire est sous la forme 𝑦 = 𝑎𝑋 + 𝑏. Elle correspond à l’équation

0,5 = 𝐴0,5 × C + b

Donc,

Y−b
𝐴0,5 =
𝑎
26 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

CHAPITRE 3

RÉSULTATS ET DISCUSSION
27 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

1. Rendement des extraits

Les résultats obtenus indiquent que le rendement d'extraction est de 17,25 % avec l'hexane,
tandis qu'il est de 14,4 % avec le méthanol. Toutefois, le rendement d’extraction dépend de
plusieurs autres facteurs y compris la durée d’extraction, la matière végétale brute, la quantité du
solvant d’extraction, la température et le pH. La variation de ces facteurs donne naissance à une
altération différentielle de la distribution des composés entre les deux phases solides et liquide.

2. Test de DPPH
Les résultats de l’activité anti radicalaire de DPPH ainsi que les IC50 sont représentés dans
les Figure 11, 12, 13 et le Tableau 2.
EH a montré une IC50 (56,28±0,81 μg/mL) significativement plus basse que celle du EM
(131,98±53,99 μg/mL). D’autre part, les standard BHA, BHT et α-Tocopherol ont démontrés une
activité antiradicalaire puissante avec des valeurs de IC50 de 6,14±0,41, 12,99±0,41 µg/mL et
13,02±5,17 µg/mL respectivement. Un pourcentage d’inhibition maximal égal à 79,65 ± 0,18 % a
été observé pour une concentration de 200 µg dans le cas de EH. Tandis que dans le cas du EM ce
pourcentage maximal est de 79,44 ± 0,95 % pour une concentration de 400 µg.

Figure 11 : Résultats de l’étude de l’activité DPPH sur microplaque.

28 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

100

80
% DPPH inhibition

60

40

20

-20
12,5 25 50 100 200 400 800
Concentration (µg/mL)
EM EH BHT BHA

Figure 12 : pourcentage d’inhibition de DPPH par EM, EH, BHT et BHA.

L’IC50 est calculé comme suit

Figure 13 : Détermination d’IC50 de l’activité DPPH pour EM et EH.

 29 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Tableau 2 : Pourcentage d’inhibition et la IC50 du test DPPH

% Inhibition du test DPPH

Echantillon 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg 400 µg 800 µg IC50 µg/mL

EM - - - 0,88±9,58 71,95±7,22 79,44±0,95 69,53±4,01 131,98±53,99

EH - - 35,47±2,39 77,43±1,28 79,65±0,18 79,02±1,2 62,25±16,93 56,28±0,81

BHA 76,55± 0,48 79,89± 0,26 81,73±0,10 84,18±0,10 87,13±0,17 89,36±0,19 90,14±0,00 6,14±0,41
BHT 49,09± 0,76 72,63± 2,06 88,73±0,89 94,00±0,31 94,97±0,08 95,38±0,41 95,02±0,23 12,99±0,41
α-Tocopherol 37,21±1,82 81,53±1,51 89,23±0,12 89,38±0,19 89,45±0,22 89,99±0,23 89,52±0,33 13,02±5,17
(-) : Absence d’activité

3. Test ABTS
Les résultats obtenus (Figure 14, 15, 16 et Tableau 3) montrent que EM a présenté une
activité plus faible par rapport à celle de EH, avec des IC50 de 119,14 ± 32,17 µg/mL et de 67,19
± 6,59 µg/mL respectivement. En comparaison avec les standards, on remarque que le BHA
présente une valeur de IC50 de 1,81 ± 0,1 µg/mL et le BHT de 1,29 ± 0,3 µg/mL, qui sont plus
élevées que celles des extraits. Un pourcentage d’inhibition maximal égal à 91,79±0,34 % a été
observé pour une concentration de 200 µg dans le cas de EH. Tandis que dans le cas du EM ce
pourcentage maximal est de 88,38±1,12 % pour une concentration de 400 µg.

Figure 14 : Résultats de l’étude de l’activité ABTS sur microplaque.

