Université BADJI-MOKHTAR

Faculté de médecine
Département de pharmacie

Haemophilus

Objectifs pédagogiques :

1. Connaitre le genre Haemophillus

2. Connaitre les techniques d'identification des principales espèces pathogènes

Plan du cours:

1. GENERALTES
2. CLASSIFICATION
3. HABITAT
HAEMOPHILUS INFLUENZAE
I. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES:
II. POUVOIR PATHOGÈNE
III. PHYSIOPATHOLOGIE
IV. DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE
V. SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES
VI. VACCIN
HAEMOPHILUS DUCREYI
HAEMOPHILUS

1. GENERALTES
Le genre Haemophilus appartient à la famille des pasteurellaceae, ce sont des coccobacilles
à Gram négatif, apparaissant souvent polymorphes dans les produits pathologiques,
immobiles, non sporulés, aéro-anaérobies facultatifs, exigeant pour se multiplier des facteurs
de croissance présents dans le sang
Facteurs de croissance:
 le facteur V
Le facteur V, thermolabile, est constitué par :
. soit du NAD (nicotinamide adénine dinucléotide) ou DPN (diphosphonucléotide) ou
coenzyme I,
. soit du NADP (NAD-phosphate) ou TPN (triphosphonucléotide) ou coenzyme II,
Ce sont des coenzymes des deshydrogénases qui sont présentes dans les globules rouges,
dans les tissus animaux et végétaux et chez la plupart des bactéries
 le facteur X
Le facteur X, thermostable, est constitué par l’hémine (ou hématine) qui est un composé
tétrapyrrolique contenant du fer, dérivé de l’hémoglobine et des enzymes de la chaîne
respiratoire (cytochrome, catalase, peroxydase). En présence de fer, l’hémine peut être
remplacée par la protoporphyrine

2. CLASSIFICATION

Le classement des différentes espèces d’Haemophilus repose sur les exigences en facteurs de
croissance et sur des caractères biochimiques:

Besoin Besoin en Oxydase Catalase Uréase Indole

en facteur V
facteur
X
H. influenzae + + + + (+) (+)
H. haemolyticus + + + + (+) V
H. parainfluenzae  + + V ( )
H. paraphrophilus  + +   
H. segnis  +    
H. aphrophilus +   +  
H. haemoglobinophilus +  + (+)  +
H. ducreyi +     
 3. HABITAT

Les Haemophilus font partie de la flore des muqueuses de l’homme et de nombreux

mammifères et oiseaux. On n’en trouve pas dans la nature.Chez l’homme, quatre
écosystèmes les accueillent : le pharynx, la bouche, la plaque dentaire et, à un degré
moindre, l’intestin et l’appareil urogénital.

HAEMOPHILUS INFLUENZAE

I. CARACTERES BACTERIOLOGIQUES:

1. Morphologie
H. influenzae est un coccobacille polymorphe, à Gram négatif, immobile, non sporulé,
parfois capsulé, ne se multipliant qu’en présence de facteurs X et V.

2. Caractères biochimiques
Haemophilus influenzae possède une catalase et une oxydase lente. Il fermente glucose,
maltose, ribose et xylose mais pas le lactose ni le saccharose. Des tests biochimiques
permettent de séparer 8 biotypes numérotés de I à VIII. Le biotype I est le plus fréquemment
isolé.

3. Caractères antigéniques et substances élaborées

Antigènes
Les souches capsulées possèdent un antigène polysaccharidique lié à la capsule dont il existe
six variants déterminant 6 sérovars : a, b, c, d, e, f. Le sérovar b est le plus fréquemment
rencontré.
Ces polysaccharides capsulaires, dont la structure chimique est connue, peuvent être
identifiés par des réactions immunologiques en présence d’anticorps spécifiques.
D’autres structures de surface présentes chez Haemophilus influenzae sont antigéniques et
peuvent être utiles pour des études épidémiologiques. Ainsi, les pili, porteurs d’adhésines,
les oligosaccharides du core central du LPS de la paroi et les protéines de surface
déterminent des sous-types au sein des sérovars. A noter qu’il n’existe pas de chaînes
latérales osidiques et donc pas de spécificités O chez les Haemophilus.

