Pr. W.
ANWAR 2021
La théorie cellulaire
- La cellule est l’unité de chaque tissu
- Tout être vivant est formé de cellules
- Une cellule est un être vivante
- Le corps humain est constitué de presque 10 13
- La durée de vie de la cellule est limitée
- les cellules se différencient en plusieurs type cellulaire
Méthodes de préparation de suspension cellulaire
* Dissociation tissulaire
* Broyage mécanique
* Méthode enzymatique
* Centrifugation et Sédimentation
Isolement cellulaire
la cellule peut être isolée de son tissu par:
dissociation tissulaire
Isolement cellulaire
la cellule peut être séparée de son milieu par:
1- Centrifugation et Sédimentation (Dans le cas de cellules sanguines )
la centrifugation permet de séparer les cellules du plasma.
Isolement cellulaire
2- Par broyage mécanique et préparation de suspension cellulaire
Le tissu est broyé à l’aide d’un Potter ou entre deux boites de Pétrie
Mortier
Potter
Isolement cellulaire
3- Soit par méthode enzymatique avec utilisation des enzymes:
- Trypsine
- Collagénose
- Lipase
La méthode enzymatique permet d’obtenir une suspension cellulaire de
viabilité supérieur à celle obtenue par la méthode mécanique
Congélation de la suspension cellulaire
à l’azote liquide
Trie cellulaire
* Les différentes catégories cellulaires peuvent être triées suivant:
- La forme
- La taille
- La granulosité
- La quantité d’ADN .
* Suivant plusieurs critères , par plusieurs méthodes ou techniques ,
exemple:
- Séparation sur gradient densité de Percole ou de saccharose
par ultracentrifugation
- Cytofluorométrie en flux
- Trie cellulaire magnétique
- Autres techniques
Gradient de densité de Pércoll
Population cellulaire hétérogène
Cellules triées d’une population homogène
la cytométrie en flux (CMF)
Elle permet le trie cellulaire . La suspension cellulaire dans un liquide passe
devant une source de laser. Chaque cellule excitée par le laser émet des signaux
lumineux qui sont analysés. La lumière émise donne des informations soit sur la
morphologie de la cellule ou sur la quantité d’ADN ou sur d’autre structures
moléculaires
Elle peut utiliser des fluorochromes associés à des anticorps qui reconnaissent
des antigènes particuliers sur la cellule
Fractionnement cellulaire
À l’aide d’une ultracentrifugeuse et suivant la vitesse de centrifugation les
cellules peuvent être séparées de leur milieu comme elle peuvent être éclatées
puis fractionnées en organites
Les méthodes d’observations
Les microscopes: sont classés selon la nature de la source utilisée
- Microscope optique (lumière) traverse la coupe.
- Microscope électronique à transmission (électrons): le
faisceau électronique traverse la coupe ultrafines de l’échantillon.
- Microscopie électronique à balayage (électrons): MEB le
faisceau électronique est réfléchi par la surface de l'échantillon.
La préparation des coupes fines
Elle se fait en plusieurs étapes :
•La fixation se fait par le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, qui
sont des aldéhydes très réactifs. Malheureusement la fixation tue
les cellules mais permet leur immobilisation et leur conservation.
•La déshydratation permet l’élimination de l’eau en la remplaçant
par des solvants de types xylène et toluène.
•L’inclusion dans de la résine, cire ou paraffine, permet une
solidification de l’échantillon. La formation des coupes semifines
est réalisée par des microtomes., celle des coupes ultrafines est
faite par des ultramicrotomes.
