RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
Université des Frères Mentouri Constantine

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie Animale

Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie

Filière : Sciences Biologiques

Spécialité : Génétique Moléculaire
Intitulé :

Caractérisation morphologique, biochimique et

mutagénèse des Klebsiella pneumoniae au CHU
de Constantine.
Présenté et soutenu par : BOUGHACHICHE ROUMEISSA Le : 21/06/2016
SEBAIS SAFA

Devant le Jury:
Président du jury : Mme. GHARZOULI R Maitre de conférences B (Université Constantine 1).
Rapporteur : Mme. BECHKRI S Maitre-assistante A (Université Constantine 1).
Examinateur : Mme. SAOUDI M Maitre-assistante A (Université Constantine1).

Année universitaire
2015 - 2016
 Remerciments

«Nous tenons à remercier Dieu le tout puissant de nous avoir donné le courage, la volonté et la patience
pour achever ce travail ».

Nous tenons avant tout à exprimer nos remerciements les plus sincères à notre encadreur Mme
Bechkri S, pour avoir accepté de diriger ce travail, pour ses précieux conseils, son aide, ses suggestions
sur la rédaction de ce mémoire ainsi que la confiance qu'elle nous a témoigné tout au long de cette étude.
Qu’elle trouve ici l’expression de notre reconnaissance et de notre respect.
Nous tenons également à remercier Mr Pr Benlabed K Chef du laboratoire de Microbiologie du
CHU Ben Badis de Constantine pour nous avoir accueillis au sein de leur laboratoire ainsi pour sa
disponibilité et ses pertinents conseils sans oublier tout le personnel pour leur bienveillance et leur
éclaircissement et leur appui scientifique dans la recherche.
Nos vifs remerciements pour les membres du jury à commencer par Mme Dr. Gharzouli R Maitre de
conférences B a l’Université Constantine 1. Qui nous a fait l’honneur de présider notre jury. Qu’elle
trouve ici l’expression de notre profond respect.
A Mme Saoudi M d’avoir accepté d’examiner ce modeste travail et de l'attribuer des remarques et
des corrections très intéressantes.
Nous aimerons également exprimer notre gratitude à tous nos professeurs de graduation et de
post-graduation de l’université de Constantine I, un grand merci pour vous nos enseignements de
génétique que dieu vous bénisse et vous donne la santé.
Un merci particulier à Mme. Saoudi M pour son aide et ses précieux conseils lors de la
réalisation de notre travail au sien du laboratoire des Biotechnologies.
A toute personne qui participé de prés ou de loin pour l’accomplissement de ce modeste travail.

Merci à tous……..
 Dédicace

Je tiens à dédier ce modeste travail à : Mon cher papa « El-Hacen »

école de mon enfance, qui a été mon ombre durant toutes les années des études et à mis à ma
disposition tous les moyens nécessaire pour que je réussisse, et qui a veillé tout au long de ma vie à
m’encourager, à me donner l’aide et à me protéger.
Ma chère maman « Nabiha »
qui m’a donné la vie, le symbole de tendresse, qui s’est sacrifiée pour mon bonheur et ma réussite,
quoique je fasse, je ne pourrais te rendre ce que tu as fait pour moi. Soyez fière de moi aujourd’hui et
voyez à travers ce travail mon amour sincère et ma
Gratitude profonde que dieu vous gardes et protèges pour moi inchalah.
A ma petite sœur « Sirine » et a mon chère frère « Zaki »
je vous remercie et j'espère que vous ferez mieux que votre grande sœur.
Pour l’homme de ma vie « Abdou » qui n’a jamais cessé de croire en moi, sans son aide, ses conseils
et ses encouragements ce travail n’aurait vu le jour, que dieu réunisse nos chemins pour un long
commun serein et que ce travail soit témoignage de ma reconnaissance et de mon amour sincère et
fidèle.
A ma belle famille « Kenoucha» un grand merci
A toute ma famille : oncles, tantes, cousins et cousines, petits et grands
A mes chères copines intimes « Chourouk et Houda » qui étions avec moi depuis mon enfance
Jusqu'à maintenant que dieu préserve notre amitié.
A mes très chères amies « Sofia, Amina et Rayene »
A mes chérés collègues d’environnement qui m’ont aidé durant cette période « madame Saida,
madame Lamia, Asma, Linda, Hassiba, Asma, Moufida, Khadija, Lilia et son oublié Oussama »
merci pour tout
Aussi beaucoup d’autres personnes que je n’ai pas eu l’occasion de les mentionner. Ceux qui m’ont
aidé de prés ou de loin.
A mon binôme « Safa » qui a partagé avec moi les moments difficiles de ce travail
A tous ceux qui m’aiment, a tous ceux que j’aime

Roumeissa
 Dédicace

Je Dédie ce travail.
A ma très chère mère « Salima »
Affable, honorable, aimable : tu représente pour moi le symbole de la bonté par excellence,
La source de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas cessé de m’encourager
et de prier pour moi.
Ta prière et ta bénédiction m’ont été d’un grand secours pour mener à bien mes études.
Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour
exprimer ce que tu mérite pour tous les sacrifices que tu n’as
Cessé de me donner depuis ma naissance, durant mon enfance
et même a l’âge adulte. Puisse Dieu, le tout puissant, te préserver et
t’accorder santé, longue vie et bonheur.
A mon très chèr père « Abd el-Hamid »
Pour son soutien constant, son amour et ses mots d’encouragement
qui m’ont permis de me rendre ici aujourd’hui. Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as
Consentis pour mon éducation et ma formation. Que Dieu tout puissant te garde et te procure santé,
bonheur et longue vie.
A ma chère sœur « Maroua »
En témoignage de l’attachement, de l’amour et de l’affection que je porte pour toi.
Je te souhaite un avenir plein de joie, de bonheur, de
réussite et de sérénité.
A mon cher frère « Amine »
Que ce travail te reflète ma profonde affection, que dieu te protège et te procure bonheur,
santé et prospérité.
A mes très chères amies
Imene, Radia, Rayen, Sofia, Amina, Roumeissa et Kaouther.
A mes chers collègues
Ils vont trouver ici le témoignage d’une fidélité et d’une amitié infinie.
A toute ma famille maternelle et paternelle.
A tous ce qui me sont chers.

Safa
 Sommaire
Résumé

Introduction............................................................................................................................................1

Revue bibliographique

I-Généralité sur Klebsiella pneumonia ....................................................................................................4

I-1- Dénomination ................................................................................................................................4

I-2- Présentation du genre ....................................................................................................................4

I-3- Classification.................................................................................................................................4

I-4- Habitat ...........................................................................................................................................5

I-5- Caractères bactériologiques ..........................................................................................................5

I-5-1- Caractères morphologiques ....................................................................................................5

I-5-2- Caractères culturaux ...............................................................................................................5

I-5-3- Caractères biochimiques ........................................................................................................6

I-5-4- Caractères antigéniques..........................................................................................................8

II-Pathogénicité de Klebsiella pneumoniae .............................................................................................8

II-1- Transmission ................................................................................................................................8

II-2- Génétique des Klebsiella pneumoniae .........................................................................................9

II-3- Pouvoir pathogène .....................................................................................................................10

II-4- Facteurs de pathogénicité ..........................................................................................................11

II-4-1- Antigènes de surface ...........................................................................................................12

II-4-2- Le lipopolysaccharide (LPS) ..............................................................................................12

II-4-3- La capsule ...........................................................................................................................13

II-4-4- Adhésines ............................................................................................................................13

II-4-5- Le fer ...................................................................................................................................13

II-4-6- Ilot de pathogénicité ...........................................................................................................14

III-Resistance de Klebsiella Pneumoniae aux Antibiotiques ................................................................14

III-1- Les antibiotiques.......................................................................................................................14

III-1-1- Définition...........................................................................................................................14

III-1-1- critères de classifications ...................................................................................................14

 III-1-1- Mode d’action....................................................................................................................14

III-2- Notion de la résistance bactérienne ..........................................................................................15

III-3- Types de résistance aux antibiotiques ......................................................................................15

III-3-1- Résistance naturelle ...........................................................................................................15

III-3-2- Résistance acquise .............................................................................................................16

III-4- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux β-lactamines ..........................................................16

III-4-1- Mécanismes de résistance .................................................................................................16

III-5- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux aminosides.............................................................19

III-6- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux quinolones: ............................................................20

III-6-1- résistance par la modification de la cible ..........................................................................20

III-6-2- résistance par défaut d’accumulation ................................................................................21

III-6-3- résistance plasmidiques aux quinolones ............................................................................21

IV-Agents mutagènes ............................................................................................................................21

Matériel et méthodes

I-Lieu et durée de l’étude .......................................................................................................................24

II-Echantillonnage .................................................................................................................................24

III-Matériel utilisé ..................................................................................................................................24

IV-Milieux de culture ............................................................................................................................25

IV-1- Milieux de culture solides ........................................................................................................25

IV-2- Milieux de culture liquides.......................................................................................................25

IV-3- Milieux d’identification biochimiques et métaboliques ...........................................................25

V-Colorants et réactifs ...........................................................................................................................25

VI-Méthodologie ...................................................................................................................................25

VI-1- Prélèvements ............................................................................................................................25

VI-2- Transport ..................................................................................................................................26

VI-3- Analyse des prélèvements au laboratoire .................................................................................26

VI-3-1- Examen macroscopique ....................................................................................................27

VI-3-2- Examens microscopiques ..................................................................................................27

 VI-3-3- Culture ...............................................................................................................................28

VI-3-4- Isolement et purification ...................................................................................................29

VI-3-5- Critères d’identifications de Klebsiella pneumoniae ........................................................29

VI-3-6- Étude de la sensibilité aux antibiotiques ...........................................................................31

VII-Mutagénèse .....................................................................................................................................33

VII-1- Définition ................................................................................................................................33

VII-2- But ...........................................................................................................................................34

VII-3- Mode opératoire ......................................................................................................................34

VII-3-1- Préparation de la suspension bactérienne ........................................................................34

VII-3-2- Préparation et stérilisation du matériel utilisé ..................................................................34

VII-3-3- Dilution ............................................................................................................................35

VII-3-4- Ensemencement sur la Gélose Nutritive ..........................................................................35

VII-3-5- Irradiation.........................................................................................................................35

Résultats et discussion

I-Prélèvements .......................................................................................................................................38

I-1- Distribution des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement ..................................38

I-2- Distribution des souches parmi les prélèvements cliniques ........................................................38

I-3- Distribution des souches de Klebsiella pneumoniae selon le sexe .............................................39

II-Analyse des prélèvements au laboratoire ..........................................................................................40

II-1- Examen macroscopique .............................................................................................................40

II-2- Examen microscopique ..............................................................................................................41

II-2-1- Etat frais ..............................................................................................................................41

II-2-2- Bleu de méthyle ..................................................................................................................41

II-2-3- Coloration de Gram ............................................................................................................41

II-3- Critères d’identification de Klebsiella pneumoniae. .................................................................41

II-3-1- Identification par galeries classique....................................................................................41

II-4- Etude de la sensibilité aux antibiotiques ....................................................................................43

II-4-1- Antibiogramme ...................................................................................................................43

 II-4- Les phénotypes de résistance de K. pneumoniae aux antibiotiques ..........................................45

II-4-1- Phénotypes de résistance aux β-lactamines ........................................................................46

II-4-2- Phénotypes de résistance aux aminosides ...........................................................................47

II-4-3- Phénotypes de résistance aux quinolones ...........................................................................48

III-Mutagénèse .......................................................................................................................................49

Conclusion ............................................................................................................................................52

Références bibliographiques ...............................................................................................................54

Annexes
 Liste des abréviations

 ADH : Arginine déhydrolase

 AmpC : Bêta-lactamase chromosomique
 ARN : Acide ribonucléique
 ARNm : Acide ribonucléique messager
 ARNr : Acide ribonucléique ribosomique
 ARNt : Acide ribonucléique de transfert
 ATB : Antibiotique
 BK : Bacille de Koch
 BLSE : β-lactamase à spectre étendu
 BMR : Bactéries multi-résistantes
 C : Chloramphenicol
 C+G % : Pourcentage en guanine + cytosine du génome (anciennement coefficient de
Chagraff)
 C1G : Céphalosporine de première génération
 C2G : Céphalosporine de deuxième génération
 C3G : Céphalosporine de troisième génération
 CHUC : Centre Hospitalo-Universitaire de Constantine
 CTX-M : Céfotaximase-Munich
 FOX : Gène codant pour une céphalosporinase
 H2S : sulfure d'hydrogène
 I : Intermédiaire
 Iga : immunoglobuline A
 IU : Infection Urinaire
 Kb : kilo bases
 K.Pneumoniae : Klebsiella pneumoniae
 KPC : Klebsiella pneumoniae Carbapenemase
 LCR : Liquide céphalorachidien
 LDC : Lysine décarboxylase
 LPS : lipo-polysaccharide
 NHSN : National Healthcare Safety Network
 nm : nanomèttre
 ODC : Ornithine décarboxylase
 ONPG : Orthonitrophényl-β-D-galactopyranoside
 ORL : Oto-rhino-laryngologie
 PBN : Pénicillinase de bas niveau
 PHN : Pénicillinase de haut niveau
 R : Résistante
 RM : Rouge de Méthyle
 S : Sensible
 SHV : Sulfydryl variable
 Sub sp : sous espèce
 TDA : Tryptophane désaminase
 TEM : D’après Temoniera : nom du malade chez qui la première souche a été isolée
 TSI : Triple Sucre à Identifié
 UV : Ultra-violets
 VIH : Virus de l'immunodéficience humaine
 VP: Voges-Proskauer
 μm : micromètre
 Liste des figures

Figure 1 : Aspect des colonies de K. pneumoniae sur milieu gélosé (Gueye, 2007). ............................6
Figure 2: Séquence du génome complet de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286 (Liu
et al., 2012). .............................................................................................................................................9
Figure 3 : Représentation schématique des facteurs de pathogénicité de K. pneumoniae (Podschun et
Ullmann, 1998). .....................................................................................................................................12
Figure 4 : Mécanisme d’action des antibiotiques (Paul H. Roy, 1997). ...............................................15
Figure 6 : Formation de dimère de pyrimidines (Klug et Spencer, 2006). ...........................................22
Figure 7 : Galerie biochimique témoin de Klebsiella pneumoniae. ....................................................29
Figure 8 : Antibiogramme de Klebsiella pneumoniae. .........................................................................32
Figure 9: Répartition des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement..............................38
Figure 10 : Répartition de Klebsiella pneumoniae parmi les prélèvements cliniques. .........................39
Figure 11 : Distribution des souches de K. pneumoniae selon le sexe. ................................................40
Figure 12: Aspect des colonies des Klebsiella pneumoniae sur milieu Hektoen. ...............................40
Figure 13 : Coloration de Gram de Klebsiella pneumoniae. ................................................................41
Figure 14 : Résultats de galerie biochimique de K. pneumoniae. ........................................................42
Figure 15 : Résultats d’antibiogramme d’une souche Klebsiella pneumoniae. ...................................43
Figure 16 : Taux de résistance de Klebsiella pneumoniae aux β-lactamines. ......................................44
Figure 17 : Taux de résistance de K. pneumoniae aux autres classes d’antibiotiques. ........................45
Figure 18 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux β-lactamines ............................46
Figure 19 : Représentation graphique des phénotypes de résistance de K. pneumoniae aux
Aminoside. .............................................................................................................................................47
Figure 20: Représentation graphique des phénotypes de résistance de Klebsiella pneumoniae aux
Quinolones. ............................................................................................................................................48
Figure 21 : Klebsiella pneumoniae sauvage et mutante .......................................................................49
Figure 22: la courbe de survie de la souche Klebsiella pneumoniae. ..................................................50
 Liste des tableaux

Tableau 1 : Principaux caractères biochimiques de K. pneumoniae (Joly et Reynaud, 2002). ..............7

Tableau 2 : Caractères biochimiques d’identification des espèces du genre Klebsiella (Freney et
Riegel, 2007)............................................................................................................................................7
Tableau 3 : Distribution des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement. .......................38
Tableau 4 : Répartition des souches de K. pneumoniae parmi les prélèvements cliniques. ................39
Tableau 5 : Distribution des souches de K. pneumoniae selon le sexe. ...............................................39
Tableau 6 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux β-lactamines............................46
Tableau 7 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux Aminosides. ............................47
Tableau 8 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux quinolones. .............................48
Tableau 9 : Temps d’irradiation et pourcentage de survie de la souche Klebsiella pneumoniae.........49
 Résumé

Résumé

Klebsiella pneumoniae est une bacterie pathogène opportuniste. elle est le chef de file des germes
responsables d’infections nosocomiales sévères et difficiles à traiter, L’augmentation et la dissémination
de la résistance aux antibiotiques chez les bacilles à Gram négatif, notamment chez K. pneumoniae,
représente un problème majeur de santé publique.

La mise en évidence du caractère épidémique de l’infection est importante pour la mise en oeuvre
rapide des mesures préventives. Dans ce but, nous nous sommes fixés les objectifs suivants :
l’identification de 20 souches de K.P selon ses caractères biochimiques, isolées a partir des différents
prélèvements cliniques au niveau du service de microbiologie du CHU Benbadis Constantine, L’étude de
la résistance aux antibiotiques des souches de K.P et déterminer leurs phénotypes de résistance, a la fin
une mutagénèse a été réalisé par irradiation des souches au Rayons Ultra-violets pour déterminer leurs
effets sur la survie de ces bactéries.
Les résultats issus de cette étude ont montré une résistance élevée des souches cliniques de K.pneumoniae
à la majorité des antibiotiques cliniquement utilisés particulièrement aux β-lactamines 50 % des souches
étaient productrices de BLSE.

Mots clés
Klebsiella pneumoniae – isolement – identification – caractères biochimiques – résistance -antibiotiques –
phénotypes – BLSE – irradiation U.V – survie des bacteries.
 Résumé

Abstract

Klebsiella pneumoniae is an opportunistic pathogen bacterium. It is the leader of the germs

responsible for severe nosocomial infections and difficult to treat. The increase and spread of antibiotic
resistance among Gram-negative bacilli, especially in K. pneumoniae is a major public health problem.
The identification of the epidemic of infection is important for the quick implementation of preventive
measures, For this purpose, we have set the following objectives : The identification of 20 strains of
k.pneumoniae according to its biochemical characteristics, isolated from different clinical samples at the
microbiology department of University Hospital Center Benbadis Constantine. The study of the resistance
of K.P strains against the antibiotics and determine their resistance phenotypes, at the end, a mutagenesis
was performed by the irradiation of the strains by the ultraviolet rays, in order to determine their effects
on the survival of these bacteria.
The results of this study showed a high resistance of clinical isolates of K. pneumoniae to the
majority of antibiotics clinically used particularly to β-lactams; which 50 % of the strains were ESBL-
producers.

