Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

Ministère de l’Enseignement Supérieur REPUBLIQUE DU MALI

Et de la Recherche Scientifique Un Peuple- Un But- Une Foi

Année Universitaire 2019 – 2020 Nº _____/

Identification et antifongigramme des levures isolées

au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

Présentée et soutenue publiquement le 16 /12/19

Devant la Faculté de Pharmacie
Par M. Jacques ARAMA
Pour Obtenir le Grade de Docteur en Pharmacie
(DIPLOME D’ETAT)

JURY

PRESIDENT : Pr Flabou BOUGOUDOGO

MEMBRES : Dr Mariam SOUMARE
Dr Souleymane DAMA
CO-DIRECTEUR : Dr Ibrehima GUINDO
DIRECTRICE : Pr DOUMBO Safiatou NIARE

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 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

LISTE DES ENSEIGNANTS DE LA FACULTE DE PHARMACIE

FACULTE DE PHARMACIE
ANNEE UNIVERSITAIRE 2018-2019
ADMINISTRATION
DOYEN : M. Boubacar TRAORE - Professeur
VICE-DOYEN : M. Ababacar I. MAIGA - Professeur
SECRETAIRE PRINCIPAL : M. Seydou COULIBALY Administrateur civil
AGENT COMPTABLE : M. Famalé DIONSAN, inspecteur des finances
PROFESSEURS HONORAIRES
M. Boubacar Sidiki CISSE Toxicologie
M. Mahamadou CISSE Biologie
M. Daouda DIALLO Chimie générale & minérale
M. Souleymane DIALLO Bactériologie- Virologie
M. Kaourou DOUCOURE Physiologie
M. Ousmane DOUMBIA Chimie thérapeutique
M. Boulkassoum HAIDARA Législation
M. Moussa HARAMA Chimie organique (décédé)
M. Gaoussou KANOUTE Chimie analytique
M. Alou A KEITA Galénique
M. Mamadou KONE Physiologie
M. Mamadou KOUMARE Pharmacognosie
M. Brehima KOUMARE Bacteriologie/Virologie
M. Abdourahamane S. MAIGA Parasitologie
M. Elimane MARIKO Pharmacologie
DER DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET MEDICALES
1. PROFESSEURS/DIRECTEUR DE RECHERCHE
M. Mounirou BABY Hématologie
M. Bakary M. CISSE Biochimie
M. Abdoulaye DABO Biologie/parasitologie
M. Mahamadou DIAKITE Immunologie-Génétique
M. Alassane DICKO Santé Publique
M. Amagana DOLO Parasitologie-Mycologie
M. Akory Ag IKNANE Santé Publique/Nutrition
M. Ousmane KOITA Biologie-Moléculaire
M. Boubacar TRAORE Parasitologie-Mycologie
2. MAITRES DE CONFERENCES/MAITRE DE RECHERCHE
M. Flabou BOUGOUDOGO Bactériologie-Virologie
M. Abdoulaye DJIMDE Parasitologie-Mycologie
M. Aldjouma GUINDO Hématologie
M. Bourèma KOURIBA Immunologie Chef de DER
M. Ousmane TOURE Santé Publique/Santé environnement
3. MAITRES ASSISTANTS/CHARGE DE RECHERCHE
M. Mohamed AG BARAIKA Bactériologie-virologie
M. Charles ARAMA Immunologie
M. Boubacar Tiétiè BISSAN Biologie clinique
M. Djibril Mamadou COULIBALY Biochimie clinique
M. Seydou Sassou COULIBALY Biochimie clinique
M. Antoine DARA Biologie Moléculaire
M. Souleymane DAMA Parasitologie-Mycologie

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Mme Djénéba Koumba DABITAO Biologie moléculaire

M. Laurent DEMBELE Biotechnologie Microbienne
M. Klétigui Casimir DEMBELE Biochimie Clinique
M. Seydina S. A. DIAKITE Immunologie
[Link] GOITA Biochimie clinique
M. Ibrehima GUINDO Bactériologie virologie
Mme Aminatou KONE Biologie moléculaire
M. Kassoum KAENTAO Santé Publique/Bio statistiques
M. Birama Apho LY Santé publique
Mme. Dinkorma OUOLOGUEM Biologie Cellulaire
M. Issaka SAGARA Santé Publique/Bio statistiques
M. Samba Adama SANGARE Bactériologie
Mme Fanta SANGHO Santé Publique/Santé communautaire
M. Mahamadou Soumana SISSOKO Santé Publique/Bio statistiques
4. ASSISTANTS/ATTACHE DE RECHERCHE
Mme Djénéba COULIBALY Nutrition/Diététique
M. Issa DIARRA Immunologie
M. Mamadou Lamine DIARRA Botanique-Biologie végétale
Mme Fatou DIAWARA Epidémiologie
Mme Merepen dit Agnes GUINDO Immunologie
M. Oumar GUINDO Epidémiologie
M. Falaye KEITA Santé publique/Santé environnement
Mme.N’Deye Lallah Nina KOITA Nutrition
M. yacouba MAIGA Bio statistique
M. Amadou Birama NIANGALY Parasitologie-Mycologie
M. Oumar SANGHO Epidémiologie
M. Djakaridia TRAORE Hématologie
DER DES SCIENCES PHARMACEUTIQUES
1. PROFESSEURS/ DIRECTEUR DE RECHERCHE
M. Drissa DIALLO Pharmacognosie
M. Saibou MAIGA Législation
Mme Rokia SANOGO Pharmacognosie Chef de DER
2. MAITRE DE CONFERENCES/ MAITRE DE RECHERCHE
Néant - -
3. MAITRES ASSISTANTS/ CHARGE DE RECHERCHE
M. Loséni BENGALY Pharmacie Hospitalière
M. Bakary Moussa CISSE Galénique
M. Yaya COULIBALY Législation
M. Issa COULIBALY Gestion
M. Balla Fatogoma COULIBALY Pharmacie hospitalière
M. Hamma Boubacar MAIGA Galénique
M. Moussa SANOGO Gestion
Mme Adiaratou TOGOLA Pharmacognosie
4. ASSISTANTS/ ATTACHE DE RECHERCHE
M. Seydou Lahaye COULIBALY Gestion pharmaceutique
M. Antoine DARA Sciences pharmaceutiques
M. Daouda Lassine DEMBELE Pharmacognosie
M. Adama DENOU Pharmacognosie
M. Sekou DOUMBIA Pharmacognosie
M. Mahamane HAIDARA Pharmacognosie

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Mme. Assitan KALOGA Législation

M. Ahmed MAIGA Législation
Mme. Aichata Ben Adam MARIKO Galénique
M. Aboubacar SANGHO Législation
M. Bourama TRAORE Législation
M. Karim TRAORE Sciences pharmaceutiques
M. Sylvestre TRAORE Gestion pharmaceutique
Mme. Aminata Tiéba TRAORE Pharmacie hospitalière
M. Mohamed dit Sarmoye TRAORE Pharmacie hospitalière
DER DES SCIENCES DU MEDICAMENT
1. PROFESSEURS / DIRECTEUR DE RECHERCHE
M. Benoît Yaranga KOUMARE Chimie Analytique
M. Ababacar I. MAIGA Toxicologie
2. MAITRES DE CONFERENCES/ MAITRE DE RECHERCHE
M. Sékou BAH Pharmacologie Chef de DER
3. MAITRES ASSISTANTS/ CHARGE DE RECHERCHE
M. Dominique Patomo ARAMA Pharmacie chimique
M. Mody CISSE Chimie thérapeutique
M. Ousmane DEMBELE Chimie thérapeutique
M. Tidiane DIALLO Toxicologie
M. Hamadoun Abba TOURE Bromatologie
4. ASSISTANTS/ ATTACHE DE RECHERCHE
M. Mahamadou BALLO Pharmacologie
M. Dalaye Bernadette COULIBALY Chimie analytique
M. Blaise DACKOUO Chimie Analytique
Mme. Fatoumata DAOU Pharmacologie
M. Ousmane DEMBELE Chimie thérapeutique
M. Abdourahamane DIARA Toxicologie
M. Aiguerou dit Abdoulaye GUINDO Pharmacologie
M. Madani MARIKO Chimie Analytique
M. Mohamed El Béchir NACO Chimie Analytique
M. Mahamadou TANDIA Chimie Analytique
M. Dougoutigui TANGARA Chimie Analytique
DER SCIENCES FONDAMENTALES
1. PROFESSEURS / DIRECTEUR DE RECHERCHE
M. Mouctar DIALLO Biologie/ Chef de DER
M. Cheik F. TRAORE Biologie/Entomologie
M. Mahamadou TRAORE Génétique
2. MAITRES DE CONFERENCES/ MAITRE DE RECHERCHE
M. Lassana DOUMBIA Chimie appliquée
3. MAITRES ASSISTANTS/ CHARGE DE RECHERCHE
M. Abdoulaye KANTE Anatomie
M. Boureima KELLY Physiologie médicale
4. ASSISTANTS/ ATTACHE DE RECHERCHE
M. Seydou Simbo DIAKITE Chimie organique
M. Modibo DIALLO Génétique
M. Moussa KONE Chimie Organique
M. Massiriba KONE Biologie Entomologie
CHARGES DE COURS (VACATAIRES)
M. Cheik Oumar BAGAYOKO Informatique

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M. Babou BAH Anatomie

M. Abdourahamane COULIBALY Anthropologie médicale
M. Souleymane COULIBALY Psychologie
M. Bouba DIARRA Bactériologie
M. Modibo DIARRA Nutrition
M. Moussa I DIARRA Biophysique
M. Babacar DIOP Chimie
M. Atimé DJIMDE Bromatologie
M. Yaya KANE Galénique
M. Boubacar KANTE Galénique
M. Aboubacary MAIGA Chimie organique
M. Massambou SACKO SCMP/SIM
M. Modibo SANGARE Anglais
M. Sidi Boula SISSOKO Histologie-embryologie
Mme. Fatoumata SOKONA Hygiène du milieu
M. Fana TANGARA Maths
M. Abdel Kader TRAORE Pathologie médicales
Mme. Djénébou TRAORE Sémiologie et Pathologie médicale
M. Boubacar ZIBEÏROU Physique

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DICACES ET
REMERCIEMENTS

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DEDICACES

A mes parents : Daniel ARAMA & Loïse GUINDO

Je ne pourrai jamais assez-vous dire merci pour les conseils, le soutien, les encouragements et
pour les prières qui m’ont accompagné tout au long de mes études. Ce travail est le fruit de
tous vos sacrifices, vous vous êtes toujours sacrifiés pour le bien être de vos enfants. Que
notre seigneur Jésus Christ vous donne une très bonne santé, une longue vie et vous comble
de bonheur, demeures bénie.

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REMERCIEMENTS

A Dieu le tout puissant :

L’Eternel est mon berger, je ne manquerai de rien. Il me fait reposer dans de verts pâturages.
Il me dirige près des eaux paisibles. Il restaure mon âme, il me conduit dans les sentiers de la
justice, à cause de son nom. Quand je marche dans la vallée de l’ombre, de la mort, je ne
crains aucun mal, car tu es avec moi. Ta houlette et ton bâton me rassurent. Tu dresses devant
moi une table. En face de mes adversaires ; tu oins d’huile ma tête. Et ma coupe déborde.
Oui, le bonheur et la grâce m’accompagneront tous les jours de ma vie. Et je reviendrai dans
la maison de l’Eternel pour la durée de mes jours

Psaume 23

Seigneur Jésus « l’Agneau immolé »:

Merci d’avoir me donné l’assurance de mon salut. Tu es le chemin, la vérité, et la vie …

jean14 :6

Tu es le secret de ma réussite, que toute la gloire et l’honneur te reviennent.

A mes frères et sœurs : Benjamin, Abraham, Nema, Rachel et Ester

Ce travail est aussi le vôtre car sans votre soutien, vos encouragements et vos conseils il
n’aurait pas vu le jour

A mes tantes et oncles : pour vos conseils et encouragements. Soyez assurés de mon profond
respect et de mon affection pour vous toutes et tous

En particulier à mon oncle Joseph ARAMA : Ce travail est plus que jamais le vôtre.

Que ce travail, fruit de tes efforts soit le témoignage de ma très grande reconnaissance et de
ma profonde affection.

A mes cousins et cousines : veillez recevoir mes remerciements les plus respectueuses de
m’avoir accompagné durant ce long cycle.

A la famille Arama Paul et à la famille Tessougué Elie :

Merci pour votre fraternité

A mes neveux et nièces : Recevez mes remerciements

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A ma fiancée Jokebeth POUDIOUGO : merci pour ta patience et la prière

Mes ami(e)s de lutte : Oumar DAMANGO, Mme Diallo Tinimba SOUNTOURA, Mme
SANGARE Hawa TRAORE, Mamoudou SANGARE, Zoumana DEMBELE, Danielle, Yaya
TOGO

A LA PROMOTION Albert Yéminingué DEMBELE

« Soyons prêts à réussir tous ensemble », merci. Je nous souhaite à tous beaucoup de
satisfaction dans l’exercice de notre profession.

A mes cadets : je vous exhorte à plus de courage et de persévérance dans le travail.

Campus pour Christ national : vous m’avez enseigné la valeur morale et spirituelle merci
infiniment

Campus pour Christ FMOS /FAPH : tu as été une famille pour moi et une source de
bénédiction qui m’a permis de rester dans la foi en JESUS CHRIST.

A mes familles Campus pour Christ : KEITA, SOGOBA, TANGARA, FANE,

N DIAYE, COULIBALY, KAMATE. . .

Merci pour vos enseignements, prières orientation

GBEEM : Également une famille qui m’a permis à développer ma vie spirituelle et de
partager ma foi avec d’autre.

ASPC MALI : Famille exceptionnelle qui gorge plein de talent et de leadership, c’est un
plaisir pour moi d’être membre fondateur de cette ASSOCIATION.

Les grand frères et collègues de l’ASPC : Dr KAMATE, Dr DAOU, Dr GUINDO Gédéon,

Dr KANAMBAYE, Dr DIARRA, Dr GUINDO Paul ; Dr Merveille ; Amos ; Roméo ; Éric ;
et tous les jeunes frères recevez mes sincères remerciements.

