UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À TROIS-RIVIÈRES

CARACTÉRISATION ET IMPACT DES ISOFORMES D’AKT ET DE LA VOIE DE

SIGNALISATION PI3K/AKT DANS L’OVAIRE, SUR LA RÉSERVE OVARIENNE,
LA DYNAMIQUE FOLLICULAIRE ET DANS LE VIEILLISSEMENT OVARIEN

THÈSE PRÉSENTÉE
COMME EXIGENCE PARTIELLE DU
DOCTORAT EN BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE

PAR
DADOU LIKONZA LOKENGO

MAI 2023
 Université du Québec à Trois-Rivières

Service de la bibliothèque

Avertissement

L’auteur de ce mémoire, de cette thèse ou de cet essai a autorisé

l’Université du Québec à Trois-Rivières à diffuser, à des fins non
lucratives, une copie de son mémoire, de sa thèse ou de son essai.

Cette diffusion n’entraîne pas une renonciation de la part de l’auteur à ses

droits de propriété intellectuelle, incluant le droit d’auteur, sur ce
mémoire, cette thèse ou cet essai. Notamment, la reproduction ou la
publication de la totalité ou d’une partie importante de ce mémoire, de
cette thèse et de son essai requiert son autorisation.
 UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À TROIS-RIVIÈRES

DOCTORAT EN BIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLÉCULAIRE (PH. D.)

Direction de recherche :

Éric Asselin Directeur de recherche

Monique Cadrin Codirectrice de recherche

Jury d’évaluation de la thèse :

Éric Asselin Directeur de recherche

Monique Cadrin Codirectrice de recherche

Carlos Reyes-Moreno Président de jury

Alexandre Fisette Évaluateur interne

Claude Robert Évaluateur externe

À titre posthume.
 Je dédie cette thèse à mon épouse
Nadine NGONDE et à mes enfants Samuella, Samuel et
Carmel LOKENGO ainsi qu’à mes regrettés parents,
pour ce qu’ils représentent dans ma vie.
 REMERCIEMENTS

Premièrement, j’aimerais remercier mon Dieu, le très haut, créateur et maître des temps
et des circonstances. De lui nous tirons vie, intelligence, force et tout ce qui est nécessaire pour
l’aboutissement de tous nos projets dont cette thèse. Merci, Seigneur Jésus-Christ pour ta
fidélité, je peux dire Eben Ezer.

Deuxièmement, j’aimerais remercier grandement mon directeur de recherche,

Éric Asselin, d’avoir accepté mon intégration dans son équipe alors que nous ne nous
connaissions pas avant. Je le remercie d’avoir cru en moi, de m’avoir supporté tout au long de
ce cheminement dans ce domaine qui était pour moi très théorique et livresque au début.
Éric, je te serai reconnaissant pour ton leadership, ton encadrement qui m’ont poussé au
dépassement de soi et à plus de rigueur scientifique. Ton sens d’organisation dans la conduite
de l’équipe de recherche et du laboratoire m’a permis de consolider et de refonder des
caractéristiques des scientifiques. Ce, en facilitant ma participation aux congrès internationaux,
par tes conseils, orientations et suggestions concernant mes idées, hypothèses et projets.
Plus encore, travailler avec toi m’a permis d’étayer une autonomie intellectuelle et une
expérience professionnelle solide. Aussi, beaucoup d’autres souvenirs sociaux et ton soutien
pour moi resteront gravés en moi toute la vie. Tu resteras un des mentors qui m’auront permis
de réaliser ce rêve grandiose.

Je remercie Monique Cadrin, ma codirectrice, pour ses remarques pertinentes et pointillées

mêlées d’humilité qui m’ont permis d’étayer cette thèse. Au travers d’elle, je remercie le corps
professoral du Département de biologie médicale de l’Université du Québec à Trois-Rivières
pour leur contribution, notamment au travers de différents séminaires. En particulier, je remercie
Patrick Narbonne de m’avoir facilité l’accès à son microscope stéréoscopique sans lequel,
une bonne partie de cette thèse n’aurait pas pu se réaliser aisément.