Key words:
Klebsiella pneumoniae, isolation, identification, biochemical characteristics, resistance, antibiotics,
phenotypes, ESBL, ultraviolet rays, survival of bacteria.
 ‫‪Résumé‬‬

‫ملخص‬
‫الكلبسيلة الرئوية هي بكتيريا انتهازية ممرضة‪ ،‬و هي الرائدة في الجراثيم المسؤولة عن عدوى المستشفيات المستعصية وصعبة‬

‫العالج‪ ،‬زيادة وانتشار المقاومة للمضادات الحيوية في العصيات سلبية الغرام‪ ،‬خصوصا عند الكلبسيلة الرئوية ‪ ،‬يشكل مشكلة رئيسية‬

‫للصحة عامة ‪.‬‬

‫تحديد وباء العدوى مهم لسرعة تنفيذ التدابير الوقائية‪ .‬لهذا الغرض‪ ،‬وضعنا األهداف التالية‪ :‬تحديد ‪ 02‬ساللة من الكلبسيالت الرئوية‬

‫وفقا لخصائصها البيوكيميائية ‪ ،‬معزولة من عينات سريرية مختلفة في قسم علم األحياء الدقيقة بالمستشفى الجامعي ابن باديس قسنطينة‪،‬‬

‫دراسة مقاومة سالالت الكلبسيالت الرئوية للمضادات الحيوية و كذلك تحديد مظاهرالمقاومة للمضادات الحيوية الخاصة بهم‪ ، .‬في النهاية‬

‫إحداث طفرات في هده السالالت بواسطة األشعة فوق البنفسجية لتحديد آثارها على بقاء هذه البكتيريا‪.‬‬

‫أظهرت نتائج هذه الدراسة وجود مقاومة عالية من طرف العزالت السريرية للكلبسيالت الرئوية لمعظم المضادات الحيوية المستخدمة‬

‫سريريا خاصة اتجاه البيتا الكتامين )‪ (β-lactamines‬حيث ‪ ٪ 02‬من السالالت كانت منتجة ل ‪.BLSE‬‬

‫الكلمات المفتاحية ‪:‬‬

‫الكلبسيلة الرئوية ‪ -‬عزل ‪ -‬تحديد ‪ -‬الخصائص البيوكيميائية – المقاومة ‪ -‬المضادات الحيوية – الظواهر‪ - BLSE -‬األشعة فوق البنفسجية‬

‫‪ -‬بقاء البكتيريا‪.‬‬
Introduction
 Introduction

Introduction
Les infections nosocomiales constituent un problème majeur de santé publique reconnu à
l’échelon mondial. Ces maladies suscitent autant d'inquiétudes que d'interrogations, depuis l'utilisation de
l'antibiothérapie, elles sont progressivement changées de visage et les cliniciens ont été confrontés à des
infections à germes autrefois réputés non pathogènes ou saprophytes. L’un des exemples le plus frappant
pour illustrer ce propos est Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae).
Klebsiella pneumoniae est une entérobactérie qui fait partie des espèces commensales de l’homme
et des animaux, c'est-à-dire des flores normales du sujet sain (Kariuki et al., 2007). Elle est responsable
d’infections communautaires (urinaires et respiratoires) et d’infections opportunistes chez les malades
hospitalisés (infections urinaires, broncho-pulmonaires, septicémies avec choc, de pneumonies et de
bactériémies) (Berrazeg et Rolain, 2013). D'après le rapport de l'European Antibiotics Resistance
Surveillance System (EARSS) de 2008, elle est responsable de plus de 10 % des infections nosocomiales.
Les espèces du genre Klebsiella sont présentes dans le monde entier, en particulier dans les
régions tropicales et subtropicales. Elles sont ubiquistes, c’est-à-dire qu’on les rencontre partout,
notamment dans les milieux forestiers, la végétation, le sol, l’eau et les muqueuses des espèces hôtes
(Janda et Abbott, 2006). Le risque d’infection et le taux de portage de Klebsiella augmentent avec la
durée du séjour à l’hôpital. D’après une étude, le taux de portage augmente de 11 à 42 % en 14 jours
d’hospitalisation (Janda et Abbott, 2006). Par ailleurs, les taux d’infection et de portage augmentent
avec l’utilisation d’agents antimicrobiens, ce qui conduit en général à l’apparition de bêta-lactamases à
large spectre qui confèrent une résistance aux antibiotiques (Janda et Abbott, 2006 ; Podschun et
Ullmann, 1998).
L’augmentation à l’échelle mondiale de la résistance médiée par les Klebsiella pneumoniae
productrices de β-lactamases à spectre élargi (BLSE) constitue une menace importante pour la santé
publique, puisque des souches de K. pneumoniae BLSE+ résistantes à toutes les β-lactamines ont été
isolées. D'après le Réseau d'Alerte d'Investigation et de Surveillance des Infections Nosocomiales
(RAISIN) de France, en 2001. Au niveau national, et selon le réseau de surveillance de la résistance des
bactéries aux antibiotiques (2007-2008), sur 3277 bactéries multi résistantes toutes espèces confondues,
isolées en milieu hospitalier et sur un effectif global de 13620 isolats, K. pneumoniae vient en tête avec
31,5 % des cas. Le réseau rapporte aussi que 46,2 % des souches de K. pneumoniae isolées à l'hôpital sont
des BLSE. Les souches résistantes aux β-lactamines sont souvent résistantes aux autres familles
d'antibiotiques laissant le champ thérapeutique très réduit. Le service de microbiologie du CHU Benbadis
enregistre en moyenne 400 souches de K. pneumoniae par an, faisant de cette espèce la deuxième
entérobactérie isolée par ordre de fréquence après E. coli.

1
 Introduction

C’est dans ce contexte général que nous avons choisi de mener ce travail de mémoire sur Klebsiella
pneumoniae, qui a pour objectifs :

- L’enrichissement des connaissances bactériologiques et génétiques concernant K. pneumoniae, on

réalisant une recherche bibliographique approfondie.
- L’isolement et l’identification des souches de K. pneumoniae au niveau du service de
microbiologie du CHU Benbadis Constantine durant une période de deux mois.
- L’étude de la résistance aux antibiotiques des souches de K. pneumoniae et déterminer leurs
phénotypes de résistance.
- Effectuer une mutagénèse en irradiant une souche de K. pneumoniae par un agent mutagène
physique (Rayons Ultras Violets) et observer les résultats obtenus. Cette manipulation a été
effectuée au sein du laboratoire des biotechnologies de la faculté des sciences de la nature et de la
vie.
Le présent mémoire est structuré en :
- Une introduction
- Une revue bibliographique
- Une partie pratique incluant :
 Matériel et méthodes
 Résultats et discussion
- Une conclusion.

2
Revue bibliographique
 Revue bibliographique

I- Généralité sur Klebsiella pneumoniae

I-1- Dénomination
Le nom Klebsiella provient du nom du bactériologiste Klebs (1877) et l’espèce type dénommée
«pneumobacille» par Friedlander qui l’a décrit comme agent de pneumonies mortelles pendant la période
1882- 1884 (Duca et Furtunescu, 1979).

I-2- Présentation du genre

Les espèces du genre Klebsiella sont des bactéries en forme de bâtonnet et font partie de la famille
des Enterobacteriaceae. Elles se distinguent par leur immobilité constante, et leur groupement en
diplobacilles. Elles sont souvent encapsulées et forment des colonies mucoïdes (Janda et Abbott, 2006;
Abbott, 2007). Les Klebsielles sont ONPG positives et VP positif caractère clé ; car elles font partie du
groupe ‘’KESH’’= KLEBSIELLA ENTEROBACTER SERRATIA HAFNIA. Ces entérobactéries, sont
fréquemment responsables d'infections hospitalières.
Ce genre comporte 5 espèces différenciées par des caractères biochimiques, l’espèce type est
Klebsiella pneumoniae parce qu’elle est la plus fréquemment retrouvée en clinique humaine (Brisse et
Grimont, 2006 ; Carbonnelle et Vargues, 1987). Cette bactérie possède toutes les caractéristiques des
Enterobacteriaceae. C’est une bactérie commensale de l’homme et des animaux. Elle est responsable
d’infections communautaires (urinaires et respiratoires) et d’infections opportunistes chez les malades
hospitalisés (Avril et al., 2000 ; Iliaquer, 2010).

I-3- Classification
Règne : Bacteria
Embranchement : Proteobacteria
Classe : Gamma Proteobacteria
Ordre : Enterobacteriales
Famille : Enterobacteriaceae
Genre : Klebsiella
Espèce : Klebsiella pneumoniae Subsp. Ozenae.
Subsp. Pneumoniae.
Subsp. Rhinoscleromatis

Klebsiella oxytoca
Klebsiella planticola
Klebsiella terrigena
Klebsiella ornithinolytica. (George et al, 2004).

4
 Revue bibliographique

I-4- Habitat
Les espèces du genre Klebsiella sont présentes dans le monde entier, en particulier dans les
régions tropicales et subtropicales. Elles sont ubiquistes, c’est-à-dire qu’on les rencontre partout,
notamment dans les milieux forestiers, le sol, eaux de surface, eaux usées, effluents industriels
(papeteries, minoteries, scieries, usines textiles…), le bois, les végétaux divers, les aliments et les
muqueuses des espèces hôtes (Janda et Abbott, 2006). Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca sont
répandues dans la nature. On peut les isoler de l’eau, de végétaux, d’aliments divers. Ces deux espèces
sont rencontrées dans la flore fécale de 30 à 40 % des animaux sauvages ou domestiques et de l’homme.
On peut les rencontrer aussi à l’état commensal sur la peau, les muqueuses et les voies respiratoires
supérieures. Klebsiella ozaenae et Klebsiella rhinoscleromatis ne sont pratiquement isolées que de l’arbre
respiratoire de l’homme (Leon et Michel, 1989). Le portage digestif de Klebsiella est plus important chez
les malades hospitalisés que dans la population normale. Sur les mains du personnel et sur les objets de
l’environnement dans les services hospitaliers, la présence de Klebsiella est très fréquente (Fauchere et
Avril, 2002).

I-5- Caractères bactériologiques

I-5-1- Caractères morphologiques
Les Klebsiella sont des bacilles à Gram négatif (coloration bipolaire fréquente), toujours
immobiles, de dimensions comparables à celles d’Escherichia coli (0,3 à 1,0 µm de diamètre sur 0,6 à 6,0
µm de longueur), très souvent encapsulées. Cette capsule de nature polysaccharidique contient des acides
hexuroniques (acides glycuronique et galacturonique) et de 2 à 4 sucres (galactose, glucose, mannose,
fucose, rhamnose). La taille des capsules va en croissant de Klebsiella oxytoca (20 à 25 % de souches non
capsulées) à Klebsiella pneumoniae (5 % environ de souches non capsulées) et surtout à Klebsiella
ozaenae et Klebsiella rhinoscleromatis qui possèdent de volumineuses capsules. La culture sur milieu
sucré, tel que le milieu hypersaccharosé de Worfel-Ferguson favorise la formation de capsules. Au
contraire, l’évolution vers des formes non capsulées peut être obtenue par croissance en bouillon bilié à
50 % (Richard et Grimont, 1992). Les Klebsiella ont un poids moléculaire d’environ 3,36.109 daltons
(Leclerc, 1983).
I-5-2- Caractères culturaux
Sur les milieux classiques d’isolement pour les entérobactéries (Drigalski, EMB, Hektoen, Mac
Conkey), les colonies de Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca sont lactoses positives, bombées,
muqueuses, parfois filantes à l’anse de platine (Le Minor et Véron, 1989 ; Freney et Bollet, 2000), d’un
o
diamètre de 3 à 4 mm en 18 à 24 heures à 37 C. La croissance de Klebsiella ozaenae et Klebsiella
rhinoscleromatis sur les mêmes milieux est quelquefois plus lente (48 heures), leurs colonies sont alors

5
 Revue bibliographique

volumineuses, bombées, muqueuses, translucides, avec tendance à la confluence. Des milieux sélectifs
ont été proposés pour l’isolement des Klebsiella lors d’épidémies hospitalières ou pour la numération de
leurs colonies en bactériologie alimentaire : milieu « MacConkey- inositol- carbénicilline » (croissance
possible des Serratia), milieu synthétique de Bruce et coll (au citrate- L- ornithine- raffinose- rouge de
phénol, pH 5,6), milieu synthétique de Wong et coll (au lactose-KNO3- rouge neutre- cristal violet),

milieu synthétique de Van Kregten et coll (au citrate-inositol).

o
En milieu liquide (bouillon nutritif, eau peptonée), la culture est rapide (quelques heures) à 30 et
o
37 C pour Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca avec parfois dépôt muqueux et collerette
o
visqueuse en surface. A 10 C, seules se développent Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola et 60 %
des souches de Klebsiella oxytoca. A la différence des autres espèces de Klebsiella, plus de 90 % des
o
souches de K.pneumoniae croissent à 44 C en bouillon lactosé bilié vert brillant et plus de 80 % en
fermentant le lactose avec production de gaz (test des « coliformes fécaux » positif) (Le Minor et Véron,
1989).

Figure 1 : Aspect des colonies de K. pneumoniae sur milieu gélosé (Gueye, 2007).

I-5-3- Caractères biochimiques

Les klebsiella sont des bactéries immobiles, non sporulées, aéro-anaérobies, ayant un métabolisme
respiratoire et fermentatif, fermentant le glucose avec production de gaz, oxydase négative, catalase
positive, ODC négative, ADH négative, tryptophane désaminase et phénylalanine désaminase négatives,
bêta-glucoronidase négative. N’hydrolysant ni l'ADN ni le Tween 80, ne produisant pas d'hydrogène
sulfuré et fermentant de nombreux sucres dont l'inositol. Réaction de Voges-Proskauer positive (VP+) et
uréase + (Jarlier et Nordman, 2000 ; Nauciel, 2000).

6
 Revue bibliographique

 Klebsiella pneumoniae peut être définie comme une Entérobactérie immobile, VP +, RM -, uréase
+ lentement (uréase moins active que celle des Proteus), ONPG +, β-xylosidase +, H2S -, indole -,

désaminase oxydative -, LDC +, ODC -, lipase, DNase et gélatinase -, KCN +, fermentant de

nombreux substrats glucidiques avec production de gaz, utilisant le citrate de Simmons et le
malonate.

Tableau 1 : Principaux caractères biochimiques de K. pneumoniae (Joly et Reynaud,

2002).
Glucose Indole ONPG Gaz Mobilité VP RM TDA H2S ODC ADH LDC Citrate

+ - + + - + - - - - - + +

 Klebsiella oxytoca se différencie de Klebsiella pneumoniae par la production constante d’indole.

Environ 80 % des souches possèdent de plus une gélatinase d’activité modérée, 20 % une TTR.
Toutes les souches de Klebsiella oxytoca fermentent le sorbose. Klebsiella ozaenae et Klebsiella
rhinoscleromatis, outre le caractère VP -, sont moins glucidolytiques que les deux espèces
précédentes. Klebsiella ozaenae n’utilise jamais le malonate. Klebsiella rhinoscleromatis est
caractérisée par une stricte auxotrophie, l’absence de production de gaz et une activité
biochimique réduite.

Tableau 2 : Caractères biochimiques d’identification des espèces du genre Klebsiella (Freney

et Riegel, 2007). V : variable.
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Subsp. Subsp. Subsp.
pneumoniae ozaenae rhinosleromatis
Indole - - - +
ODC - - - -
LDC + v - +
VP + - - +

 Certaines souches de Klebsiella pneumoniae et de Klebsiella oxytoca peuvent paraître « uréase - »

après 24 heures à 37°C si on utilise des cultures sur gélose nutritive et un milieu réactif à l’urée du
type Ferguson (par exemple, milieu « urée-indole »). Chez plus de la moitié de ces souches,
l’uréase peut être mise en évidence en quelques heures, lorsqu’elles ont été cultivées sur des
milieux contenant des sucres fermentescibles (milieu de Hajna ou milieu hypersaccharosé de

7
 Revue bibliographique

Worfel-Ferguson) : la fermentation des glucides, en acidifiant les milieux de culture, favorise la

synthèse de l’uréase par les Klebsiella. L’autre moitié de ces souches, effectivement dépourvues
d’uréase, acidifie pour une raison inconnue le milieu «urée-indole », dont l’indicateur vire au
jaune citrin (Courvalin et Phillippon, 1989).
I-5-4- Caractères antigéniques
Les Klebsiella possèdent des antigènes O (somatiques), et K (capsulaires). La recherche des
antigènes O présente peu d’intérêt pratique, en raison de leur nombre réduit (13 antigènes O différents) et
de la difficulté de leur détermination par suite du caractère thermostable des antigènes capsulaires K qui
masquent l’agglutination O (Singleton, 2005). La recherche des antigènes K est indispensable à toute
enquête épidémiologique. Ils sont recherchés par agglutination sur lame ou en tubes, ou encore par la
réaction de Neufeld dite du « gonflement » de la capsule (opacification de la capsule résultant d’une
réaction antigène-anticorps).
Il existe 77 types capsulaires, soit K1 à K72, K74, K79 à 82. Les souches les plus souvent
pathogènes pour l'homme et les animaux appartiennent au type capsulaire 1 et 2, plus rarement 3 et 4 K
(Struve et al., 2003). Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca se distribuent selon un grand nombre
de types capsulaires. K. pneumoniae type capsulaire K1 croît plus lentement et après 48 heures
d'incubation, les colonies sont volumineuses, bombées, très muqueuses translucides et elles présentent
une tendance à la confluence (Riegel, 2003 ; Fauchère et Avril 2002). Klebsiella ozaenae appartient
généralement au type 4, plus rarement aux types 1, 5, 6, 22. Klebsiella rhinoscleromatis uniquement au
type 3 (Euzéby, 2004). Il existe des communautés antigéniques K entre Klebsiella pneumoniae,
Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli et d’autres entérobactéries quand elles sont capsulées
(Richard et Grimont, 1992).

II- Pathogénicité de Klebsiella pneumoniae

II-1- Transmission
Klebsiella pneumoniae est responsable d’infections spontanées dans 25% des cas, mais surtout
d’infections nosocomiales sévères et difficiles à traiter (Arafa et al., 2009). La transmission de ces
bactéries d’un patient à un autre se fait facilement par les mains du personnel soignant ou les instruments
de travail du personnel médical ou paramédical (cathéter, masque à oxygène…) (Raud, 2003), ou moins
souvent par la contamination de l’environnement. La transmission de K. pneumoniae est très facile et
rapide mais ne se propage pas dans l’air. Elle est pathogène chez l’immunodéprimé, souvent traité par les
antibiotiques, chez lequel elle est parfois inoculée lors de manœuvres dans un but diagnostique ou
thérapeutique. Les paramètres de santé sont les plus vulnérables aux infections à Klebsiella en raison de la

8
 Revue bibliographique

nature des procédures qui permettent un accès facile des bactéries dans le corps et causer cette infection
mortelle (Boston Medical Research Occupational Health Program, 2012).

II-2- Génétique des Klebsiella pneumoniae

La figure 2 représente une souche résistante aux carbapénèmes appartenant au clone dominant ST11 de
Klebsiella pneumoniae en Chine.

Figure 2: Séquence du génome complet de Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286

(Liu et al., 2012).