A mes camarades thésards de l’INSP : merci pour tous les moments passés ensemble.
Bonne chance pour l’avenir !

A mes aînés du service de l’INSP : merci pour tout le soutien que vous m’avez apporté. Que
Dieu vous accorde une longue et riche carrière médicale
Au personnel de l’INSP : merci pour tous les moments passés ensemble. Vous avez été et
resterez une famille pour moi.

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Mes Maitres du premier et deuxième cycle et lycée :

Merci pour votre formation de base, trouvez ici mes sentiments les plus profonds

A corps professoral de la FMOS/FAPH :

Je vous dis tout simplement merci et grand merci pour votre formation de qualité

La famille Camara à Sévaré :

Merci pour votre hospitalité sans faillite pendant que j’étais au lycée

La famille Tomon FMOS /FAPH : je remercie les ainés pour cette initiative de famille et
leur soutien sans faillite, j’exhorte les cadets de continuer dans le même sens.

Dr TRAORE Amidou :

Merci pour vos soutiens matériels financier et moral. C’est le moment de vous dire merci
infiniment.

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HOMMAGE AUX
MEMBRES DU JURY

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HOMMAGE AUX

MEMBRES DU JURY

A notre Maître et président du jury :

Pr Flabou BOUGOUDOGO PharmD ; PhD

 Professeur Agrégé en bactériologie et virologie à la faculté de Pharmacie ;

 Responsable de l’enseignement de la bactériologie et de la virologie à la faculté de
Pharmacie,
 Directeur de l’INRSP de 2002 à 2012,

 Officier de l’Ordre du mérite de la santé

Honorable maître,

Que dire d’un grand maître qui, de par ses qualités humaines particulières épargne de
l’orphelinat tout étudiant de la FAPH. Vos qualités humaines, scientifiques, votre rigueur dans
le travail et surtout votre sens élevé de la responsabilité font de vous un maître respectable et
admiré. Nous sommes très fiers d’être compté parmi vos disciples. Soyez rassurer honorable
maître de notre sincère reconnaissance

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A notre Maître et juge :

Dr Souleymane DAMA PharmD ; PhD

 Docteur en pharmacie
 Titulaire d’un PhD en parasitologie ISFRA/USTTB
 Titulaire d’un Master en Pharmacologie à la Faculté de Pharmacie
 Maître assistant /chargé de recherche

Cher maître
Nous sommes très touchés par l’honneur que vous nous faites en acceptant de juger ce travail
malgré vos multiples occupations.
Vos observations ont contribué à améliorer la qualité de ce travail.
Homme aux multiples qualités scientifiques et humaines, votre rigueur et votre courage font
de vous un exemple à suivre.
Recevez ici cher Maître, l’expression de notre reconnaissance et de notre profonde gratitude.

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A notre Maître et juge :

Dr Dicko Mariam SOUMARE MD

 Médecin spécialiste en Maladies Infectieuses et en Microbiologie

 Praticienne hospitalière au CHU du Point G
 Enseignante chargée de chercheur à la FMOS
 Membre de la Société Africaine de Pathologies Infectieuses (SAPI)
 Membre de la Société Malienne de Pathologies Infectieuses Et Tropicales
(SOMAPIT).

Cher maître,

Vous nous faites un grand honneur en acceptant de juger ce travail. Nous

sommes très touchés par la spontanéité avec laquelle vous avez accepté de
siéger dans ce jury. Votre sympathie fait de vous une femme remarquable.
Nous vous prions de recevoir cher maître, l’expression de notre sincère
reconnaissance

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A notre Maître et co-directeur de thèse :

Dr Brèhima GUINDO: PharmD ; DES biologie clinique

 Pharmacien microbiologiste,

 Chef de service du laboratoire Bactériologie-Virologie à l’INRSP

 Maitre-assistant de Bactériologie Virologie à la Faculté de Pharmacie

 Point focal de RAM

Cher maître,

Nous vous remercions de la confiance que vous nous avez accordée en nous proposant ce
travail. Votre encadrement précieux a contribué à l’élaboration de ce travail. Votre qualité
d’homme de science très méthodique, votre dévouement et votre sens élevé d’humanisme font
de vous un homme vertueux admiré de tous. Veuillez accepter cher maître, l’expression de
notre plus haute considération

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A notre Maître et Directrice de thèse :

MAITRE DE CONFERENCES AGREGE DOUMBO Safiatou NIARE: MD; PhD

 Maître de conférences agrégé en Parasitologie-Mycologie à la FMOS/USTTB

 Représentante du PTR-SANTE du CAMES au Mali
 Responsable du laboratoire biologique de l’unité d’immunogénétique du Malaria
Research and Training Center (MRTC)
 Chef de laboratoire de diagnostic mycologique du MRTC/Département
d’Epidémiologique des Affections Parasitaires (DEAP)
 Secrétaire générale de l’Association des Femmes Scientifiques du Mali (AFSM)

Chère maître,

Nous avons admiré vos qualités scientifiques et humaines tout au long de ce travail.

Nous avons été séduits par votre qualité d’accueil et d’encadrement.

Femme de principe, votre rigueur scientifique fait de vous un maître exemplaire et reconnu de
tous.

Votre souci du travail bien fait nous a ramené à croire en nos propres capacités.

Nous vous prions d’accepter ici l’expression de notre profond respect et de notre profonde
gratitude

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ABREVIATIONS
ABC : ATP-binding cassette
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
AMB : Amphotéricine B
C : Candida
CDR : Candida Drug Resistance
CMF : Concentration Minimale Fongicide
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice
CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques
CYP51 : Cytochrome 51
DAP : Département Administration et Personnel
DDRB : Département de Diagnostic et de Recherche Biomédicale
DEAP : Département d’Epidémiologique des Affections Parasitaires
DF : Département Formation
DMT : Département Médecine Traditionnelle
DSC : Département Santé Communautaire
EPST : d’Établissement Public à caractère Scientifique et Technologique
FKS1, FKS2 : gènes
GOF : gain of function
GPI : Glycosylphosphatidylinositol
HOG : High Osmolarity Glycerol
IFI : infection fongique invasive
MDR1 : MultiDrug Resistance 1
MFS : Facilitator Superfamily
MFS : Major Facilitator Superfamily
MRTC : Malaria Research and Training Center
NaCl : Chlorure de sodium
ODL : données de l’Observatoire des levures
PCB: Pomme de Terre Carotte –Bile

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PKC : protéine kinase C

RVVC : candidose vulvo-vaginale récurrente
SIDA : Syndrome d’Immunodéficience Acquise
SNP : Single Nucléotide Polymorphisme
TAC1 : Transcriptional Activator of CDR gènes - C. albicans
UPC2 :
UPRT : l’Uridine Phosphoribosyl-Transférase
USI : unité de soins intensifs
VIH : Virus de l'Immunodéficience Humaine

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TABLE DE MATIERE
Liste des
tableaux……………………………………………………………………………………………………………………………….22
Liste des
figures………………………………………………………………………………………………………………………………….23
I
INTRODUCTION………………………………………………………………………………………………………………………………..24
II
OBJECTIFS……………………………………………………………………………………………………………………….……………….25
1 Objectif
général……………………………………………………………………………………………………………………..25
2 Objectifs
spécifiques………………………………………………………………………………………………………………25
III
GENERALITES………………………………………………………………………………………………………………………………….26
1 Définition du
champignon…………………………………………………………………………………………………….26
2 Historique et classification des
champignons…………………………………………………………………………26
3 Genre Candida…………………………………………………………………………………………………………………….28
3.1 Définition d’une Candidose : .............................................................................................. 28
3.2 Taxonomie des Candida ........................................................................................................ 29
3.3 Structure et Morphologie ...................................................................................................... 30
3.4 Habitat de candida ................................................................................................................ 31
3.5 Génome ................................................................................................................................. 31
3.6 Epidémiologie ........................................................................................................................ 32
3.7 Physiopathologie ................................................................................................................... 32
3.8 Aspects cliniques ................................................................................................................... 34
3.8.1 Candidoses superficielles .............................................................................................. 34
3.8.2 Candidoses profondes ................................................................................................... 36
4 Cryptococcose …………………………………………………………………………………………………………………..37
5 Les principaux facteurs incriminés aux infections fongiques………………………………………………..38
5.1 Les facteurs intrinsèques liés à l’hôte ................................................................................... 38
5.2 Les facteurs extrinsèques et / ou iatrogènes ........................................................................ 38
6 Antifongiques……………………………………………………………………………………………………………………..38
6.1 Les azolés : ............................................................................................................................. 38

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6.1.1 Structures chimiques ..................................................................................................... 38

6.1.2 Mécanisme d’action ...................................................................................................... 39
6.1.3 Mécanismes de résistance aux azolés ........................................................................... 40
6.2 Les échinocandines................................................................................................................ 45
6.2.1 Structures moléculaires ................................................................................................. 45
6.2.2 Mécanisme d’action ...................................................................................................... 45
6.2.3 Mécanisme de résistance .............................................................................................. 46
6.3 Les polyènes : ........................................................................................................................ 48
6.3.1 Structure moléculaire .................................................................................................... 48
6.3.2 Mécanisme d’action ...................................................................................................... 48
6.3.3 Mécanisme de résistance .............................................................................................. 49
6.4 Les analogues nucléosidiques ............................................................................................... 49
6.4.1 Structure moléculaire .................................................................................................... 49
6.4.2 Mécanisme d’action ...................................................................................................... 50
6.4.3 Mécanisme de résistance .............................................................................................. 50
6.5 Les allylamines ....................................................................................................................... 50
6.6 Les morpholines .................................................................................................................... 50
IV METHODOLOGIE…………………………………………………………………………………………………………………………..52
1 Lieu et cadre d’étude………………………………………………………………………….………………………………..52
2 Population d’étude…………………………………………………………………………….………………………………..53
2.1 Critères d’incluions ................................................................................................................ 53
2.2 Critères non d’inclusions ....................................................................................................... 53
2.3 Type et période d’étude ........................................................................................................ 53
2.4 Echantillonnage ..................................................................................................................... 53
2.4.1 Collecte des données..................................................................................................... 54
3 Diagnostic Mycologique………………………………………………………………………………………….……………54
3.1 Les prélèvements biologiques ..................................................................................................... 54
Matériels de prélèvement ................................................................................................................. 55
Matériels d’identification .................................................................................................................. 55
Milieu et réactif ................................................................................................................................. 55
Boite de pétri gélose Sabouraud, NaCl 0.85% ................................................................................... 55
3.2 Examen direct .............................................................................................................................. 55
 A l’état frais ............................................................................................................................... 55
3.3 Culture ......................................................................................................................................... 55
Identification ................................................................................................................................. 56

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4 Test de blastèse :…………………………………………………………………………………………………………………………..56

5. Antifongigramme....................................................................................................................... 56
6. Analyses statistiques……………………………………………………………………………………………………………56
7. Aspects éthiques………………………………………………………………………………………………………………….56
1 Résultats globaux…………………………………………………………………………………………………………………57
2 Résultats Descriptifs…………………………………………………………………………………………………………….60
3 Résultats Analytiques………………………………………………………………………………………………..…………66
4 Profil de résistance des souches isolées aux antifongiques…………………………………………………..68
5 Sensibilité /Résistance aux
antifongiques…………………………………………………………………………….lxix
VI COMMENTAIRES
DISCUSSIONS…………………………………………………………………………………………………….lxxii
VII
CONCLUSION……………………………………………………………………………………………………………………………….lxxv
VIII
RECOMMANDATION…………………………………………………………………………………………………………………..lxxvi

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Liste des tableaux

Tableau 1: La fréquence des levures isolées par type de prélèvements .............................................. 57
Tableau 2: la résistance des souches testées aux différents antifongiques ......................................... 57
Tableau 3: Fréquence d’isolement des levures .................................................................................... 58
Tableau 4: Distribution des espèces de levures selon la nature de prélèvement ................................ 59
Tableau 5: Distribution des germes isolés à l’examen de la routine .................................................... 63
Tableau 6: Distribution des levures isolées par le VITEK2 .................................................................... 65
Tableau 7: Distribution des levures identifiées par VITEK2 selon la provenance des patients (service)
............................................................................................................................................................... 66
Tableau 8: Distribution des levures selon la nature de prélèvement .................................................. 67
Tableau 9: la résistance des fongies aux différents germes isolés ....................................................... 68
Tableau 10: Le profil de résistance de C. albicans aux antifongiques.................................................. lxix
Tableau 11: Le profil de résistance de C. dubliniensis aux antifongiques ........................................... lxix
Tableau 12: Le profil de résistance de C. glabrata aux antifongiques ................................................. lxix
Tableau 13 : Le profil de résistance de C. kefyr aux antifongiques ...................................................... lxx
Tableau 14: Le profil de résistance de C. krusei aux antifongiques ...................................................... lxx
Tableau 15: Le profil de résistance de C. lipolitica aux antifongiques .................................................. lxx
Tableau 16: Le profil de résistance de C. lusitaniea aux antifongiques ................................................ lxx
Tableau 17: Le profil de résistance de C. parasilosis aux antifongiques .............................................. lxxi
Tableau 18: Le profil de résistance de C. tropicalis aux antifongiques ................................................ lxxi

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Liste des figures

Figure 1: Classification des champignons (14, 15). ............................................................................... 28
Figure 2 :Schéma : d’une cellule de Levure ........................................................................................... 31
Figure 3 : portes d’entrées des Candida chez l’homme (25) ................................................................ 33
Figure 5 : Interaction de C. albicans avec les cellules de l’hôte et communication cellulaire dans les
vaisseaux sanguins (25). ........................................................................................................................ 34
Figure 6: Structure des antifongiques triazolée (47)............................................................................. 39
Figure 7: Voie de biosynthèse de l’ergostérol (48). .............................................................................. 40
Figure 8: Rôle de la protéine Erg3p (55). .............................................................................................. 43
Figure 9: Mécanismes de résistance aux antifongiques azolés chez Candida spp................................ 44
Figure 10: Structure des échinocandines(47). ...................................................................................... 45
Figure 11: Mécanismes de résistance aux échinocandines (C. albicans)(63). ...................................... 47
Figure 12: Mécanisme d’action des polyenes (64)................................................................................ 49
Figure 13: Cibles des différents antifongiques (68). ............................................................................. 51
Figure 14 : Répartition des patients selon la tranche d’âge ................................................................. 60
Figure 15: Répartition des patients selon le sexe ................................................................................. 60
Figure 16 : répartition des patients selon leur profession. ................................................................... 61
Figure 17 : Répartition selon la résidence des patients ........................................................................ 61
Figure 18: Répartition des patients selon la provenance des échantillons. ......................................... 62
Figure 19: Répartition des patients selon la nature de prélèvement ................................................... 62
Figure 20: Répartition des patients selon le traitement préalable réussit sur le bulletin .................... 63
Figure 21: Répartition selon le résultat du test de filamentation (ou blastèse) ................................... 64

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 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

I INTRODUCTION

Les infections fongiques systémiques restent des affections graves dont l’incidence est en
constante progression ces dix dernières années. Elles sont associées à une élévation
significative de la morbidité et de la mortalité des patients immunodéprimés. La principale
cause de cette progression réside dans l’augmentation considérable des facteurs de risques
comme l’immunosuppression (SIDA, transplantation, pathologies cancéreuses et
hématologiques), l’utilisation de cathéters vasculaires et l’administration d’antibiotiques à
large spectre (1) .

