Phase pré-analytique : le prélèvement

Le succès de l’examen dépend largement de cette étape.

• Choix du site : selon la localisation de l’infection (urines, sang, LCR, plaie, gorge,
etc.)
• Méthode de prélèvement : stérile, adaptée au type d’échantillon (ECBU,
coproculture, hémoculture…)
• Transport : rapide, dans des conditions appropriées (température, milieu de transport)

2. Phase analytique : examen en laboratoire

Elle comprend plusieurs techniques pour identifier le germe :

Examen direct

• Macroscopie : aspect de l’échantillon (purulent, sanglant…)

• Microscopie :
o Cytologie : présence de polynucléaires
o Coloration de Gram : classification bactérienne
• Diagnostic moléculaire : PCR, sondes, recherche d’ADN bactérien

Mise en culture

• Choix des milieux : spécifiques selon le germe suspecté

• Incubation : température, atmosphère (aérobie/anaérobie), durée
• Résultats :
o Culture positive → identification du germe (J1)
o Antibiogramme → sensibilité aux antibiotiques (J2)
o Culture négative → prolongation possible

3. Phase post-analytique : interprétation

• Identification : nom du germe, type (sérotype, biotype…)

• Antibiogramme : choix du traitement adapté
• Typage : si nécessaire pour épidémiologie ou suivi

Remarques importantes

• Le diagnostic direct (culture, PCR) est le seul de certitude.

• Le diagnostic indirect repose sur la détection d’anticorps spécifiques (sérologie).
• L’examen bactériologique peut être complété par des tests rapides (TROD), surtout en
médecine de ville.

Souhaites-tu que je t’explique plus en détail une étape spécifique, comme l’antibiogramme ou
les milieux de culture ?

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demarche de l'examen bacteriologique
Je vais effectuer une recherche approfondie sur la démarche de l'examen bactériologique, en
mettant l'accent sur les étapes clés, les techniques utilisées et les considérations importantes.
Cela inclura une explication claire et détaillée de chaque phase, de la collecte des échantillons
à l'interprétation des résultats, tout en tenant compte des meilleures pratiques et des avancées
récentes dans le domaine. Ce travail prendra un peu de temps, alors n'hésitez pas à revenir
plus tard pour consulter le rapport. Il sera sauvegardé dans cette conversation pour un accès
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Démarche de l'examen bactériologique
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Démarche de l'examen bactériologique

Rapport sur la démarche de l'examen

bactériologique
1. Introduction
L’examen bactériologique est un processus complet et structuré visant à confirmer l’étiologie
bactérienne d’une infection, identifier l’agent pathogène et guider le traitement antibiotique. Il
se décompose en trois grandes phases : pré-analytique, analytique et post-analytique. Chacune
de ces phases comporte des étapes clés où la rigueur technique et la traçabilité sont
essentielles pour garantir la fiabilité des résultats. Ce rapport détaille chaque étape du
processus, des prélèvements aux innovations récentes, en s’appuyant sur les meilleures
pratiques et la littérature scientifique.

2. Phase pré-analytique
2.1 Collecte des échantillons

La qualité du prélèvement conditionne en grande partie la validité de l’examen

bactériologique. Les sites et modalités de prélèvement varient selon la suspicion clinique
(urines, selles, sang, LCR, Expectoration, biopsie, etc.). Le prélèvement doit toujours être
réalisé avec du matériel stérile à usage unique, en respectant scrupuleusement les règles
d’asepsie pour éviter toute contamination exogène. Il convient de réaliser le prélèvement de
préférence avant toute antibiothérapie, idéalement à un moment de pics de température, et de
fournir des informations cliniques complètes (antibiothérapie, début des symptômes, contexte
épidémiologique).