La souche multirésistante de K. pneumoniae HS11286 a été isolée à partir d'un échantillon de

crachat en 2011 à l'Hôpital Huashan, Shanghai, Chine. Elle se compose de sept réplicons circulaires, y
compris un chromosome (ADN bicaténaire) et six plasmides. Le chromosome (5332752 pb, 57,5%
teneur en G + C) code pour 5316 protéines putatives et réalise 87 ARNt , 1 ARNm, et 8 copies de l’ARNr
16S-23S-5S (Shao et al., 2010). Six plasmides se produisent naturellement dans la souche K.
pneumoniae:
- pKPHS1 (122 799 pb, 49,5% teneur en G + C).
- pKPHS2 (111 195 pb, 53,3% teneur en G + C).
- pKPHS3 (105 974 pb, 52,5% teneur en G + C).
- pKPHS4 (3751 pb, 52,2% teneur en G + C).
9
 Revue bibliographique

- pKPHS5 (3353 pb, 42,8% teneur en G + C).

- pKPHS6 (1308 pb, 47,9% teneur en G + C).
pKPHS1 code pour un bêta-lactamase a spectre étendu CTX-M-14.
pKPHS2 porte le bla TEM-1 et le bla du gène carbapénème KPC-2 et a une épine dorsale similaire avec
le récemment rapporté le plasmide pKP048 de K. pneumoniae (Jiang et al. 2010).
pKPHS3 possède 13 déterminants de résistance importants, tels que tetG, chat, sul1, dfra12, aac
(HennequinC et Forestier, 2007) -Ia et aph, et est le plus semblable à un plasmide Yersinia pestis,
pIP1202 (Galimand et al., 1997). Remarquablement, les gènes de transfert de conjugaison tels que tra
dans pKPHS2 et pKPHS3 peuvent conduire à la propagation de la multirésistance entre les différents
genres. Les trois petits plasmides pKPHS4, pKPHS5 et pKPHS6 codent pour des protéines inconnues. À
notre connaissance, le plasmide pKPHS6 de 1-kb est le plus petit plasmide de K. pneumoniae jamais
identifié. Certaines souches de Klebsiella pneumoniae et Klebsiella oxytoca hébergent des plasmides qui
possèdent des gènes (nif) qui leur permettent de fixer l’azote atmosphérique. Ces plasmides peuvent être
transférés à Escherichia coli K12 (Kone Koumba Diallo, 2010).

II-3- Pouvoir pathogène

Les espèces du genre Klebsiella sont d’importants pathogènes communs, à l’origine de
pneumonies nosocomiales (7 à 14 % de tous les cas), de septicémies (4 à 15 %), d’infections urinaires (6
à 17 %), d’infections de plaies (2 à 4 %), d’infections survenant dans les unités de soins intensifs (USI) (4
à 17 %) et de septicémies néonatales (3 à 20 %) (Janda et Abbott, 2006). Elles peuvent également causer
des bactériémies et des infections hépatiques et ont été isolées dans un grand nombre d’infections
inhabituelles, notamment des cas (d’endocardite, d’abcès médiastinal primaire gazeux, de péritonite, de
cholécystite aiguë, de myonécrose crépitante, de pyomyosite, de fasciite nécrosante, d’abcès du psoas,
d’infection de l’espace fascial au niveau de la tête et du cou, et d’arthrite septique) (Janda et Abbott,
2006). Ce sont également des pathogènes opportunistes importants, en particulier chez les personnes
immunodéprimées.
Klebsiella pneumoniae est un agent classique et majeur d’infections nosocomiales chez l’enfant
soit de 19,6 % en Chine et de 22,7 % d’infections nosocomiales en service de néonatologie et de
réanimation pédiatrique en général et néonatales particulièrement en Europe (Boukadida et Salem,
2002). Elle est l’une des principales espèces bactériennes impliquées dans les IU soit de 6 à 17 %
d’infection (Ben Haj Khalifa et Khedher, 2010). Selon le NHSN (National Healthcare Safety Network),
K. pneumoniae est responsable de 7,9 % de l’ensemble des infections urinaire aux Etats-Unis, classée
ainsi en cinquième position parmi tous les agents pathogènes incriminés. Cependant, en Tunisie, d’après
le réseau de l’Anti bio-Résistance en Tunisie (LART), K. pneumoniae est essentiellement isolée
d’infections urinaires en milieu hospitalier avec un taux de 60,4 % (Nedjai et Barguigua, 2011). K.
10
 Revue bibliographique

pneumoniae fait partie du groupe KESH qui est d’une grande importance en clinique hospitalière
(Podschun et Ullmann, 1998).
 K. pneumoniae subsp. pneumoniae est surtout actuellement un agent d'infections nosocomiales,
responsable d'infections urinaires sur sonde, de bactériémies de pneumonies, d'infections de sites
opératoires et d'infections néonatales (Carpenter, 1990).
 K. pneumoniae subsp. ozaenae est responsable d'une rhinite chronique atrophique décrite sous le
nom d'ozène. Cette infection se manifeste par une ulcération chronique de la muqueuse nasale
pouvant aboutir à une perforation du cartilage nasal, accompagnée de décharges nasales
purulentes (Podschun et Ullmann, 1998). Elle a été également isolée à partir de surinfections de
bronchite chronique, de bactériémies, de méningites, d'abcès cérébraux d'otites, de mastoïdites,
d'infections urinaires, de surinfections de plaies et d'ulcères de la cornée.
 K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis est responsable du rhinosclérome, infection
granulomateuse chronique des voies aériennes supérieures, dont quelques cas ont été rapportés
chez des patients infectés par le VIH. Un cas de septicémie a été rapporté (Strampfer et Cunha,
1987).
Les facteurs de pathogénicité des espèces du genre Klebsiella comprennent des adhésines, des
sidérophores, des polysaccharides capsulaires, des lipopolysaccharides de surface cellulaire (LSP) et des
toxines, qui jouent chacun un rôle particulier dans la pathogenèse associée à ces espèces. Selon le type
d’infection et le mode d’infectivité, les bactéries du genre Klebsiella peuvent, en vue de les attaquer,
adhérer aux cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures, aux cellules du tractus gastro-
intestinal, aux cellules endothéliales ou aux cellules uroépithéliales, avant de coloniser les muqueuses.
Les affections sous-jacentes sont souvent l’alcoolisme, le diabète sucré, l’atteinte chronique du foie
(cirrhose), l’insuffisance rénale chronique, le cancer, les greffes, les brûlures et l’utilisation de cathéters
(Janda et Abbott, 2006).

II-4- Facteurs de pathogénicité

Les facteurs de pathogénicité de K. pneumoniae sont représentés dans la figure 3.

11
 Revue bibliographique

Figure 3 : Représentation schématique des facteurs de pathogénicité

de K. pneumoniae (Podschun et Ullmann, 1998).

Les termes facteurs de pathogénicité et facteurs de virulence sont souvent utilisés comme
synonymes. Mais certains auteurs font une distinction claire entre les deux : le terme
pathogénicité définit la capacité de la bactérie à causer une maladie alors que la virulence est la mesure ou
le degré de pathogénicité (Podschun et Ullmann, 1998).
II-4-1- Antigènes de surface
Deux types d'antigènes sont exprimés à la surface de K. pneumoniae. Ces deux antigènes
contribuent à la pathogénie de cette bactérie. Le premier est l'antigène (O) qui est le composant du
lipopolysaccharide et dont 9 types ont été identifiés. Le second est l'antigène capsulaire (K), un
polysaccharide capsulaire dont 82 ont été décrits et 77 caractérisés.
II-4-2- Le lipopolysaccharide (LPS)
Le LPS est formé de plusieurs composés : le lipide A de structure oligosaccharidique et l'antigène
"O". L'antigène "O", composé le plus externe du LPS, est formé d'unités répétées de polymères
d'oligosaccharides. Le lipide A correspond à l'endotoxine des bactéries à Gram négatif et participe au
pouvoir pathogène. Sa libération massive dans la circulation au cours des bactériémies conduit au choc
endotoxinique. Le rôle principal du LPS in vivo est de protéger K. pneumoniae du pouvoir bactéricide du
sérum (Dabernat et Schlemmer, 1997).

12
 Revue bibliographique

II-4-3- La capsule
La capsule a été le premier facteur de virulence décrit (Hennequin et al., 2012 ; Hsieh, 2012).
Elle confère à Klebsiella pneumoniae un fort pouvoir invasif en protégeant les bactéries de la phagocytose
et du pouvoir bactéricide du sérum (Lai et al., 2000; Held et al., 2000 ; Ofek et al., 2001). C’est une
véritable enveloppe de nature polysaccharidique présentant un antigène K (Hennequin et al., 2007). In
vitro, la présence d'une capsule diminue l'attachement aux cellules intestinales HCT-8 et aux cellules
vésicales T-24. Toutefois, in vivo la capsule n'inhibe pas la colonisation de l'intestin et elle semble être un
facteur de virulence important dans les infections urinaires. Divers modèles expérimentaux montrent qu'il
existe une relation entre la taille de la capsule et l'intensité du pouvoir pathogène. Parmi les 77 sérotypes
capsulaires K1, K2, K4 et K5 sont les plus pathogènes (Fung et Chang, 2000 ; Lai et al., 2000).
II-4-4- Adhésines
Les adhésines sont des facteurs d’adhésion produits par la majorité des souches dont deux types
ont été mis en évidence chez des souches pathogènes pour l’homme : les pili de type 1 et de type 3 qui
permettent l’adhérence de la bactérie à la face baso-latérale des cellules trachéales et bronchiques et une
adhésine non filamenteuse (adhésine CF 29 K) qui permet l’adhérence de la bactérie aux cellules
intestinales et uro-épithéliales (Joly et Reynaud, 2002 ; Hennequin et al., 2007). K. pneumoniae peut
produire des fimbriae de type 1 qui semblent être impliquées dans l’attachement aux cellules ciliées de
l’appareil respiratoire et aux cellules vésicales (Hennequin et al, 2007). Elle peut également produire des
fimbriae de type 3 (Stahlhut, 2012 ; Aartsen, 2012) dont l'importance in vivo est mal connue, mais qui
pourraient permettre un attachement sur des surfaces inertes comme du matériel médical (Lai et al., 2000
; Di-Martino et al., 2003; Riegel 2003), dans une étude au Danemark, montrent que le genre fimbriae
type 1 est un facteur significatif dans les infections du tractus urinaire.
II-4-5- Le fer
Il joue un rôle essentiel dans la croissance et la multiplication bactérienne et la majorité des
bactéries pathogènes ont développé des systèmes de captation du fer. Les souches de K. pneumoniae sont
aptes à synthétiser des sidérophores de type aérobactine (hydroxamate) et entérochéline ou entérobactine
(phénolate) qui favorisent la multiplication bactérienne dans les tissus (Joly et Reynaud, 2002). Grâce à
ces sidérophores, environ 97 % des souches de K. pneumoniae utilisent l'hémoglobine et 56% utilisent
l'hémoglobine liée à l'haptoglobine (Fauchère et Avril, 2002). La grande majorité des souches synthétise
de l'entérobactine. Son rôle dans la virulence est mal connu. Dans le sérum, ce sidérophore est inactivé
par l'albumine et les IgA. Cependant, l'entérobactine semble être un facteur de virulence important dans
les infections urinaires (Euzéby, 2004). L'aérobactine est produite par environ 16% à 50% des souches.
Les gènes codant pour la synthèse de l'aérobactine sont présents sur un plasmide de 180 kb.
L'introduction de ce plasmide dans une souche qui en est dépourvue permet d'augmenter la virulence d'un

13
 Revue bibliographique

facteur 100. Parmi les souches produisant de l'aérobactine, certaines d'entre elles hébergent l'îlot de
pathogénécité HPI (High Pathogenecity Island) des Yersinia sp synthétisent de la yersiniobactine (Lai et
al., 2000).
II-4-6- Ilot de pathogénicité
C’est un grand fragment chromosomique d'ADN (35-45kb), il porte les gènes de virulence, en
particulier le locus de la yersiniabactine indispensable à l'expression du phénotype hyper-virulent de
Yersinia sp, il s'insère au niveau de la terminaison 3' du gène de l'ARNt, (iii) le taux de G+C% est
différent de celui du reste du chromosome et il est flanqué de séquences répétées. Sa fonction essentielle
est de capter des molécules de fer essentielles à la croissance et à la dissémination de la bactérie (Carniel,
1999).

III- Resistance de Klebsiella Pneumoniae aux Antibiotiques

III-1- Les antibiotiques
III-1-1- Définition
Les antibiotiques sont des molécules à activité antibactérienne. Ils sont soit d’origine biologique
(β-lactamines, aminosides, macrolides, polypeptides) semi synthétiques ou synthétiques (sulfamides,
quinolones). Ils agissent spécifiquement sur des cibles moléculaires perturbant une étape essentielle du
métabolisme des bactéries (synthés protéiques, synthèse des acides nucléiques, réplication, transcription,
transport transmembranaire…).
III-1-1- critères de classifications
Les antibiotiques peuvent être classés selon leur mode d’action, leur spectre d’activité, l’origine de
la molécule et la structure chimique. Au sein de la même famille, les antibiotiques peuvent aussi être
regroupées en fonction des modifications successives apportées a leurs structure chimique pour élargir
leur spectre d’activité ou améliorer leur pharmacologie. On parle de ‘’génération d’antibiotiques’’ telles
les céphalosporines et les quinolones.
III-1-1- Mode d’action
Les antibiotiques agissent à l’échelon moléculaire sur une ou plusieurs étapes métaboliques
indispensables à la vie de la bactérie au niveau de :
 La paroi bactérienne.
 La membrane cytoplasmique.
 La synthèse des protéines.
 La synthèse des acides nucléiques.
 la synthèse des folates (Yala et al, 2001).

14
 Revue bibliographique

Figure 4 : Mécanisme d’action des antibiotiques (Paul H. Roy, 1997).

III-2- Notion de la résistance bactérienne

Une bactérie est dite résistante lorsqu’elle supporte une concentration d’antibiotique nettement
plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des autres bactéries de la même espèce.
(Carl, 2009). La résistance bactérienne est à différencier de la résistance clinique qui est la non réponse
au traitement, responsable de l’échec thérapeutique.

III-3- Types de résistance aux antibiotiques

L'efficacité de l’antibiotique dépend d'au moins trois facteurs : la quantité d'antibiotique au contact
de la cible, l'affinité de l'antibiotique pour la cible et la production d’enzymes inactivant l'antibiotique.
Ces facteurs sont responsables soit d'une résistance naturelle, et donc présents chez toutes les souches de
l'espèce, soit d'une résistance acquise par certaines souches, suite à l'apparition de mutations
chromosomiques ou à l'acquisition de matériel génétique tels que des plasmides, des transposons ou des
intégrons (Comité de l'antibiogramme de la société Française de Microbiologie, 1997).
III-3-1- Résistance naturelle
La résistance naturelle ou intrinsèque est un caractère d’espèce qui touche toutes les cellules de
toutes les souches. Elle est stable, transmise à la descendance mais pas ou peu transmissible sur un mode
horizontal. La résistance naturelle a pour support génétique le chromosome bactérien et elle permet de
définir le spectre d’activité des antibiotiques (Fauchère et Avril, 2002).
Les mécanismes de la résistance naturelle peuvent être l’imperméabilité de la paroi bactérienne ou
la synthèse d’enzymes naturelle chromosomiques. K. pneumoniae est naturellement résistante aux
15
 Revue bibliographique

aminopénicillines (amoxicilline, ticarcilline) par production d'une β-lactamase de classe A d'espèce

(chromosomique) du groupe fonctionnel 2a, inhibée par l'acide clavulanique (exemple : Klebsiella
pneumoniae 1189) (Haeggman, 1997 ; Chaves, 1995).
III-3-2- Résistance acquise
La résistance acquise est un caractère qui ne concerne que quelques (ou parfois de nombreuses)
souches d’une espèce donnée. Elle est moins stable, mais elle se propage souvent de façon importante
dans le monde bactérien par l’acquisition des nouveaux gènes capables de rendre la bactérie insensible à
un antibiotique ou à un groupe d’antibiotique. Ce nouveau gène peut être obtenu soit par mutation au
niveau du chromosome, soit par transfert d’ADN de plasmide conjugatif ou de transposons (Yala et
Ouar, 2001).
De nombreuses souches de K. pneumoniae résistent aux inhibiteurs des beta-lactamases (des beta-
lactamases de classe A de type IRT insensibles à l’acide clavulanique (mutants d’enzymes TEM) ont été
décrites) (Lemozy, 1995 ; Bermudes, 1997).

III-4- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux β-lactamines

Les bêta-lactamines sont les antibiotiques les plus utilisés dans le traitement des infections causées
par les K. pneumoniae vue leur diversité, faible toxicité, activité bactéricide et large spectre d'action. Elles
comprennent les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes, et
ont toutes en commun le cycle β-lactame (Bryskier, 1984).
III-4-1- Mécanismes de résistance
La résistance naturelle ou acquise aux β-lactamines est caractérisée par au moins deux
mécanismes qui peuvent par ailleurs être combinés : Enzymatique et non enzymatique.
a- Enzymatique
- Pénicillinase
 Phénotype pénicillinase à bas niveau
Klebsiella pneumoniae est naturellement résistante aux pénicillines des groupes G et A et à la
carbénicilline sous l’effet d’une pénicillinase chromosomique appelée SHV1. Elle est sensible aux autres
antibiotiques actifs sur les bacilles à Gram négatif (Joly et Reynaud, 2002).
 Phénotype pénicillinase à haut niveau
Chez Klebsiella pneumoniae le phénotype pénicillinase à haut niveau se caractérise par la
résistance à très haut niveau aux amino et carboxypénicillines, et par une réduction de l’activité des
uréedopénicillines et des céphalosporines de première et de deuxième génération ainsi par une réduction
de l’activité des pénicillines (ampicilline, ticarcilline, pipéracilline et amoxicilline) associées aux
inhibiteurs de β-lactamases (Jarlier et Nordmann, 2000).