J’aimerais remercier particulièrement un autre mentor, Justin Mboloko Esimo, pour son
encadrement dans ma vie tant étudiante que professionnelle comme médecin, mais aussi pour
 v

l’aboutissement à ce doctorat. Son leadership, sa passion pour la science, la recherche et son

dévouement dans l’encadrement de la jeunesse et à la patientèle resteront pour moi une référence.
Au travers de lui, je tiens à remercier tous mes maitres et encadreurs (que je ne saurai tous
citer ici) de la Faculté de médecine de l’Université de Kinshasa. Ils et elles ont su semer en moi
les ingrédients nécessaires et utiles à l’accomplissement de cette thèse.

Je remercie aussi Sophie Parent, malgré le court temps passé ensemble avec elle au
laboratoire, pour ses judicieux conseils, son aide et son expertise technique dès mes premiers
moments et pas au laboratoire. Sa disponibilité et sa bonne humeur demeurent des qualités qui
me marqueront longuement.

Je remercie mes collègues du laboratoire qui ont été d’un précieux apport quant à leurs
contributions techniques et intellectuelles, soutien et pour des moments passés ensemble.
Je cite François Fabi et Pascal Adam, pour leurs aides dans la mise en place de certains
expérimentations et protocoles; Christian Mayemba, pour son apport dans les manipulations;
Junie Huriette Chansi Kegni et Laurence Tardif, pour leurs conseils et aides techniques dans la
réalisation de mes projets. Mais également Nicholas Thibodeau, Léa Renaud ainsi que les
différent(e)s stagiaires pour des moments de collaboration passés dans le laboratoire.

J’adresse un remerciement particulier à mon épouse Nadine Ngonde Nanikundila ainsi qu’à
mes chers enfants pour avoir supporté mes longues absences et surtout accepté de soutenir à tout
point de vue mes difficiles décisions. Que vous trouvez ici ma reconnaissance profonde et la fierté
de vous avoir comme famille! Laissez que cette thèse soit pour vous, mes enfants, un modèle
de dévouement au travail et à la productivité. Au travers de vous, je remercie également mes
frères et sœurs ainsi que ma belle-famille pour leur soutien tous azimuts.

Je ne saurais oublier de remercier le Programme canadien de bourses de la Francophonie

qui, par l’octroi de sa bourse, m’a permis de compléter ce doctorat. Au travers de lui,
mes remerciements vont au Canada et à mon pays, la République démocratique du Congo pour
cette coopération bilatérale.
 vi

En fin à l’ensemble de personnes que j’ai côtoyées ces dernières années et qui ont permis,
chacune à sa façon, d’accomplir ce rêve, dont le parcours aura été long et émaillé des
rebondissements, je dis merci.
 RÉSUMÉ