2.2 Transport et conservation des échantillons

Le transport des échantillons vers le laboratoire doit se faire dans les plus brefs délais, à l’abri
de la chaleur et des contaminations, en respectant la chaîne du froid si nécessaire. Selon les
recommandations de l’OMS, les échantillons biologiques doivent être emballés selon le triple
emballage (contenants primaires étanches, emballage secondaire hermétique, emballage
extérieur rigide) et étiquetés du numéro UN approprié pour le transport des matières
biologiques de catégorie B (UN 3373). Dans le cas d’échantillons sensibles (LCR,
hémocultures), l’idéal est un acheminement sous 4 °C et un délai d’analyse inférieur à deux
heures pour préserver la viabilité bactérienne. En cas d’impossibilité, l’utilisation de milieux
de transport spécifiques (Stuart, Cary-Blair, Amies) est recommandée pour certaines espèces
(Neisseria, Vibrio)2.

3. Examen macroscopique
L’examen macroscopique constitue la première évaluation de l’échantillon, apportant des
éléments de présomption diagnostique. On étudie la turbidité, la couleur, la consistance et
l’odeur de liquides biologiques (urines, LCR, liquide pleural/articulaire) ou de matières
fécales (diarrhée, hématochézie). Un LCR trouble ou hémorragique oriente immédiatement
vers une méningite bactérienne, tandis qu’une coloration verte et une odeur parfumée dans un
pus évoquent un germe anaérobie (Pseudomonas aeruginosa). Ces observations, bien que non
spécifiques, guident le choix des examens microscopiques et des milieux de culture à utiliser.

4. Examen microscopique et colorations

4.1 Examen à l’état frais et cytologie

L’état frais permet d’évaluer la mobilité des bactéries et le nombre de cellules

(polynucléaires) en lame humide, à l’aide de la chambre de Malassez ou en fond clair à 40×.
Le dénombrement des cellules peut orienter vers une forte présomption d’infection
(leucocyturie dans les urines, LCR purulent) et guider le choix des milieux de culture.

4.2 Colorations différentielles

4.2.1 Coloration de Gram

La coloration de Gram est la clé de voûte du diagnostic microscopique, distinguant bactéries à

Gram positif (violet) et Gram négatif (rose) selon la perméabilité à l’alcool de l’alcool-lugol-
cristal violet et fuchsine final. Elle renseigne également sur la morphologie (cocci, bacilles),
le groupement (chaînes, amas, diplocoques) et oriente l’antibiothérapie probabiliste
(Staphylococcus en amas ou diplocoques à Gram négatif en méningite).

4.2.2 Autres colorations

La coloration de Ziehl–Neelsen détecte les bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) comme

Mycobacterium tuberculosis. D’autres colorations (May–Grünwald–Giemsa pour cytologie,
blue négatif pour capsules, coloration au fond noir pour spirochètes) sont employées selon les
besoins diagnostiques et la suspicion clinique.

5. Diagnostic moléculaire direct

5.1 PCR et amplification génique
La PCR (Polymerase Chain Reaction) permet la détection rapide de séquences d’ADN ou
d’ARN bactérien/fongique, utile lorsque la culture est impossible ou lente (Chlamydia,
spirochètes, mycobactéries). Les méthodes en PCR en temps réel offrent quantification,
sensibilité accrue et limitation des faux positifs par système fermé de détection par sondes
fluorescentes. Des approches ciblées (PCR spécifique) utilisent des amorces/sondes propres à
l’espèce, tandis que la PCR à large spectre (eubactérie, 16S rRNA) explore un spectre plus
large, souvent pour orienter un syndrome infectieux d’origine bactérienne indéterminée.

5.2 Sondes et tests rapides

Les tests immuno-enzymatiques (ELISA, TRID, agglutination) détectent des antigènes

bactériens (Legionella, pneumocoque) en quelques dizaines de minutes et complètent la PCR
pour accélérer la prise en charge dans les infections graves (méningites, sepsis sévères). Les
TROD (tests rapides d’orientation diagnostique) ciblant Streptococcus pyogenes en angine
illustrent l’apport des tests antigéniques rapides, distincts de l’examen bactériologique
classique.