IgA protéases
Haemophilus influenzae produit une enzyme capable de cliver les IgA. On trouve cette
enzyme chez d’autres Haemophilus et chez d’autres bactéries (Streptococcus pneumoniae,
Neisseria meningitidis et gonorrhoeae. Sa présence amoindrit les défenses locales des
muqueuses infectées.
Facteurs de virulence
Les principaux facteurs de virulence sont: le polysaccharide capsulaire, les pili porteurs
d’adhésines et les IgA protéases.

II. POUVOIR PATHOGÈNE

Haemophilus influenzae est une bactérie pyogène responsable d’infections variées, plus
sévères chez l’enfant ou les sujets fragiles. Il convient de distinguer des infections aiguës
avec bactériémie occasionnées par des souches invasives, capsulées, (du sérovar b, biotype I
le plus souvent) et des infections aiguës ou chroniques, sans bactériémie, provoquées par des
souches non capsulées.

Chez l’enfant
Les manifestations invasives sont dues à des souches capsulées de sérotype b, biotype I.
Les méningites à H. influenzae sont très souvent précédées d’infections des voies
respiratoires supérieures ou oto-rhino-larygologiques et accompagnées d’un état
septicémique. Elles sont surtout observées chez le nourrisson âgé de 3 à 30 mois;
D'autres localisations : arthrite, otite, ostéite, ostéomyélite, cellulite, péricardite,
pneumonie…sont observées.
Les souches non capsulées, réputées non invasives, sont isolées au cours d’infections
diverses :
o otites moyennes aiguës et autres infections de la sphère oto-rhino-laryngologique,
o infections broncho-pulmonaires et conjonctivites.
Une contamination pendant l'accouchement peut être l’origine d’une infection néonatale
généralisée sévère.

Chez l’adulte
Ce sont surtout des souches non capsulées qui sont responsables d’infections chez l’adulte.
Les manifestations respiratoires sont les plus fréquentes et donnent lieu à des broncho-
pneumonies compliquant une bronchite chronique ou à des pneumonies avec parfois
bactériémie.
Les méningites à Haemophilus sont rares chez l’adulte et surviennent surtout chez les sujets
âgés.

III. PHYSIOPATHOLOGIE
Haemophilus influenzae était la cause la plus fréquente de méningite chez l’enfant entre 3 et
36 mois avant qu'on dispose du vaccin mais elle est maintenant de plus en plus rare. Il vient
au deuxième rang, après Streptococcus pneumoniae, dans l’étiologie des otites moyennes
aiguës.
C’est une bactérie exclusive de l’espèce humaine, la transmission est donc interhumaine.
Les enfants sont contaminés après l’âge de 2 mois car le portage est très fréquent dans la
population.
Ce sont surtout des souches capsulées que l’on isole chez les nourrissons qui sont démunis
d’anticorps anticapsulaires tandis que les adultes et grands enfants ont des anticorps et sont
porteurs de souches commensales non capsulées.
L’organisme ne peut pas empêcher le commensalisme des Haemophilus mais s’oppose à la
généralisation de l’infection grâce à ces anticorps anticapsulaires à effet opsonisant et au
système du complément. Les IgA sécrétoires protègent plus spécialement les muqueuses.
Les infections à Haemophilus influenzae commencent par une colonisation de la muqueuse
pharyngée ou des voies respiratoires supérieures souvent favorisée par une infection virale
intercurrente. Survient alors une extension locale avec réaction inflammatoire. Si les
défenses sont efficaces et la souche peu virulente, l’infection reste localisée, sinon les
ganglions lymphatiques sont envahis, entraînant une propagation bactériémique et
systémique.

IV. DIAGNOSTIC BACTÉRIOLOGIQUE

L’examen direct du produit pathologique est souvent évocateur grâce à la morphologie
particulière du genre.
La mise en culture :
- gélose au sang cuit ou gélose chocolat,
- milieux d’isolement contenant des antibiotiques.
- On incube ensuite à 36°C.
- Les colonies, obtenues après 24 heures, sont petites, blanc grisâtres et luisantes si la
souche est capsulée.
L’identification repose sur les exigences en facteur X et V qu’on met en évidence par
exemple par le test du satellitisme ou par culture en présence de NAD et d’hémine. On
emploie souvent des disques de papier-buvard imprégnés de substance X ou V ou X+V.
Haemophilus influenzae ne se développe qu’autour du disque X+V.
L’étude des caractères biochimiques (uréase, ornithine décarboxylase et production
d’indole) permet de reconnaître le biotype et des réactions d’agglutination sur lame en
présence de sérums spécifiques permettent de reconnaître le sérotype si la souche est
capsulée.
Un diagnostic rapide peut être obtenu grâce à la mise en évidence d’antigènes solubles
dans les humeurs du malade (LCR, sérum, urines) à l’aide d’un réactif constitué de
particules de latex recouvertes d'anticorps antipolysaccharidiques.

V. SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES

Β-lactamines :
Mécanismes de résistance
Naturellement insensible à la pénicilline G. il est également peu sensible à la plupart des
céphalosporines orales de 1ere génération, les CMI modales étant supérieures ou égales aux
concentrations sériques obtenues.
Deux molécules font exception: le cefaclor et la cefatrizine qui ont cependant des
concentrations minimales inhibitrices (CMI) relativement élevées pour H. influenzae, et qui
sont l'objet d'un effet inoculum important.
Les pénicillines A ont représenté longtemps les antibiotiques de choix des infections à H.
influenzae. Ce n'est qu'en 1972 que les premières souches sécrétrices de β-lactamases ont
été isolées, et c'est à la fin des années 70 qu'elles se sont multipliées et ont posé des
problèmes thérapeutiques.
Le mécanisme essentiel de la résistance aux β-lactamines est la sécrétion d'une β-lactamase
de type TEM I, d'origine plasmidique et codée par le transposon Tn3.
Elle est identique à celle produite par certaines entérobactéries, E.coli notamment.
Les CMI pour H. influenzae sont plus basses que celles pour E.coli producteur de la même
β-lactamase, et les inhibiteurs de β-lactamases tels que l'acide clavulanique sont plus actifs
sur H. influenzae. En effet, H. influenzae produirait moins de β-lactamase, en raison d'un
plus petit nombre de copies de plasmide; de plus, les porines de H. influenzae sont plus
perméables aux β-lactamines, laissant donc pénétrer plus d'antibiotique.
D'autres β-lactamases ont été décrites chez H. influenzae : TEM 2, ROB 1 : elles jouent un
rôle mineur.
Les céphalosporines de 3e génération orales ou parentérales, l’association amoxicilline-
acide clavulanique, et à un degré moindre le cefaclor, sont actifs sur ces souches.
Plus inquiétante est la description assez récente de souches résistantes aux β-lactamines soit
par diminution de la perméabilité, de la membrane externe, soit surtout par modification de
l'affinité des protéines de liaison à la pénicilline (PLP). Ces souches (BLANAR) entrainent
une augmentation des CMI de 4 à 8, y compris avec les céphalosporines de 3 e génération.
Mise en évidence de la résistance aux β-lactamines :
La présence de β-lactamase est révélée par différentes techniques : une céphalosporine
chromogéne, iodométrie, acidimétrie,... L'antibiogramme permet de déceler les autres
mécanismes de résistance par comparaison des diamètres d'inhibition autour des disques
d'amoxicilline-acide clavulanique et d'amoxicilline.
La mise en évidence d'une résistance liée à une modification d'affinité, des PLP requiert
l'utilisation de disques d'ampicilline faiblement chargée, ou bien le test de trèfle.

Autres antibiotiques :

Tétracyclines :
Les tétracyclines ont une place très réduite chez l'enfant car elles sont contre-indiquées
avant 8 ans, Lorsque les infections à H. influenzae sont le plus fréquentes. La tétracycline
sert de marqueur de résistance de H. influenzae. Découverte en 1970, il s'agit d'une
résistance d'origine plasmidique.

Chloramphénicol :
Cette famille d'antibiotiques est peu utilisée du fait de ses risques hématologiques mais
néanmoins elle constitue un bon marqueur de l'évolution de la résistance de H.influenzae.
Décrit depuis 1972, le mécanisme le plus fréquent est enzymatique : il s'agit d'une
chloramphénicol-acétyltransférase d'origine plasmidique.
Un même plasmide peut coder pour la résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline. Là
encore, les entérobactéries sont l'origine probable de ce plasmide.

Kanamycine :
Les aminosides ne sont pas des antibiotiques adaptés au traitement des infections
réspiratoires communautaires. Néanmoins la kanamycine est un marqueur de l'évolution de
la résistance de H.influenzae. La résistance à la kanamycine est de nature plasmidique, liée
à une inactivation par une 3'aminosidephospho-transférase de type 1. Les souches
résistantes à la kanamycine restent sensibles aux autres aminosides.