L’infertilité du couple représente un problème majeur de santé publique par sa prévalence qui
tourne autour de 16 % ou plus. Parmi les causes féminines de celle-ci, les pathologies ovariennes
tiennent une place déterminante. Au sein de l’ovaire, organe complexe et dynamique,
se déroulent des processus biologiques nécessaires à la fertilité et à la bonne santé de la femme.
Parmi ces processus, il y a la régulation de la réserve ovarienne (RO), la dynamique folliculaire,
l’ovulation ainsi que le vieillissement ovarien (VO). Ils s’y déroulent également des processus
pathologiques dont la diminution de la RO et l’insuffisance ovarienne prématurée (IOP). L’IOP
est un problème de santé qui a pris de l’ampleur au cours des dernières décennies et pour lequel
un effort particulier a été mis dans le développement de thérapies. Ce dernier appelle d’abord à
l’élucidation des mécanismes qui entrainent la survenue de la pathologie. Les différents
processus impliqués dans la dynamique de l’ovaire et le développement de pathologies exigent
la participation des voies moléculaires de signalisation. La voie phosphatidylinositol 3 kinase
(PI3K) /Akt en occupe une place centrale et elle est cruciale étant donné son implication dans la
prolifération, la croissance, la différenciation et l’apoptose cellulaires. En effet, ces processus
cellulaires sous-tendent les différents événements biologiques susmentionnés qui sont impliqués
dans le fonctionnement normal de l’ovaire, mais aussi dans le développement de certaines
pathologies ovariennes comme le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) et l’IOP.
Akt existe sous trois isoformes (Akt1, Akt2 et Akt3) qui partagent jusqu’à 80 % d’homologie
structurale, selon les espèces, bien qu’elles soient codées par trois gènes différents. Akt3 est
l’isoforme d’Akt la moins exprimée et la moins étudiée dans divers organes, dont l’ovaire.
Les données retrouvées dans la littérature établissent que les trois isoformes d’Akt possèdent
certaines spécificités dans leurs localisations tissulaires et cellulaires. En dehors de leurs
redondances fonctionnelles, elles possèdent des rôles spécifiques, voire opposés dans divers
processus physiologiques et pathologiques. La participation d’Akt dans ces processus se fait en
médiant l’action d’hormones et de facteurs de croissance. Cependant, bien qu’Akt soit impliqué
dans les différents processus susmentionnés, les connaissances concernant l’implication des
différentes isoformes d’Akt dans l’ovaire demeurent peu connues. Il nous est paru de ce fait
important de cerner l’expression, la localisation ainsi que l’implication des isoformes d’Akt dans
l’ovaire. Les hypothèses principales étudiées dans notre thèse sont les suivantes :
1) Les isoformes d’Akt sont différemment exprimées et régulées dans l’ovaire à travers le cycle
œstral par la présence des stéroïdes ovariens. 2) Les stéroïdes ovariens ainsi que le
4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD) régulent Akt de manière isoforme- spécifique. 3) Il existe
une spécificité dans l’implication des isoformes d’Akt dans le processus du VO malgré les
redondances possibles. 4) Akt3 pourrait jouer un rôle dans divers processus biologiques
ovariens, particulièrement dans la préservation de la RO, la dynamique folliculaire et
l’ovulation. 5) Akt joue un rôle crucial dans la protection de la RO et, de ce fait, pourrait être un
élément de régulation dans la prévention de son épuisement précoce. Ainsi, dans le cadre de cette
thèse, nous avons analysé l’expression des isoformes d’Akt dans l’ovaire au travers du cycle
œstral et déterminé leurs implications dans le VO. Nous avons aussi porté une attention
particulière sur l’effet de l’élimination d’Akt3 sur la RO, la dynamique folliculaire, le volume
ovarien et l’ovulation. Cette étude permettra de mettre les bases pour envisager des thérapies
spécifiques qui auront pour but de réduire entre autres, VO précoce le SPOK et l’IOP.
 viii

Dans un premier temps, nous avons analysé dans un modèle in vivo soit la souris C57 BL/6J,
l’expression, la localisation et l’activation des isoformes d’Akt dans l’ovaire au travers du cycle
œstral. Les résultats obtenus montrent que les isoformes d’Akt possèdent certaines spécificités
quant à leur localisation dans les différents compartiments et structures ovariens ainsi que dans
leur localisation subcellulaire dans les différents types cellulaires. De plus, leur expression,
localisation et activation, au travers du cycle œstral, varient de manière isoforme-spécifique.
Ces résultats suggèrent que la régulation des isoformes d’Akt est dépendante de la régulation
hormonale propre à chaque phase du cycle. Par exemple, cette régulation pourrait se faire
par la Follicle stimulating hormone (FSH) et l’œstradiol (E2) en proestrus, la Luteinizing
Hormone (LH) en œstrus, la progestérone en metestrus et diestrus. Ces variations spécifiques
des isoformes d’Akt suggèrent qu’elles joueraient des rôles spécifiques, à côté de rôles
redondants, dans des phases particulières du cycle œstral.