Les infections fongiques invasives sont des infections sévères associées à une lourde
mortalité. Elles sont actuellement un problème majeur de santé publique et leur incidence
augmente. Les candidémies, présence de levures du genre candida dans le sang, représentent
la quatrième cause d’infections hématogènes nosocomiales (2). Les cryptococcoses, quant à
elles, sont responsables de 600 000 décès chaque année en Afrique. L’aspergillose invasive
infecte 10% des patients transplantés de cellules souches, la mortalité de ces infections reste
élevée avec des taux de 50,15 et 40% respectivement (2).

L’augmentation de la fréquence des infections à levures durant ces trois dernières

décennies s’est également accompagnée d’une augmentation de l’incidence de certaines
espèces auparavant peu représentées (3).

Candida albicans est responsable d’infections qui, par leur gravité, se situent au premier rang
des infections fongiques (3).

Si C. albicans reste de loin l’espèce la plus fréquente, C. glabrata est devenue, selon les
études récentes et la forme clinique de l’infection, la deuxième ou troisième espèce la plus
fréquemment isolée (2).

Cependant depuis 2006, C. parapsilosis est devenue la deuxième espèce responsable de

candidémies, devançant ainsi C. glabrata (4). Selon Gallien et coll., en 2007, l’isolement de
C. parapsilosis est fortement associé à une infection du cathéter veineux (5, 6).

Malgré l’émergence des mycoses en pathologie humaine, très peu d’études se sont penchées
sur l’identification et l’antifongigramme de ces germes au Mali.

Le service bactériologie-virologie isole en routine des levures et les procédures

d’identification ne sont pas très bien élaborées ; d’où le but de ce travail est d’identifier les

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levures (germes et espèce) afin d’améliorer la qualité des résultats que nous produisons. Cela
contribuera à mettre à jour les données dans le contexte national et d’améliorer le pronostic
des mycoses.

Questions de recherche

Quelles sont les espèces de levures isolées au laboratoire de bactériologie-virologie ?

Quelle est la sensibilité de levures isolées au laboratoire de bactériologie-virologie aux

antifongiques usuels ?

OBJECTIFS

Objectif général
Evaluer la prévalence et la sensibilité des levures dans les différents prélèvements
biologiques.

Objectifs spécifiques
 Déterminer la fréquence d’isolement des levures.
 Décrire les espèces identifiées
 Identifier les espèces de levures selon la nature de prélèvement biologique
 Déterminer la sensibilité des souches isolées aux antifongiques.

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III GENERALITES

1 Définition du champignon
Un champignon est un organisme eucaryote uni ou pluricellulaire, dépourvu de pigment
assimilateur (chlorophylle) ; ce qui le distingue profondément du règne végétal.

Le champignon peut rester invisible à l'œil nu (Micromycète) sauf en cas de développement

intense formant des « colonies », c'est le cas des levures et des filamenteux sur des milieux
appropriés, tandis que d'autres sont toujours visibles (Macromycètes) en particulier par leur «
chapeau » ou « carpophore » (organe reproducteur). Qu'ils soient macromycètes ou
micromycètes, l'organisation végétative ou nutritionnelle et reproductive des champignons est
la même. Rappelons ici que la nutrition du champignon se fait par absorption et non par
phagocytose comme les composants du règne animal ou par photosynthèse comme chez les
végétaux. Les champignons, à l'opposé des animaux, sont des êtres immobiles qui
compensent ce handicap par la production d'un nombre considérable de spores (7).

2 Historique et classification des champignons

On les a longtemps assimilés au règne végétal de par leur morphologie (thalle, spores, etc.),
de par leur absence de mobilité et leur nutrition (absorption). En effet, au 18ème siècle, le
monde vivant était partagé en 2 règnes : le végétal et l’animal. Le règne végétal regroupait les
plantes et les algues, qui sont des espèces photosynthétiques, les bactéries et les champignons.
Le règne animal, quant à lui, était composé à la fois d’êtres unicellulaires, c’est-à-dire les
Protozoaires et des Métazoaires (8).

En 1866, le naturaliste et philosophe allemand Haeckel proposa d’y ajouter un troisième

règne, celui des Protistes, ce que Copeland transformera plus tard en Protoctistes pour y
regrouper la plupart des unicellulaires c’est-à-dire des bactéries, les Protozoaires, les
Myxomycètes et autres protistes fongoïdes en raison de leur similitude avec les Rhizopodes.
Les champignons et les algues sont quant à eux restés encore longtemps associés au règne
végétal (9).

C’est en 1969 que l’américain Wittaker propose un système taxinomique à 5 règles soit les
monomères (bactéries), les protistes, les végétaux, les champignons et les animaux (10).

L'identification des champignons est fondée principalement sur des critères morphologiques
liés aux modes de reproduction. Classiquement, on distingue chez les champignons, deux
types de reproduction, l'une étant appelée asexuée car la cellule fongique se divise par simple

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mitose, l'autre appelée sexuée car elle intègre un processus de fusion cytoplasmique, de
caryogamie et de méiose (7).

Quatre divisions sont différenciées selon les modalités de reproduction sexuée : les
Chytridiomycotina, les Zygomycotina, les Ascomycotina et les Basidiomycotina.

Chytridiomycotina, les Zygomycotina :

La reproduction asexuée se fait par des endospores non mobiles, dite endogène, tandis que la
reproduction sexuée consiste en la fusion directe de deux gamétocystes en une spore enkystée
ou zygospore qui donne naissance à des sporophytes par une méiose.

Ascomycotina :

La multiplication asexuée de ce phylum se fait par des conidies (haploïdes) de formes très
variées alors que la reproduction sexuée entre les gamétophytes haploïdes commence par une
fusion des cytoplasmes (plasmogamie) qui conduit à la formation de dicaryons, puis se
poursuit par une caryogamie (fusion des noyaux) et enfin par la méiose, aboutissant
finalement à la formation d'ascospores haploïdes. Ces ascospores sont produites de manière
endogène à l’intérieur d'un sac appelé asque, généralement sont octosporée (7, 11, 12).

Basidiomycotina :

Ces champignons se caractérisent par la production de spores sexuées (basidiospores),

formées par bourgeonnement à l'extrémité d'éléments allongés (basides), elles-mêmes
disposées sur un organe de fructification (basidiocarpe). Ils ont un thalle cloisonné avec
présence de « boucles » au niveau des cloisons. En outre, lorsque la reproduction sexuée n’est
pas connue, la division est appelée Deuteromycotina ou Fungi imperfectif (13).

Les classifications actuelles se basent principalement sur ces critères morphologiques liés aux
modes de reproduction (14, 15).

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Figure 1: Classification des champignons (14, 15).

* : Champignons connus par leur stade asexué, en attente de classification.

** : Actuellement les espèces issues de cette division ne sont plus classées parmi les vrais
champignons (Eufungi).

3 Genre Candida
3.1 Définition d’une Candidose :
Les infections causées par les espèces de Candida sont connues sous le nom de candidoses.
Mais il existe des noms communs décrivant des pathologies spécifiques telles que le Muguet
(ou candidose buccale). Du point de vue historique, la première est une pathologie bien
connue puisque Hippocrate, initiateur de l'observation clinique, en fait la description au 4ème
siècle avant J.C (16).
Les pathologies associées aux candidoses sont extrêmement variées puisque virtuellement
tout organe ou système du corps (sanguin, nerveux) peut être infecté. Les candidoses existent
sous deux formes: l'une superficielle (cutanée et unguéale, digestive, génito-urinaire), l'autre
disséminée ou septicémique (candidose profonde ou candidémies). La capacité de ce
champignon à adhérer au tissu hôte, à secréter des protéases et des phospholipases, à changer

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de morphologie et à moduler la défense de l’hôte constituent les déterminants majeurs de sa

pathogénicité (16).

3.2 Taxonomie des Candida

La taxonomie des champignons du genre Candida se fait comme suite (17).

Règne : Champignon
Phylum : Ascomycota
Classe : Hemiascomycètes
Ordre : Saccharomycétales
Famille : Candidaceae
Genre : Candida
Espèces : plus de 120 espèces
Les plus couramment rencontrées : Candida albicans, Candida glabrata, Candida
parapsilosis, Candida tropicalis, Candida famata.
Candida albicans
C’est l’espèce la plus fréquemment incriminée dans les infections et les colonisations à
Candida sp (18, 19). Elle est commensale du tube digestif et des muqueuses humaines. Sa
présence sur la peau est systématiquement pathogène. Cette espèce est responsable d’atteintes
cutanéo-muqueuses, d’infections profondes (pyélonéphrite, péritonite) et d’infections
hématogènes (candidémies, candidose hépatosplénique et méningite)
Candida glabrata
En deuxième position en Europe et aux Etats-Unis en terme de fréquence après C. albicans,
on retrouve cette espèce au niveau du tube digestif et des muqueuses humaines. Elle est
responsable de candidémies, d’infections du tractus urinaire et de candidoses profondes
Candida parapsilosis
C. parapsilosis est préférentiellement retrouvé sur la peau. Il est responsable d’infections
cutanées, mais aussi d’infections profondes qui peuvent être d’origine endogène ou exogène.
Le portage manuel du personnel soignant est fréquent, la transmission horizontale est donc
aisée et certaines épidémies en milieu hospitalier ont déjà été décrites.
Candida tropicalis
La neutropénie étant un facteur prédisposant de candidémies à C. tropicalis, on retrouve cette
levure principalement chez les populations de patients ayant des tumeurs solides, des
pathologies onco-hématologiques ou chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques.
Candida krusei

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Les candidémies à C. krusei sont redoutables, avec une mortalité très élevée (mortalité brute
de 80% et mortalité attribuable de 40%) (20).
Les espèces C. famata C. colliculosa, C. dubliniensis C. lusitaniae, C. kefyr ont été également
isolées.

3.3 Structure et Morphologie

Les Candida sont des champignons levuriformes dont l’appareil végétatif peut se présenter
sous des formes variées (blastospores ovales de 2 à 5 µm, filaments ou pseudofilaments) et se
multipliant par bourgeonnement. Certaines espèces ont conservé la capacité à se reproduire
par voie sexuée et à faire la méiose (par exemple Issatchenkia orientalis, Clavispora
lusitaniae). Les cellules de ces microorganismes eucaryotes ont la particularité, comme tous
les champignons, d’avoir une paroi contenant de la chitine (21). Cette dernière joue un rôle de
protection contre les attaques physico-chimiques de l’environnement et permet de résister aux
variations de la pression osmotique. Elle est composée d’éléments structuraux et d’une
matrice qui assurent une balance entre résistance et plasticité. Le composant majeur de la
paroi est le β-1,3 glucane liée covalemment à des β-1,6 glucanes et à la chitine (polymère de
N-acétylglucosamine lié en β-1,4). Ces polymères forment des microfibrilles liées par des
liaisons hydrogènes, et se situent dans les couches les plus basales de la paroi, notamment la
chitine qui est proche de la membrane plasmique. La matrice est constituée de protéines
glycosylées. L’ensemble de ces composants pariétaux est commun au règne fongique, mais
chaque espèce peut avoir des composés spécifiques et une proportion et une répartition
différente de chaque élément, ce qui peut modifier l’interaction avec les cellules de l’hôte
(21).

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Figure 2 :Schéma : d’une cellule de Levure

3.4 Habitat de candida

Les Candida sont habituellement commensaux des muqueuses et de la peau ou peuvent être
des espèces environnementales. Certaines espèces peuvent se manifester en tant que
pathogène animal (16).

3.5 Génome
Au niveau génétique, le genre Candida regroupe des levures haploïdes ou diploïdes, capables
pour certaines espèces de reproduction sexuée. Ce clade est caractérisé par une variation du
code génétique : le codon CUG est décodé en sérine plutôt qu’en leucine.

De nos jours, de nombreux génomes de Candida sont séquencés. Leurs tailles varient de 10
Mb pour (C. guilliermondii) à 15 Mb (pour Lodderomyces elongisporus) et ils contiennent
environ 6000 gènes (16).

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3.6 Epidémiologie
Malgré le développement de nouveaux moyens thérapeutiques, en particulier chez des
patients immunodéprimés (22). Les levures du genre Candida sont la cause de pathologies
graves et dont la fréquence reste constante (23). En effet, 54,3% des infections sont dues à C.
albicans, 16,4% à [Link], 14,9% à [Link], 8,2% à [Link] et 1,6% à [Link]
(24). Il faut toutefois noter que la zone géographique peut fortement influencer
l’épidémiologie de l’espèce isolée.

3.7 Physiopathologie
Les candidoses disséminées sont en nette augmentation en raison de la multiplication des
facteurs favorisant leur apparition. Ils dépendent du champignon en cause mais surtout de
l’organisme hôte. Les facteurs peuvent être locaux ou généraux. Ainsi, suite à un défaut
d’immunité de l’hôte et/ou à une rupture de l’intégrité des barrières cutanéo-muqueuses ou
respiratoire (éventuellement iatrogène), les Candida spp. pénètrent dans l’organisme, sont
disséminés par voie hématogène et peuvent provoquer des abcès à distance (Voir Figure 7
(25)). Les candidémies peuvent être d’origine endogène ou exogène (Voir Figure8). La
majorité d’entre elles se développe à partir de souches endogènes dont le patient est porteur,
comme le montrent plusieurs études qui ont utilisé le génotypage (26, 27).

