N” 664 BuLLETIN DE L’UNION DES PHYSICIENS 1043
Chromatographie sur papier
et électrophorèse d’acides oc-aminés
par Odile DURUPTHY,
Lycée Dumont-d’urville, Toulon
André DURUPTHY,
Lycée Jean-Perrin, Marseille
et Michèle D~EUX,
Université de Provence, Marseille.
Les jus de la plupart des fruits contiennent des acides aminés
libres et des protéines. Ces substances peuvent être séparées par
chromatographie sur papier ou par électrophorèse, la séparation
étant ensuite mise en évidence par révélation à la ninhydrine.
Ces deux techniques de séparation peuvent être présentées
au lycée en classe de terminales D, à l’aide d’un matériel simple
et de produits peu coûteux.
CHROMATOGRAPHIE .
Cette technique de séparation est basée sur la différence des
coefficients de partage des divers acides aminés et protéines entre
deux solvants : l’un aqueux là un ‘pH choisi en fonction des
pH{ (*) des acides aminés à séparer), l’autre organique (alcool,
cétone...).
Un très grand nombre d’extractions successives se font entre
l’eau, phase fixe, retenue dans les pores du papier et la phase
organique mobile qui migre par capillarité.
Les acides aminés à résidus polaires (Cys, Lys, His, Asp, Arg,
Ser, Glu, Thr...) ou à petits résidus non polaires (Gly, Ala, Pro)
(*) N.D.L.R. - pH du point isoélectrique égal à 1/2 (pK,, + pK,,)
où pKG1 et pKa2 sont les pK, des couples (AH,+, AH* ) et (AH* , A-)
mis en je; par l’acide aminé. A ce pH, la concentration du zwitté-
rion AH* est maximale.
Voir chimie fondamentale. Etudes biologiques et médicales. I.
Echanges d’énergie et équilibres. J.-C. CHOTTARD, J.-C. DEPEZAY, J.-P. LE-
ROUX. Hermann, p. 94-104.
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plus solubles dans l’eau migrent peu, les autres, plus solubles dans
les solvants moins polaires, sont plus facilement entraînés (fig. 1).
J Pro
Alaf-l$9
Glu :_ $3 Thr
Q
GIY
ASP
LYS
direction de
migration du
t solvant
-‘origine
solvant :
butanol-l (40 cm31
acide éthanoïque (10 cm3)
eau (50 cm3)
Fig. 1
MANIPULATION.
Etude des acides a-aminés suivants :
A acide aspartique (10-2 mol. 1-l dans le mélange 90 Oh
eau, 10 % propanol-2),
B leucine (10-2 mol. 1-l dans le mélange 90 % eau, 10 %
propanol-2),
C lysine (10-2 mol. 1-l dans le mélange 90 % eau, 10 %
propanol-2),
D mélange équivolumique des 3 acides aminés ci-dessus,
E jus d’orange filtré,
F jus de citron filtré,
G jus de tomate filtré.
BULLETIN DE L’UNION DES PHYSICIENS 1045
Préparation des solvants :
solvant acide : 25 cm3 butanol-l + 10 cm3 acide éthanoïque
+ 15 cm3 eau,
solvant basique : 20 cm3 propanol-2 + 10. cm3 NH3 à 2 %
(192 NI.
Préparation des « cuves » :
Dans un pot haut (type Nescafé), verser la moitié du sol-
vant acide ; bien refermer. Dans 2 boîtes de Pétri, verser un fond
de solvant acide dans l’une, basique dans l’autre ; replacer les
couvercles. Dans quelques tubes à essais, verser environ 1 cm3
de solvant acide ou basique, les boucher.
Préparation des chromatogrammes :
Utiliser des gants pour éviter les traces d’acides a-aminés
des doigts.
1) Papier rectangulaire pour pot haut (papier filtre ou
Wattman), tracer au crayon, à 2 cm du bord inférieur (lon-
gueur), une ligne de base ; y repérer 7 points équidistants, les
deux extrêmes au moins à 1,5 cm des bords. Sur ces points,
placer dans l’ordre, à l’aide d’un effilé, une petite tache (0 = 5
à 6 mm) des solutions A à G. Rouler le papier en cylindre ; le
maintenir en forme à l’aide de papier collant ou d’agrafes mais
sans que les bords ne se chevauchent.
Placer ce cylindre dans le pot (fig. 2) (ligne de base en bas)
en veillant à ce qu’il ne touche pas les parois. Refermer et
laisser migrer.
Fig. 2
2) Papiers filtre ronds pour boîtes de Pétri : : découper
une languette et tracer au crayon un cercle de 2 cm de diamètre
centré sur l’origine de la mèche. Y repérer 5 points comme indi-
qué fig. 3 a. Sur ces points, placer à l’effilé des taches (0 < 5 mm)
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de 5 solutions au choix parmi les solutions A à G. Replier la
languette sur elle-même .pour lui donner une épaisseur double
et placer le cercle sur la boîte de Pétri en faisant tremper la
languette. Replacer le couvercle et laisser migrer (fig. 3 b).