16
 Revue bibliographique

- Céphalosporinase de haut niveau

Ce sont des β-lactamases plasmidique de classe C d’Ambler qui présentent une résistance à
l’ensemble des β-lactamines excepté les carbapénèmes et notament aux C3G par acquisition d’un gène
plasmidique (AmpC) qui a migre des especes naturellement produtrices d’Amp C (groupe III des
enterobacteries) sur des plasmides. Cette résistance a été décrite en 1990 pour la première fois avec MIR-
1 chez Klebsiella pneumoniae (Gueudet et al, 2009).
Klebsiella pneumoniae, ont connait un grand nombre de β-lactamase plasmidiques de classe C qui
dérivent des cephalosporinases chromosomiques. On peut citer FOX-1 et MOX-1 (homologues a AmpC
de P. aeruginosa), et LAT-1 et CMY-2 (homologues a AmpC de Citrobacter freundii) (Sougakoff et
Trystram 2003). Les premières souches cliniques de Klebsiella pneumoniae ayant acquis un plasmide
codant pour une β-lactamase de classe C sont décrites en 1988 (Cavallo et al, 2004).
- Carbapénèmases
Les carbapénèmases de classe A, les plus fréquentes, sont les carbapénèmases de type KPC (KPC-
2 à KPC-8). La première souche exprimant KPC-2 (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) fut identifiée
dans une souche de K. pneumoniae en 1996, aux Etats-Unis. KPC-2 hydrolyse toutes les β-lactamines
sauf les céfamycines et la ceftazidime (Nordmann et al, 2010). Son activité est partiellement inhibée par
l’acide clavulanique ou le tazobactam. Parmi les céphalosporines de troisième génération, les KPC
hydrolysent le plus efficacement le céfotaxime. (Grall et al, 2011). Les souches qui produisent KPC
expriment également d’autres β-lactamases dont de nombreux types de BLSE (TEM, SHV, CTX-M). Les
souches KPC apparaissent donc le plus souvent multirésistantes aux β-lactamines, l’ertapénème étant la
carbapénème dont le niveau de résistance est le plus élevé (Nordmann et al, 2010).
Les enzymes de type GES sont initialement des BLSE dont seuls quelques variant touchent les
carbapénèmes. Ces carbapénèmases de type GES (GES-2, 4, 5 et 6) ont été identifiées dans le monde
entier de façon sporadique ou lors de petites épidémies chez P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli et E.
cloacae (Grall et al, 2011).
Les carbapénèmases de classe B : les enzymes de type VIM (Verona Integron encoded Metalo-β-
lactamase) et IMP (Imipénémase) qui représentent la majorité des carbapénèmases de classe B ont été
rejointes en 2008 par une nouvelle enzyme appelée NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase 1). Le cas
décrit était celui d’un patient d’origine indienne ayant auparavant été hospitalisé à New Delhi. Ce type
d’enzyme à été principalement isolé chez K. pneumoniae (Boutet-Dubois et al, 2012).
La carbapénamase de classe D, OXA-48, décrite chez K. pneumoniae, hydrolyse fortement les
carbapénèmes et n’hydrolyse pas les céphalosporines de 3ème génération. Son activité n’est pas inhibée
par l’acide clavulanique (Nordmann et al, 2010). La première souche de K. pneumoniae
productriced’OXA-48 à été isolée en Turquie en 2003 (Boutet-Dubois et al, 2012).

17
 Revue bibliographique

- β-lactamase à spectre élargi (BLSE)

Depuis le milieu des années 1980, notamment chez Klebsiella pneumoniae, et presque
exclusivement en milieu hospitalier, des phénotypes de résistance acquise caractérisés par une forte
diminution de l’activité des pénicillines, des céphalosporines de première, deuxième et troisième
générations et de l’aztréonam. Ces phénotypes se caractérisent de plus par une très forte synergie entre les
β-lactamines inactivées et les inhibiteurs de β-lactamases de type acide clavulanique (disque d’augmentin
ou de claventin) (exemple, K. pneumoniae 1249). On peut noter que certaines BLSE sont caractérisées
par une activité faible vis-à-vis des céphalosporines de troisième génération. Dans ce cas, le niveau de
résistance est bas et les images de synergies sont plus discrètes (exemple, K. pneumoniae 1112). Ces
phénotypes sont la conséquence de la production de β-lactamases plasmidiques appelées «à spectre élargi
» en raison du nombre plus élevé de substrats qu’elles sont capables d’inactiver par référence aux β-
lactamases «à spectre élargi» classiques de type TEM-1 ou 2 ou SHV-1, dont elles dérivent par mutations
ponctuelles (Jarlier et Nordmann, 2000). En 2009 plus de 160 variants de TEM et 100 variants de SHV
sont connus (Carrer et Nordmann, 2009) dont la diversité des β-lactamases a spectre étendus décrites
dans Klebsiella pneumoniae est très grande, des BLSE tels que TEM-3, TEM-10, TEM-12, TEM-24,
TEM-26 ont été décrites T. de nombreux variants de types SHV sont également connus (SHV-4, SHV-
5,SHV-6 ou SHV-8 ) (Sougakoff et Trystram, 2003). Plus récemment, la BLSE TEM-52 a été
caractérisée : elle présente une activité inhabituelle vis-à-vis du moxalactame, ainsi qu’une synergie entre
cet antibiotique et le clavulanate.
Il existe un autre type de β-lactamases a spectre étendu il s’agit de CTX-M, enzymes hydrolysant
le cefotaxime, la ceftriaxone plus efficacement que ceftazidime (Gniadkowski, 2001 ; Villegas et al.,
2004). C’est une grande famille phylogenetiquement différentes de TEM et SHV, qui comprend plus de
19 enzymes (Arafa, 2011). En juin 2009 la dissémination de ces enzymes concerne maintenant
l’ensemble des entérobactéries notamment Klebsiella pneumoniae. Les enzymes de de type CTX-M sont
divisées en 5 sous groupes phylogenetiquement différents (Carrer et Nordmann, 2009).
La resistance au cefepime et au cefpirome a été recement decrite chez Klebsiella pneumoniae et
semble liée a la combinaison de deux mécanismes : la production a haut niveau d’une BLSE SHV-5 et
une diminution de la perméabilité de la membrane externe (Sougakoff et Trystram, 2003). La
production de β-lactamase à spectre élargi confère à Klebsiella pneumoniae une large résistance aux β-
lactamines. Parmi ces dernières et selon la variété de l’enzyme, seuls l’imipénème et encore souvent les
céphamycines demeurent stables vis-à-vis des β-lactamase à spectre élargi (Boukadida et al, 2002). La
résistance à l’imipénème chez k.p peut être due à l’association d’une imperméabilité de la membrane
externe (perte d’une porine de 42 Kda) à une production à haut niveau d’une beta-lactamase plasmidique
de classe C (ACT- 1, homologue à AmpC de E. cloacae et MIR-1). On a également décrit au Japon une

18
 Revue bibliographique

souche de K. pneumoniae résistante à l’imipénème et à la ceftazidime et hébergeant le gène d’une

métallo-beta-lactamase IMP sur une structure de type intégron.
Les premières observations de BLSE sont décrites en Europe et rapidement après, aux Etats-Unis
à partir de 1988 ou une nouvelle résistance à la ceftazidime et à l’aztréonam a permis de retrouver une
nouvelle β-lactamase à transmission plasmidique chez K. pneumoniae. Dans des études européennes
précédentes il a été démontré que K. pneumoniae et E. coli étaient les espèces les plus fréquemment
responsables de la sécrétion de BLSE (Ben Haj Khalifa et al, 2010).
b- Non enzymatique
- Diminution de la perméabilité
Des mécanismes de résistance aux carbapénèmes, ont été décrits combinant une céphalosporinase
plasmidique (DHA-1, cmY-2…) ou une BLSE (TEM, SHV, CTX-M…) à une imperméabilité dans des
espècesd’entérobactéries qui n’expriment pas naturellement de céphalosporinases comme Klebsiella
pneumoniaes, Proteus mirabilis, Escherichia coli et Salmonella spp. L’analyse des propriétés
biochimiques de plusieurs céphalosporinases plasmidiques montre que certaines d’entre elles ont une très
faible activité de carbapénémase qui pourrait entrainer un certain degré de résistance aux carbapénèmes
en association avec une imperméabilité (Nordmann et al, 2010).
Les souches de K. pneumoniae possèdent un certain degré de résistance aux céfépime et au
cefpirome par imperméabilité ainsi que les souches qui produisent KPC (Nordmann et al, 2010).
Une résistance à l’ertapénème par perte de porine chez des souches de K. pneumoniae ou d’E. coli
productrices de CTX-M et exposées à des concentrations croissantes d’ertapénème (Grall et al, 2011).

III-5- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux aminosides

Comme la plupart des entérobactéries, Klebsiella présente une résistance aux aminosides
gentamicine et à la nétilmicine alors que leur résistance à l’amikacine, ciprofloxacine est faible
(Hmamouchi et al, 2005). La résistance acquise résulte d’une mauvaise pénétration de l’aminoside à
l’intérieur de la cellule bactérienne ou de la modification enzymatique des antibiotiques par
phosphorylation (APH aminoside phosphotransférase), nucléotidylation (ANT aminoside
nucléotydiltransférase) ou acétylation (AAC aminoside acétyltransférase) (Archambaud et Clave, 2008).
En 1990 14% en moyenne des souches de Klebsiella pneumoniae isolées dans les CHU étaient
productrices de BLSE mais l’écart aller de 2 a 47% selon les centres. Leurs profil de résistance a d’autres
antibiotiques que les beta-lactamines indique une résistance aux aminosides de 74% pour l’Amikacine, de
95% pour la Tobramycine ; elle n’est que de 40 a 55% pour la Gentamycine, l’enzyme d’inactivation des
aminosides produit par les Klebsiella étant une acétylase de type AAC6’IV qui n’active pas la
Gentamycine ; celle-ci peut être inactivée par une autre acétylase de type (AAC(3)II) ou par une

19
 Revue bibliographique

adénylase de type ANT (2’’) produites par klebsiella pneumoniae, bactérie susceptible de présenter une
multi-résistance aux aminosides (kanamycine, gentamycine, tobramycine, netilmecine-R) associé ou non
a la production des BLSE (Eyquem et al., 2000).

III-6- Résistance de Klebsiella pneumoniae aux quinolones:

La résistance des bactéries, notament Klebsiella pneumoniae, aux fluoroquinolones est devenue
préoccupante tant en milieu hospitalier qu’en médecine communautaire. Les quinolones sont des
composés antibactériens de synthèse dont le chef de file, l'acide nalidixique, a été décrit en 1962 par
Lesher et coll (Lesher et Brundage, 1962).
Chez klebsiella pneumoniae, la resistance aux fluoroquinolones est limitée pour les souches
sauvages a 9-10%, est très fortement associée pour les souches productrices de BLSE atteignant des taux
de 80% a 97% (Eyquem et al., 2000). La résistance aux quinolones fait intervenir différents mécanismes,
dont le mécanisme le plus fréquent et le mieux connu est la modification de la cible.

Figure 5 : Mécanisme d’action des Quinolones (Claire, 2013).

III-6-1- résistance par la modification de la cible

Ce mécanisme de resistance correspondant a une modification de cible de l’antibiotique avec une
altération de l’ADN gyrase (sous-unité GyrA) et de la topoisomérase (sous-unité ParC) La perte d’affinité
pour la cible provient de modification structurale dans une région appelée la QRDR (Quinolone
Resistance Determining Region), où sont trouvées la majorité des mutations responsables de la résistance
aux fluoroquinolones (Archamboud et Clave, 2008).

20
 Revue bibliographique

III-6-2- résistance par défaut d’accumulation

Klebsiella pneumonoiae peut également développer une résistance aux quinolones par diminution de
pénétration à travers la paroi ou par efflux actif, cette résistance par défaut d’accumulation concerne
surtout les quinolones hydrophiles (Illiaquer, 2010).
III-6-3- résistance plasmidiques aux quinolones
Le support de la résistance aux quinolones étaient supposé être uniquement chromosomique
jusqu’en 1998 ou Martinez-Martinez à découvert le premier déterminant de résistance plasmidique aux
quinolones chez K. pneumoniae qui est un plasmide transférable (pMG252) qui héberge le gène qnr A. La
protéine codée par le gène de résistance (qnr A) à été nommée QNR A, de 218 acides aminés appartenant
à la famille des protéines à motifs pentapeptidiques répétés qui protège le complexe ADN-gyrase de
l’inhibition par les quinolones. Quatre autres déterminants plasmidiques également impliqués dans la
résistance aux quinolones ont été rapportés (qnr B,qnr S, qnr C et qnr D), ainsi que différents variants des
protéines Qnr A et Qnr B.(Meradi et al, 2009). Il existe une fréquente association entre les déterminants
génétiques de type Qnr et ceux des BLSE, ce qui souligne la possibilité d’une co-sélection de ces deux
mécanismes de résistance plasmatique (Ben Haj Khalifa et al, 2010).

IV- Agents mutagènes

On appelle agent mutagène tout agent naturel ou résultant de l’activité humaine, physique ou
chimique qui augmente la mutagénèse et qui peut entrainer une mutation génétique (Ennis, 2001). Les
agents mutagènes ont des actions aléatoires qui peuvent altérer la structure de l’ADN, n’importe quelle
partie du génome ou du gène peut subir une modification (Morére et Pujol, 2003).
De nombreux produits chimiques différents peuvent avoir une action mutagène (Winter et al.,
1999). Parmi ces agents chimiques : les analogues de bases, agents désaminants (ou modifiant l’ADN),
les agents alkylants et agents intercalants. On les distingue par leur mode d’action. Certains agissent par
des mécanismes semblables aux mécanismes spontanés, d’autres agissent davantage comme les
radiations. Parallèlement, différentes actions peuvent avoir lieu par des mutagènes physiques, Les agents
physiques sont le principal agent mutagène et sont essentiellement des rayonnements ionisants ou non
ionisants (ex : Champs électromagnétiques, rayonnements optiques et rayonnements ultraviolets (UV)).
La lumière UV est la plus fréquemment utilisée au laboratoire pour induire des mutations et son
mécanisme d’action est le plus connu. Leurs longueurs d'onde sont absorbées préférentiellement par des
bases de l'ADN et par les acides aminés aromatiques des protéines. Les acides nucléiques absorbant le
rayonnement UV a une longueur d’onde d’environ 260 nm, une propriété utile pour la détection des
acides nucléique. Leur principal effet est la création de dimères de pyrimidine cyclobutane et plus
particulièrement des dimères de thymine impliquant des thymines contigües (TT) mais, selon la longueur
d’onde, la dose et les séquences adjacentes, des dimères TC, CT ou CC peuvent également être formés
21
 Revue bibliographique

mais sont plus rares. Ces dimères créent des distorsions dans la conformation de la double hélice, ce qui
inhibe la transcription et la réplication normale et introduit des erreurs dans la séquence d’ADN (Nicklin,
2000 ; Ravanat et al., 2001 ; William et Michael, 2006). On distingue parmi les UV :
- les UV-C (100 - 280 nm) : les plus énergétiques. Ils son létaux mais absorbés par la couche
d'ozone.
- les UV-B (280 - 320 nm) : ils peuvent être létaux. Ils constituent le rayonnement mutagène de la
lumière solaire.
- les UV-A (320 – 400) : ils ont des effets délétères parce qu'ils créent des radicaux oxygénés mais
ils produisent peu de dimères de la pyrimidine. (Centre canadien d'hygiène et de sécurité au
travail, 2013).
La figure 6 représente un dimère de cytosines induit par Les rayons UV (UVB et UVC), provoquant une
déformation de l'ADN qui amènera des mutations lors de la réplication de l'ADN.

Figure 6 : Formation de dimère de pyrimidines (Klug et Spencer, 2006).

22
Matériel et méthodes
 Matériel et méthodes

I- Lieu et durée de l’étude

Cette étude a été réalisée en grande partie au laboratoire de microbiologie du Centre Hospitalo-
universitaire Benbadis de Constantine. Notre étude s’est étalée sur une période de deux mois (du 31
janvier au 31 mars 2016).
L’induction des mutants a été réalisée au laboratoire des biotechnologies de la faculté des sciences de la
nature et de la vie durant une période de 15 jours.

II- Echantillonnage
Nous avons choisi de mener ce travail de mémoire sur Klebsiella pneumoniae, du fait d’une
documentation devenue nécessaire chez nous à cause de sa fréquence dans les services et des épidémies
causées par des souches résistantes à une large variété d’antibiotiques.
Durant la période de notre stage, 20 souches de Klebsiella pneumoniae ont été isolées à partir des
prélèvements pathologiques des différents services du CHU de Constantine (Réanimation, Médecine,
Pédiatrie, Chirurgie…), dont 5 communautaires et 15 hospitalières, 9 souches proviennent de femmes et
11 d’hommes.
Une étude rétrospective portant sur des résultats bactériologiques enregistrés pendant l’année 2015 a été
réalisée. Les résultats de cette étude sont représentés dans l’Annexe 9.

III- Matériel utilisé

Pipettes Pasteur ;
Anse de platine ;
Boites de pétri ;
Lames et lamelles ;
Etuve ;
Distributeurs et disques d’antibiotiques ;
Ecouvillons ;
Pince ;
Huile à immersion ;
Pipette graduée ;
Autoclave ;
Hotte d’isolement ;
Vortex ;
Agitateur magnétique ;
pH-mètre.

24
 Matériel et méthodes

IV- Milieux de culture

IV-1- Milieux de culture solides
Milieu Chapman ;
Milieu Hektoen;
Milieu gélose au Chocolat ;
Milieu Mueller Hinton ;
Milieu gélose nutritive.
IV-2- Milieux de culture liquides
Bouillon cœur cervelle
Bouillon nutritif
IV-3- Milieux d’identification biochimiques et métaboliques
Milieu TSI;
Milieu Mannitol mobilité;
Milieu Citrate de Simmons;
Milieu Liquide Urée-Indole.

V- Colorants et réactifs
Bleu de méthyle ;
Violet de gentiane ;
Lugol ;
Fuchsine ;
Réactif de Kovacs.

VI- Méthodologie
VI-1- Prélèvements
Les prélèvements reçus au laboratoire sont accompagnés d’une fiche de renseignements qui comporte :
 Nom et prénom du malade.
 Age et sexe.
 Service d’hospitalisation.
 Nature de prélèvements.
 Date et heure du prélèvement.
 Antibiothérapie éventuelle (nature et durée).
 Renseignements cliniques.

25
 Matériel et méthodes

Tous les prélèvements sont réalisés à des fins diagnostiques. Pour chaque site, la nature de l’examen
réalisé est indiquée entre parenthèses. Les sites sont les suivants :
- Le sang (hémoculture).
- L’urine (examen cytobactériologique des urines).
- Pus profond et séreuses (examen bactériologique des liquides des séreuses infectées).
- Cathéter vasculaire (analyse bactériologique après ablation d’un cathéter).
- Sonde urinaire ou sonde d’intubation (analyse bactériologique après ablation de la sonde).
- Le site broncho-pulmonaire (examen cytobactériologique des sécrétions broncho-pulmonaires).
- Drain (analyse bactériologique après ablation du drain).
- Le site cutané superficiel (écouvillonnage des plais et des pus superficiels).
- Autres sites : site ORL (écouvillonnage), site uro-génital (examen des sécrétions et exsudats
urogénitaux).

VI-2- Transport
Le prélèvement doit être transporté rapidement au laboratoire d’analyse. La durée de transport doit être
aussi courte que possible (si possible inferieur, à 1 heure). Pour ce qui est de la température de transport,
on distingue :
-Les prélèvements qu’il est préférable de garder à + 4 o C : ils comportent une flore microbienne qui
risque d’interférer avec l’agent causal. La multiplication de cette flore est ralentie a + 4o C. C’est le cas
pour tous les prélèvements poly microbiens. Ces prélèvements sont : les urines post-mictionnelles, les
selles, les expectorations pour la recherche du BK.
-Les prélèvements que l’on doit maintenir à + 37 o C (étuve) : ils sont mono microbiens et renferment
généralement des bactéries pathogènes fragiles, supportant mal les écarts de température. Ceci justifie le
transport rapide vers le laboratoire, à l’abri du froid et de la dessiccation. Ce sont les hémocultures, les
LCR et liquide de ponction, les pus d’abcès non fistualisés, les prothèses et les pièces opératoires ou
biopsie.
-Les prélèvements qu’il faut mettre immédiatement en culture en raison du risque de dessiccation on
couru si la culture est retardée. En effet, ces prélèvements sont généralement pratiqués à l’aide d’un
écouvillon, dispositif stérile constitué d’une tige surmontée d’un coton. De tels prélèvements doivent être
réalisés au laboratoire même. C’est le cas des prélèvements de gorge, des pus d’oreille, des pus d’abcès
fistualisés, des prélèvements génitaux masculins et féminins.

