Méthodes

chromatographiques
 DEFINITION

La chromatographie, méthode d'analyse

physico-chimique, sépare les constituants d'un
mélange (les solutés) par entraînement au
moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le
long d'une phase stationnaire (solide ou liquide
fixé), grâce à la (ré)partition sélective des
solutés entre ces deux phases. Chaque soluté
est donc soumis à une force de rétention
(exercée par la phase stationnaire) et une force
de mobilité (due à la phase mobile).
 Définition (suite)
• Selon la technique chromatographique
mise en jeu, la séparation des composants
entraînés par la phase mobile, résulte soit
de leur adsorption et de leur désorption
successives sur la phase stationnaire, soit
de leur solubilité différente dans chaque
phase.
 Classification
• On peut classer les méthodes
chromatographiques d'après la nature des
supports utilisés ou celle des phénomènes
mis en oeuvre dans la séparation
 Classification selon le support (phase fixe
ou mobile)

• La phase solide, la silice ou alumine traitées,

permettent la séparation des composants des
mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils
peuvent être employés:
➢ comme remplissage d'une colonne
(chromatographie par gravité et chromatographie à
haute performance ou HPLC)
➢ étalés en couche mince sur une plaque de verre,
d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique
(chromatographie sur couche mince ou CCM)
• La phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz
porteur : Chromatographie en phase gazeuse
Classification d'après la nature des
phénomènes de séparation
On distingue cinq types de phénomènes :
• chromatographie d'adsorption
• chromatographie de partage
• chromatographie ionique
• chromatographie d'exclusion
• chromatographie d'affinité
 Chromatographie d’adsorption
• Elle est illustrée par la séparation
chromatographique classique, sur colonne
remplie ou sur couche mince, des
composés moléculaires.
• Le principe de séparation est basé sur la
différence de polarité des éléments entre
les différentes phases
Ne pas confondre
 chromatographie de partage
• Elle est fondée sur la différence de solubilité des
substances à séparer dans deux fluides
parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique
en chromatographie sur papier .
• Le facteur principal qui intervient est le
coefficient de partage entre chaque phase. On
peut séparer des solutés dont les coefficients de
partage entre les deux phases sont différents
 chromatographie ionique

• La phase stationnaire est un échangeur

d'ions constitué par une résine porteuse
de groupements ionisés négativement ou
positivement, exerçant des interactions de
type électrostatique avec les solutés
ioniques du milieu
La chromatographie d'exclusion
elle est encore appelée chromatographie
d'exclusion-diffusion, tamisage
moléculaire, gel-filtration, perméation de
gel. La phase stationnaire est un solide
poreux : les grosses particules sont
exclues de la phase fixe, en revanche les
petites particules incluses diffusent dans
les pores du gel.
 La chromatographie d'affinité

• La phase stationnaire est un support

macromoléculaire chimiquement inerte,
sur lequel est greffé un effecteur qui
présente une affinité biologique (bio-
affinité) pour un soluté de l'échantillon à
analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-
récepteur, antigène-anticorps).
 Applications en Biochimie clinique:
chromatographie sur couche mince

• Définition : La chromatographie sur couche

mince (CCM) repose principalement sur des
phénomènes d'adsorption : la phase mobile est
un solvant ou un mélange de solvants, qui
progresse le long d'une phase stationnaire fixée
sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-
rigide de matière plastique ou d'aluminium. Après
que l'échantillon ait été déposé sur la phase
stationnaire, les substances migrent à une vitesse
qui dépend de leur nature et de celle du solvant.
 Applications en Biochimie clinique:
chromatographie sur couche mince
• Appareillage

✓ la cuve chromatographique : un récipient habituellement

en verre, de forme variable, fermé par un couvercle
étanche.
✓ la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm
de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur une
plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de
calcium hydraté (plâtre de Paris) l'amidon ou un polymère
organique.
✓ l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution
diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point
repère situé au-dessus de la surface de l'éluant.
✓ l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre
lentement le long de la plaque en entraînant les composants
de l'échantillon.
 Applications de la chromatographie en
Biochimie clinique
• CCM
• Séparation et révélation des acides aminés
par la ninhydrine
 Chromatographie en phase
gazeuse (CPG)
• Définition
La CPG ou CPV (chromatographie en
phase vapeur ) est une méthode d'analyse
immédiate. Elle permet de séparer les
constituants d'un mélange selon leur
partage (par solution ou adsorption ) entre
deux phases dont l'une est fixe ou
stationnaire (solide ou liquide) et l'autre
mobile et gazeuse (gaz vecteur).
 Chromatographie en phase
gazeuse (CPG) : appareillage
• L'appareil de CPV comporte un élément
essentiel la colonne. Celle ci est un tube d'acier
ou de cuivre de 1/8 pouce de diamètre et de 1à
3 m de long. La phase stationnaire y est placée
déposée en une pellicule recouvrant des micro-
billes d'un support inerte, (silice, Téflon, brique
pillée etc..).
• La phase mobile sera ici de l'hélium: bombe de
20 l sous 200 bars.
CPG : schéma
 CPG: chromatogramme
• C'est la courbe donnant la concentration des
produits sortant de la colonne (effluents) en
fonction du temps ou du volume de gaz vecteur
débité. Généralement cette courbe est une
courbe de type gaussien (pic). Le premier pic
est, uniquement avec un détecteur à
catharomètre, le pic de l'air, inévitablement
injecté avec le mélange inconnu. Il correspond
au volume de gaz de la colonne car l'air n'est
pas retenu par la phase stationnaire.
 CPG: chromatogramme
Le pic d'un composé quelconque se caractérise par:
• Le temps de rétention (tr)
• La largeur du pic à mi-hauteur, l1/2
• La hauteur, h
• L'aire, A. On l'assimile souvent à un triangle S = h . l1/2
• Le temps de rétention réduit est égal à la différence
d'abscisses entre le composé et l'air, il est directement
lié au cœfficient de partage du composé entre les
phases mobile et stationnaire.
CPG: chromatogramme
 Chromatographie Liquide Haute
Performance (HPLC)
• Principe
HPLC
 HPLC en BC
• Etudes des Hb ( fichier démo)

- Recherches des Hémoglobines anormales

- Dosage de l’Hb glyquée