Macrolides et streptogramines :
Les macrolides commercialisés actuellement ne sont pas des antibiotiques à recommander
dans les infections à H.influenzae en particulier chez l’enfant.
En effet, bien qu'il n'y ait pas de mécanisme de résistance mis en évidence à ce jour,
l'activité in vitro est modérée, les CMI modales étant trop proches des concentrations
sériques.

Triméthoprime-suIfaméthoxazole :
L’appréciation de la résistance de H. influenzae à cet antibactérien est malaisée, les milieux
utilisés pour l'antibiogramme étant riches en 2 composants qui antagonisent l’action du
triméthoprime (TMP) : la thymidine, et du sulfamide : l'acide amino-benzolique. Pour ces
raisons le pourcentage de souches résistantes est souvent surestimé. A l’inverse une souche
qui apparait sensible sur l’antibiogramme est toujours effectivement sensible

Rifampicine :
La quasi-totalité des souches est sensible à la rifampicine, mais plusieurs rapports ont
documenté l’émergence de souches de H. influenzae résistantes à cet antibiotique donné soit
comme collyre, soit en prévention de cas secondaires de méningites à H.influenzae de
sérotype b. Le support génétique de la résistance est chromosomique.

Fluoroquinolones :
Ces molécules ont une excellente activité sur H.influenzae. il n'y a, à notre connaissance,
qu'une seule publication japonaise qui mentionne l’existence d'une souche d'H. influenzae
résistante aux quinolones. L'utilisation de cette famille d'antibiotiques se heurte cependant à
2 obstacles majeurs.
-Tout d'abord ils sont contre-indiqués chez l'enfant de moins de 15 ans, l’âge or les
infections à H. influenzae sont les plus fréquentes et les plus graves.
-Ensuite, les molécules actuellement sur le marché, sont peu actives sur le pneumocoque, ce
qui limite leur prescription dans les infections bronchopulmonaires.

L'antibiogramme est réalisé sur milieu HTM ou sur milieu MH au sang cuit;
- Disques d’Antibiotiques à tester :
ampicilline 10, amoxicilline + acide clavulanique, cefalotine, cefotaxime/ceftriaxone ,
azithromycine, tetracycline chloramphenicol cotrimoxazle, acide nalidixique, pefloxacine.

Recherche de la Pénicillinase par le test du trèfle:

Ensemencer par écouvillonnage une suspension ajustée à 0,5 MF, de Staphylococcus aureus
ATCC 25923, sur une gélose MH au sang cuit.

- Appliquer un disque d’AMPICILLINE au centre de la boîte.

- Ensemencer en stries radiales :
Une souche de S.aureus ATCC 25923; une souche de S.aureus ATCC 43300
La souche d’Haemophilus influenzae à tester
Incuber 18h à 35° sous CO2.

- Lecture :
Rechercher une image de « feuille de trèfle » formée entre la souche d’Haemophilus
influenzae , la souche de S.aureus ATCC 43300 (témoin +) et l' induction d’une
culture de la souche de S.aureus ATCC 25923 (témoin -) jusqu’au disque
d’AMPICILLINE :

- si l’image est présente, la souche d’H.influenzae est Bêtalactamase +

- si l’image est absente, la souche d’H.influenzae est Bêtalactamase –

VI. VACCIN
La détection dans le sérum d’anticorps anti-capsulaires, a incité les chercheurs à utiliser les
polysaccharides capsulaires comme vaccin. Le polyribosyl-ribitol-phosphate (PRP) qui
caractérise les souches du sérotype b s’étant montré peu immunogène (antigène T
indépendant), on l’a associé à des protéines pour produire des vaccins conjugués.
On a ainsi associé le PRP à :
o l’anatoxine diphtérique (PRP-D),
o une protéine de la membrane externe du méningocoque (PRP-OMP)
o l’anatoxine tétanique (PRP-T)
La vaccination est recommandée chez les nourrissons entre 3 et 12 mois. Elle nécessite trois
injections à un mois d’intervalle avec rappel après un an. En Algérie elle est réalisée aves
les vaccinations antidiphtérique, antitétanique, anticoquelucheuse et antipoliomyélitique.
Son utilisation permet une diminution de la fréquence des méningites à Haemophilus qui
représente la forme la plus sévère des pathologies dues à cette bactérie.