30 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

100

80

60
% ABTS inhibition

40

20

-20

-40

-60

-80
12,5 25 50 100 200 400 800
Concentration (µg/mL)
EM EH BHA BHT

Figure 15 : Pourcentage d’inhibition de l’ABTS par EM, EH, BHA et BHT.

L’IC50 est calculé comme suit :

 31 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Figure 16 : Détermination d’IC50 de l’activité ABTS pour EM et EH.

Tableau 3 : Pourcentage d’inhibition et la IC50 du test ABTS

Echantillon % Inhibition de l’activité ABTS

12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg 400 µg 800 µg IC50 µg/mL
EM - 16,79±7,18 27,58±10,23 40,09±17,69 80,61±11,14 88,38±1,12 84,46±2,54 119,14±32,17
EH - 14,22±3,12 38,75±5,42 76,42±9,03 90,72±0,26 91,73±0,1 91,79±0,34 67,19±6,59
BHT 69,21±0,40 78,23±1,34 88,12±1,28 88,76±3,07 90,85±1,74 90,95±0,51 96,68±0,39 1,29±0,30
BHA 92,83±1,42 94.68±0,42 94,95±0,90 95,32±0,25 95,59±0,47 95,83±0,15 95,86±0,10 1,81±0,10

(-) : Absence d’activité

4. Activité de phénanthroline
La phénanthroline est une activité pour mesurer la capacité antioxydante totale des
antioxydants. Cette méthode est basée sur la réduction de Fe+³ par un agent antioxydant pour
donner l’ion Fe+2qui ensuite réagit avec la phénanthroline pour donner un complexe de couleur
rouge orangé, et qui absorbe à 510 nm (Szydłowska-Czerniaka et al., 2008).

Les résultats présentés dans la Figure 17, 18 et le Tableau 4 indiquent que EH exerce la meilleure
activité de réduction du fer par rapport au EM avec une valeur de A0,5 égales à 12,13 ±1,94μg/mL,
neuf fois supérieure à celle du EM (A0,5= 107,17 ±3,8μg/mL). En comparaison avec les standards
BHA et BHT, l'activité de EH est inférieure à celle du BHA et du BHT, qui ont une A0,5 de 0,93
32 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

± 0,07 et 2,24 ± 0,17 μg/mL respectivement. L’EM présente la plus faible activité, qui est
incomparable aux résultats des standards BHA et BHT.

Figure 17 : Résultats de l’étude de l’activité phénanthroline sur microplaque.

L’IC50 est calculé comme suit :

Figure 18 : Détermination d’IC50 de l’activité Phénanthroline pour EM et EH.

Tableau 4 : Absorbances et IC50 de l’activité phénanthroline

Echantillon Absorbances de l’activité phénanthroline

3,125 µg 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200µg A0,5 µg/mL
EM 0,27±0,04 0,29±0,05 0,31±0,08 0,3±0,01 0,34±0,04 0,39±0,05 0,77±0,01 107,17±3,83
EH 0,27±0,02 0,38±0,04 0,5±0,1 0,8±0,2 1,56±0,22 3,24±0,47 3,78±0,08 12,13±1,94
BHA 0,49±0,01 0,59±0,01 0,73±0,02 0,93±0,01 1,25±0,04 2,10±0,05 4,89±0,06 0,93±0,07
BHT 0,47±0,01 0,47±0,01 0,53±0,03 1,23±0,02 1,84±0,01 3,48±0,03 4,84±0,01 2,24±0,17
33 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

5. Activité du pouvoir réducteur (FRAP)

Le pouvoir réducteur d’un extrait est associé à son pouvoir donneur d’électron. Cette technique
permet de mesurer la capacité des extraits testés à réduire le fer ferrique (Fe3+) présent dans le
complexe K3Fe(CN) en fer ferreux (Fe2+) (Bentabet et al., 2014).