L’origine de la souche responsable de candidémie est dans la majorité des cas digestive (26,
28). L’adhérence de la levure à la cellule hôte par l’intermédiaire d’adhésines constitue la
première étape de l’invasion (29). La transition morphogénétique levure-(pseudo)filament et
la sécrétion de protéases et de phospholipases permettent alors aux Candida spp. d’envahir les
tissus (30). Des phénomènes de translocation directe des Candida spp. à travers la paroi
digestive altérée ont déjà été observés (31, 32). Et peuvent également aboutir à une
dissémination hématogène. L’autre voie de dissémination des Candida spp est la violation des
barrières cutanées, respiratoires ou du tractus urinaire par cathétérisme vasculaire,
implantation de matériel médical, plaies chirurgicales, traumatismes vasculaires, brûlures. Les
chirurgies fréquemment en cause sont la chirurgie abdominale, cardiaque et les
transplantations, en particulier hépatiques (33). Selon des études, la responsabilité d’un
cathétérisme (cathéters veineux centraux, dialyse péritonéale et cathétérismes
cardiovasculaires) dans la survenue d’une candidémie a été suspectée ou prouvée dans 35 à 80
% des cas. Lorsque le cathéter est retiré et mis en culture, on retrouve la
même espèce de Candida que dans les hémocultures dans 60 à 70 % des cas (34, 35).

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Figure 3 : portes d’entrées des Candida chez l’homme (25)

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Figure 4 : Interaction de C. albicans avec les cellules de l’hôte et communication cellulaire

dans les vaisseaux sanguins (25).

3.8 Aspects cliniques

Au niveau clinique, les candidoses peuvent être classées en deux groupes : les candidoses
superficielles et les candidoses profondes.

3.8.1 Candidoses superficielles

Les candidoses superficielles sont les manifestations les plus communes et sont très variées.
Elles peuvent atteindre les surfaces épidermiques et les muqueuses telles que la cavité
buccale, le pharynx, l’œsophage, les intestins, le système urinaire, et la muqueuse vaginale
cutanée.

 Les candidoses digestives :

Ce sont les affections les plus représentées. C’est au niveau de l’intestin et de l’estomac, les
plus importants réservoirs de Candida albicans, que se multiplient les levures. Ceci entraîne
des troubles digestifs qui peuvent devenir chroniques : aigreurs, douleurs œsophagiennes,

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douleurs stomacales, diarrhées, constipation, colite intestinale. Parmi les affections digestives
on distingue :

 La candidose orale :

C’est la manifestation la plus fréquente des candidoses, concerne à la fois les sujets non
immunodéprimés et les sujets immunodéprimés, avec un caractère de gravité systématique
chez ces derniers. L’intérêt porté à cette infection s’est accru ces dernières années, car elle
constitue l’une des manifestations orales de l’infection par le VIH, mais elle peut aussi
survenir chez des patients leucémiques ou cancéreux ;

 La candidose œsophagienne :

Cliniquement, elle se traduit par une dysphagie douloureuse, un pyrosis et une sensation de
brûlure au passage des aliments. L’examen révèle des membranes blanchâtres reposant sur
une muqueuse très inflammatoire ;

 La candidose gastro-intestinale :

Elle intéresse tout l’intestin, de l’estomac au colon. Les lésions se présentent comme un
muguet intestinal avec des ulcérations. Elle se manifeste par des douleurs abdominales
atypiques, des nausées et des vomissements et de diarrhée.

 Les candidoses uro-génitales :

La vulvo-vaginite est une affection extrêmement fréquente chez la femme. En effet, on estime
qu’environ 75% des femmes en activité génitale feront un épisode de candidose vulvo-
vaginale. Les symptômes les plus évocateurs sont l’existence de leucorrhées abondantes
blanchâtres, d’aspect granuleux et d’un prurit vulvaire souvent intense. Le point de départ
d’une telle infection reposerait sur un dysfonctionnement hormonal ou immunitaire local. La
récidive de la candidose vulvo-vaginale est un phénomène assez fréquent. Le caractère
récidivant des infections candidosiques chez la femme est susceptible d’induire, lors de
traitements répétés, des phénomènes de résistance aux traitements passant par l’émergence de
souches moins sensibles.

Chez l’homme, l’atteinte génitale par Candida albicans est plus rare et correspond à une
balanite mycosique ou balanoposthite, qui débute au niveau du sillon balanopréputial, puis
s’étend au gland et au prépuce. L’homme n’est pas porteur sain de la levure au niveau génital.
Le développement de ces symptômes cliniques est plutôt secondaire à un rapport sexuel. Une

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cystite candidosique peut s’observer essentiellement chez le patient diabétique ainsi que sur
des malades porteurs d’une sonde vésicale à demeure. La lésion est localisée au niveau du
bassinet avec la formation d’une boule fongique. Elle s’accompagne d’une inflammation du
méat urinaire et d’une urétrite (36).

 Les candidoses cutanées et unguéales :

Ces candidoses des plis se manifestent par un érythème, associé à un enduit crémeux
blanchâtre, et sont souvent prurigineuses. Elles sont favorisées par l’obésité, l’humidité et la
macération, ainsi que le manque d’hygiène. On distingue classiquement deux grands types :

 L’intertrigo des grands plis et celui des petits plis :

Le premier concerne les plis inguinaux, axillaires, abdominaux, sous mammaires, inter-
fessiers. Quant au second, il concerne les plis interdigitaux palmaires, plus rarement les plis
interdigitaux plantaires. Les onyxis et périonyxis candidosiques siègent préférentiellement
aux mains. Candida albicans pénètre d’abord le bourrelet péri-unguéal et provoque un
périonyxis. L’onyxis fait habituellement suite au périonyxis. La contamination se fait le plus
souvent à partir d’un réservoir chez l’individu même.

 Les candidoses cutanéo-muqueuses chroniques :

Ces candidoses sont relativement rares et peuvent toucher des enfants dans les premières
années de leur vie. La première infection à Candida albicans est généralement bien contrôlée
par le système immunitaire de l’hôte. Cependant chez certains patients, dont le système
immunitaire est fragilisé, ces infections deviennent récidivantes. Peu à peu, les symptômes
deviennent chroniques et les défenses immunitaires trop sollicitées tolèrent désormais un
pathogène qu’elles sont incapables d’éliminer. Ces affections chroniques touchent
principalement les muqueuses buccales, les ongles et la peau (36).

3.8.2 Candidoses profondes

Les candidoses profondes, encore appelées systémiques, recouvrent les septicémies à Candida
et les affections viscérales profondes dont le point de départ est le plus souvent une
dissémination hématogène. Rares il y a quelques années, elles surviennent surtout chez des
patients hospitalisés dans les unités de soins intensifs, dans les services de réanimation
médicale ainsi que dans les unités d’oncohématologie. A ce titre, elles occupent désormais le
4ème rang des infections nosocomiales en Europe (37).

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Les septicémies à Candida albicans peuvent avoir deux origines :

Endogène : à partir d’une infection préexistante au niveau digestif (38, 39). La dissémination
se fait alors par le système porte pour atteindre des organes plus profonds, et notamment le
foie, la rate, et plus rarement les poumons (40).

Exogène : à partir d’un acte thérapeutique impliquant un traumatisme vasculaire (cathéters,

prothèses). Dans ce cas, l’origine de la levure est exogène. Elle va adhérer au cathéter, le
coloniser pour former un biofilm (41) , puis franchir la voie veineuse pour atteindre des
organes tels que la rétine de l’œil, le cœur, le foie et les reins (42-44).

La symptomatologie est aspécifique. Elle se présente habituellement comme une fièvre

persistante ne répondant pas à une antibiothérapie antibactérienne à large spectre. L’état est en
général dégradé et associé à des douleurs diffuses. Cet état peut entraîner un choc septique
conduisant à la mort du patient (36).

4 Cryptococcose
La cryptococcose est une infection fongique cosmopolite opportuniste d'évolution subaiguë
ou chronique, due à une levure capsulée : Cryptococcus neoformans. On distingue deux
variétés : Cryptococcus neoformans var. neoformans comportant les sérotypes A et D ;
Cryptococcus neoformans var. gattii correspondant aux sérotypes B et C. Ils sont associés à
ces deux variétés, deux formes sexuées classées parmi les basidiomycètes et appelées
respectivement, Filobasidiella neoformans et Filobasidiella bacillospora. D'autres espèces
sont plus rarement incriminées en pathologie humaine, ce sont Cryptococcus albidus et
Cryptococcus laurentii. La variété neoformans, est une variété cosmopolite inféodée aux
fientes d'oiseaux (pigeons) et aux chauves-souris. La contamination se fait généralement par
inhalation des poussières virulentes contenant les spores du champignon, plus rarement par
voie transcutanée lors d'un traumatisme tellurique. La variété gattii est localisée aux régions
tropicales ou subtropicales, elle n'est pas isolée du sol et sa niche écologique est surtout
constituée par les forêts d'Eucalyptus camaldulensis et E. terreticornis. Pour l'anecdote, en
Australie, ce sont les fécès de koala se nourrissant de feuilles de cet eucalyptus, qui
contiennent la variété gattii (45).

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5 Les principaux facteurs incriminés aux infections fongiques

5.1 Les facteurs intrinsèques liés à l’hôte

Ces facteurs peuvent être d’ordre :

Physiologique : Age extrême (vieillard et nouveau - né) ; Grossesse (augmentation de

presque 30% des candidoses)

Pathologique : Hémopathies malignes (surtout les leucémies) ; Diabète Endocrinopathies ;

Déficit acquis de l'immunité (Sida).

5.2 Les facteurs extrinsèques et / ou iatrogènes

Il s'agit surtout de la prise de médicaments : Anti-infectieux (antibiotiques,
antituberculeux…) ; Oestroprogestatifs ; Immunosuppresseurs ; Corticoïdes, antimitotiques

Ou autres tels que : Cathétérisme veineux ou artériels ; Sondage vésicale ou gastrique ;

Chirurgies cardiaques, pulmonaires, osseuses ; Transplantations d'organes, transfusions
sanguines ; vaccins.

La pénétration dans l'organisme se fait en général à travers les muqueuses (44) La voie
cutanée

Diagnostic biologie : voir annexe 3

6 Antifongiques
6.1 Les azolés :
6.1.1 Structures chimiques
Les antifongiques azolés sont des molécules organiques cycliques qui peuvent être divisées en
deux classes en fonction du nombre d’atomes d’azote sur le noyau azolé : les imidazolés
(noyau imidazole : deux atomes d’azote) et les triazolés (noyau triazol: trois atomes d’azote)
(Figure 6) (46).

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Figure 5: Structure des antifongiques triazolée (47).

6.1.2 Mécanisme d’action

Les antifongiques azolés agissent par liaison et inhibition de la lanostérol 14α déméthylase :
Erg11 ou CYP51, enzyme responsable de la conversion du lanostérol en ergostérol, composé
indispensable de la membrane des cellules fongiques (Figure6).

Il en résulte une altération membranaire, ainsi qu’une accumulation de stérols méthylés

toxiques pour la cellule fongique parmi lesquels le 14α méthylergosta-8,24 dien-3β,6α-diol.

Ils inhiberaient également un autre cytochrome P450 impliqué dans la biosynthèse de

l’ergostérol : Erg5. Toutefois, il s’agirait d’une cible mineure puisque située en aval de Erg11
dans cette voie biosynthétique (Figure 6) (48).

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 39

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Figure 6: Voie de biosynthèse de l’ergostérol (48).

Ces antifongiques sont fongistatiques sur Candida spp.: ils permettent d’inhiber la croissance
des levures, sans les supprimer

6.1.3 Mécanismes de résistance aux azolés

Différents mécanismes de résistance aux antifongiques azolés peuvent coexister au sein d’un
même isolat chez Candida spp. (Figure11) (49). Il s’agit principalement de :

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 40

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La diminution de la concentration intracellulaire en antifongique, la modification ou

surproduction de la cible, le contournement (by-pass) métabolique et l’altération
chromosomique.

 Diminution de la concentration intracellulaire en antifongique

Le mécanisme majeur de résistance aux antifongiques azolés chez Candida spp est la
diminution de la concentration intracellulaire en antifongique, par surproduction des
transporteurs de la superfamille ABC (ATP-binding cassette) et, dans une moindre proportion,
des transporteurs de la superfamille MFS (Major Facilitator Superfamily). Le niveau
d’expression des gènes des transporteurs de la superfamille ABC CDR1 (Candida Drug
Resistance) et CDR2 chez C. albicans, et CgCDR1, CgCDR2 et CgSNQ2 chez C. glabrata,
est régulé par les facteurs de transcription TAC1 (Transcriptional Activator of CDR gènes - C.
albicans) et CgPDR1 (C. glabrata) (35, 46). Des mutations gain de fonction ou gain of
function (GOF) ont été décrites au sein des gènes TAC1 et CgPDR1 : elles sont responsables
d’une surexpression de (Cg) CDR1, (Cg) CDR2 et dans une moindre mesure de CgSNQ2, qui
entraîne une résistance croisée aux différents antifongiques azolés (48-50) . Dix-neuf
mutations GOF ont déjà été décrites au sein de TAC1. Chez C. glabrata, les mutations GOF
du gène CgPDR1 sont plus nombreuses, et peuvent être regroupées au sein de trois régions
prédominantes ou régions hot spot (48, 51). Chez C. albicans, la surexpression du gène codant
pour le transporteur MDR1 (MultiDrug Resistance 1) de la superfamille MFS est associée à
une résistance au fluconazole uniquement. Le niveau d’expression de ce transporteur est
régulé par le facteur de transcription MRR1, pour lequel 14 mutations GOF ont été
caractérisées (46, 48). Chez C. glabrata, un homologue de MDR1, CgFLR1, est contrôlé par
le facteur de transcription YAP1. Cependant, l’implication de ces gènes dans la résistance de
C. glabrata aux antifongiques azolés n’a pas été démontrée.