Dans un deuxième temps, notre travail s’est intéressé à la régulation des isoformes d’Akt par les
stéroïdes ovariens grâce à un modèle moins complexe in vitro réalisé sur des cellules de la
granulosa. Ces cellules président ensemble avec l’ovocyte au destin folliculaire et possèdent des
récepteurs pour différentes hormones et molécules qui agissent sur les follicules. Les résultats
nous suggèrent que la régulation de l’expression d’Akt1 et 2 par la dihydrotestostérone (DHT)
et l’E2 tend à se réaliser de manière isoforme-spécifique. L’activation des isoformes d’Akt et de
certaines de leurs cibles par ces deux stéroïdes se fait significativement de manière opposée,
mais non spécifique; l’E2 augmente le niveau de leur activation tandis que la DHT le diminue.

Dans un troisième temps, nous avons étudié in vivo l’implication d’Akt3 sur la dynamique
folliculaire et l’ovulation grâce à un modèle de Knock out (KO) constitutif (Akt3-/-). Le volume
ovarien était diminué de manière significative dans toutes les phases du cycle œstral chez les
souris Akt3-/-. Nos résultats ont aussi démontré que l’élimination d’Akt3 entraine une diminution
significative de la RO et une augmentation des follicules secondaires chez les souris âgées de
45 jours. Ces résultats suggèrent que Akt3 joue un rôle de frein à la sortie des follicules du pool
de la RO. Nous avons observé également une baisse significative du nombre de corps jaunes chez
les souris Akt3-/- âgées de 100 jours comparativement aux souris de type sauvage.
Ces observations suggèrent qu’Akt3 jouerait aussi un rôle dans l’ovulation et par conséquent la
formation des corps jaunes. Ces données suggèrent de nouveaux rôles pour Akt3 dans la
physiologie ovarienne.

Finalement, en vue d’étudier le rôle des isoformes d’Akt dans le VO/épuisement de la RO,
nous avons induit le VO in vitro et in vivo, à l’aide d’un traitement avec le 4-vinylcyclohexène
diépoxyde (VCD) un agent ovo-toxique ciblant les follicules primordiaux et primaires.
Nous avons analysé l’expression ainsi que l’activation des isoformes d’Akt. Nos résultats
montrent qu’in vitro, les isoformes d’Akt sont régulées à un double niveau par le VCD.
Au niveau protéique, la quantité des trois isoformes d’Akt et de leurs cibles (Bad
(pro-apoptotique), Foxo3a (facteur de transcription), GSK3β (métabolisme du glucose) et mTOR
(serine/thréonine kinase) est significativement réduite. In vitro le VCD réduit significativement
l’activation de deux isoformes étudiées (Akt1 et Akt2) ainsi que de leurs cibles moléculaires
susmentionnées. Au niveau transcriptionnel, nous avons aussi observé que l’expression
(ARNm) est régulée à la baisse pour Akt1 et Akt3. Cependant, in vivo, bien qu’en induisant le
VO, des effets du VCD sur les isoformes d’Akt n’ont pas été observés. Ces résultats permettront
 ix

d’orienter des études futures sur les stratégies à développer pour cibler les isoformes d’Akt dans
le t rai t em ent du VO.

En conclusion, chacune des études conduites dans cette thèse nous a permis de cerner encore
mieux la régulation et les rôles des isoformes d’Akt dans l’ovaire. Notre travail servira des bases
pour des études futures en vue, par exemple, de développer des stratégies qui ciblent les
isoformes d’Akt pour des thérapies concernant entre autres les patientes à risque du VO précoce
ou d’infertilité d’origine ovarienne.