6. Culture bactérienne : milieux et incubation

6.1 Types de milieux de culture

Catégorie Milieu Usage principal

Gélose Nutrient, Tryptic
Milieu de base Multipurpose pour germes non exigeants
Soy Agar (TSA)
Drigalski, Chapman, Isolation d’entérobactéries,
Milieu sélectif
MacConkey, Cetrimide staphylocoques, Pseudomonas
Milieu Flacon hémoculture, Détection faible quantité de germes (sang,
d’enrichissement bouillon cœur-cerveau liquides de ponction)
Gélose au sang, Müller- Mise en évidence de propriétés
Milieu différentiel
Hinton, XLD, BCP (hémolyse, fermentation du lactose)
Identification rapide et directe de certains
Milieu chromogène ChromID, UriSelect
germes

Ces milieux peuvent être définis (composition chimique connue) ou complexes (peptones,
extraits de viande/levure) selon les exigences nutritives des microorganismes.

6.2 Conditions d’incubation

L’incubation se fait à des températures optimales selon le germe :

• 35–37 °C en aérobiose pour la majorité des bactéries;

• 35–37 °C + 5–10 % CO₂ pour streptocoques, Haemophilus, Listeria;
• 42 °C pour Pseudomonas aeruginosa sélective;
• 3–5 jours (ou plus) pour mycobactéries, anaérobies stricts. La durée varie de 18 h à
plusieurs semaines, avec lecture quotidienne des cultures et prolongation en cas de
suspicion clinique forte.
7. Identification biochimique et automatisée
7.1 Tests manuels biochimiques

Les galeries API® (Analytical Profile Index) miniaturisent 20 à 50 tests biochimiques en

alvéoles déshydratées (API 20E pour entérobactéries, API Staph, API Candida, etc.). Après
réhydratation par suspension bactérienne calibrée (0,5 McFarland), incubation 18–24 h et
ajout de réactifs (TDA, IND, VP), la lecture des profils colorimétriques génère un code
d’identification via les tableaux API ou logiciels APIweb™.

7.2 Automates et spectrométrie de masse

Des automates (VITEK®, WalkAway®, Phoenix™) combinent tests biochimiques et AST,

réduisant les délais de 24 h. La spectrométrie de masse MALDI-TOF révolutionne
l’identification en produisant un spectre de masse des protéines ribosomales uniques à chaque
espèce, avec des résultats en 1–2 min par analyse après dépôt direct de la colonie sur la cible.
Les performances dépassent 96 % d’accord avec les méthodes classiques et le coût par
échantillon est inférieur à 0,5 €6.

8. Antibiogramme et sensibilité aux antibiotiques

8.1 Méthode de diffusion en gélose (Kirby–Bauer)

La technique la plus courante repose sur la diffusion d’antibiotiques depuis des disques
appliqués sur une gélose Mueller–Hinton (4 mm d’épaisseur) pré-inoculée par écouvillonnage
uniforme d'une suspension calibrée à 0,5 McFarland (10⁸ UFC/mL). Après incubation 16–24
h, le diamètre des zones d’inhibition mesuré en millimètres est comparé aux critères
CLSI/EUCAST pour qualifier sensible (S), intermédiaire (I) ou résistant (R) du germe à
chaque antibiotique.

8.2 Méthodes de dilution et Etest

La microdilution en bouillon permet de déterminer la concentration minimale inhibitrice

(CMI) en milieu liquide, tandis que la méthode Etest repose sur une bandelette contiguë de
concentration d’antibiotique sur gélose, fournissant un gradient et la CMI en un point précis
sur la bandelette. Ces méthodes sont essentielles dans l’évaluation quantitative de la
sensibilité et complètent la diffusion standard.