 Modification de la cible

Des mutations du gène ERG11, codant pour l’enzyme cible des azolés, la lanostérol 14α
déméthylase, sont également à l’origine de résistance aux azolés chez Candida spp. Plus
d’une centaine de SNP ont été décrits au sein du gène ERG11 chez C. albicans. La plupart de
ces mutations sont localisées au sein de 3 régions hot spot : acides aminés 105-165, 266-287
et 405-488. Toutefois, l’implication de ces mutations dans la résistance aux azolés n’a été

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 41

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démontrée que pour un faible nombre d’entre elles. En effet, la contribution individuelle de
chaque mutation à la résistance est difficile à évaluer, car d’une part plusieurs mutations sont
souvent associées au sein d’un même allèle, et d’autre part différents mécanismes de
résistance sont souvent combinés chez C. albicans (48, 52).

 Surproduction de la cible

Le niveau d’expression du gène ERG11 est régulé par le facteur de transcription UPC2 chez
C. albicans. Une dizaine de mutations GOF de UPC2 induisant une surexpression de ERG11
et une diminution de la sensibilité de C. albicans au fluconazole ont été décrites à ce jour (48,
53).

Cependant, la surexpression de ERG11 reste modérée (d’un facteur 3 à 5) et ne semble avoir

qu’un effet modeste dans la résistance aux azolés (48, 53).

 Contournement métabolique

Des mutations au sein du gène ERG3, codant pour le stérol Δ 5,6-désaturase, autre enzyme de
la voie de biosynthèse de l’ergostérol ont également été associées à une résistance croisée aux
différents azolés chez C. albicans. Ces mutations permettent de protéger la cellule fongique
par accumulation de 14α méthylfecostérol (dérivé non toxique dont la biosynthèse fait
intervenir Erg3p), au lieu du produit toxique 14α-méthylergosta-8,24-dien-3β,6α-diol
résultant de l’inhibition de Erg11 par les antifongiques azolés (Figure11 ) (54).

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Figure 7: Rôle de la protéine Erg3p (55).

 Altérations chromosomiques
Des altérations chromosomiques peuvent entrainer une augmentation du nombre de copies des
gènes impliqués dans la résistance aux azolés :

- Formation d’isochromosome

La formation d’un isochromosome i5L chez C. albicans (correspondant au bras

gauche du chromosome 5) permet d’augmenter le nombre de copies des 2 gènes TAC1
et ERG11, et est associée à un haut niveau de résistance aux antifongiques azolés (48,
49).

- Perte d’hétérozygotie

Elle est liée à des recombinaisons mitotiques et/ou à des conversions géniques, et
permet la pleine expression des mutations GOF des gènes des facteurs de transcription
impliquées dans la résistance aux antifongiques (mutations qui seraient normalement
exprimées à l’état de codominance). Ils entrainent donc une surexpression de la cible
des azolés ou des transporteurs impliqués dans leur efflux, et participent ainsi au
développement de la résistance (48, 49).

- Formation de mini-chromosome

Une formation de novo de mini-chromosome par duplication de segments

chromosomiques a été mise en évidence pour des isolats de C. glabrata résistants aux
azolés. Dans un cas, le mini-chromosome incluait le gène CgCDR2, suggérant que
cette espèce serait capable de s’adapter à la pression antifongique par plasticité
chromosomique (48, 56).

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Figure 8: Mécanismes de résistance aux antifongiques azolés chez Candida spp

1. Diminution de la concentration intracellulaire en antifongique par surexpression des
transporteurs des superfamilles ABC et MDR,

2. Modification de la cible des azolés Erg11p (par substitution d’acides aminés),

3. Surexpression du gène ERG11, 4. Modification de Erg3p (C. albicans) : absence de

formation du métabolite toxique 14α-methylergosta-8,24dien-3β,6α-diol (= 3,6-diol) (53).

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6.2 Les échinocandines

6.2.1 Structures moléculaires
Trois molécules de cette famille sont commercialisées et indiquées dans le traitement des
candidoses invasives : la caspofungine (CANCIDAS®, MSD), l’anidulafungine (ECALTA®,
Pfizer) et la micafungine (MYCAMINE®, Astellas). Elles sont composées d’une partie
centrale cyclique, d’une courte chaîne hydroxylée, et d’une chaîne latérale plus longue qui
détermine le spectre d’activité de la molécule

Figure 9: Structure des échinocandines(47).

6.2.2 Mécanisme d’action

Les échinocandines inhibent l’action de la Béta-(1,3) -D glucane synthase, une enzyme
fongique responsable de la synthèse du Béta-(1,3) -D glucane. Ce sucre est un constituant
majoritaire et spécifique de la paroi fongique, il est absent des cellules mammifères. Les
échinocandines exercent un effet fongicide indirect par inhibition de la synthèse de la paroi
fongique (57).

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6.2.3 Mécanisme de résistance

Le principal mécanisme de résistance de Candida spp aux échinocandines est l’altération de
l’enzyme cible : la β-1,3-glucane synthase (Figure14).

Diverses mutations de FKS1 associées à la résistance aux échinocandines ont été décrites chez
C. albicans. Elles se répartissent au sein de 2 régions hots spot définies par les séquences
d’acides aminés de la protéine : HS1 (acides aminés 641-649) et HS2 (acides aminés 1345-
1365) (58).

Il s’agit de mutations dominantes, homos- ou hétérozygotes, conférant une résistance à

l’ensemble des échinocandines (59).

La substitution de la sérine en position 645 est la modification la plus fréquente, et entraîne le

phénotype de résistance le plus sévère (48).

Chez C. glabrata, des mutations conférant une sensibilité diminuée ou une résistance aux
échinocandines ont été identifiées au sein de FKS1 (HS1 : acides aminés : 659 à 666) et de
FKS2 (acide aminé 1375). La moindre sensibilité de C. parapsilosis aux échinocandines
s’explique par des polymorphismes naturels de la région HS1 de FKS1 entrainant la
substitution de la proline 660 par une alanine. Cette substitution est observée pour les trois
espèces du complexe C. parapsilosis. Aucune mutation « acquise » de FKS1 ou FKS2
associée à une résistance aux échinocandines n’a été décrite à ce jour pour cette espèce.

Dans la plupart des cas, les mutations des régions hots spot de FKS1 et FKS2 entraînent une
augmentation des CMI plus importante pour la caspofungine que pour les deux autres
molécules, anidulafungine et micafungine (60).

Contrairement aux antifongiques azolés, les échinocandines sont de mauvais substrats pour la
plupart des transporteurs chez Candida spp. L’efflux est donc un mécanisme de résistance
mineur pour cette classe d’antifongiques.

Des mécanismes d’adaptation aux stress interviennent également dans la tolérance et la

résistance aux échinocandines chez Candida spp. (Figure 14), et leur caractérisation pourrait
remettre en cause l’activité fongicide des échinocandines (61).

Ils impliquent la calcineurine et son effecteur Crz1, la protéine chaperonne HSP90, la voie
médiée par la protéine kinase C (PKC) ou encore la voie HOG (High Osmolarity Glycerol).
Ces voies sont activées en réponse à différentes situations de stress liées à des modifications

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 46

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du milieu extracellulaire, et réagissent notamment aux agressions pariétales induites par les
échinocandines (59, 60).

Elles entrainent une synthèse accrue de chitine, autre polysaccharide majeur de la paroi
fongique, et permettent ainsi de maintenir l’intégrité pariétale et d’assurer la survie de la
cellule.

Chez C. albicans, l’accumulation de chitine est responsable d’une baisse de sensibilité aux
échinocandines in vitro et in vivo ainsi que de l’apparition de mutations dans FKS1 du fait de
l’altération des fonctions de réparation de l’ADN

La réponse compensatrice pariétale est également impliquée dans l’effet paradoxal ou Eagle
effect (58-60, 62).

L’utilisation de concentrations supérieures à la CMI entraîne parfois une croissance

paradoxale des levures alors que des concentrations plus faibles l’inhibent. L’effet paradoxal
est aboli par les inhibiteurs de chitine synthases (nikkomycine Z) ou de la calcineurine (58).
Cet effet a été décrit pour C. albicans ou C. parapsilosis, mais pas pour C. glabrata, et plus
fréquemment avec la caspofungine qu’avec les autres molécules. Il n’y a aujourd’hui pas de
preuves permettant d’associer cet effet paradoxal à la survenue d’infections perthérapeutiques
(breakthrough infections) lors d’un traitement par échinocandines et la relevance clinique de
ce phénomène observé uniquement in vitro n’est pas établie.

Figure 10: Mécanismes de résistance aux échinocandines (C. albicans)(63).

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 47

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(A) Des mutations du gène FKS1 codant pour la β-1,3-glucane synthase peuvent entrainer
une résistance aux échinocandines (minimisation de l’effet de l’antifongique sur la cellule).
(B) La sous-unité régulatrice Rho joue un rôle dans la tolérance aux échinocandines par la
médiation des réponses au stress (activation du « cell wall integrity pathway », augmentation
de la synthèse de chitine, …)

6.3 Les polyènes :

6.3.1 Structure moléculaire
L’amphotéricine B (AMB) est la seule molécule de cette classe à être utilisée par voie
systémique. Trois formulations galéniques de l’amphotéricine B existent :

- Desoxycholate, FUNGIZONE®
- Suspensions lipidiques ABELCET®
- Inclusions liposomales, AMBISOME®

6.3.2 Mécanisme d’action

L’amphotéricine B exerce une action fongicide en se fixant et en altérant directement
l’ergostérol, principal composant stéroïdien de la paroi des champignons. La fixation de la
molécule à la paroi fongique génère une perméabilité anormale via la formation de pores dans
cette paroi. Ceci génère une fuite des composants intra cytoplasmiques du champignon et
entraine sa mort (64).

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 48

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Figure 11: Mécanisme d’action des polyenes (64).

6.3.3 Mécanisme de résistance

La résistance à l’AMB est plutôt rare. La résistance se manifeste surtout chez les patients
immunodéprimés ayant reçu de l’AMB sur de longues périodes. Les mécanismes de
résistance des polyènes concernent surtout la diminution ou l’absence d’ergostérol, principale
cible de l’AMB.

- Diminution / disparition de l’ergosterol membranaire

- Remplacement ergosterol par autres stérols
- Limitation de l’accès à l’ergostérol : modifications de la paroi

6.4 Les analogues nucléosidiques

6.4.1 Structure moléculaire
La seule molécule antifongique de cette classe est la 5-Flucytosine (ANCOTIL®).
ANCOTIL® est disponible sous la forme de comprimés pour voie orale ou de poudre pour
usage parentéral

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 49

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6.4.2 Mécanisme d’action

Il s’agit d’un analogue synthétique d’une base nucléosidique ; la cytosine. Elle exerce une
activité fongistatique sur certaines espèces en pénétrant dans la cellule fongique. Il co-existe
ensuite deux voies de métabolisation dans la cellule fongique : l’une conduisant à une
inhibition de la synthèse de l’acide nucléique fongique, l’autre consistant en une inhibition de
la synthèse protéique fongique. Il est indispensable d’utiliser ANCOTIL® en association
systématique avec un autre ATF et de ne jamais l’utiliser en monothérapie afin de limiter le
risque de sélection de mutants résistants. L’association de flucytosine est synergique avec
l’amphotéricine B (65).

6.4.3 Mécanisme de résistance

- Spectre d’activité restreint
- Résistance acquise
 Liée à la monothérapie
 D’apparition rapide
Mécanismes :
- Déficit de pénétration (activité perméase)
- Déficit du métabolisme (activité cytosine désaminase ou UMP
pyrophosphorylase)

6.5 Les allylamines

Cette classe d’antifongiques, comprend la naftifine et la terbinafine (LAMISIL®). Le mode
d’action des allylamines repose sur l’inhibition de la synthèse de l’ergostérol par un
mécanisme distinct de celui des azolés qui implique l’inhibition de la squalène époxydase.
L’effet antifongique qui en résulte est fongistatique. La terbinafine est quasi exclusivement
utilisée pour la prise en charge des infections candidosiques superficielles mais peut aussi
trouver sa place dans la prise en charge des infections invasives notamment réfractaires aux
traitements habituels en association avec d’autres antifongiques (66). La naftifine, réservée à
la prise en charge des dermatophyties.

6.6 Les morpholines

Le seul composé de cette famille utilisé en clinique est l’amorolfine (LOCERYL®). Elle
possède une activité fongistatique qui repose sur l’inhibition de la C14 stérol réductase
(Erg24) et de la C8 stérol isomérase (Erg2), deux enzymes impliquées dans la biosynthèse de
l'ergostérol (Polak, 1992). L’utilisation de l’amorolfine est limitée à la prise en charge des
infections superficielles (onyxis) (67).

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 50

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Figure 12: Cibles des différents antifongiques (68).

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IV METHODOLOGIE

1 Lieu et cadre d’étude

L’Institut National de Sante Publique (INSP) anciennement appeler l’Institut National de
Recherche en Santé Publique a servi de cadre d’étude (INRSP)

Ordonnance n°2019-011 création de l'Institut national de Santé publique INSP

ORDONNANCE N°011 /P-RP DU 27 MARS. 2019

Les départements n’étaient pas créés et le travail a été fait dans l’ancien service de
bactériologie-virologie de l’Institut National de Recherche en Santé Publique (INRSP)

DESCRIPTION de l’INRSP :

Créé par la loi N° 81-17/AN-RM du 31 mars 1981, et érigé en Établissement Public à

caractère Administratif (EPA) par la loi N° 93-014 du 11 février 1993, l’INRSP est passé de
ce statut à celui d’Établissement Public à caractère Scientifique et Technologique (EPST) par
l’Ordonnance N° 06-007/P– RM du 28 février 2006.