Les résultats de l’activité ont été illustrés dans la Figure 19, 20 et le Tableau 5. En comparant EH
avec les standards : acide ascorbique et α-tocophérol, dont les A0,5 sont respectivement de 6,77 ±
1,15 et 34,93 ± 2,38 µg/ml, nous constatons que l'EH a une A0,5 plus élevée que l'acide ascorbique,
ce qui signifie que l'EH est moins actif que l'acide ascorbique. Cependant, notre extrait est plus
actif que l’α-tocophérol car il a une A0,5 plus faible que le α-tocophérol.

Figure 19: Résultats de l’étude de l’activité FRAP sur microplaque.

34 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Figure 20 : Détermination d’IC50 de l’activité FRAP pour EH.

Tableau 5 : Absorbances et IC50 du pouvoir réducteur par la formation du complexe Fe+2.

Absorbance de l’activité FRAP

3,125 µg 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg A0,5 µg/mL

Echantillon
EM 0,07±0,01 0,07±0,01 0,08±0,01 0,08±0,01 0,07±0,01 0,1±0,01 0,09±0,01 -
EH 0,24±0,04 0,34±0,14 0,42±0,01 0,64±0,05 0,86±0,09 1,02±0,09 0,91±0,26 15,85±1,82
Ascorbic acid 0,35±0,05 0,46±0,03 0,84±0,12 0,93±0,30 1,18±0,34 1,37±0,20 1,44±0,21 6,77±1,15
α-Tocopherol 0,11±0,00 0,16±0.00 0,21±0,03 0,35±0,03 0,73±0,03 1,37±0,08 1,81±0,09 34,93±2,38
(-) : Absence d’activité

En résumé, EH présente une activité antioxydante plus importante par rapport à celle du
EM. La différence d’efficacité entre les deux solvants peut être due aux types de composés
chimiques extraits. L’EM généralement des composés polaires tels que les polyphénols et les
flavonoïdes, tandis que l’EH a tendance à extraire des composés apolaires comme les huiles
essentielles et les terpènes. Il a été démontré que le romarin présente plusieurs classes de composés
apolaires qui présentent une activité antioxydante tel que [19]:
Les terpènes : comme le camphre, le pinène, le cinéole et le bornéol),
35 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Les diterpènes : tels que l'acide carnosique et l'acide rosmarinique, présents dans le romarin, sont
des diterpènes).
Les polyphénols : bien que certains polyphénols soient polaires, certains composés
polyphénoliques du romarin, tels que les acides rosmarinique et caféique, peuvent également être
extraits avec des solvants apolaires et contribuer à son activité antioxydante.

Conclusion
Le présent travail s’inscrit dans le cadre de la valorisation de la flore locale d’intérêt
thérapeutique, par l’évaluation des activités biologiques in vitro et l’étude de la plante
Rosmarinus officinalis appartenant à la famille des Lamiacea. L'étude menée sur les deux
extraits de Rosmarinus officinalis a révélé des propriétés antioxydantes significatives, avec des
performances notables observées pour l'extrait d'hexane par rapport au méthanol. Les résultats
obtenus à partir des différentes méthodes d'évaluation, notamment le test DPPH, la stabilisation
du radical ABTS•+, le test phénanthroline et le test FRAP, ont démontré l'efficacité de l'extrait
d'hexane dans la réduction des radicaux libres et dans la capacité de réduction du fer. Ces
résultats suggèrent que le choix du solvant est crucial dans l'extraction des composés bioactifs,
Cela fait de l'extrait hexane un candidat prometteur pour des applications dans les domaines de la
santé et de la nutrition. Cependant, L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette étude,
constitue une première étape dans la recherche des substances biologiquement active de source
naturelle, il serait intéressant d’étayer ce travail par :

• Une étude plus approfondie sur la toxicité de la plante étudiée

• L’étude de la composition chimique de la plante
• Evaluer les activités biologiques in vivo
36 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

Références
[1] Mainardi T, Kapoor S, Bielory L. Complementary and alternative medicine: Herbs,
phytochemicals and vitamins and their immunologic effects. J Allergy Clin Immunol
2009;123:283–294.e10. [Link]