Méthode Type Délai Donnée obtenue Coût relatif

Diffusion (disques) Qualitative 16–24 h Zone Ø (S/I/R) Faible
Microdilution bouillon Quantitative 18–24 h CMI (mg/L) Moyen
Etest Gradient sur gelose 18–24 h CMI (mg/L) Moyen/élevé

9. Séquençage et nouvelles méthodes NGS

Le séquençage de Sanger a été progressivement supplanté par les NGS (Illumina, PacBio
SMRT, Oxford Nanopore), offrant des lectures courtes ou longues à haut débit. L’approche
métagénomique shotgun permet l’identification simultanée de toutes les espèces présentes
dans un échantillon, sans culture, et la détection de gènes de résistance ou de virulence par
comparaison aux bases de référence (EMBL, NCBI). Les données massives nécessitent des
outils bioinformatiques pour l’assemblage, l’annotation et l’analyse phylogénétique. Ces
technologies sont essentielles pour le suivi épidémiologique et la traçabilité fine des foyers
d’infection.

10. Sécurité biologique et gestion des déchets

10.1 Biosécurité en laboratoire

Les laboratoires de niveau BSL-2 (prélèvements cliniques, cultures bactériennes fréquentes)

imposent des précautions standard (tabliers, gants, lunettes, lavages de mains, désinfection
des surfaces). Des enquêtes sur incidents sont menées selon les guides OMS et CDC pour
limiter les contaminations et infections professionnelles. Les manipulations à risques
aérosolisants (centrifugeuse, vortex, lames ouvertes) doivent se faire en ESB (Classe I ou II
selon l’agent) avec filtres HEPA.

10.2 Gestion des déchets

Les déchets infectieux (culture, lames, pipettes, gants) sont collectés en sacs ou cartons
fermés, autoclavés ou incinérés. Les aiguilles et autres objets pointus sont jetés dans des box
rigidifiées selon la norme AFNOR. Les matières biologiques liquides sont neutralisées (1 %
hypochlorite) puis déversées après décontamination. Des indicateurs physiques et biologiques
validant l’autoclave sont utilisés systématiquement.

11. Assurance qualité et normes

11.1 ISO 15189

La norme ISO 15189:2022 spécifie les exigences de qualité et de compétence des

laboratoires médicaux, incluant la phase pré-analytique, analytique et post-analytique. Elle
impose l’implication de la direction, le management des risques, la validation et la
vérification des méthodes, et l’évaluation de la performance. L’accréditation par le COFRAC
en France ou des organismes équivalents certifie la conformité à ces normes internationales.

11.2 Contrôles internes, audits et indicateurs

Le programme d’assurance qualité comprend :

• Contrôles externes (équipes de références, UPT);

• Contrôles internes (blancs, témoins positifs, fréquences régulières);
• Audits périodiques (organisationnels, méthodologiques);
• Indicateurs clés (taux de retraits, délais TAT, % de contaminations).

12. Gestion des données et logiciel LIS

Les Laboratory Information Systems (LIS) centralisent la prescription, l’enregistrement
des prélèvements, l’intégration des automates (via HL-7, RS-232, LIMS), la saisie et
validation des résultats, l’émission d’antibiogrammes et de rapports. Ils offrent traçabilité,
sécurité des données, et génération de statistiques (aspects épidémiologiques, antibiotiques
résistances)12. Les solutions SaaS permettent un déploiement cloud sécurisé et une mise à
jour continue.

13. Avancées récentes et innovations

• Diagnostic direct dans les urines et hémocultures positives par MALDI-TOF et PCR
pour identifier pathogènes en <6 h.
• Nanopore sequencing pour lectures longues et assemblages rapides au chevet du
patient.
• IA et deep learning pour interprétation automatisée de spectres MALDI-TOF et de
profils NGS.
• Biosenseurs microfluidiques couplés à qPCR pour diagnostics en temps réel.

Cette démarche exhaustive, encadrée par les standards internationaux et enrichie par les
innovations, garantit au clinicien un diagnostic bactériologique rapide, précis et fiable,
condition indispensable à une prise en charge optimale des patients.