VI-3- Analyse des prélèvements au laboratoire

Le traitement des prélèvements au niveau du laboratoire se fait selon les étapes suivantes :

26
 Matériel et méthodes

VI-3-1- Examen macroscopique

a- Urines
L’urine normale a une couleur claire, d’aspect jaune citron tandis que l’urine infectée est souvent trouble,
d’odeur nauséabonde et de couleur plus foncée. Parfois, on note même la présence de sédiments tantôt
blanchâtres (phosphates), tantôt rouge brique (acide urique).
b- Pus
Il est difficile de faire une évaluation macroscopique des prélèvements de pus. Un technicien expérimenté
doit évaluer soigneusement la couleur, la consistance, l’aspect et l’odeur des prélèvements de pus reçus au
niveau du laboratoire (le pus peut être épais, visqueux, élastique, mélangé au sang ou non, fluide ou
séreux. La couleur varie de la teinte chocolat au blanc, certains pus sont verdâtres ou bleutés).
c- LCR
Après homogénéisation par une légère agitation, on note le degré de limpidité du liquide et sa coloration.
Un liquide clair (appelé souvent eau de roche) correspond soit à un liquide normal, soit à un liquide
pathologique. Un liquide trouble ou franchement purulent (eau de riz) correspond à une réaction
leucocytaire marquée. En cas de piqûre d'un vaisseau au cours de la ponction, on note une coloration
rouge du liquide avec souvent formation d'un petit caillot. Les liquides sanglants ou jaunes (appelés
xanthochromiques) évoquent plutôt une hémorragie méningée.
VI-3-2- Examens microscopiques
a- État frais
- Principe et technique
C’est un examen de mise en œuvre très simple qui permet d’apprécier la morphologie des bactéries, leur
mode de regroupement, et surtout leur mobilité. Il est réalise en déposant sur une lame porte objet stérile
une goutte d’eau physiologique et une colonie homogénéisée et de recouvrir d’une lamelle en évitant
d’emprisonner les bulles d’air. La préparation est examinée au Microscope Optique au grossissement x40.
b- Coloration au bleu de méthylène
La coloration au bleu de méthylène (BM) est une coloration très simple qui permet d'apprécier la
morphologie des bactéries (ne permet pas de différencier les bactéries de même morphologie), mais aussi
les cellules qui sont en général mieux conservées qu’avec la coloration de Gram.
- Technique
 Réaliser un frottis et le fixer a la chaleur
 Le recouvrir de bleu de méthylène et laisser agir 3 min
 Rincer à l'eau distillée
 Sécher entre 2 feuilles de papier essuie-tout.

27
 Matériel et méthodes

- Observations
Examiner à l'objectif x100 à immersion (avec une goutte d'huile) avec un éclairage important
(diaphragme ouvert). Toutes les cellules apparaissent colorées en bleu.
Noter:
 La morphologie des bactéries: bacilles, coques...
 Leur mode de groupement: isolées, par 2, en amas, en chaînettes.
 La présence de cellules (polynucléaires, lymphocytes et cellules épithéliales...) et de germes.
c- Coloration de Gram
- Principe et technique
La coloration de Gram est la coloration de base de la bactériologie. C'est une coloration double qui
permet de différencier les bactéries non seulement d'après leur forme et leur disposition, mais surtout
d'après leur affinité pour les colorants liée à la structure de la paroi.
La coloration de Gram se déroule en plusieurs étapes qui consistent à :
 Faire un frottis ;
 fixer le frottis a la flamme d’un bec bunsen ;
 recouvrir le frottis de la solution de violet de gentiane on laisse agir une minute ;
 rejeter le colorant puis laver à l’eau ;
 recouvrir la préparation de lugol, laisser agir 30 secondes ;
 rejeter le lugol puis laver à l’eau ;
 décolorer à l’alcool on le laissant agir pendant 30 secondes ;
 rincer a l’eau courante et recouvrir la lame de solution de fuchsine diluée, laisser agir 30
secondes ;
 rejeter la fuchsine, laver abondamment, égoutter, sécher entre deux feuilles de papier buvard
propres.
- Lecture
La lecture se fait au grossissement x 100 avec une goutte d’huile à immersion. Les bactéries à Gram
positif apparaissent colorées en violet, alors que les bactéries à Gram négatif sont roses.
VI-3-3- Culture
Les prélèvements ont été réalisés par écouvillonnage, on procède directement à une recherche de germes
et cela en déchargeant en stries condensées l'écouvillon de prélèvement sur toute la surface des boites
gélosées des trois milieux solides différents (milieux Hektoen, Chapman et chocolat) puis introduire
l'écouvillon de prélèvement dans un tube contenant du bouillon d’enrichissement (bouillon cœur
cervelle).

28
 Matériel et méthodes

Le milieu Hektoen est un milieu gélosé sélectif pour les entérobactéries qui contient des sels biliaires
lactosé, sacharosé, et saliciné et du verre brillant qui permet le développement des bacilles à Gram négatif
et l’inhibition de la croissance des germes à Gram positif.
Le milieu de Chapman est utilisé pour l’isolement des Staphylococcus ; il inhibe la grande majorité des
autres bactéries.
Le milieu gélose au chocolat permet la culture des bactéries exigeantes et des bactéries non exigeantes.
Les milieux ensemencés, sont incubés à 37°C ± 1°C pendant 18 à 24 heures.
VI-3-4- Isolement et purification
Après la lecture des boites de cultures, et après l’identification des germes. Si on trouve une Klebsiella sur
le milieu Hektoen les différentes colonies obtenues sont ré-isolées sur le même milieu afin d'obtenir des
souches pures.
VI-3-5- Critères d’identifications de Klebsiella pneumoniae
L’identification des souches est réalisée par l’étude de plusieurs tests biochimiques et métaboliques.
 Identification par galeries classiques
- Préparation de la suspension bactérienne
La préparation de la suspension bactérienne consiste en un transfert en condition aseptique d’une ou de
plusieurs (4 à 5 colonies identiques) bien isolée sur un milieu Hektoen vers un tube qui contient 1 à 2 ml
d’eau physiologique stérile. Cette suspension sert à ensemencer différents milieux de culture et
d’identification permettant ainsi de mettre en évidence différents caractères biochimiques.
- Inoculation de la galerie
A l’aide d’une pipette pasteur, les tubes sont remplis par la suspension bactérienne déjà préparés en
évitant d’introduire les bulles d’air. La série des milieux utilisés et leurs modes d’ensemencement sont
mentionnés ci dessous.

Figure 7 : galerie biochimique témoin de klebsiella pneumoniae. 1 : TSI ; 2 : Citrate de Simmons

; 3 : Mannitol-mobilité ; 4 : Urée-indole.
29
 Matériel et méthodes

a- Milieu TSI
Le milieu Triple-Sugar-Iron est un milieu d’identification rapide pour les entérobactéries, il permet de
mettre en évidence la fermentation du glucose (avec ou sans dégagement gazeux), du lactose, du
saccharose et la production de H2S.
La téchnique consiste à ensemencer à l’aide d’une pipette pasteur en stries serrées la pente de la gélose
puis par piqûre centrale le culot, la lecture se fait après 24 h d’incubation à 37°C.
 Lecture
La fermentation du glucose se traduit par le virage au jaune du culot, et la production de gaz se traduit par
la formation de bulles de gaz dans la gélose ou le décollement de celle-ci.
La fermentation du lactose et/ou du saccharose se traduit par le virage au jaune de la pente. Production du
H2S se traduit par noircissement au niveau du culot.
b- Milieu citrate de Simmons
Le milieu citrate de Simmons est utilisé pour l’identification des bacilles à Gram négatif. Il permet de
rechercher l’utilisation de citrate comme seul source de carbone.
L’ensemencement se fait au moyen d’une pipette pasteur par des stries longitudinales de la pente, la
lecture se fait après 24 h à 7 jours d’incubation à 37°C.
 Lecture
L’utilisation du citrate de Simmons se traduit par un virage de couleur du vert au bleu qui signifie qu’il y
a eu une alcalinisation du milieu et que la bactérie possède un citrate perméase plus observation
d’apparition des colonies sur le milieu.
c- Milieu mannitol-mobilité
Le milieu mannitol-mobilité est utilisé pour la différenciation rapide des Entérobactéries.
Il permet de déceler la dégradation du mannitol et la mobilité de la bactérie.
L’ensemencement se fait au moyen d’une pipette pasteur par une simple piqure centrale jusqu’au fond du
tube, la lecture se fait après 24 h d’incubation à 37°C.
 Lecture
La fermentation du mannitol se traduit par un virage de couleur du rouge au jaune.
La présence des bactéries au-delà de l’axe central signifie qu’elles sont mobiles; cependant leur présence
uniquement au niveau de la piqure centrale signifie qu’elles sont immobiles.
d- Milieu urée-indole
Le milieu urée-tryptophane appelé improprement milieu urée-indole c’est un milieu complexe qui fournit
un ensemble de résultats utiles pour la différenciation des entérobactéries. Il permet de rechercher :

30
 Matériel et méthodes

-L’uréase
Les entérobactéries peuvent dégrader l’urée qui est un composé organique et qui peut servir de source
d’azote unique aux bactéries possédant une uréase très active. En présence de cette enzyme, les bactéries
uréolytiques peuvent transformer l’urée en ammoniac et en carbonate d’ammonium qui alcalinise le
milieu, et qui fait virer l’indicateur coloré de pH (le rouge de phénol) du jaune au rouge-rose en milieu
basique.
-La tryptophanase
Après addition du réactif de Kovacs : le diméthylamino- 4-benzaldéhyde contenu dans le réactif de
Kovacs réagit avec l'indole, produit de l'activité de la tryptophanase, et forme un anneau coloré en rouge à
l’interface du tube.
L’ensemencement se fait au moyen d’une pipette pasteur par l’ajout de quelques gouttes du milieu urée-
indole dans un tube contenant la suspension bactérienne. La lecture se fait après 24 h d’incubation à
37°C.
 Lecture
-L’hydrolyse de l’urée
Le virage de la couleur de l’orange vers le rouge ou le rose violet signifie qu’il y a eu une alcalinisation
du milieu et que la bactérie possède une uréase.
-La tryptophanase
Après addition du réactif de Kovacs, l’apparition d’un anneau rouge a l’interface du tube montre que la
bactérie est indole positif.
VI-3-6- Étude de la sensibilité aux antibiotiques
 Antibiogramme
L'antibiogramme est l'examen biologique destiné à mesurer l'interaction entre chacune des
molécules antibactériennes utilisables et une souche bactérienne susceptible d'être pathogène, isolée d'un
patient. Le résultat contribue à évaluer la sensibilité de la souche bactérienne examinée ou sa résistance.
Le résultat numérique brut est accompagné d'une interprétation ou remplacé par elle: résistant, sensible,
intermédiaire, ou (indéterminée) (Scavizzi et al., 2000).
Pour chaque souche de Klebsiella pneumoniae isolée, un antibiogramme est réalisé par la méthode de
diffusion en milieu gélosé Mueller Hinton. La technique de l’écouvillonnage et la mesure des diamètres
se font selon les recommandations du CLSI.
Les résultats de cet examen peuvent aider les médecins dans le choix de l'antibiotique approprié pour la
thérapie.

31
 Matériel et méthodes

Figure 8 : Antibiogramme de Klebsiella pneumoniae.

a- Milieu pour l’antibiogramme

On utilise un milieu non sélectif Mueller-Hinton, il doit être coulé en boites de Pétri sur une épaisseur de
4mm, les boites doivent être séchées avant leur emploi.
b- Réalisation de l’inoculum bactérienne
A partir d’une culture pure de 18 h à 24 h sur milieu d’isolement approprié, prélever à l’aide d’un
écouvillon stérile une ou plusieurs (4 à 5 colonies identiques) bien isolée, et les transférer dans un tube
contenant 2.5 ml d’eau physiologique stérile. Bien homogénéiser la suspension bactérienne en frottant
l’écouvillon sur la paroi interne du tube.
c- Ensemencement par écouvillonnage
- L’écouvillon est trempé dans l’inoculum ;
- l’essorer en le pressant fermement (et en le tournant) contre la paroi interne du tube, afin de
décharger au maximum ;
- Frotter l’écouvillon sur la totalité de la surface gélosée, de haut en bas, en stries serrées,
l’opération est répéter 2 fois, en tournant la boite de 60° à chaque fois, sans oublier de faire
pivoter l’écouvillon sur lui-même ;
- Finir l’ensemencement en passant l’écouvillon sur la périphérie de la gélose ;
- Recharger l'écouvillon pour chaque boîte de Pétri.
d- Choix des antibiotiques
Dans notre étude, les antibiotiques utilisés sont :
- Pour les β-lactamines : Amoxicilline (AMX), Amoxicilline+acide clavulanique (AMC),
Ticarcilline (TIC), Céfazoline (KZ), Céfoxitine (FOX), Céfotaxime (CTX), Imipenèmes (IPM).
32
 Matériel et méthodes

- Pour les quinolones : Ciproflaxacine (CIP), acide nalidixique (NA).

- Pour les aminosides : Amikacine (AK), Gentamicine (CN).
- Pour les sulfamides : sulfamethoxazole+trimetoprim (SXT).
- Pour les phénicol : chloramphénicol (C).
- Pour les polymyxines : la colistine (CT).
e- Application des disques d'antibiotiques
L’application des disques se fait à l'aide de distributeurs automatiques. Certains disques sont déposés
manuellement avec une pince flambée (utiles pour un rapprochement ou éloignement des disques, ou pour
un choix positionnel) qui sont parfaitement appliqués à plat sans glissement en appuyant légèrement sur
la surface de la gélose. Une distance minimale de 15 mm doit séparer un disque périphérique du bord de
la boite et deux disques doivent être éloignés au minimum de 30mm de sorte que les zones d’inhibitions
ne se chevauchent pas. Les boites sont ensuite portées à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures.
f- Lecture et interprétation
Les résultats sont exprimés en mm après lecture des diamètres des zones d'inhibition et sont interprétés en
trois catégories: S= sensible, R= résistant, et I= intermédiaire, en se référant aux normes CLSI (Clinical
and Laborotory Standards Institute).

VII- Mutagénèse
VII-1- Définition
Ensemble de technologie permettant d’accroitre la fréquence des mutations. La mutagenèse, fait
parfois appel au génie génétique, Deux méthodes sont possibles, la mutagénèse aléatoire et la mutagénèse
dirigée. La première consiste à utiliser un agent mutagène, qui induira de manière aléatoire des mutations
dans le génome de l'organisme étudié. L'endroit et la nature des mutations ne sont pas prévisibles et ne
peuvent pas être contrôlés. La seconde utilisera des méthodes de biologie moléculaire pour induire une
mutation précise dans le gène ciblé.
 La mutagenèse classique aux UV
D'un point de vue de la sécurité, les UV sont préférables en particulier depuis que du matériel
facile d'utilisation et parfaitement sécurisé est disponible. Cependant, le spectre des mutations obtenues
avec les UV ne permet pas toujours d'obtenir ce que l'on désire. De même, certains organismes sont très
résistants aux traitements avec des UV. Les mutagènes chimiques sont alors utilisés. Il existe alors des
conditions draconiennes d'utilisation de ces produits qui se fait dans des pièces sécurisées. Pour que ce
traitement soit efficace, il faut que de nombreuses mutations soient produites. Les mutations apparaissant
au hasard dans le génome, beaucoup d'entre elles vont toucher des gènes essentiels et donc après le
traitement le taux de survie va être fortement diminué. En pratique, il faut donc partir d'un effectif

33
 Matériel et méthodes

suffisamment grand pour tenir compte de cette létalité. Réciproquement, le taux de survie est une
indication de l'efficacité du traitement mutagène. Classiquement, un taux de survie de 1 à 5% est indicatif
que le traitement a bien fonctionné et que de nombreuses mutations ont été produites.
Les mutations obtenues avec ce type de traitement sont le plus souvent ponctuelles (il est aussi
possible d'obtenir avec certains produits des délétions). Elles peuvent inactiver le gène, modifier son
fonctionnement voire augmenter son fonctionnement. Ce type de mutagenèse permet donc d'obtenir des
mutations qui ont un large éventail d'effets. (M. Silar, Université de Paris Diderot 2008).

VII-2- But
Le but de cette manipulation est d’induire des mutations et de voir l’influence des UV sur la survie des
souches de Klebsiella pneumoniae après irradiation aux rayons ultras violets.

VII-3- Mode opératoire

VII-3-1- Préparation de la suspension bactérienne
Sous la hotte d’isolement à l’aide d’une anse de platine stérile (trompée dans un flacon d’éthanol puis
flamber au bec bunsen) on prélève à partir des boites de gélose Hektoen une colonie de Klebsiella
pneumoniae bien isolée puis l’introduire dans un tube stérile contenant du bouillon nutritif on vortex les
tubes pendant 1 à 2 min pour bien homogénéiser le milieu puis on réalise une incubation à l’étuve à 37 o
C, pendant 24h.
VII-3-2- Préparation et stérilisation du matériel utilisé
Pour chaque souche on à besoin d’une pipette graduée et 5 tubes contenant 9 ml d’eau distillé (tout le
matériel est stérilisé à l’autoclave a 110 o - 120 o C), puis on prépare la gélose nutritive, les ingrédients
constituants le milieu sont pesés puis dissous dans 500 ml d’eau distillé, ce qui peut nécessiter un léger
chauffage sous agitation constante pour assurer la fusion et l’homogénéisation du milieu. La solution
portée ensuite au volume 1000 ml et ajustée au PH désiré c'est-à-dire 7.2 - 7.4 est repartis en 100 ml par
flacon de 250 ml de volume. Les flacons bouches, sans que la vis soit trop serrée, sont stérilisés à
o o
l’autoclave pendant 20 a 30 min à 110 - 120 C. on visse les flacons après autoclavage et
refroidissement complet du milieu. Les boites de pétri sont coulées immédiatement sous une hotte a flux
laminaire par les étapes suivantes :
- On débloque éventuellement le bouchon du flacon contenant le milieu gélosé en surfusion.
- On tient le flacon et on l’ouvre dans le périmètre de stérilité on maintient le bouchon contre la
pomme de la main droite avec le petit doit pour éviter de le poser sur le plan de travail.
- On entrouvre la boite de pétri à couler, placé à gauche du bruleur à gaz, avec la main gauche.