• La coloration des coupes se fait par différents types de
colorants ou méthodes de mise en évidence
Préparation des lames en histologie
Le microtome
Le microtome
Ruban de coupes semi-finies
Déparaffinage sur une plaque chauffante
Coloration
Bac et panier de coloration manuelle
de lames
Un automates de coloration de lames
Les colorations histochimiques les plus courantes
Le montage de la lame permet de protéger la coupe
est de conserver la coloration
Les microscopes optiques (à lumière ou
photoniques) permettent l’observation de
cellules vivantes ou mortes, grâce à des
coupes très fines de préparations fixées. Le
microscope photonique utilise des lentilles de
verre. Il contient 2 lentilles principales:
Microscope à contraste de phase
microscope à contraste de phase visualise des structures
transparentes quand leur indice de réfraction diffère de
celui de leur voisinage
Microscope à fluorescence vertical ou inversé
Dans ce type de microscope on utilise des filtres qui permettent la formation
d’une lumière monochromatique qui éclairera l’échantillon. Les microscopes
optiques à fluorescence détectent la lumière émise par la structure marqué
au fluorochrome
Microscope électronique à transmission
Le principe de fonctionnement d'un
microscope électronique ressemble un
peu à celui d'un microscope optique sauf
que: - Les photons sont remplacés par
des électrons. - Les lentilles de verre
sont remplacées par des lentilles
électromagnétiques. - La limite de
résolution du ME est plus élevée à celle
du MO. Elle est de 2 nm (c’est-à-dire
1000 fois plus élevé que le MO).
L’agrandissement du ME peut atteindre
jusqu’à 500.000 contre 2000 pou un MO.
Microscope électronique à balayage (MEB)
Le MEB permet d'observer l’objet en
trois dimensions (en pseudo 3D..). Il est
utilisé dans l’étude des surfaces des
objets massifs après leur traitement
par des substances métalliques
réfléchissantes telles que le platine,
l’argent et l’or.
Le MEB permet d'observer l’objet en trois dimensions
Microscope optique Microscope électronique
Schéma structural Photo en MO Schéma ultrastructural Photo en ME
Immunocytochimie
Des molécules des protéines ou des substances peut être détectées en utilisant:
anticorps primaire: reconnaissance de protéine sur la coupe histologique
anticorps secondaire: dirigé contre l’anticorps primaire et marqué par :
* Une radioactivité (révélé ou détecté par autoradiographie)
* Un fluorochrome (révélé ou détecté par immunofluorescence)
* Ou couplé à une enzyme révélée par immunoperoxidase)
L’immunohistochimie
Technique immuno-enzymatique
Collège Français des Pathologistes (CoPath)
L’immunofluorescence est une méthode qui consiste à
détecter et localiser une protéine à l’aide d’un anticorps
spécifique (directement couplé à un fluorochrome ou
révélé par un anticorps secondaire fluorescent)
Culture cellulaire
La culture cellulaire: c’est le maintient d’une lignée cellulaire en vie en dehors de
l’organisme (in vitro). Technique indispensable à la biologie cellulaire et moléculaire
et à la biotechnologie.
Les modèles in vitro peuvent être des bactéries, des levures, ou des cellules
d’origine animale.
Cette technique nécessite
- Un environnement favorable (parfaitement contrôlé) pour la prolifération cellulaire
en termes de température, de concentration en oxygène et en dioxyde de
carbone.
- un milieu de culture fournissant les éléments nécessaires à la croissance des
cellules (le sérum de veau fœtal (SVF)+antibiotiques+ facteurs de croissance)
- Des locaux (des chambres et des hottes à flux stériles)
- Du matériel stérile (boites Petrie, flacons, bouteille, boites à puits, pipettes, gants,
étuve, congélateur,, autoclave).
Le tapis cellulaire après culture cellulaire
Congélation cellulaire à l’azote liquide
Le tapis cellulaire
Cellules cancéreuses en culture
Un tapis cellulaire après une culture primaire
Des locaux (des chambres et des hottes à flux stériles) bien équipés
Repiquage cellulaire
1) Observation de l’aspect du milieu et l’état de cellules au microscope
inversé
2) Lavage du tapis cellulaire
3) Décollement du tapis par la trypsine
4) Numération pour voir la concentration en cellules
5) Mise en culture dans de nouvelles boites ou flacons
6) Entretien des cellules tout les deux jours
Des contenants: boites Petrie, flacons, bouteilles, boites à puits
Cellules en culture observées au microscope à
contraste de phase
D’autres techniques d’étude seront vues en Biochimie
L’ELISA
Spectrométrie de masse
PCR et RT-PCR
L’électrophorèse
séquençage
HPLC
Western blot
Références
Matthieu SIMON
Khalfaoui Youness
www.mediprepa.com
Collège Français des Pathologistes (CoPath)
