TP 2 La Coloration de Gram
Transféré par
Safa BrahmiaTP 2 La Coloration de Gram
Transféré par
Safa BrahmiaDr.
Boufafa Mouna
UNIVERSITE BADJI MOKHTAR - ANNABA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
2ème ANNEE TRONC COMMUN
UNITE D’ENSEIGNEMENT FONDAMENTALE
MODULE : MICROBIOLOGIE GÉNÉRALE
TP. N°2
Examen microscopique après coloration différentielle
(La coloration de Gram)
1
Dr. Boufafa Mouna
Objectifs du TP :
Étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration. La coloration de GRAM
permet de différencier des bactéries dites Gram + de bactéries dites Gram -.
Matériel nécessaire :
Microscope optique, lame, bec de bunsen, pipette pasteur, anse de platine, huile de cèdre, ainsi que
le matériel habituel du laboratoire de Microbiologie.
Mode opératoire :
1. Préparation d’un frottis :
Les frottis doivent être étalés en couche mince et régulière, puis séchés et fixés :
1-Étalement sur lame de verre : notez la référence de l’échantillon sur une lame propres ;
2-Prélevez stérilement à l’aide d’une anse de platine une goutte de lactosérum et étalez un film
mince,
2-Séchage : le séchage est effectué à l’aire libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.
3-Fixation du frottis : consiste à tuer les bactéries et les coller sur la lame, sans altérer leur structure.
La fixation s’effectue par la chaleur.
2. Examen microscopique après coloration (Coloration différentielle)
1-Principe :
Cette coloration est une coloration complexe qui permet de différencier les bactéries d'après leur
forme et leur affinité pour les colorants.
La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à leurs différences de
nature de paroi. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en lipides, alors que
les bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.
2-Mode opératoire :
LES ÉTAPES DE LA COLORATION DE GRAM
2
Dr. Boufafa Mouna
ETAPES MODE OPERATOIRE TEMPS PRINCIPE
- Recouvrir la lame de cristal violet ou Le colorant violet pénètre dans les
COLORATION violet de gentiane cellules bactériennes
1 minute
PRIMAIRE
- Rincer à l’eau distillée
Il se forme un complexe chimique
- Recouvrir de Lugol entre le violet et le Lugol qui fixe le
MORDANÇAGE 1 minute
violet et colore le cytoplasme de
- Rincer à l’eau distillée et l’égoutter
toutes les bactéries en violet.
L'alcool dissout le violet de
gentiane, si la paroi bactérienne est
perméable à l'alcool (les lipides sont
- Tenir la lame inclinée et faire couler dissous par l’alcool), celui-ci pénètre
pendant quelques secondes de l'alcool dans les bactéries et décolore leur
5 secondes cytoplasme : les bactéries
DECOLORATION à 95° jusqu'à écoulement incolore.
environ deviennent incolores.
- Rincer immédiatement à l’eau distillée Si les bactéries ont une paroi
et égoutter imperméable à l'alcool (épaisse et
sans lipides), elles restent colorées
en violet et elles sont dites GRAM +
ou positif.
La fuschine recolore en rose les
COLORATION - Recouvrir la lame de fuschine
1 minute bactéries précédemment décolorées
SECONDAIRE - Rincer à l’eau distillée : les bactéries Gram – ou négatif.
- Egoutter entre 2 morceaux de papier-
SECHAGE
filtre et laisser sécher
- Observez les résultats de la procédure de coloration sous immersion dans l'huile. Examiner
au microscope, objectif x100.
3-Résultats :
A l’issue de cette coloration, on peut distinguer :
-Des bactéries colorées en violet foncé : elles sont dites à Gram positif ;
- Des bactéries colorées en rose : elles sont dites à Gram négatif.
3
Dr. Boufafa Mouna
4-Explication :
1-Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.
2- Le Lugol permet de fixer cette coloration interne.
3- L'alcool sert à décolorer le cytoplasme des bactéries à Gram négatif : elles ont une paroi pauvre
en peptidoglycanes (donc plus fine) qui va laisser passer l'alcool (molécule hydrophile), et qui
décolorera le cytoplasme. Pour les bactéries à Gram positif, la paroi constitue une barrière
imperméable à l'alcool car elle est composée d'une couche importante de peptidoglycanes (donc
plus épaisse). Elles resteront alors de couleur violette.
4- La recoloration à la Fushine ou la contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries à
Gram négatif décolorées une teinte rose permettant leur visualisation au microscope.