34
 Matériel et méthodes

- On passe l’ouverture du flacon dans la flamme du bec bunsen et on verse entre 10 à 20 ml de

milieu fondu (45o C - 50o C) dans la boite de manière à couvrir le fond.
- On laisse la boite à moitie ouverte en direction de la flamme pendant quelques instants pour
permettre l’évacuation de la vapeur d’eau. On passe l’ouverture du flacon dans la flamme du
bruleur à gaz une deuxième fois, puis on coule les boites suivantes de la même manière avant de
fermer le flacon définitivement.
- On déplace les boites par glissement doux sur une zone froide sous la hotte et on les referme dès
qu’elles sont complètement solidifiées.
- On retourne les boites pour empêcher l’eau de condensation accumulée sous le couvercle de
retomber sur le milieu.
VII-3-3- Dilution
Toujours sous la hotte, à partir de chaque suspension et à l’aide d’une pipette graduée stérile on réalise
des séries de dilutions de 10-1, 10-2 jusqu'à 10-5 dans les tubes a essais contenant 9 ml d’eau physiologique
stérile. Une dilution au 1/10 est obtenue en mélangeant 1 ml d’échantillon a 9ml de diluant. Si 1 ml de
cette dilution au 1/10 est ajoute à 9ml de diluant, on obtient une dilution au 1/100 le processus de dilution
est répète jusqu'à obtention d’une souche diluée à 10-5 (après chaque dilution on vortex les tubes pendant
1 a 2 min pour homogénéiser la suspension).
VII-3-4- Ensemencement sur la Gélose Nutritive
A partir du dernier tube contenant la suspension diluée à 10-5 et au moyen d’une pipette pasteur stérile :
- On tient le tube contenant la suspension microbienne dans la main gauche, en position horizontale,
l’ouverture dirigée vers la flamme, afin de réduire l’entrée d’éventuelles chutes de germes.
- On ouvre le tube en saisissant le bouchon dans la main droite entre le petit doit et la pomme de la
main, alors que la pipette pasteur est tenue entre le pouce et l’index.
- On flambe légèrement l’orifice du tube et on prélève la souche en y introduisant la pipette pasteur
flambée et refroidie de telle sorte que la suspension reste pure sans qu’il est un apport de germes
étrangers c'est-à-dire une contamination.
- On pose le tube sur un portoir placé à gauche du brûleur, et on dépose un faible volume de l’ordre
de 0,1 ml de suspension à la surface des 5 boite de pétri qui contient la GN stérile. L’échantillon
est alors étalé de façon homogène sur la surface au moyen d’un râteau stérile formé à l’aide d’une
pipette pasteur, on recourbant la partie effilée de la pipette à environ 4 cm de la pointe boutonnée
puis une deuxième fois à 4 cm de la partie coudée.
VII-3-5- Irradiation
- L’irradiation se fait à l’aide d’une lampe à UV (à une longueur d’onde égale à 320 nm).

35
 Matériel et méthodes

- Mettre une boîte sous les UV, enlever le couvercle, enlever les mains de dessous les UV et
déclencher le chronomètre.
- Garder une boite de la souche non irradiée comme témoin.
- Le nombre des boites irradiées est de 4.
- Les boites de pétri sont irradiées, ouvertes pendant différents temps (5s, 10s, 15s, 20s), à une
distance fixe de 30 cm de la source des rayons ultra-violets.
- Marquer les durées d’exposition aux UV au dos des boîtes.
- N’exposer pas les boîtes à une trop forte intensité de lumière visible après la mutagenèse afin
d’éviter la photoréversion.
- Les boites sont enveloppées par du papier aluminium, et incubées dans l’étuve à 37 o C pendant
24h.
- Le nombre de colonie dans chacune des boites est compté. Le pourcentage de survivants est
ensuite calculé. La courbe de survie est enfin tracée.

36
Résultats et discussion
 Résultats et discussion

I- Prélèvements
I-1- Distribution des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement
Les résultats illustrés ci-dessous montrent une prédominance des souches hospitalières par rapport aux
souches communautaires. Conformément aux données de la littérature, l'espèce K. pneumoniae est plus
fréquemment isolée à l'hôpital qu'en communauté, 85% contre 15% pour Decré et al, (2000).

Tableau 3: Distribution des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement.

Origine Effectif Pourcentage (%)
Souches hospitalières 15 75
Souches communautaires 5 25
Total 20 100

Souches
communautair
es 25 %

Souches
hospitalières
75%

Figure 9: Répartition des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement.

I-2- Distribution des souches parmi les prélèvements cliniques

Sur les 20 souches de K. pneumoniae isolées, 40 % des prélèvements ont été diagnostiquées dans les
urines, 35 % proviennent des prélèvements de pus, 15 % de liquide bronchique et 10 % de sang. Dans
notre étude K. pneumoniae est isolée essentiellement à partir des urines. Ces résultats correspondent aux
rapports de la littérature, où les prélèvements urinaires sont toujours dominants.

38
 Résultats et discussion

Tableau 4: Répartition des souches de K. pneumoniae parmi les prélèvements

cliniques n= 20.
Prélèvement Nombre de K.p isolée Pourcentage (%)
Urines 8 40
Pus 7 35
Liquide bronchiques 3 15
Sang 2 10
Total 20 100

Sang 10%
Liquide
bronchiques 15%
Urines 40%

Pus 35%

Figure 10 : Répartition de Klebsiella pneumoniae parmi les prélèvements cliniques.

I-3- Distribution des souches de Klebsiella pneumoniae selon le sexe

Parmi les 20 souches isolées, On peut remarquer une légère prédominance des souches isolées chez les
hommes (55 %) par rapport à celle des femmes (45 %). Le sexe ratio est de 1,22.
Ces résultats correspondent à ceux de l’étude de Sekhri A (2011), avec une prédominance masculine.

Tableau 5 : Distribution des souches de K. pneumoniae selon le sexe.

Sexe Effectif Pourcentage (%)
Femme 9 45
Homme 11 55
Total 20 100

39
 Résultats et discussion

Femme 45%
Homme 55%

Figure 11 : Distribution des souches de K. pneumoniae selon le sexe.

II- Analyse des prélèvements au laboratoire

II-1- Examen macroscopique
L’aspect des colonies sur le milieu solide permet de déterminer la forme, le relief, la taille, la consistance
et la couleur (fermentation) sur boîte de Pétri.

Figure 12: Aspect des colonies des klebsiella pneumoniae sur milieu Hektoen.

L'aspect des colonies sur milieu Hektoen est en relation de la capacité des microorganismes à fermenter le
lactose mis dans le milieu. Cela conduit à une production d'acide qui abaisse le pH et modifie l'indicateur
de pH placé dans le milieu qui vire du vert au jaune-oronge, Notre souche se présente sous formes de

40
 Résultats et discussion

grosses colonies muqueuses, bombées, lactose (+), ayant un aspect d’une goutte de miel, avec une
tendance a la confluence. Ces résultats sont compatibles avec ceux mentionnées par Illiaquer (2010).

II-2- Examen microscopique

II-2-1- Etat frais
L’observation microscopique montre des bacilles immobiles courts. Ce résultat est compatible avec celui
de Seck (2005).
II-2-2- Bleu de méthyle
L’observation microscopique montre la présence de 8 à 10 lymphocytes par champ et de 3 à 4
polynucléaires par champ.
II-2-3- Coloration de Gram
Les résultats obtenus par observation microscopique après coloration de Gram, montre que les souches se
présentent sous forme de bacilles ou diplobacilles colorées en rose. Donc ce sont des bacilles à Gram
négatif, Ceci est compatible avec les résultats de Gueye (2007).

Figure 13 : Coloration de Gram de Klebsiella pneumoniae.

II-3- Critères d’identification de klebsiella pneumoniae.

II-3-1- Identification par galeries classique
Il est possible de connaitre certaines caractéristiques du métabolisme de la bactérie analysée grâce aux
galeries biochimiques classiques. Les figures montrent les résultats de la galerie biochimique de K.
pneumoniae.

41
 Résultats et discussion

Figure 14 : Résultats de galerie biochimique de K. pneumoniae.

Les résultats de la galerie biochimique des souches étudiés sont notés dans l’Annexe 7.
a- Milieu TSI
Après l’incubation, on a remarqué que la souche K. pneumoniae a fermente le lactose ainsi que le
saccharose, il y a eu une acidification dans la pente et le culot, d’où le virage du rouge de phénol au jaune
(tube 1, figure 14) avec présence des bulles d’air et absence de noircissement du milieu car il n y’a pas eu
de production de sulfure d’hydrogène (H2S). Donc la souche est: lactose et saccharose (+), glucose (+),
gaz (+), H2S (-), comme signalé par Meziani (2012).
b- Milieu citrate de Simmons
Apres 24 h d’incubation on a remarqué qu’il y a eu une alcalinisation du milieu, d’où le virage du bleu de
bromothymol du vert au bleu (tube 2, figure 14), donc la souche K.P utilise le citrate comme seule source
de carbone. Les résultats obtenus sont superposables à ceux obtenues par les travaux de Meziani (2012).
c- Milieu mannitol mobilité
Les résultats qu’on a obtenus montrent que il y a eu une acidification du milieu la souche a fermenté le
mannitol, d’où le virage du rouge de phénol au jaune (tube 3, figure 14), donc la souche est mannitol (+).
En ce qui concerne la mobilité Klebsiella pneumoniae a poussé le long de la strie d’ensemencement mais
elle ne crée pas un trouble du milieu donc elle est immobile. Conformément a la littérature de Nkang et al
(2009) et Gueye (2007), nous avons bien observé la souche de K. pneumoniae, qui a utilisé le mannitol
comme source de carbone et d’énergie.

42
 Résultats et discussion

d- Milieu urée-indole
- L’uréase
Concernant l’hydrolyse de l’urée, Klebsiella pneumoniae étaient urée (+) car il y a eu une alcalinisation
du milieu d’où le virage de couleur de l’orange vers le rouge-rose (tube 4, figure 14). Les résultats
obtenus du test uréase sont accords avec ceux obtenues par Carleen et al (2006) et Meziani (2012).
- L’indole
Notre souche est indole négatif, car l’indole ne se matérialise pas par un anneau rouge, après addition du
réactif de Kovacs (tube 4, figure 14). Notre résultat est compatible avec ceux obtenues par Alves et al
(2006) et Nkang et al (2009).

II-4- Etude de la sensibilité aux antibiotiques

II-4-1- Antibiogramme
Toutes les souches de Klebsiella pneumoniae ont été testées vis-à-vis de 14 molécules d’antibiotiques
appartenant à 4 familles différentes dont 7 β-lactamines, 2 aminosides, 2 quinolones, et autres (Bactrim,
chloramphénicol et colistine).

Figure 15 : Résultats d’antibiogramme d’une souche Klebsiella pneumoniae.

Les résultats d’antibiogramme des souches étudiés sont notés dans l’Annexe 8.

43
 Résultats et discussion

a- β-lactamines
A partir des résultats obtenus, toutes les souches étudiées sont résistances à l’amoxiciline et la ticarcilline
avec un taux de résistance de 100%, les résultats obtenus sont donc en parfait accord avec les résistances
naturelles de ces bactéries mentionnées par Arafa et al (2009) et Gavaret et Briffaud (2009). L’association
amoxicilline-acide clavulanique et la céfazoline présentent un taux de résistance de 60 % suivis par le
céfotaxime qui présente un taux de résistance de 50 %. Ces résultats sont différents de ceux de Sekhri A
(2011), qui rapportent des taux de résistance respectivement de 43,35 % pour l'AMC, de 73,07 % pour la
cefazoline, et de 61,76 % pour le céfotaxime. Par contre nous observons les mêmes résultats pour
l’imipinèm et la céfoxitine qui présentent une bonne activité sur les souches de Klebsiella pneumoniae
(aucune résistance observée).

R% 100% 100%
100%
90%
80%
70% 60% 60%
60% 50%
50%
40%
30%
20%
10% 0% 0%
0%
AMX AMC TIC KZ FOX CTX IPM ATB

Figure 16 : Taux de résistance de Klebsiella pneumoniae aux β-lactamines.

b- Aminosides
Pour les aminosides toutes les souches de Klebsiella pneumoniae présente un taux de résistance de 45 %
pour la gentamycine, mais beaucoup faible pour l’amikacine qui présente un taux de résistance de 10 %,
donc une excellente activité est enregistrée pour ce dernier. Ces résultats sont différents de ceux de Sekhri
A (2011), qui rapportent des taux de résistance respectivement de 69,23 % pour gentamycine et de 48,07
% pour l’amikacine.

44
 Résultats et discussion

c- Quinolones
En ce qui concerne les quinolones, les souches de K. pneumoniae présentent des taux de résistances
respectivement de 40 % pour l’acide nalidixique et de 20 % pour la ciprofloxacine. Ces résultats sont
différents de ceux de Sekhri A (2011), qui rapportent un taux de résistance de 28,84 % pour l’acide
nalidixique et une sensibilité à 100 % pour la ciprofloxacine. Selon Ben Haj Khalifa et Khedher (2010),
K. pneumoniae est naturellement sensible aux quinolones. Donc se sont des résistances acquises.
d- Autres
Pour l’association sulfamethaxazole+triméthoprim (Bactrim), les souches de K. pneumoniae présentent
un taux de résistance de 50 % suivi par une faible résistance (10 %) au chloramphénicol et une sensibilité
à 100 % pour la colistine. Les résultats obtenus sont différents de ceux de Sekhri A (2011), qui rapportent
des taux de résistance respectivement de 65,38 % pour le Bactrim et de 20 % pour le chloramphénicol.

R% 50%
50% 45%
45% 40%
40%
35%
30%
25% 20%
20%
15% 10% 10%
10%
5% 0%
0%
ATB
CN AK NA CIP SXT C CT

Figure 17 : Taux de résistance de K. pneumoniae aux autres classes d’antibiotiques.

II-4- Les phénotypes de résistance de K. pneumoniae aux antibiotiques

A fin d’obtenir une meilleure interprétation des résistances bactériennes vis-à-vis des molécules testées,
les résultats de l’antibiogramme sont traduits en phénotypes de résistance.

45
 Résultats et discussion

II-4-1- Phénotypes de résistance aux β-lactamines

Les phénotypes de résistance vis-à-vis Les β-lactamines sont illustrés dans le tableau 6.

Tableau 6 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux β-lactamines

n=20. BLSE: β-lactamases à spectre étendu, PBN : Pénicillinase de bas niveau, PHN :
Pénicillinase de haut niveau.
Phénotype de résistance Effectifs Fréquence %
BLSE 10 50
PBN 8 40
PHN 2 10

L’analyse phénotypique des souches de Klebsiella pneumoniae isolées montre trois phénotypes de
résistance aux β-lactamines, dont un sauvage (PBN), sont représentés dans notre étude. Celui des BLSE
domine dans 50 % des cas, suivi de celui du type sauvage dans 40 %, du type PHN dans 10 %. Les
résultats de notre étude sont accord avec ceux de Sekhri A (2011), qui rapporte une dominance des BLSE
dans 62 % des cas, suivi du type sauvage dans 27 % des cas, et du type PHN dans 8 % des cas.

PHN 10%

BLSE 50%
PBN 40%

Figure 18 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux β-lactamines

46
 Résultats et discussion

II-4-2- Phénotypes de résistance aux aminosides

Trois phénotypes de résistance aux aminosides sont illustrés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux Aminosides.

Phénotypes de Antibiotiques Effectifs Fréquence %
résistance CN AK
I (sauvage) S S 11 55
II R S 7 35
III R R 2 10

La répartition des phénotypes de résistance aux aminosides montre une nette prédominance du phénotype
I ou sauvage sensible avec une fréquence de 55 %, suivi du phénotype II conférant une résistance à la
gentamicine dans 35 % des cas, et du phénotype III qui confère une association de la résistance dans 3%
des cas. Nos résultats sont différents de Sekhri A (2011), qui montre plusieurs phénotypes, une nette
prédominance du phénotype II avec une fréquence de 41 %, suivi du phénotype I sauvage avec une
fréquence de 27 %, et le type III enregistre un taux de 10 %.

III 10%

I (sauvage)
II 35% 55%

Figure 19 : Représentation graphique des phénotypes de résistance de K. pneumoniae aux

Aminoside.

47
 Résultats et discussion

II-4-3- Phénotypes de résistance aux quinolones

Les phénotypes de résistance aux quinolones sont illustrés dans le tableau 8.

Tableau 8 : Répartition des principaux phénotypes de résistance aux quinolones.

Phénotypes de Antibiotiques Effectifs Fréquence %
résistance NA CIP
I (sauvage) S S 11 55
II R I 5 25
III R R 4 20

La répartition des phénotypes de résistance aux quinolones montre une prédominance du phénotype I ou
sauvage sensible avec une fréquence de 55 %,suivis du phénotype II qui confère une résistance à l’ac-
nalidixique dans 25 % des cas, et le phénotype III de la résistance associée entre l’ac-nalidixique et la
ciprofloxacine qui est représenté dans 20 % des cas. Ces résultats sont similaires de ceux de Sekhri A en
(2011), le phénotype I sauvage sensible est le plus fréquent (65,38 %) dans les deux études.

III 20%

I (sauvage)
II 25% 55%

Figure 20: Représentation graphique des phénotypes de résistance de K. pneumoniae aux

Quinolones.

48
 Résultats et discussion

III- Mutagénèse
Les boites de pétri de la souche sauvage de Klebsiella pneumoniae et les résultats obtenues après
mutagénèse aux rayons UV sont représentés dans la figure 21.

Figure 21 : Klebsiella pneumoniae sauvage et mutante

1 : souche de K.P témoin ;
2 : souche de K.P après irradiation pendant 5s ;
3 : souche de K.P après irradiation pendant 10s ;
4 : souche de K.P après irradiation pendant 15s ;
5 : souche de K.P après irradiation pendant 20s.
Les résultats du comptage des colonies de Klebsiella pneumoniae témoins et ceux obtenues après
irradiation aux UV a des différents temps sont mentionnes dans le tableau 9.

Tableau 9 : temps d’irradiation et pourcentage de survie de la souche klebsiella

pneumoniae.
Le temps d’irradiation 00s 05s 10s 15s 20s
Nombre de colonies 474 64 30 2 0
% de survie 100 % 13.50 % 6.32 % 0.42 % 0%

49
 Résultats et discussion

La courbe de survie de K. pneumoniae est montrée dans la figure 22.

% de survivants
120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
00s 05s 10s 15s 20s
temps d'irradiation

Figure 22: la courbe de survie de la souche Klebsiella pneumoniae.

D’après les résultats obtenus et la courbe de survie de Klebsiella pneumoniae, on constate que plus
la durée d’irradiation est importante, plus le nombre total de colonies est faible. Ainsi, les UV agissent en
augmentant la fréquence des mutations dans le génome des cellules exposées (lésions au niveau de l’ADN
qui est dénaturé ou des modifications structurales membranaires induisant des pertes en composés
cellulaires vitaux). Ces mutations conduisent d’une part à la mortalité des cellules et d’autre part à la
modification de l’information génétique, d’où l’impossibilité pour une bactérie de former une colonie
visible après irradiation. Un changement d’aspect des colonies a été observé après irradiation les colonies
sont plates et de couleur plus claire par rapport aux colonies de Klebsiella pneumoniae sauvage qui sont
bombées et de couleur un peut foncer. Les résultats obtenus sont en accord avec ceux obtenues par Cottaz
et al (E. coli) (2008).