Fig. 3 a
Fig. 3 b
Mvélation :
Quand le front du solvant est arrivé à 1 cm du haut (ou du
bord de la boîte de Pétri selon le dispositif de la fig. 3 b), sortir
avec des gants le chromatographe, repérer le front du solvant
par un trait de crayon. Sécher à l’air froid (sèche-cheveux froid).
Pulvériser le révélateur (ninhydrine à 2 g. 1-l dans la propanone)
sur toute la surface du chromatogramme, puis le placer 5 mi-
nutes à l’étuve à 80 OC ou au-dessus d’une plaque chauffante :
les taches violettes qui apparaissent localisent les acides &-aminés.
Les identifier.
Nota. - Ces chromatogrammes se conservent mal : les taches
s’estompent progressivement en 4 à 5 mois.
ELECTROPHORESE
Sous l’effet d’un champ électrique, les ions migrent ; leur
sens de migration dépend du signe de leur charge ; la vitesse de
déplacement dépend de leur mobilité et d’éventuelles interactions
avec un support ou des parois.
La séparation par électrophorèse consiste à placer dans un
champ électrique le mélange à séparer, à un pH tel, que les
charges des divers constituants soient, le plus possible, différentes.
Exemple : mélange leucine, acide aspartique, lysine (le
signe et la valeur des charges portées sont indiqués pour chaque
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domaine de pH). Les zones hachurées correspondent au domaine
de prépondérance des espèces neutres (zwittérions). Une telle
zone est limitée par les pK,, et pK,, de l’acide aminé considéré.
Dans la zone de 4 < pH < 8, l’électrophorèse d’un mélange
placé initialement au centre d’une bande d’électrophorèse conduit
à la séparation :
Fig. 4
MANIPULATION.
Solutions :
- tampon pH 6,l :
1 50 cm3 d’hydrogénophtalate de potassium KHCsH404
0,2 mol. 1-t
92,8 cm3 d’hydroxyde de sodium NaOH 0,l mol. 1-l
eau q.s.p. 200 cm3
ou :
15 cm3 d’hydrogénophosphate de sodium Na2HP04
1/15 mol. 1-r
85 cm3 de dihydrogénophosphate de potassium
KH2P04 1/15 mol. 1-l ;
- acides aminés de référence (cf. chromatographie) ;
- jus de fruits :
filtrats de jus de citron, d’orange, de tomate.
Montage :
Dans une grande cuve munie d’un couvercle (ou sous un
grand cristallisoir), placer deux béchers contenant des hauteurs
égales de solution tampon ; y plonger deux électrodes de graphite
neuves que l’on reliera à un générateur de courant continu per-
mettant de délivrer une tension d’environ 100 V. Entre les béchers,
un support maintenant une tige en verre à l’horizontale à envi-
1048 BULLETIN DE L’UNION DES PHYSICIENS
ron 6 cm de hauteur, permettra de suspendre en forme de V ren-
versé des bandes de papier en pont entre les béchers.
3
,trge drvcr,
Fig. 5
Prbparation des blectrophor6grammes :
En manipulant si possible avec des gants, découper des bandes
de papier Wattman de 15 cm de long par 1 à 2 cm de large; les
plonger dans la solution tampon pH 6,l ; les égoutter sur papier
filtre. Au centre de chaque bande, déposer une mince ligne de la
solution à étudier.
Electrophorèse :
Suspendre les bandes entre les béchers (3 ou 4 bandes peuvent
être suspendues en parallèle mais il faut alors veiller à ce que
leurs bords ne se chevauchent pas). Appliquer une tension d’envi-
ron 100 V pendant au moins 2 heures (l’intensité est alors d’en-
viron 2 mA). Veiller à ce que les bandes ne sèchent pas (effet
Joule) ; au besoin, on pourra les réhumidifier par pulvérisation
avec la solution tampon.
Révélation :
Egoutter et sécher les bandes puis les révéler à la ninhy-
drine (cf. chromatographie).
CONCLUSION.
Ces deux expériences sont, bien sûr, trop imprécises pour
permettre l’identification des composants des jus de fruits étu-
diés. Elles ne prétendent que présenter aux élèves des méthodes
de séparation qui, dans des conditions plus sérieuses, sont au-
jourd’hui très performantes : études très précises de sérums san-
guins, de protéines animales et végétales...
Remarque : Réaction avec la ninhydrine :
Par chauffage d’un mélange de ninhydrine (en solution dans
l’éthanol ou l’acétone) et d’acide cc-aminé, il apparaît une colo-
ration pourpre (sauf pour Pro et HPro qui donnent une colora-
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tion jaune). Les réactions qui ont lieu sont (sauf pour Pro et
HPro) :
ninh 7 dvime trisi t onc \
0
imina 2
composé b\cu-vdct
Fig. 6
BIBLIOGRAPHIE
- SMITH et FEINBERC. - Paper and thin layer chromatography and
électrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd 1965.
- Encyclopédie Universalis. - Vol. 4 : Chromatographie - Vol. 6 :
Electrophorèse.
Coût de quelques produits (T.T.C.) chez. Jeulirt :
Acide aspartique (50 9) 29 F,
Leucine (25 g) 46 F,
Lysine (10 g) 56 F,
Ninhydrine (5 g) 45 F,
Papier Wattman (25 feuilles) 93 F.