Ses missions se résument comme suit :

 promouvoir la recherche médicale et pharmaceutique en santé publique, notamment

dans les domaines des maladies infectieuses, néoplasiques et sociales, de la santé
familiale, de l’éducation sanitaire, de l’hygiène du milieu, de la biologie clinique
appliquée à la nutrition et aux affections endémo-épidémiques, de la toxicologie
médicale et expérimentale, de la bromatologie, de la génétique, de la socio économie,
de la médecine et pharmacopée traditionnelle ;
 participer à la formation technique, au perfectionnement et à la spécialisation dans le
domaine de sa compétence ;
 assurer la référence dans le domaine de la biologie clinique ;
 assurer la mise au point et la formulation des médicaments traditionnels améliorés ;
 assurer la protection du patrimoine scientifique relevant de son domaine ;
 promouvoir la coopération nationale et internationale dans le cadre des programmes et
d’accords d’assistance mutuelle ;
 gérer les structures de recherche qui lui sont confiées

L’INRSP comprend cinq départements et une agence comptable qui sont :

- Département Santé Communautaire (DSC) ;

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 52

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 Département Médecine Traditionnelle (DMT) ;

 Département Formation (DF) ;
 Département Administration et Personnel (DAP) ;
 Département de Diagnostic et de Recherche Biomédicale (DDRB) qui se compose de :

 Service de biochimie clinique

 Service de parasitologie

 Service de sérologie

 Service d’hématologie

 Service de bactériologie-virologie

Le service de bactériologie-virologie est équipé de toutes les commodités permettant la

recherche et analyse bactériologique et virologique des échantillons de routine. Ce service a
servi de lieu pour analyser nos échantillons.

2 Population d’étude
La population d’étude était constituée de tous les clients dont l’échantillon biologique a été
acheminé et/ou prélevé au laboratoire de bactériologie-virologie de l’INRSP.

2.1 Critères d’incluions

Patients chez qui des levures ont été isolés

2.2 Critères non d’inclusions

N’étaient pas inclus dans notre étude des patients chez qui des levures n’ont pas été isolées.

2.3 Type et période d’étude

Il s’agissait une étude transversale prospective à but descriptif qui s’est déroulée de janvier
2018 à juin 2019.

2.4 Echantillonnage
C’était un modèle d’échantillonnage simple basé sur un recrutement systématique de tous les
échantillons durant la période d’étude dans lesquels des levures ont été isolées.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 53

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2.4.1 Collecte des données

Une fiche de collecte des données a été remplie pour chaque patiente comportant les données
suivantes :

-Données sociodémographiques : nom, prénom, âge, sexe, profession, ethnie

-Données cliniques et thérapeutiques y compris les antécédents de prise d’antimicrobiens.

3 Diagnostic Mycologique

3.1 Les prélèvements biologiques

 Les expectorations

L’examen de l’expectoration spontanée ou induite permet d’étudier la présence de

champignon. Elles sont recueillies après rinçage de la bouche par un antiseptique pour limiter
la contamination par la flore buccale.

 Frotti vaginal

Les prélèvements étaient dans la majorité des cas des frottis vaginaux. Le prélèvement est
réalisé sans aucune recommandation préalable concernant la toilette intime le jour de
l’examen. Celui-ci est effectué minutieusement par écouvillonnage, au niveau des culs de sacs
vaginaux, de l’endocol et de l’exocol. Après la pose du spéculum, deux écouvillons stériles
sont chargés par balayage du vagin de haut en bas, l’un pour l’examen direct à l’état frais et
l’autre pour coloration, et la culture. Les échantillons peuvent aussi provenir d’une autre
structure. Dans ce cas l’écouvillon est acheminé au laboratoire dans les deux heures qui
suivent le prélèvement.

 Pus
Le prélèvement des pus a été collecté soit dans un tube sec, soit par écouvillonnage et
acheminé immédiatement au laboratoire, à défaut le conserver au frais pour le lendemain
 Urines
Les urines ont été collectées dans un flacon stérile, et acheminés immédiatement au
laboratoire pour traitement. Le recueil des urines est une étape essentielle qui conditionne
pour une grande part la qualité et l’interprétation de l’examen

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 54

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Matériels de prélèvement
Ecouvillons
Un flacon stérile

Matériels d’identification
-Examen à l’état frais : lames porte-objets et lamelles.
-Microscope optique
- Densitomètre
-L’automate VITEK® 2 compact et sa carte
-Autres : anse de platine, étuve, pipette Pasteur, coton,

Milieu et réactif
Coloration Gram : Violet de gentiane, Lugol, Alcool, Fuchsine.

Boite de pétri gélose Sabouraud, NaCl 0,85%

3.2 Examen direct

 A l’état frais
Après réception du prélèvement ou après le prélèvement, une goutte d’eau physiologique est
mise sur une lame sur laquelle est trituré l’écouvillon. Ensuite, elle est recouverte d’une
lamelle pour l’observation au microscope optique à l’objectif x40.

Elle nous a permis d’apprécier la desquamation cellulaire, la présence des leucocytes, des
hématies, des spores et des filaments de levures

 Après la coloration de Gram

Après séchage de la lame on la fixe et on la colore. Ensuite la lame est observée au

microscope optique avec l’objectif x100, sous huile à immersion.

On peut observer entre autres des spores, des pseudo-filaments, des filaments.

3.3 Culture
Les ensemencements ont été faits sur gélose Sabouraud et incubé dans une étuve à 37°C pour
24 heures
Les levures poussent en 24 à 48h, formant des colonies blanc- crème, lisses et crémeuses

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Identification
L’identification des levures s’est effectuée à l’aide du test de filamentation ou de blastèse
couplée à l’utilisation de l’automate VITEK®2 Compact

4 Test de blastèse :
Appelé aussi test de filamentation, il consiste à émulsionner une pointe de pipette de levures
dans 1 ml de sérum de lapin, puis laisser incuber à 37°C pendant 3 à 4 heures.

Lorsqu’il s’agit de Candida albicans, on observe dans presque 90% des cas un tube
germinatif partant de la levure sans présence de constriction à la base, visible au microscope
optique.

5. Antifongigramme
L’antifongigramme a été effectué par l’automate VITEK®2 Compact.

Grâce à la technologie VITEK®2 Compact l'antifongigramme est devenu automatisé,

standardisé et rapide, les résultats sont disponibles en 13 heures seulement.

La lecture et l’interprétation est automatique, mais la confirmation et validation est faite par
un biologiste

6. Analyses statistiques
Les données ont été enregistrées sur Microsoft Excel 2016 Les tests statistiques ont été
réalisés à l’aide du logiciel IBM SPSS version 21

7. Aspects éthiques
Les prélèvements ont été effectués dans des tubes portant un numéro d’identification unique
par patient. Les bulletins d’analyses étaient remis aux patients après l’analyse biologique.
L’identification des patients a été maintenue confidentielle et anonyme mais les résultats au
laboratoire ont permis d’élaborer la thèse d’exercice en Pharmacie.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 56

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V RESULTATS

1 Résultats globaux
Au total 1818 échantillons ont été collectés pendant la période d’étude (de janvier 2018 à
janvier 2019) dans le laboratoire de bactériologie générale de l’INRSP, sur lesquels nous
avons obtenu 71 levures soit une fréquence de 3,9% ; dont 53/71 de genre Candida ; 16/71
Cryptococcus ; 1/71 Stephanoascus ciferrii ; 1/71 Trichosporon asahii.

Tableau 1: La fréquence des levures isolées par type de prélèvements

1818 échantillons

306 Frottis vaginaux 247 Expectorations 1078 Urines 187 Pus

Positifs Négatifs Positifs Négatifs Positifs Négatifs Positifs Négatifs

47 259 14 233 9 1069 1 186

Nous avions isolé des levures 47/259 dans les frottis vaginaux ;14/233 dans les
expectorations ; 9/1069 dans les urines et 1/186 dans les pus.

La majorité des échantillons proviennent des hôpitaux 29/71 soit (41%) suivi des CSREF
10/71 soit (14%). Notre étude montre une prédominance féminine : 63 femmes et 8 hommes
soit un sexe ratio H/F=0,127.

Parmi les 71 échantillons, 26/71 soit 37% étaient positifs aux tests de blastèse (filamentés).
Les Cryptococcus laurentii et Candida famata n’étaient pas associables aux antifongiques.

Tableau 2: la résistance des souches testées aux différents antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 39 2 2 43
Voriconazole 38 1 4 43
Amphotéricine B 35 4 5 44
Flucytosine 37 1 5 43

NB : Nous n’avons trouvé aucune résistance concernant à la Micafungine et la Caspofungine

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Tableau 3: Fréquence d’isolement des levures

Germes Effectifs Pourcentage

[Link] 25 35,2
[Link] albicans 28 39,2
Cryptococcus albidus 1 1,4

Cryptococcus laurentii 14 19,7

Cryptococcus neofarmans 1 1,4
Stephanoascus ciferrii 1 1,4
Trichosporon asahii 1 1,4
Total 71 100,0

Candida albicans était l’espèce la plus fréquemment rencontrée avec 35,2%

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Tableau 4: Distribution des espèces de levures selon la nature de prélèvement

Germes Nature de prélèvement Total

Expectorations Frottis vaginaux Pus Urines

Candida 6 16 1 2 25
albicans
Candida 1 0 0 0 1
colliculosa
Candida 0 1 0 0 1
dubliniensis
Candida famata 2 6 0 0 8

Candida 1 5 0 2 8
glabrata
Candida kefyr 0 1 0 0 1

Candida krusei 0 2 0 0 2

Candida 0 0 0 1 1
lipolytica
Candida 0 1 0 0 1
lusitaniae
Candida 2 0 0 0 2
parapsilosis
Candida 0 1 0 0 1
spherica
Candida 0 1 0 1 2
tropicalis
Cryptococcus 0 1 0 0 1
albidus
Cryptococcus 2 9 0 3 14
laurentii
Cryptococcus 0 1 0 0 1
neofarmans
Stephanoascus 0 1 0 0 1
ciferrii
Trichosporon 0 1 0 0 1
asahii
Total 14 47 1 9 71

Les frottis vaginaux sont les matériels biologiques les plus représentés dans notre étude suivi
de l’expectoration

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2 Résultats Descriptifs

tranche d'age
25,0

19,7
20,0
16,9
15,0 14,1
11,3
9,9
10,0 8,5
7,0 7,0
5,6
5,0

0,0
14-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50 + 9,00

Figure 13 : Répartition des patients selon la tranche d’âge

La tranche d’âge [30-34] était la plus représentée avec soit 19,7%

Le sexe

11,3; 11%

F
M

88,7; 89%

Figure 14: Répartition des patients selon le sexe

89% des patients étaient de sexe féminin

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33,3

20,0
14,7
10,7 9,3
6,7

Figure 15 : répartition des patients selon leur profession.

Les ménagères étaient la couche la plus représentée avec un pourcentage de 33,3%

8,5

18,3
BAMAKO
KOULIKORO
NON RENSEIGNE

73,2

Figure 16 : Répartition selon la résidence des patients

La majorité des patients résident à Bamako avec un pourcentage de 73,2%

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HOPITAL

CSREF ET ASACO
35%
41%
CLINIQUE

CABINET ET
7% INFIRMERIE
3% 14%
NON RENSEIGNE

Figure 17: Répartition des patients selon la provenance des échantillons.

La majorité de nos échantillons viennent des hôpitaux avec 29/71 soit 41%.

70,0 66,2

60,0
50,0
40,0
30,0
19,7
20,0 12,7
10,0
1,4
0,0
EXPETORATION FROTTI VAGINAL PUS URINE

Figure 18: Répartition des patients selon la nature de prélèvement

Les frottis vaginaux avaient une prédominance de 47/71 soit 66,2%

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 62

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21,1 23,9
N
NR
O

54,9

Figure 19: Répartition des patients selon le traitement préalablement réussit sur le bulletin
Absence de renseignement à 54,9% sur les bulletins d’analyse concernant le traitement
préalable

Tableau 5: Distribution des germes isolés à l’examen de la routine

Germes Effectifs Pourcentage

Levure filamenteuse 21 29,6

Levure non filamenteuse 35 49,3

AUTRES 15 21,1

Total 71 100,0

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positif
37%

negatif
63%

negatif positif

Figure 20: Répartition selon le résultat du test de filamentation (ou blastèse)

Seulement 37% des candida observés ont été positif au test de filamentation

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 64

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Tableau 6: Distribution des levures isolées par le VITEK2

Germes Effectifs Pourcentage

C. albicans 25 35,2

C. colliculosa 1 1,4

C. dubliniensis 1 1,4

C. famata 8 11,3

[Link] 8 11,3

C. kefyr 1 1,4

[Link] 2 2,8

C. lipolytica 1 1,4

[Link] 1 1,4

[Link] 2 2,8

C. spherica 1 1,4

[Link] 2 2,8

Cryptococcus albidus 1 1,4

Cryptococcus laurentii 14 19,8

Cryptococcus neofarmans 1 1,4

Stephanoascus ciferrii 1 1,4

Trichosporon asahii 1 1,4

Total 71 100,0

Ce tableau montre que le Candida albicans était le plus représenté avec un pourcentage de
35,2% ; secondé par Cryptococcus laurentii 19,7%.

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3 Résultats Analytiques
Tableau 7: Distribution des levures identifiées par VITEK2 selon la provenance des patients
(service)

HOPITAL CSREF ET CLINIQUE CABINET ET NON

Provenance ASACO INFIRMERIE RENSEIGNE
Total

Germes
C. albicans 8 4 1 3 9 25

C. colliculosa 0 0 0 0 1 1

C. dubliniensis 0 0 0 1 0 1

C. famata 4 2 0 0 2 8

C. glabrata 5 0 0 0 3 8

C. kefyr 1 0 0 0 0 1

C. krusei 1 1 0 0 0 2

C. lipolytica 0 0 0 0 1 1

C. lusitaniae 0 0 0 0 1 1

C. parapsilosis 2 0 0 0 0 2

C. spherica 0 0 0 0 1 1

C. tropicalis 1 0 0 1 0 2

Cryptococcus 7 2 1 0 4 14
laurentii
Cryptococcus 0 0 0 0 1 1
neofarmans
Cryptococcus 0 0 0 0 1 1
abidus
Stephanoascus 0 1 0 0 0 1
ciferrii
Trichosporon 0 0 0 0 1 1
asahii
Total 29 10 2 5 25 71
La majorité des germes isolés proviennent des hôpitaux 29 /71

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Tableau 8: Distribution des levures selon la nature de prélèvement

Nature de prélèvement
FROTTIS
Germes EXPECTORATION VAGINAL PUS URINES Total
Candida albicans
6 16 1 2 25
Candida colliculosa 1 0 0 0 1
Candida
dubliniensis 0 1 0 0 1

Candida famata 2 6 0 0 8
Candida glabrata 1 5 0 2 8
Candida kefyr 0 1 0 0 1
Candida krusei 0 2 0 0 2
Candida lipolytica 0 0 0 1 1
Candida lusitaniae 0 1 0 0 1
Candida
parapsilosis 2 0 0 0 2

Candida spherica 0 1 0 0 1
Candida tropicalis 0 1 0 1 2
Cryptococcus
0 1 0 0 1
albidus
Cryptococcus
2 9 0 3 14
laurentii
Cryptococcus
neofarmans 0 1 0 0 1

Stephanoascus
0 1 0 0 1
ciferrii
Trichosporon asahii 0 1 0 0 1
Total 14 47 1 9 71

La plupart des C albicans et de Cryptococcus laurentii sont isolés dans des frottis vaginaux

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4 Profil de résistance des souches isolées aux antifongiques

Tableau 9: la résistance des germes isolés aux différents antifongiques .