50
Conclusion
 Conclusion

Conclusion

Le pouvoir pathogène de K. pneumoniae a évolué depuis plusieurs décennies, en particulier dans

le domaine humain. Les infections dont elle est responsable sont devenues plus variées dans leur
localisation et leur manifestation. Les résultats de cette étude permettent de fournir des données
épidémiologiques sur K. pneumoniae au niveau de l'hôpital Benbadis ainsi qu’une évaluation de la
sensibilité à plusieurs antibiotiques des trois principales familles. Ce type d'étude d'incidence représente
un des éléments épidémiologiques qui peut être intégré dans un programme plus global de lutte contre les
infections nosocomiales.
Rappelons que notre étude pratique avait pour principaux objectifs l’identification d’une souche
de K.pneumoniae par la galerie biochimique classique (après isolement et identification, K. pneumoniae a
montre les caractères biochimiques suivants : Lactose (+), Gaz (+), Citrate (+), mannitol (+), H2S (-),
Uréase (+) et Indole (-), et l’établissement du profil de résistance ou de sensibilité vis-à-vis de 14
antibiotique réalisé par la méthode de diffusion sur disque (les résultats de l’antibiogramme de Klebsiella
pneumoniae ont révélés que un grand nombre de ces souches ont présenté un fort taux de résistance à une
ou plusieurs familles d’antibiotiques en particulier les β-lactamines, les aminosides, et les quinolones. Par
ailleurs l’imipénème, le cefoxitine et la colistine restent les molécules les plus actives). L’application de
la mutagénèse aux Rayons UV sur une souche de K. pneumoniae permis de montrer l’effet de la lumière
ultra-violette sur la survie de cette bactérie : diminution du nombre de colonies en fonction de
l’augmentation du temps d’irradiation, se traduisant par un effet bactéricide dû a la dénaturation de
l’ADN de la bactérie (gène de survie).
Les infections à Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae et surtout à K. pneumoniae
productrices de β-lactamases à spectre étendu (BLSE) représentent une cause importante de morbidité et
de mortalité en milieu hospitalier. En ce qui concerne les K. pneumoniae du CHU de Constantine, elles
sont multi-résistantes et hyperproductrices de BLSE, elles représentent une cause importante de morbidité
et de mortalité, en 2002, sur 350 K. pneumoniae hospitalières, 67.3 % sont des K. pneumoniae BLSE, en
2004 la fréquence diminue légèrement pour atteindre 65 %. Entre 2005-2006 le taux des K. pneumoniae
BLSE+ diminue à 56% (Résultats du réseau national de la surveillance de la résistance aux antibiotiques)
ces chiffres restent considérables. L’analyse phénotypique des souches de Klebsiella pneumoniae isolées
est en faveur d’une production de β-lactamase à spectre étendu (BLSE) soit 50 %, qui ont exprimé
également des résistances notamment aux aminosides et aux fluoroquinolones, mais le phénotype
carbapénèmase n’a pas été retrouvé dans notre série.
La dissémination de la résistance aux antibiotiques n'est pas due à la transmission clonale de
souches résistantes, en revanche, la pression de sélection exercée par les antibiotiques (β-lactamines et
aminosides, et quinolones) favorise cette évolution. La promotion d'alternatives thérapeutiques et un
52
 Conclusion

usage raisonné des antibiotiques sont probablement indispensables pour contrôler la diffusion de la
résistance chez les souches de K. pneumoniae. La résistance change d’un pays à l’autre, bien que
l’émergence se développe rapidement localement puisque les bactéries sont exposées aux mêmes
antibiotiques et soumis aux mêmes conditions.
La résistance bactérienne est générée par l'homme, par un mauvais usage des antibiotiques
prescrits soit inutilement, soit incorrectement, les bactéries multi résistantes se transmettent ensuite en
faveur d'un manque d'hygiène. Nous rappelons les objectifs prioritaires pour la structure de soins que sont
des mesures d'hygiène strictes, une politique de l'usage antibiotique et l'apport d'information régulière sur
l'épidémiologie des souches et des résistances dans les services.
Il convient donc de souligner que l'émergence de tel clone multi résistant qui est à l’origine
d’épidémie est inquiétante car cela a déjà limité les options du traitement pour ce type d’infections. En
définitive, une politique de surveillance régulière des mécanismes de résistance doit être mise en place
dans nos hôpitaux pour définir des stratégies préventives et l'usage plus rationnel des antibiotiques afin de
limiter l’émergence des BMR en Algérie.

53
 Références bibliographiques
A/
 Aartsen J J., Stahlhut S G., Harrison EM., Crosatti M., Ou H-Y., Krogfelt K A., Struve C and
Rajakumar K. 2012. Characterization of a novel chaperone/usher fimbrial operon present on
KpGI-5, a methionine tRNA gene-associated genomic island in Klebsiella pneumoniae.van
Aartsen et al. BMC Microbiology 2012, 12:59.
 Abbott, S. L. (2007). Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and Other
Enterobacteriaceae. In P. R. Murray, E. J. Baron, J. H. Jorgensen, M. L. Landry & M. A. Pfaller
(Eds.), Manual of Clinical Microbiology (9th ed., pp. 698-711). Washington, USA: ASM Press.
 Alobwed I, M’Zali F.H, Livermore D.M, Heritage J, Todd N, Hawkey P.M. 2003. CTX-M
extended-spectrum β-lactamase arrives in hte UK. J Emerging Infectious Diseases 7: 178-82.
 Alves M.S., Rubens C.S.D., De Castro A.C.D., Riley L.W., Moreira B.M. 2006. Identification of
clinical isolates of indole-positive and indole-negative Klebsiella spp Journal of clinical
microbiology 44, p3640-3646.
 Arafa N,Smati F, Scheftel M.J, Meunier O.2009. Caractérisation phénotypique et génotypique de
souches de Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae isolées a l’hôpital universitaire, Algérie.
Science et Technologie30, P44, 45, 46.
 Archambaud M., Clave D. 2008. Fiche technique : Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae.
Centre Toulousain pour le Contrôle de qualité en Biologie clinique. Laboratoire de Bactériologie
Hygiène CHU Toulouse. Fiche technique-Bactériologie 83 EN.FTBAC.14610611.01.
 Avril J-L., Dabernat H., Denis F. et al. (2000). Bactériologie Clinique. Ellipses. 3ème Edition.
511p..
B/
 Ben Haj Khalifa.A et Khedher. M. 2010. Epidémiologie des souches de Klebsiella
spp.uropathogènes productrices de B-lactamases à spectre élargi dans un hopital universitaire
Tunisien.pathologie Biologie 60(2012) e1-e5.
 Bermudes H. Jude F. Arpin C. Quentin C. Morand A. Labia R. Characterization of an inhibitor-
resistant tem (irt) beta-lactamase in a novel strain of klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy., page 222, 1997 Jan.
 Berrazeg, M., S. M. Diene, M. Drissi, M. Kempf, H. Richet, L. Landraud, and J. M. Rolain. 2013.
Biotyping of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolates from France and Algeria
using MALDI-TOF MS. PLoS.One. 8:e61428.
 Boucher A.S ,2002- Mutation, mutagenèse et réparation de l’ADN. A partir d'un article de Beth A.
Montelone , Division of Biology, Kansas State University.

54
  Boukadida J., Salem N., Hannachi N., Monastiri K., Snoussi N. 2002. Exploration génotypique
d’une bouffée épidémique nosocomiale néonatale à Klebsiella pneumoniae productrice de
bètalactamase à spectre étendu.Arch Pédiatr 2002 ; 9 :463-8.
 Boutet-Dubois A., Pantel A., Sotto A., Philippe Lavigne J. 2012. Les entérobactéries productrices
de carbapénémases. Lettre d'information du CClin Sud-Est destinée aux Acteurs de la Lutte contre
les Infections Nosocomiales & Associées aux Soins. Avril 2012.
 Bradford PA. Urban C. Mariano N. Projan SJ. Rahal JJ. Bush K. Imipenem resistance in klebsiella
pneumoniae is associated with the combination of act-1, a plasmid-mediated ampc beta-lactamase,
and the loss of an outer membrane protein. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., pages 563-
9, 1997 Mar.
 Brisse S, Grimont F Et Grimont P. A. D. (2006). The Genus Klebsiella. Procaryotes. Chapitre
3.3.8.
 Bryskier, A. 1984. (Classification of beta-lactams). Pathol.Biol.(Paris) 32:658-667.
C/
 Carbonnelle B., denis F., Marmonier A., Pinon G et Vargues R. (1987). Bactériologie Médicale :
Techniques usuelles. S.I.M.E.P. S. A., Paris, p 121-137; 146-155.
 Carleen M.C, Delia M.G, Heike L. 2006. Idetification of a nitrogen-regulated promoter
controlling expression of Klebsiella pneumoniae urease genes. Molecular Microbiology 8, P187-
198.
 Carl S. 2009. La Résistance aux antibiotique : un enjeu de santé publique imporant.le parrainage
des antimicrobiènnes .p47 .
 Carniel, E. 1999. The Yersinia high-pathogenicity island. Int.Microbiol. 2:161-167.
 Carpenter, J. L. 1990. Klebsiella pulmonary infections: occurrence at one medical center and
review. Rev.Infect.Dis. 12:672-682. Strampfer, M. J., P. E. Schoch, and B. A. Cunha. 1987.
Cerebral abscess caused by Klebsiella ozaenae. J.Clin.Microbiol. 25:1553-1554.
 Carrer A, Nordman P.2009. Klebsiella pneumoniae CTX-M-15 : vers une modification de
l’épidémiologie des beta-lactamases à spectre étendu. Pathologie Biologie59, P 133-135.
 Cavallo J-D., R. Fabre R., Jehl F., Rapp C., Garrab E. 2004. Bêtalactamines. EMC-Maladies
Infectieuses 1 (2004) 129-202.
 Chaves J. Coira A. Segura C. Reig R. Identification and location of the shv-1 gene in klebsiella
pneumoniae strains. Journal of Chemotherapy., pages 49-51, 1995 Nov.
 Comité de l'antibiogramme de la société Française de Microbiologie. 1997.
 Courvalin P, Leclercq R, Bingen E. 2006. Antibiogramme. 141. ED. Masson.

55
D/
 Dabernat, H., O. Petitjean, and S. J. P. W. P. Schlemmer. 1997. Infectiologie de A à Z.354-355.
 Di Martino P, Cafferini N, Joly B, Darfeuille-Michaud A. 2003. Klebsiella pneumoniae type 3 pili
facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology 154: 9-
16.
 Duca M., Furtunescu G., Microbiologie médicale, 2e Ed. Didactique et pédagogique, Bucarest,
1979, 436p.
E/
 Ennis D.G.2001.Mutagenesis.Encyclopedia of life sciences.P4.
 Euzéby J.P 2004. Dictionnaire de bactériologie vétérinaire.
 Eyquem A, Alouf J, Montagnier L. 2000 Traite de microbiologie clinique : deuxième mises a jour
et compléments. Piccin, P84.
F/
 Fauchère J.L et Avril J.L. 2002. Bactériologie générale et médicale. Ed Ellipses. 15: 252-253; 10:
151-176.
 Freney J, R. F., Hansen W, and Bollet TC. 2000. Précis de bactériologie clinique.
 Freney J, Renaud F, R. Leclercq, and Riegel P. 2007. Précis de Bactériologie Clinique.1001-
1014.649-665.
 Fung C.P, Hu B.S, Chang F.Y. 2000. A 5-year study of the seroepidemiology of Klebsiella
pneumoniae: high prevalence of capsular serotype K1 in Taiwan and implication for vaccine
efficacy. J Infect Dis 181: 2075-9.
G/
 Galimand M, et al., 1997. Résistance Multidrug dans Yersinia pestis médiée par un plasmide
transférable. N. Engl. J. Med 337:. 677-681.)
 Gavaret T, Briffaud M. 2009. Klebsiella pneumoniae en aviculture fréquence d’isolement
sensibilité aux antibiotiques. Huitièmes Journée de la Recherche Avicole, St Malo. P423-424.
 George M Garrity., Julia A Bell et Timothy G Lilburn. 2004. Taxonomic Outline of the
Procaryotes. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition.DOI:
10.1007/bergeysouline 200405.
 Gniadkowski M. 2001. Evolution and epidemiology of extended-spectrum beta-lactamases
(EBLSs) and EBLS-producing microorganisms. Clin Microbiol Infect 7. P597-608.
 Grall N., Andremont A., Armand-Lefèvre L. 2011. Résistance aux carbapénèmes : vers une
nouvelle impasse ? ANTINF-16 ; No. of Pages 16.

56
  Gueudet T., Richter S., Szulc M et Jehl F. 2009. Les nouvelles formes de résistance des bactéries
aux antibiotiques : deux cas de Klebsiella pneumoniae produisant une céphalosporinase
plasmidique. MEDMAL-2927 ; No. Of Pages3.
 Gueye O. 2007. Utilisation des méthodes biométriques dans l’identification de quelques bacilles a
Gram négatif. P27, 28-44.
H/
 Haeggman S. Lofdahl S. Burman LG. An allelic variant of the chromosomal gene for class a beta-
lactamase k2, specific for klebsiella pneumoniae, is the ancestor of shv-1. Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, pages 2705-2709, 1997 Dec.
 Held T.K, Jendrike N.R.M, Rukavina T, Podschun R, Trautman M. 2000. Binding to an
Opsonophagocytic Activity of O-antigen-specific Monoclonal antibodies against Encapsulted and
nonencapsulted Klebsiella pneumoniae serotype O1 strains. Infect Immun 68: 2402-2409.
 Hennequin C., Forestier C. 2007.Influence of capsule and extended-spectrum beta-lactamases
encoding plasmids upon Klebsiella pneumoniae adhesion. Research in Microbiology 158(2007)
339-347.)
 Hsieh P-F., Lin TL., Yang FL., Wu M-C., Pan YJ., Wu S H., Wang J T.2012. Lipopolysaccharide
O1 Antigen Contributes to the Virulence in Klebsiella pneumoniae Causing Pyogenic Liver
Abscess. March 2012 | Volume 7 | Issue 3 | e33155.
I/
 Iliaquer M. (2010). Epidémiologie et caractérisation moléculaire de souches cliniques de
Klebsiella pneumoniae résistantes aux céphalosporines de 3ème génération hors BLSE, isolées
entre 2007 et 2009, au C.H.U de Nantes. Université de Nantes. 123p.
J/
 Janda, J. M., & Abbott, S. L. (2006). The Genera Klebsiella and Raoultella. The
Enterobacteria (2nd ed., pp. 115-129). Washington, USA: ASM Press.
 Jarlier V, Nordmann P. 2000. Entérobactéries et bêta-lactamines. In Freney J, Renaud F, Hansen
W, Botler C. Précis de bactériologie clinique. Ed Paris; ed ESKA 649-665.
 Jiang Y,et al. 2010. Séquence de nucleotides complète de Klebsiella pneumoniae multirésistance
pKP048 plasmide, portant blaKPC-2, blaDHA-1, qnrB4, et armA. Antimicrob. . Agents
Chemother 54: 3967-3969.).
 Joly B et Reynaud A. 2002. Entérobactéries. Systématique et méthodes de diagnostic. P : 79-80-
83.

57
K/
 Kariuki S, Corkill J.E, Revathi G, Musoke R, Hart A, Keynan Y, Rubinstein E. 2007. The
changing face of Klebsiella pneumoniae infections in the community. International journal of
Antimicrobiol Agents 6: 2474-2479.
 Klug W. Cummings M. Spencer Ch. 2006. Génétique 8éme edition. Ed. Nouveaux horizons.
 Kone Koumba Diallo.2010. Frequence D’isolement Des Klebsiella Au Laboratoire De
Bacteriologie Cvd Du Chu Gabriel Toure De 2002 A 2007.Thèse Pour obtenir le Grade de
Docteur en Pharmacie (Diplome D’etat).).
L/
 Lai Y.C, Yang S.L, Peng H.L, Chang H.Y. 2000. Identification of genes present specifically in a
virulent strains of Klebsiella pneumoniae. Infect Immun 68: 7149-7151.
 Le Minor L and Véron M. 1989. Bactériologie médicale, 2éme édition, Flammarion Médecine-
Sciences, Paris.2:428-432.
 Lemozy J. Sirot D. Chanal C. Huc C. Labia R. Dabernat H. Sirot J. First characterization of
inhibitor-resistant tem (irt) beta-lactamases in klebsiella pneumoniae strains. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy., pages 2580-2, 1995 Nov.
 Leon le Minor, Michel Veron, Bactériologie Médicale 2èmeEdition Paris, 1989, 396- 795p.
 Lesher, G. Y., E. J. Froelich, M. D. Gruett, J. H. Bailey, and R. P. Brundage. 1962. 1,8-
naphthyridine derivatives. A new class of chemotherapeutic agents. J. Med. Pharm. Chem.
91:1063-1065.
 Liu, et al. Journal of Bacteriology, 2012.

M/
 Meziani M. 2012. Contribution du diagnostic biochimique bactérien dans l’établissement des
parentes phylogénétiques : cas des Entérobactéries et Pseudomonas. P39-41-45.
 Meradi L., Djahoudi A., Abdi A., Bouchakour M., Perrier Gros Claude J-D., Timinouni M.
2009.Resistance aux quinolones de types qnr, aac (60)-Ib-cr chez les entérobactéries isolées a`
Annaba en Algérie. Pathologie Biologie 59(2011) e73-e78.
 Morére J.L ,Pujol R. 2003.Dictionnaire raisonné de biologie .Paris :frison Roche.
N/
 Nauciel C. 2000. Bctériologie médicale. P 55-64 .Ed Masson.
 Nedjai S., Barguigua A., Djahmi N., Jamali L., Zerouali K., Dekhil M., Timinouni
M.2011.Prevalence and characterization of extended spectrum -lactamases in Klebsiella-
Enterobacter-Serratia group bacteria, in Algeria. Médecine et maladies infectieuses 42 (2012) 20–
29.
58
  Nkang A.O, Okonko O.I, Fowotade A, Udeze A.O, Ogunnusi T.A, Fajobi E.A, et al. 2009.
Antibiotics susceptibility profales of bacteria from clinical samples in Calabar, Nigeria. J.
Bacteriol. Res 1, P89-96.
 Nicklin J, Graeme-cook K, Paget T,Killington R.2000.L’essentiel en microbiologie.Port Royal
livers.BERTI Edition.P 113-121.
 Nordmann P et Carrer A. 2010. Les carbapénèmases des entérobactéries. Archives de pédiatrie
2010 ; 17 :S154-162.
O/
 Ofek I, Messika A, Kalina M, Keisari Y, Podschun R, Sahly H, Chang D, McGregor D, Crouch E.
2001. Surfactant protein D enhances phagocytosis and killing of unencapsulated phase variants of
Klebsiella pneumoniae. Infect Immun 69:24-33.
P/
 Phillippon A, Arlet G.2006. β-lactamases de bacilles à Gram négatif: le mouvement perpetuel! J
Ann Biol Clin 64 (1): 37-51.
 Podschun, R. and U. Ullmann. 1998. Klebsiella spp. as nosocomial pathogens: epidemiology,
taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin.Microbiol.Rev.11:589-603.
 Poyart C. Mugnier P. Quesne G. Berche P. Trieucuot P. A novel extended-spectrum tem-type
beta-lactamase (tem-52) associated with decreased susceptibility to moxalactam in klebsiella
pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy., pages 108-113, 1998 Jan.
R/
 Raud P. 2003. Etude de la diversité génétique des souches de Klebsiella pneumoniae productrices
de beta-lactamases à spectre étendu (BLSE), isolées au CHU de Nantes, de 1990 à 2001. P39-
41,77-79.
 Ravanat J.L, Douki T.and Cadet J.2001.Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and
its components.Journal of photochemistry and photobiology 63,P 88-102
 Richard Cl. Et Grimont F. Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, In : LE MINOR (L).
Bactériologie médicale, Paris : Flammarion, 1992, 427-31p. LECLERC H., Microbiologie
générale, 2e édition, 1983, 95p .
 Riegel P. 2002. Aspects bactériologiques des infections urinaires nosocomiales. J Médecine et
maladies infectieuses 33: 255s-265s.
S/
 Seck R. 2005. Resistance des souches d’Escherichia coli et de Klebsiella pneumoniae isolées
d’infections urinaires, P12-13.