Haemophilus ducreyi
BGN groupés en chaine
Pousse qu’en présence du facteur X
Responsable d’une infection appelée chancre mou
CARACTÉRISTIQUES: Il s’agit d’un coccobacille Gram négatif anaérobie facultatif,
exigeant et non sporulé. Il mesure 1,5 µm de longueur et 0,5 µm de largeur(. Dans les exsudats,
les bactéries ont une disposition typique en chaîne de bicyclette.
H. ducreyi pousse le mieux dans des conditions microaérophiles à 33-35 °C et dans une
atmosphère humide contenant 5 % de CO2. Il existe de nombreux milieux artificiels permettant
de cultiver cette bactérie, et la croissance se fait habituellement en 24 à 48 heures. Cette bactérie
présente une coloration bipolaire.
La paroi cellulaire de H. ducreyi renferme des lipo-oligosaccharides. Habituellement, la paroi
cellulaire des bactéries Gram négatif renferme des lipopolysaccharides, mais H. ducreyi ne
contient pas d’antigène O. Les deux souches types se distinguent par la longueur de leur chaîne
saccharidique : la souche la plus courante exprime un nona saccharide et l’autre souche, un
penta saccharide.
PATHOGÉNICITÉ ET TOXICITÉ: Infection bactérienne aiguë habituellement localisée
dans la région génitale. La maladie débute par l’apparition, de 4 à 7 jours après les rapports
sexuels, d’une papule sensible (phase papulaire) entourée d’une petite zone érythémateuse. Des
lésions peuvent apparaître sur le prépuce, le frein du prépuce, le gland et l’anus chez l’homme et
sur la vulve, le col de l’utérus et la région périanale chez la femme. Par la suite, la lésion forme
une pustule (phase pustuleuse). Cette pustule se rompt après deux ou trois jours et forme un
ulcère irrégulier présentant de nombreuses projections et dépressions (phase ulcéreuse). Le
cratère peut être rempli d’un exsudat purulent jaune ou gris, et il peut saigner facilement s’il est
gratté. Selon leur siège, les ulcères peuvent être plus ou moins douloureux, et leur taille et
apparence peuvent varier. Les femmes peuvent aussi présenter des ulcères internes souvent
indolores. Des cas extragénitaux ont été décrits sur la partie intérieure des cuisses, sur les seins
et sur les doigts.
Sans traitement, l’ulcère peut devenir chronique et la guérison peut prendre jusqu’à trois mois (8).
Les complications comprennent un phimosis (chez l’homme seulement), une ulcération
phagédénique associée à une infection bactérienne secondaire, et une adénopathie unilatérale
(50 % des cas(2)). Les ganglions lymphatiques touchés peuvent devenir des bubons sensibles et
douloureux. Ces bubons peuvent se rompre spontanément et former des ulcères inguinaux.

ÉPIDÉMIOLOGIE: L’homme est plus souvent touché que la femme. La maladie survient
principalement dans les pays en développement (sa fréquence diminue en Asie du Sud-Est et en
Afrique), mais les données sont insuffisantes. Les hommes qui ne sont pas circoncis sont
légèrement plus à risque. Le chancre mou est un cofacteur de transmission du VIH, et le VIH est
un cofacteur de transmission du chancre mou. Dans les pays développés, les éclosions sont
souvent causées par des personnes qui sont revenues depuis peu d’une région où la maladie est
endémique, par des travailleurs de l’industrie du sexe et par des utilisateurs de crack ou de
cocaïne.
GAMME D’HÔTES: Dans la nature, H. ducreyi peut causer la maladie uniquement chez
l’humain(4), mais il existe des modèles animaux (p. ex. macaque, souris et porc).
MODE DE TRANSMISSION: H. ducreyi se transmet par contact direct avec les lésions
ouvertes et les exsudats des ganglions lymphatiques durant les rapports sexuels. L’auto-
inoculation de sièges non génitaux est possible.
PÉRIODE D’INCUBATION: La période d’incubation est d’environ 4 à 7 jours(4); elle est
rarement inférieure à 3 jours ou supérieure à 10 jours(2).
SENSIBILITÉ AUX MÉDICAMENTS: H. ducreyi est sensible à
l’érythromycine, à l’azithromycine, au chloramphénicol, à la norfloxacine, à
l’ofloxacine, à la péfloxacine, au ceftriaxone et à la ciprofloxacine(4, 16). La
résistance plasmidique est possible.
RÉSISTANCE AUX MÉDICAMENTS : La résistance aux antimicrobiens est
en hausse et a été observée avec l’ampicilline, d’après la production de bêta-
lactamase, la tétracycline, le sulfaméthoxazole et le triméthoprime(