[2] Cole SB, Langkamp‐Henken B, Bender BS, Findley K, Herrlinger‐Garcia KA, Uphold
CR. Oxidative Stress and Antioxidant Capacity in Smoking and Nonsmoking Men With
HIV/Acquired Immunodeficiency Syndrome. Nutr Clin Pract 2005;20:662–7.
[Link]

[3] Liu Z-Q. Chemical Methods To Evaluate Antioxidant Ability. Chem Rev 2010;110:5675–
91. [Link]

[4] Hendel N, Napoli E, Sarri M, Saija A, Cristani M, Nostro A, et al. Essential Oil from
Aerial Parts of Wild Algerian Rosemary: Screening of Chemical Composition,
Antimicrobial and Antioxidant Activities. J Essent Oil Bear Plants 2019;22:1–17.
[Link]

[5] Sarmoum R, Haid S, Biche M, Djazouli Z, Zebib B, Merah O. Effect of Salinity and
Water Stress on the Essential Oil Components of Rosemary (Rosmarinus officinalis L.).
Agronomy 2019;9:214. [Link]

[6] Palazzetti S, Richard M-J, Favier A, Margaritis I. Overloaded Training Increases

Exercise-Induced Oxidative Stress and Damage. Can J Appl Physiol 2003;28:588–604.
[Link]

[7] Farooq MA, Niazi AK, Akhtar J, Saifullah, Farooq M, Souri Z, et al. Acquiring control:
The evolution of ROS-Induced oxidative stress and redox signaling pathways in plant
stress responses. Plant Physiol Biochem 2019;141:353–69.
[Link]

[8] Maleki M, Ghorbanpour M, Kariman K. Physiological and antioxidative responses of

medicinal plants exposed to heavy metals stress. Plant Gene 2017;11:247–54.
[Link]
37 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

[9] Mishra K, Ojha H, Chaudhury NK. Estimation of antiradical properties of antioxidants

using DPPH assay: A critical review and results. Food Chem 2012;130:1036–43.
[Link]

[10] Ilyasov IR, Beloborodov VL, Selivanova IA, Terekhov RP. ABTS/PP Decolorization
Assay of Antioxidant Capacity Reaction Pathways. Int J Mol Sci 2020;21:1131.
[Link]

[11] Miguel MG. Antioxidant activity of medicinal and aromatic plants. A review. Flavour
Fragr J 2010;25:291–312. [Link]

[12] Munteanu IG, Apetrei C. Analytical Methods Used in Determining Antioxidant Activity:
A Review. Int J Mol Sci 2021;22:3380. [Link]

[13] BLOIS MS. Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical. Nature
1958;181:1199–200. [Link]

[14] Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C. Antioxidant

activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol
Med 1999;26:1231–7. [Link]

[15] SZYDLOWSKACZERNIAK A, DIANOCZKI C, RECSEG K, KARLOVITS G, SZLYK

E. Determination of antioxidant capacities of vegetable oils by ferric-ion
spectrophotometric methods. Talanta 2008;76:899–905.
[Link]

[16] Orhan I, Üstün O. Determination of total phenol content, antioxidant activity and
acetylcholinesterase inhibition in selected mushrooms from Turkey. J Food Compos Anal
2011;24:386–90. [Link]

[17] Bentabet N, Boucherit-Otmani Z, Boucherit K. Composition chimique et activité

antioxydante d’extraits organiques des racines de Fredolia aretioides de la région de
Béchar en Algérie. Phytothérapie 2014;12:364–71. [Link]
0834-x.

[18] Khalfallah A, Kabouche Z, Kabouche A, Berrehal D, Boutaghane N, Voutquenne-

Nazabadioko L. A new acylated flavonol triglycoside and evaluation of the antioxidant
38 Ecole Nationale Polytechnique De Constantine

activity of Astragalus armatus subsp. numidicus (Murb.) Emb. & Maire. Nat Prod Res
2023:1–6. [Link]

[19] Özcan MM, Chalchat J-C. Chemical composition and antifungal activity of rosemary (
Rosmarinus officinalis L.) oil from Turkey. Int J Food Sci Nutr 2008;59:691–8.
[Link]