59
  Sekhri Arafa N. 2011. Fréquence et marqueurs épidémiologiques de Klebsiella pneumoniae dans
les services à haut risque infectieux au niveau du CHU Benbadis de Constantine.Thèse Pour
l'obtention du Grade de Docteur en Sciences.
 Senda K. Arakawa Y. Ichiyama S. Nakashima K. Ito H. Ohsuka S. Shimokata K. Kato N. Ohta M.
Pcr detection of metallo-beta-lactamase gene (blaimp) in gram-negative rods resistant to broad-
spectrum beta-lactams. Journal of Clinical Microbiology., pages 2909-13, 1996 Dec.
 Singleton P. 2005. Bactériologie pour la médecine, la biologie et les biotechnologies. Ed Dunno,
6ème édition. Sciences SUP. 15: 464-467.
 Sougakoff W, Trystram D. 2003. Résistance aux beta-lactamines. P41-42.
 Stahlhut S G., Struve C., Krogfelt K A et Reisner A.2012. Biofilm formation of Klebsiella
pneumoniae on urethral catheters requires either type 1 or type 3 fimbriae. FEMS Immunol Med
Microbiol 65 (2012) 350–359.
 Struve C, Bojer M, Krogfelt K.A. 2008. Characterization of Klebsiella pneumoniae type 1fimbriae
by detection of phase variation during colonization and infection and impact on virulence. J Infect
Immun 76(9): 4055-65.
T/
 Tzouvelekis LS. Tzelepi E. Prinarakis E. Gazouli M. Katrahoura A. Giakkoupi P. Paniara O.
Legakis NJ. Sporadic emergence of klebsiella pneumoniae strains resistant to cefepime and
cefpirome in greek hospitals. Journal of Clinical Microbiology., pages 266-268, 1998 Jan.
U/
 Urban C. Rahal JJ. Klebsiella and extended spectrum beta-lactamases. International Journal of
Antimicrobial Agents., pages 37-43, 1997 Feb.
V/
 Villegas M.V, Correa A, Perez F, Zuluaga T, Radice M, Gutkind G, Casellas J.M, Ayala J, Quinn
JP. 2004. CTX-M-12 beta-lactamase in Klebsiella pneumoniae Clinical Isolate in Colombia. J
Antimicrobiol Agents and and Chemotherapy 48, P 629-631.
W/
 William K.S,Michael C.C.2006.Génétique 8eme edition .P 380
 Winter P.C, Hickey G.I , Fletcher H.L.1999.L’essentiel en génetique .Berti Edition .P 108-109
Y/
 Yala D, Merad A.S, Mohamadi D, et Ouar Korich M.N. 2001. Classification et mode d’action des
antibiotiques, Médecine du Maghreb 91. P1, 2-13.
 Yala D., Merad A.S., Mohamedi D et Ouar Korich M.N. 2001. Classification et mode d’action des
antibiotiques. Médecine du Maghreb n°91.

60
  Y Shao, et al ... 2010. Genome Subtractor: un outil basé sur le Web pour parallèle in silico
soustractive analyse d'hybridation de plusieurs génomes bactériens Nucleic Acids Res. 38: W194 -
W200.)

Webographie :
 Boston Medical Research Occupational Health Program, 2012 Available at
http://www.bu.edu/rohp/files/2012/08/KPC-Klebsiella.pdf
 Centre canadien d'hygiène et de sécurité au travail, 2013 valable a
http://www.cchst.com/oshanswers/phys_agents/ultravioletradiation.html
 M. Silar Université de Paris Diderot 2008 valable a
http://gec.sdv.univ-paris-diderot.fr/genetique/chapitre5.html

61
 Annexes

Annexe 1 : Composition des milieux de cultures

1. Gélose de Chapman

Peptones 11 g/l
Extrait de viande 1 g/l
Chlorure de sodium 75 g/l
Mannitol 10 g/l
Rouge de phénol 0,025 g/l
Agar 15 g/l

pH = 7,4

2. Gélose de chocolat

Peptone trypsique de caséine 7,5 g/l

Peptone pepsique de viande 7,5 g/l
Amidon de maïs 1 g/l
Hydrogénophosphate de potassium 4 g/l
Dihydrogénophosphate de potassium 1 g/l
NaCl 5 g/l
Hémoglobine 10 g/l
Agar 15 g/l

pH = 7,2

3. Gélose Hektoen

Protéose-peptone . 12 g/l
Extrait de levure 3 g/l
Lactose 12 g/l
Saccharose 12 g/l
Salicine 2 g/l
Citrate de fer III et d'ammonium 1,5 g/l

62
Sels biliaires 9 g/l
Fuchsine acide 0,1 g/l
Bleu de bromothymol 0,065 g/l
Chlorure de sodium 5 g/l
Thiosulfate de sodium 5 g/l
Agar 14 g/l

pH = 7,5

4. Gélose de Mueller Hinton

Infusion de viande de bœuf 300 g/l

Peptone de caséine 17,5 g/l
Amidon de maïs 1,5 g/l
Agar 17 g/l

pH = 7,4

5. Gélose nutritive

Extrait de viande 1g
Extrait de levure 2g
Peptone 5g
Chlorure de sodium 5g
Agar 15 g

pH = 7

6. Milieu TSI

Peptone 15 g
Extrait de viande 3g
Extrait de levure 3g
Peptone pepsique de viande 5g

63
Glucose 1g
Lactose 10 g
Saccharose 10 g
Rouge de phénol 0,024 g
Chlorure de sodium 5g
Sulfate de fer II (pasteur) 0,2 g
Thiosulfate de sodium 0,3 g
Agar 11 g

pH = 7,5

7. Milieu citrate de Simmons

Citrate de sodium 2 g/l

Bleu de bromothymol 0,08 g/l
Chlorure de sodium 0,08 g/l
Sulfate de magnésium 5 g/l
Hydrogénophosphate de potassium 0,2 g/l
Dihydrogénophosphate d'ammonium 1 g/l
Agar 1 g/l
15 g/l
pH = 6,9

8. Milieu Mannitol-Mobilité

Peptone 20 g/l
Nitrate de potassium 1 g/l
Mannitol 12 g/l
Rouge de phénol 40 mg/l
Gélose 4 g/l

pH= 7,6 - 7,8

64
 9. Milieu Urée-Indole

Urée 2g
L-tryptophane 0,3 g
KHPO4 0,1 g
KH2PO4 0,1 g
NaCl 0,5 g
Alcool à 95 °C 1,0 g
Rouge de phénol à 1 % 0,25 g
Eau distillée 100 ml

pH = 7

10. Bouillon cœur cervelle

Protéose-peptone 10 g/l
Infusion de cervelle de veau 12,5 g/l
Infusion de cœur de bœuf 5 g/l
Glucose 2 g/l
Chlorure de sodium 5 g/l
Hydrogénophosphate de sodium 2,5 g/l

pH = 7,4

11. Bouillon nutritif

Peptone 10 g/l
Extrait de viande 4 g/l
Chlorure de sodium 5 g/l

pH = 7,2

65
Annexe 2 : Les réactifs

1. Réactif de Kovacs

Para dimethylamino benzaldehyde 0,5 g

Alcool iso anylique 75 ml
Acide chlorhydrique 25 ml

Annexe 3 : Les colorants

1. Violet de gentiane

Violet de gentiane 1 g/l

Ethanol a 90% 10 ml
Phénol 2 g/l
Eau distillé 100 ml

2. Lugol

Lode 1 g/l
Lodure de potassium 2 g/l
Eau distillé 300 ml

3. Fuchsine

Fuchsine basique 1 g/l

alcool éthylique a 90o 10 ml
Phénol 5 g/l
Eau distillé 10 ml

66
Annexe 4 : Antibiogramme des entérobactéries.

67
Annexe 5 : Tableau des antibiotiques testés.

Familles Antibiotiques testés Abréviation Charge des

d’antibiotiques Disques

Amoxicilline AMX 25 μg

Amoxicilline-acide AMC 30 μg
clavulanique
Ticarciline TIC 75 μg

Céfazoline KZ 30 μg
β-Lactamines
Cefoxitine FOX 30 μg

Céfotaxime CTX 30 μg

Imipénème IPM 10 μg

Amikacine AK 30 μg
Aminosides
Gentamicine CN 15 μg

Acide Nalidixique NA 30 μg
Quinolones
Ciprofloxacine CIP 5 μg

Triméthoprime- SXT 25 μg
Sulfamides
Sulfaméthoxazole
Chloramphénicol C 30 μg
phénicol
Colistine CT 50 μg
polymixines

68
Annexe 6 : Break-points des antibiotiques selon le CLSI:

Antibiotiques Breack-points

Amoxicilline 14- 16

Amoxicilline-acide clavulanique 15 – 20

Ticarciline 15 - 19

Céfazoline 15 – 17

Cefoxitine 15 – 17

Céfotaxime 15 – 22

Imipénème 14 – 15

Amikacine 15 – 17

Gentamicine 13 – 14

Acide Nalidixique 14 - 18

Ciprofloxacine 16 - 20

Triméthoprime- Sulfaméthoxazole 11 - 15

Chloramphénicol 8 - 16

Colistine 10 - 11

69
Annexe 7 : résultats de la galerie biochimique des 20 souches de Klebsiella pneumoniae isolées.

souches Galeries biochimique

TSI CITRATE MANNITOL UREE
1 + - + +
2 + - + +
3 + - + +
4 + + + +
5 + + + +
6 + + + +
7 + + + -
8 + + + -
9 + - + -
10 + - + -
11 + + + -
12 + + + -
13 + - + -
14 + - + -
15 + + + +
16 + + + +
17 + + + +
18 + + + +
19 + + + +
20 + + + +

70
 Annexe 8 : résultats d’antibiogramme des 20 souches de Klebsiella pneumoniae isolées.

souches Antibiotiques testés

AMX AMC TIC KZ FOX CTX IPM CN AK NA CIP SXT C CT

1 R R R R S R S R S R I R S S

2 R R R R S R S R S R I R S S

3 R R R R S R S R S R R R R S

4 R R R R S R S R S R R R S S

5 R R R R S R S R S R R R S S

6 R S R S S S S S S S S S R S

7 R S R S S S S S S S S S S S

8 R S R S S S S S S S S S S S

9 R S R S S S S S S S S S S S

10 R R R R S R S S S S S R S S

11 R S R S S S S S S S S R S S

12 R R R R S R S R S R I R S S

13 R R R R S R S R R R I R S S

14 R S R S S S S S S S S S S S

15 R S R S S S S S S S S S S S

16 R R R R S R S R R S S S S S

17 R R R R S R S R S S S S S S

18 R R R R S S S S S R R R S S

19 R R R R S S S S S I S S S S

20 R S R S S S S S S S S S S S

R% 100 60 100 60 0 50 0 45 10 40 20 50 10 0

S% 0 40 0 40 100 50 100 55 90 55 60 50 90 100

I% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 20 0 0 0

71
Annexe 9 : résultats de l’étude rétrospective sur les souches de Klebsiella pneumoniae isolées durant
l’année 2015.

1. Distribution des souches isolées selon l’espèce :

543 souches de Klebsiella pneumoniae ont été isolées dont 0,36 % (2/543) Klebsiella pneumoniae subsp
ozenae et 99,63 % (541/543) Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae. Ces résultats montrent que
Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae est l’espèce la plus fréquemment isolée en milieu hospitalier.

K.p subsp
ozenae
0,36 %

K.p subsp
pneumoniae
99,63 %

Figure 1 : Distribution des souches isolées selon l’espèce n = 543.

2. Distribution des souches isolées selon l’origine du prélèvement

Parmi les 543 souches de Klebsiella pneumoniae isolées, 16,39 % (89/543) communautaires et 83,60 %
(454/543) hospitalières. Ces résultats montrent une prédominance des souches hospitalières par rapport
aux souches communautaires. Conformément aux données de la littérature, l'espèce K. pneumoniae est
plus fréquemment isolée à l'hôpital qu'en communauté, 85% contre 15% pour Decré et al, (2000).

Tableau 1: Distribution des souches K. pneumoniae selon l’origine du prélèvement.

Origine Effectif Pourcentage (%)
Souches hospitalières 454 83,60
Souches communautaires 89 16,39
Total 543 100

72
 Communaut
aires
16,39 %

Hospitalieres
83,60 %

Figure 2 : Distribution des souches isolées selon l’origine du prélèvement n = 543.

3. Distribution des souches parmi les prélèvements cliniques

Sur les 543 souches isolées, 38,67 % proviennent de la bactériologie générale (qui regroupe les
prélèvements de pus et sérosités purulentes, prélèvements respiratoires, drains, sondes urinaires et
trachéal), 41,80 % d'urines et 18,04 % d'hémocultures. Dans notre étude le nombre de prélèvements
urinaires est le plus élevé. Cette valeur correspond aux rapports de la littérature, où les prélèvements
urinaires sont toujours dominants.

Tableau 2: Répartition des souches de K. pneumoniae parmi les prélèvements cliniques n = 543.
Prélèvement Nombre de K. pneumoniae Pourcentage (%)
isolée
Urines 227 41,80
Pus et sérosité 210 38,67
Hémoculture 98 18,04
LCR 8 1,47
Total 543 100

73
 LCR
Hémoculture 1,48%
18,04%

Urines
41,80%

Pus et sérosité
38,67%

Figure 3 : Répartition de Klebsiella pneumoniae parmi les prélèvements cliniques

4. Fréquence d’isolement de Klebsiella pneumoniae au CHU de Constantine parmi les

prélèvements effectués en 2015

Parmi tous les prélèvements effectués en 2015, K. pneumoniae enregistre une fréquence de 3,15 %.

Tableau 3 : Fréquence d’isolement de Klebsiella pneumoniae au CHU de Constantine parmi les

prélèvements effectués en 2015.
Année Nombre total de Nombre de K. Pourcentage (%)
prélèvements pneumoniae isolée
2015 17228 543 3,15

74
 K.
pneumoniae
3,15%

Prélèvements

Figure 4 : Fréquence d’isolement de Klebsiella pneumoniae au CHU de Constantine parmi les

prélèvements effectués en 2015.

5. Répartition des souches selon l’origine et le service d'hospitalisation

La répartition des souches selon leur provenance montre que 83.58 % des souches sont isolées des
différents services de l’hôpital, (souches hospitalières), contre 16.39 % isolées de l’extérieur (souches
communautaires). Les services de Médecines enregistre un taux important de souches de K. pneumoniae
avec une fréquence de 28,54 %, suivi des services des unités de soins intensifs avec une fréquence de
23,38 %, Pédiatrie avec une fréquence de 14,91 %, et de chirurgie avec une fréquence de 13,62 %. En
revanche la plus basse distribution est enregistrée aux autres services de l’hôpital (Épidémiologie, ERB,
Protection sanitaire, Biochimie, Médecine légale et Médecine de travail) avec une fréquence de 3,13 %.

Tableau 4 : Répartition des souches par service d’hospitalisation

Service Effectif Pourcentage %
Médecine 155 28,54
Unités de soin Intensif 127 23,38
Pédiatrie 81 14,91
Chirurgie 74 13,62
Autres 17 3,13
Externes 89 16,39
Total 543 100

75
 Autres
Externes
3,13%
16,39% Médecine
28,54%
Chirurgie
13,62%

Unités de soin
Pédiatrie Intensif
14,91% 23,38%

Figure 5 : Répartition des souches par service d’hospitalisation.

6. Distribution globale selon le sexe :

274 (50,46 %) des souches isolées proviennent de femmes et 269 (49,53 %) d’hommes, Le sexe ratio est
de 0,98. On peut remarquer que les souches de Klebsiella pneumoniae se répartissent presqu'à part égale
pour les deux sexes. Ce critère physiologique ne semble pas influencer les infections nosocomiales. Selon
le sexe la fréquence d’isolement est statistiquement non significative. Par contre celui de l’âge et qui est
en rapport avec le statut immunitaire des patients, aurait son influence, c’est en effet un des facteurs de
risque pour l’infection par Klebsiella pneumoniae , puisque les plus touchés sont les personnes âgées et
les immunodéprimées, ainsi que les nourrissons, conformément à de nombreux rapports.

Tableau 5 : Distribution globale des souches de Klebsiella pneumoniae selon le sexe.

Sexe Effectif Pourcentage (%)
Femme 274 50,46
Homme 269 49,53
Total 543 100

76
 Homme
Femme 49,53 %
50,46 %

Figure 6 : Distribution globale des souches isolées selon le sexe n = 543.

77
 Année universitaire : 2015/2016 Présenté par : BOUGHACHICHE ROUMEISSA
SEBAIS SAFA

Caractérisation morphologique, biochimique et

mutagénése des Klebsiella pneumoniae au CHU de Constantine.

Mémoire de fin de cycle pour l’obtention du diplôme de Master en Génétique Moléculaire.

Résumé :
Klebsiella pneumoniae est une bactérie pathogène opportuniste. elle est le chef de file des germes
responsables d’infections nosocomiales sévères et difficiles à traiter, L’augmentation et la dissémination
de la résistance aux antibiotiques chez les bacilles à Gram négatif, notamment chez K. pneumoniae,
représente un problème majeur de santé publique.
La mise en évidence du caractère épidémique de l’infection est importante pour la mise en œuvre
rapide des mesures préventives. Dans ce but, nous nous sommes fixés les objectifs suivants :
l’identification de 20 souches de K. pneumoniae selon ses caractères biochimiques, isolées a partir des
différents prélèvements cliniques au niveau du service de microbiologie du CHU Benbadis Constantine,
L’étude de la résistance aux antibiotiques des souches de K. pneumoniae et déterminer leurs phénotypes
de résistance, a la fin une mutagénèse a été réalisé par irradiation des souches au Rayons Ultra-violets
pour déterminer leurs effets sur la survie de ces bactéries.
Les résultats issus de cette étude ont montré une résistance élevée des souches cliniques de K.
pneumoniae à la majorité des antibiotiques cliniquement utilisés particulièrement aux β-lactamines 50 %
des souches étaient productrices de BLSE.

Mots clés : Klebsiella pneumoniae – isolement – identification – caractères biochimiques – résistance -

antibiotiques – phénotypes – BLSE – irradiation U.V – survie des bacteries.

Lieu de l’étude : laboratoire de Microbiologie du Centre Hospitalo-Universitaire Benbadis Constantine.

Jury d’évaluation :
Président du jury : Mme. GHARZOULI R Maitre de conférences B (Université Constantine 1).
Rapporteur : Mme. BECHKRI S Maitre-assistante A (Université Constantine 1).
Examinateur : Mme. SAOUDI M Maitre-assistante A (Université Constantine1).
Date de soutenance : 21/06/2016