Antifongiques
FLUCO VORICO CASPOF MICAF AMPHO FLUCYTO
C. albicans 0 1 0 0 2 2
C. 0 0 0 0 0 0
colliculosa
C. 0 0 0 0 0 0
dubliniensis
C. glabrata 0 1 0 0 0 0
C. kefyr 0 0 0 0 1 0
C. krusei 2 0 0 0 0 2
Germes

C. lipolytica 0 0 0 0 0 0
C. 0 1 0 0 1 1
lusitaniae
C. 0 0 0 0 0 0
parapsilosis
C. spherica 0 0 0 0 0 0
C. tropicalis 0 1 0 0 1 0
Cryptococc 0 0 0 0 0 0
us
neofarmans
Total 2 4 0 0 5 5

NB : Candida krusei est naturellement resistant au fluconazole

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE 68

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5 Sensibilité /Résistance aux antifongiques

Tableau 10: Le profil de résistance de C. albicans aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 23 2 0 25
Voriconazole 23 1 1 25
Amphotéricine B 21 1 1 25
Flucytosine 23 0 2 25
Ce tableau indique 2/25 de c. albicans sont résistant au Flucytosine ; 1/25 sont résistant à
l’Amphotéricine et Voriconazole

Tableau 11: Le profil de résistance de C. dubliniensis aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 1 0 0 1
Voriconazole 1 0 0 1
Amphotéricine B 1 0 0 1
Flucytosine 1 0 0 1
Pas de résistance aux différents antifongiques testés

Tableau 12: Le profil de résistance de C. glabrata aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 8 0 0 8
Voriconazole 7 0 1 8
Amphotéricine B 7 1 0 8
Flucytosine 8 0 0 8
Nous avions 1/8 de C. glabrata résistant au voriconazole

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXIX

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Tableau 13 : Le profil de résistance de C. kefyr aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 1 0 0 1
Voriconazole 1 0 0 1
Amphotéricine B 0 0 1 1
Flucytosine 1 0 0 1
Le C. kefyr (1/1) était résistant à l’Amphotéricine.
Tableau 14: Le profil de résistance de C. krusei aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 0 0 2 2
Voriconazole 2 0 0 2
Amphotéricine B 2 0 0 2
Flucytosine 0 0 2 2
Nous avions noté une résistant 2/2 de C. krusei au Flucytosine.
Tableau 15: Le profil de résistance de C. lipolitica aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 1 0 0 1
Voriconazole 1 0 0 1
Amphotéricine B 1 0 0 1
Flucytosine 0 1 0 1
Le C. lipolitica était intermédiaire au Flucytosine.
Tableau 16: Le profil de résistance de C. lusitaniea aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 1 0 0 1
Voriconazole 0 0 1 1
Amphotéricine B 0 0 1 1
Flucytosine 0 0 1 1
Le C. lusitaniea était au Flucytosine ; à l’Amphotéricine B et à la Voriconazole

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXX

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Tableau 17: Le profil de résistance de C. parasilosis aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 2 0 0 2
Voriconazole 2 0 0 2
Amphotéricine B 2 0 0 2
Flucytosine 2 0 0 2
Nous n’avons noté aucune résistance concernant le C. parasilosis

Tableau 18: Le profil de résistance de C. tropicalis aux antifongiques

Antifongiques Sensibilité Intermédiaire Résistant Total

Fluconazole 2 0 0 2
Voriconazole 1 0 1 2
Amphotéricine B 1 0 1 2
Flucytosine 2 0 0 2
Le C. tropicalis a été résistant au Voriconazole et Amphotéricine B
NB : Tous les germes testés étaient sensibles à la Caspofungine et Micafungine.

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VI COMMENTAIRES DISCUSSIONS
La présente étude transversale prospective a été réalisée à l’Institut National de Recherche en
Santé Publique de Bamako du janvier 2018 au juin 2019. L’objectif de cette étude était
d’évaluer la prévalence et la sensibilité des levures dans les différents prélèvements
biologiques. Elle a porté sur 71 souches.
Renseignements sociodémographiques
Age
L’âge moyen des patients est de 33 ,8 avec un âge minimum de 15 ans et un maximum de
65ans.
La tranche d’âge la plus représentée était [30 ;34] avec un pourcentage de 19,7%.
Notre résultat se distingue de celle de H. JAMILI en 2010 qui a travaillé sur les candidoses
vulvo- vaginales chez la consultante à l’hôpital militaire d’instruction Mohamed v de Rabat :
Etude prospective 2009-2010. Il a noté que la tranche d’âge [25-30] avec un pourcentage
34,8% était la plus fréquente (69).
Sexe
Dans notre étude les 2 sexes étaient touchés avec une prédominance féminine de 63/71 soit
(89%), parce que le frottis vaginal était le matériel biologique le plus prélevé. Qui est
contraire à celle de Nicolas Caraes en 2016 sur Épidémiologie des candidoses profondes au
Centre Hospitalier Universitaire de Rouen dont le sexe masculin est le plus touché (911/1509)
soit 60,37% cette différence peut être due au type de prélèvement. Cette différence peut être
expliquée par la nature de prélèvement qui dans notre cas était beaucoup représenté par les
Frottis vaginaux.
Identification par le test de filamentation
Résultat de test du blastèse
les résultats de notre travail a objectivé une positivité de 37% (26/71) qui est inférieur à celle
de Sy O, et collaborateur en 2018 (32/52) soit 61,5% portant sur les Candidoses vulvo-
vaginales chez les femmes enceintes au centre hospitalier Mère et Enfant de Nouakchott (70).
La différence pourrait s’expliquer par le fait que ces auteurs n’ont travaillé que sur le
prélèvement vulvo- vaginal
La nature des germes identifiés :
Au cours de cette étude, nous avons identifié 35 ,2% soit (25/71) de Candida albicans
secondé par Cryptococcus laurentii 19,7% soit (14/71). Ce résultat est comparable à celui de
M. Sissoko en 2008 à Bamako (commune IV) qui avais travaillé sur l’étude de la prise en

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXII

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charge du syndrome écoulement vaginal et/ou douleur abdominale basse au centre de sante de
référence de la COMMUNE IV dont (4/9) soit 44,4% de Candida albicans en 2008 (71).
Elle se rapproche de celle de Rieu P et collaborateur sur leur étude épidémiologique
multicentrique française conduite en octobre 2004 par le collège de bactériologie, virologie,
hygiène (72). La distribution des espèces était la suivante : 23 C. albicans (50 %), 12 C.
glabrata de (26,1 %), cinq C. tropicalis (10,8 %), trois C. parapsilosis (6,5 %), un C. krusei,
C. kefyr et C. guilliermondii (2,2 %) sur 46 souches fongiques isolées.

Prévalence
Globalement parmi les levures isolées, le candida albicans prédomine avec un pourcentage
35,2 %. Nos résultats sont inférieurs à ceux de l’étude
« Epidémiologie et spectre des levures isolées en Tunisie (Etude multicentrique nationale)
nationale »54 ,7%. Sur 31576 souches de levures, cette différente peut être due à la taille de
l’échantillon.
Nos valeurs se rapprochent à celle de Dhraief S et coll qui ont travaillé sur la sensibilité de
levures aux antifongiques, les resultats montrent que: C. albicans était (48,4 %), suivi
de C. glabrata (18,9 %)(73). Cependant nos résultats sont considérablement inférieurs à ceux
de Bouchekoua M et coll qui ont également travaillé sur la typologie et profil de résistance les
levures isolées en milieu de réanimation , C. albicans était retrouvée dans 53 % (74);
également de celles rapportées par JAMILI H et coll qui ont noté une fréquence de 69% de
[Link] au cours des Candidoses vulvo- vaginales (69)

Profil de résistance aux principaux antifongiques testés

FLUCONAZOLE :
Concernant le fluconazole tous les germes testés étaient sensibles à part C. krusei qui était
résistant à 2/2 (soit 100%) dont c’est une résistance naturelle.

Nos résultats se distinguent avec celui de Dhraief S et coll qui ont noté une résistance
pour C. glabrata et C. albicans respectivement dans 17,6 % et 13 % (73). Bouchekoua M et
coll qui ont egalement noté une résistance 2 souches C. albicans parmi 25 testées 2 souches
de C. glabrata parmi 13 testées 1 souche de C. tropicalis parmi 10 testées 1 souche de C.
parapsilosis parmi 8 testées (74).

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VORICONAZOLE :

Les résultats de notre travail montrent un niveau de résistance au Voriconazole pour les
espèces de Candida à savoir 4% (1/25) C. albicans ; 12,5% (1/8) C. glabrata ; 100% (1/1) C.
lusitaniae ; 50% (1/2) C. tropicalis. Nos chiffres concordent avec ceux de Bouchekoua M et
coll. qui ont noté une resistance de 4% soit (1/25) C. albicans (74).

AMPHOTERICINE B

Concernant amphotéricine, nos résultats objectivent une résistance de 8% (2/25) C. albicans ;

100% (1/1) C. Kefyr ; 100% (1/1) C. lusitaniae et 50% (1/2) C. tropicalis. Nos résultats se
rapprochent à ceux de Bouchekoua M et coll. qui ont noté une résistance de 8% de
[Link] (soit 2/25) et 40% de [Link] (soit 4/10) (74). Ces resultats se distinguent avec
ceux de Dhraief S et coll qui n’ont trouvé aucune résistance (73).

FLUCYTOSINE

Nous avons noté une résistance de 2/25 (8%) C. albicans ; 2/2 (100%) C. krusei et 1/2 (100%)
C. lusitanias au flucytosine

Ces resultats se distinguent avec ceux de Dhraief S et coll qui n’ont trouvé aucun cas de
résistance à cette molécule (73).

Au cours de notre étude nous n’avons noté aucune résistance concernant le Caspofungine et
Micafungine.

Parmi les 71 échantillons, seulement 37% ont été positifs au test de filamentation; les
Cryptococcus laurentii ; Cryptococcus abidus ; Candida famata ; Stephanoascus ciferrii ;
Trichosporon asahii n’ont pas été tester aux antifongiques.

Les limites de notre étude

-Le manque de données de renseignements sur les patients : par exemple le traitement
préalable peut influencer le résultat d’antifongigramme

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VII CONCLUSION

Au terme de notre étude, nous pouvons dire que le Candida albicans et les levures
appartenant au genre Candida sont les germes les plus fréquentes dans les ’infections
fongiques. L’espèce Cryptococcus laurentti a été aussi isolé après C. albicans.

L’analyse des résultats de l’antifongigramme de nos souches a dénoté une émergence de la

résistance de ces germes face aux antifongiques usuels.

En vue de ces résultats il serait indispensable dans les perspectives de mettre en place un plan
de lutte face à l’émergence de la résistance des levures aux antifongiques usuels.

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VIII RECOMMANDATION

A l’issue de cette étude, nous formulons les recommandations suivantes :

Au Ministère de la santé :

-Effectuer des enquêtes épidémiologiques régulières sur l’état de sensibilité des fongies aux
antifongiques (surveillance de la résistance).

Aux prestataires de santé :

-Prescrire de façon rationnelle les antifongiques afin de diminuer l’émergence de nouvelles

souches résistantes.

-Demander un antifongigramme devant tout cas récidivant

A la direction de l’INSP :

-Maintenir le plateau technique existant du laboratoire pour le diagnostic mycologique.

-Approvisionner régulièrement le laboratoire des réactifs et des consommables en vue de la

réalisation de l’examen mycologie.

-Utiliser l’automate VITEK®2 COMPACT pour le diagnostic d’espèces

A la population

Suivre correctement les conseils sur les facteurs de risque des candidoses, les indications
thérapeutiques et les directives données par les prestataires de santé

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXVI

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JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXVII

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JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXX

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ANNEXES

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXI

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ANNEXES

ANNEXE1
MODE OPERATOIRE DE LA TECHNIQUE DE
COLORATION DE GRAM
1. Principe
C’est la coloration de base en bactériologie et elle permet une classification des bactéries
selon leur structure. Elle est l’une des caractères essentiels de la classification des bactéries.
Plusieurs facteurs vont intervenir dans cette coloration :
 La différence de composition chimique de bactéries ;
 La différence de perméabilité de la paroi bactérienne à l’alcool-acétone.
2. Matériel
 Microscope ;
 Blouse ;
 Bac de coloration ;
 Plaque chauffante ;
 Bec bunsen ;
 Centrifugeuse.
3. Consommable
 Gants ;
 Lames porte objet ;
 Tube conique ;
 Pipette pasteur.
4. Réactif
 Colorants : violet de gentiane, le Lugol, l’alcool-acétone, la fuchsine.
 L’huile d’immersion.
5. Nature du prélèvement
Frottis d’un produit pathologique bien séché sur une lame
6. Contrôle de qualité
Les lames positives (frottis préparés avec une souche de bactérie connue) sont conservées et
utilisées comme lames de référence.
7. Technique
 La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes qui se succède et consiste à :
 Fixer le frottis ;

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXII

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

 Recouvrir le frottis de la solution de cristal violet, laisser agir une minute (violet de
gentiane) ;
 Rejeter le colorant puis laver à l’eau ;
 Recouvrir la préparation de Lugol, laisser agir une minute ;
 Rejeter le colorant puis laver à l’eau ;
 Décolorer à l’alcool-acétone ;
 Rincer à l’eau de robinet et recouvrir la lame de solution de fuchsine diluée, laisser
agir 30secondes ;
 Rejeter la Fuchsine, laver à l’eau, égoutter, sécher entre deux feuilles de papier buvard
propres ;
 Lire le frottis coloré au microscope à l’objectif x100 à l’huile d’immersion.
8. Résultat
 A la coloration de Gram :
 Bactéries Gram négatif : coloration rose
 Bactéries Gram positif : coloration violette
 Levures : forme ovale coloration violet

ANNEXE2
Gélose de SABOURAUD au chloramphénicol

DOMAINE D’UTILISATION

La gélose de Sabouraud au chloramphénicol est recommandée pour l’isolement des levures et

des moisissures, surtout lorsque les prélèvements sont fortement contaminés par des bactéries.

PRINCIPES

- La peptone pepsique de viande constitue la source azotée de croissance.

- Le glucose est une source énergétique.
- Le chloramphénicol, antibiotique thermostable à large spectre antibactérien, inhibe le
développement de la microflore contaminant.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXIII

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

PREPARATION

- Mettre en suspension 45,5 g de milieu déshydraté (BK027) dans 1 litre d’eau distillée ou
déminéralisée.
- Porter lentement le milieu à ébullition sous agitation constante et l’y maintenir durant le
temps nécessaire à sa dissolution.
- Répartir en tubes ou en flacons.
- Stériliser à l’autoclave à 121°C pendant 15 minutes.

NB :
Eviter un chauffage excessif du milieu qui conduirait à la dénaturation de l’agar en pH acide
et par conséquent à l’obtention d’un milieu trop mou.

MODE D’EMPLOI

- Refroidir et maintenir le milieu à 47°C.

- Transférer 1 ml du produit à analyser et de ses dilutions décimales successives dans des
boîtes de Pétri stériles.
- Couler 10 à 15 ml de milieu.
- Homogénéiser parfaitement.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Incuber à 25-30°C pendant 3 et 5 jours.

LECTURE

Les boîtes doivent être examinées chaque semaine, pendant 5 semaines avant de conclure à
l’absence de cultures.

FORMULE – TYPE

(Pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)

Pour 1 litre de milieu :
- Peptone pepsique de viande .........................................................10,0 g

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXIV

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- Glucose..........................................................................................20,0 g
- Chloramphénicol ..............................................................................0,5 g
- Agar agar bactériologique..............................................................15,0 g
pH du milieu prêt-à-l ’emploi à 25°C : 5,7 ± 0,2.

CONTRÔLE QUALITE

- Milieu déshydraté : poudre blanc crème, fluide et homogène.

- Milieu préparé : gélose ambrée.
- Réponse culturale typique après 72 heures d’incubation à 30°C :
Microorganismes Croissance
(Rapport de productivité : PR)

Saccharomyces cerevisiae ATCC® 9763 PR ≥ 50%

Candida albicans ATCC 10231 PR ≥ 50%

Aspergillus brasiliensis DSM 1988 PR ≥ 50%

Escherichia coli ATCC 25922 Inhibée

Bacillus subtilis ATCC 6633 Inhibée

STOCKAGE / CONSERVATION

Milieu déshydraté : 2-30°C.

- La date de péremption est mentionnée sur l’étiquette.
- Milieu préparé en flacons : 6 mois à 2-8°C (à titre indicatif).
- Milieu préparé en boîtes : 1 mois à 2-8°C (à titre indicatif).
PRESENTATION Code

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXV

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

Milieu déshydraté :
- Flacon de 500 g BK027HA

REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUE

XP CEN ISO/TS 11133-2 (V 08-104-2). Janvier 2004. Microbiologie des aliments. Guide
pour la préparation et la production des milieux de culture. Partie 2 : Guide général pour les
essais de performance des milieux de culture.
Les mentions portées sur l’étiquette sont prédominantes sur les formules ou les instructions

MODE OPERATOIRE DE L’UTILISATION DU VITEK 2 COMPACT

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXVI

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

1. Principe

Le système Vitek 2 Compact est destiné à l’identification des bactéries et levures, ainsi qu’à
la réalisation d’antibiogrammes et /ou d’antifongigrammes pour les bactéries et/ou
significatives au plan clinique. Le système comprend l’instrument Vitek 2 Compact, un
ordinateur et une imprimante.
Le logiciel fourni par le système Vitek 2 Compact inclut des programmes d’analyses, de
gestion de données et un système de contrôle de qualité afin de valider le kit test du Vitek 2
Compact.

2. Mode opératoire

 Prendre le flacon eau saline Vitek 2, introduire la dispensette ;

 Prendre des tubes secs pour Vitek 2, y introduire dans les puits de la cassette ;
 La cassette peut prendre jusqu’à 10 tubes soit 2x5 (identification+ antifongigramme) ;
 Mettre dans chaque tube, 3ml de la solution saline du Vitek 2 à l’aide de la dispensette
préalablement réglée à 3 ml.
N.B : Pour un germe, deux tubes secs seront utilisés dont l’un servira à l’identification et
l’autre à l’antibiogramme ;
 Sur une feuille vierge, porter la date et le numéro de l’échantillon ainsi que le nom
approximatif du germe à identifier ;
 A partir de la culture pure sur gélose (culture jeune 24 h), à l’aide d’une oese, prélever
quelques colonies et les introduire dans le tube sec contenant la solution saline ;
 Homogénéiser la suspension et bien vortexer ;
 A l’aide du densitomètre, mesurer la concentration des bactérienne à 0,5 McFarland ;
 Poser le tube contenant la suspension bactérienne e en première position et faire suivre
celui prévu pour l’antibiogramme ;
 Préparer la solution pour antibiogramme :
o Si la bactérie à identifier est à :
Gram positif, utiliser la micropipette calibrée à 280μl (bleue),
Gram négatif, utiliser la micropipette calibrée à 145μl (rouge) ;
o A partir de la suspension bactérienne, pipeter en fonction de la nature du germe
suspecté (BGN ou BGP) et diluer dans 3ml d’eau saline contenu dans le tube voisin.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXVII

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

On aurait ainsi préparé la suspension pour l’antibiogramme.

 Placer la carte d’identification (soit GN, soit GP ou YST) et la carte pour
l’antibiogramme (Soit AST- N, soit SST- P ou AST- Y) en fonction de la nature du
germe sur la cassette.

NB : différentes cartes utilisables :

o Streptocoques et entérocoques : ID : GP 67, réf 22226 ; ATB : AST-P 586, réf 22276
o Staphylocoques : ID GP : réf 21342. ATB : AST-P 580, réf 22233
o ID GN : réf 21341 ; ATB : non entérobactéries : AST- 222, réf 413083
entérobactéries : AST-N 233, réf 413117
o Levures : ID : YST, réf 21343 ; ATB : AST-YS01, réf 22108
 Au niveau de l’ordinateur de l’automate, à l’apparition de la page principale ;
o Cliquer sur Vitek 2
o Mettre Identifiant : labsuper, le mot de passe : labsuper
o Cliquer sur gérer la cassette virtuelle
o Créer une cassette virtuelle
o Identification de la cassette 1, 2, …
o Lecture du code à barre de chaque carte à partir de la douchette
o Saisir les données de l’isolat ;
o Entrer les informations de l’isolat (numéro attribué au laboratoire, nom du germe si
déjà identifié par d’autres techniques)
 Puis enregistrer les données de la cassette virtuelle
 Au niveau de l’automate Vitek 2 Compact,
 Ouvrir le capot de remplissage et insérer la cassette à l’intérieur de la chambre ;
 Fermer le capot de remplissage ;
 Appuyer sur la touche Lancer remplissage, un bip indique que le cycle de
remplissage est terminé ;
 Retirer la cassette du capot de remplissage et l’introduire dans la chambre de lecture
où s’effectue le scellage. Le processus de chargement/déchargement permet la lecture
du code à barre des cartes et le code à barre de la cassette ;

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXVIII

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 Lorsque le message retiré s’affiche dans la chambre de lecture, cela indique que le
Vitek 2 a terminé le traitement des cartes contenues sur la cassette. On peut la retirer
en ouvrant le capot chargement puis le refermer ;
 On attend le jour suivant où les résultats seront imprimés.

3. Résultats

Le Vitek 2 Compact est un appareil qui permet d’identifier les germes et de réaliser
l’antibiogramme puis d’interpréter les phénotypes de résistances acquise et naturelle puis la
sensibilité naturelle du germe.
Exemple : les bétalactamases des entérobactéries (Klebsiella, E. coli), S. aureus résistant à
méthicyline et vancomycine, Pseudomonas résistant à l’imipenème…et les phénotypes des
souches sauvages (le germe sensible à tous les antibiotiques testés excepté les sensibilités
naturelles).

4. Gestion des déchets

 Retrait des cartes éjectées :

Pour éjecter une carte, le Vitek 2 Compact la retire du carrousel/incubateur, la présente au
lecteur de cartes et la dépose dans le récipient collecteur de déchets. Le réceptacle collecteur
de déchet peut contenir jusqu’à 60 cartes, il est recommandé de contrôler régulièrement le
niveau du réceptacle collecteur de déchet et le vider.

 Retrait du réceptacle collecteur de déchet :

o Ouvrir le capot du récipient collecteur de déchets. Noter que les cartes usagées sont
stockées à l’intérieur du réceptacle ;
o Retirer le réceptacle collecteur de déchet de la station de travail en tirant sur le bord avant,
vers soi ;
o Jeter les cartes usagées dans la poubelle de déchets contaminés ;
o Remettre en place le réceptacle collecteur de déchets en le faisant glisser vers l’intérieur ;
o Fermer le capot du récipient collecteur de déchets.
Le Vitek 2 Compact réinitialise le compteur de déchets si le réceptacle est entièrement
vidé.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE LXXXIX

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

:
Figure Automate d’identification et d’antifongigramme Vitek 2

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE XC

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

Fiche signalétique :
Nom : ARAMA
Prénom : Jacques
Adresse électronique : jacquesaram@[Link]
Nationalité : Malienne
TITRE : Identification et antifongigramme des levures responsables d’infections et
isolés au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP
ANNEE UNIVERSITAIRE : 2019- 2020
VILLE DE SOUTENANCE : Bamako
LIEU DE DEPOT : Bibliothèque de la faculté de médecine et d’odontostomatologie et de la
faculté pharmacie de Bamako.
SECTEUR D’INTERET : épidémiologie, mycologie.

RESUME

Les mycoses sont des infections fréquentes dont l’impact pour la santé humaine est loin d’être
négligeable. Les levures appartenant au genre Candida, dont le chef de file est Candida
albicans, sont les espèces les plus fréquemment incriminées dans ces infections fongiques.

Nous avons mené une étude transversale prospective à but descriptif qui s’est déroulée de
janvier 2018 à juin 2019 dans le but d’évaluer la prévalence et la sensibilité des levures dans
les différents prélèvements biologiques au service de Bactériologie-Virologie de l’Institut
National de Recherche en Santé Publique.

Etude portait sur 71 échantillons (63 femmes et 8 hommes) Ces échantillons proviennent
majoritairement de sources hospitalières. Les levures de genres Candida prédomine avec un
pourcentage 74,6%. Les espèces les plus fréquemment isolées sont Candida albicans (35,2%)
Cryptococcus laurentii (19,7%) Candida glabrata (11,3%) et Candida famata (11,3%). Parmi
les 71 échantillons, 37% ont été positifs au test de filamentation ; les Cryptococcus laurentii et
Candida famata n’étaient associable aux antifongiques. Parmi ceux qui étaient associables,
nous avons eu une résistance de 5% à la fluconazole ;9% au voriconazole ;0% à la
caspofungine ; 0% à la Micafungine ; 11% à l’Amphotéricine ; 12% de flucytosine.

L’identification et antifongiramme restent le meilleur moyen pour diminuer l’émergence de

souches résistantes aux antifongiques utilisés en pratique courante.

MOTS-CLES : Mycoses, Antifongigramme , Résistance, Levures, INRSP, Bamako

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE XCI

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

ABSTRACT

Fungal infections are frequent infections whose impact on human health is far from
negligible. Yeasts belonging to the genus Candida, whose leader is Candida albicans, are the
species most frequently implicated in these fungal infections.

We carried out a descriptive prospective cross-sectional study that took place from January
2018 to January 2019 in order to evaluate the prevalence and sensitivity of yeasts in the
various biological samples received in the Bacteriology-Virology department of the National
Institute of Research in Public Health.

The study included 71 samples (63 women and 8 men). These samples come mainly from
hospital.

Yeasts of the genus Candida predominate with a percentage of 74.6%. The most frequently
isolated species are Candida albicans (35.2%) Cryptococcus laurentii (19.7%) Candida
glabrata (11.3%) and Candida famata (11.3%).

Of the 71 samples, 37% were positive for the filament test. The sensibility of Cryptococcus
laurentii and Candida famata could not be determined by the equipment as it is not included
in the parameters.

Among those who were tested, we had a resistance of 5% to fluconazole, 9% to voriconazole,

0% to caspofungin; 0% Micafungin; 11% to Amphotericin; 12% flucytosine.

Identification and antifungal range remain the best way to reduce the emergence of antifungal
resistant strains used in routine practice.

KEY-WORDS: Mycoses, Antifungal, Resistance, Yeast, INRSP, Bamako

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE XCII

 Identification et antifongigramme des levures isolées au service de Bactériologie-Virologie à l’INSP

SERMENT DE GALIEN :

Je jure, en présence des maîtres de la Faculté, des conseillers de

l’Ordre des Pharmaciens, et de mes condisciples :

D’honorer ceux qui m’ont instruit dans les préceptes de mon art et de
leur témoigner ma reconnaissance en restant fidèle à leur
enseignement ;

D’exercer dans l’intérêt de la santé Publique ma profession avec

conscience et de respecter non seulement la législation en vigueur,
mais aussi les règles de l’honneur, de la probité et du
désintéressement ;

De ne jamais oublier ma responsabilité et mes devoirs envers le

malade et sa dignité humaine ;

En aucun cas, je ne consentirai à utiliser mes connaissances et mon

état pour corrompre les mœurs et favoriser les actes criminels ;

Que les hommes m’accordent leur estime si je suis fidèle à mes

promesses ;

Que je sois couvert d’opprobres et méprisé de mes confrères si j’y

manque !

Je le jure.

JACQUES ARAMA THESE DE PHARMACIE XCIII