Mots-clés : AKT, PI3K, réserve ovarienne, ovulation, folliculogenèse, vieillissement ovarien,

insuffisance ovarienne, 4-vinylcyclohexène diépoxyde, androgènes, œstrogènes, cycle œstral.
 TABLE DES MATIÈRES

REMERCIEMENTS ........................................................................................................... iv
RÉSUMÉ .............................................................................................................................. vii
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................ xiii
LISTE DES ABRÉVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES ......................................... xv

CHAPITRE I
INTRODUCTION ............................................................................................................... 1
1.1 Anatomie et régulation endocrinienne de l’ovaire ....................................................... 1
1.1.1 Anatomie macroscopique et microscopique de l’ovaire .................................. 2
1.1.2 Microscopie et dynamique fonctionnelle des follicules ................................... 4
1.1.3 Régulation fonctionnelle hypothalamo-hypophysaire (HT-HP) et interne
de l’ovaire ......................................................................................................... 6
1.2 Réserve ovarienne et dynamique de la croissance folliculaire..................................... 10
1.3 Vieillissement ovarien, infertilité et ses autres conséquences ..................................... 15
1.4 Aspects moléculaires de la formation de la réserve ovarienne, la dynamique
folliculaire, du vieillissement ovarien et implication de la voie PI3K/Akt .................. 19
1.5 Voie de signalisation PI3K/Akt ................................................................................... 25
1.5.1 Structure, isoformes, activation et régulation d’Akt ........................................ 26
1.5.2 Cibles moléculaires d’Akt impliquées dans la dynamique folliculaire,
la réserve ovarienne et le vieillissement ovarien .............................................. 29
1.6 Interaction entre la voie PI3K/Akt et les hormones régulant les fonctions endocrines
de l’ovaire..................................................................................................................... 32
1.7 Les traitements hormonaux chez la femme et leur impact sur l’ovaire ....................... 33
1.7.1 Les œstrogènes ................................................................................................. 34
1.7.2 Les androgènes ................................................................................................. 35
1.8 Pathologies ovariennes retentissant sur la folliculogénèse et impliquant la voie
PI3K/Akt : cas du SOPK .............................................................................................. 36
1.9 Problématique, hypothèses et objectifs de la recherche ............................................... 37
1.10 Choix du modèle expérimental, correspondances avec la femme et éléments
spécifiques du cycle œstral........................................................................................... 39
 xi

CHAPITRE II
MATÉRIEL ET METHODES ........................................................................................... 46
2.1 Animaux et procédures d’étude ................................................................................... 46
2.2 Isolation et culture des cellules de la granulosa ovarienne .......................................... 47
2.3 Induction du vieillissement ovarien par le 4-vinylcyclohexène diépoxyde ................. 48
2.3.1 Expérimentation in vitro................................................................................... 48
2.3.2 Expérimentation in vivo ................................................................................... 48
2.4 Traitements avec les stéroïdes ovariens réalisés sur les cellules de la granulosa ........ 49
2.5 Frottis vaginal pour détermination des phases du cycle œstral .................................... 49
2.6 Histologie ovarienne, compte de follicules, de corps jaunes et calcul du volume
ovarien .......................................................................................................................... 49
2.6.1 Compte de follicules ovariens et de corps jaunes ............................................ 49
2.6.2 Calcul du volume ovarien ................................................................................ 50
2.7 Immunohistochimie et immunocytochimie.................................................................. 51
2.8 Immunofluorescence .................................................................................................... 52
2.9 Extraction de protéines et Western blot ....................................................................... 53
2.10 Extraction de l’ARN et RT-qPCR................................................................................ 54
2.11 Analyses statistiques .................................................................................................... 55
2.12 Considérations éthiques ............................................................................................... 55

CHAPITRE III
RÉSULTATS ....................................................................................................................... 56
3.1 Expression des isoformes d’Akt dans les différents compartiments et structures
ovariens ........................................................................................................................ 56
3.2 Localisation subcellulaire, intensité et activation des isoformes d’Akt au cours
du cycle œstral.............................................................................................................. 58
3.3 Validation du Knock out d’Akt3 dans notre modèle ................................................... 64
3.4 La déficience en Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique folliculaire ...... 65
3.5 L’élimination d’Akt3 est accompagnée de la diminution des corps jaunes et
du volume ovarien ........................................................................................................ 69
3.6 Validation du modèle de cellules de la granulosa ........................................................ 73
3.7 Expression et localisation des isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa ....... 74
3.8 Régulation de l’expression et de la localisation des isoformes d’Akt par les stéroïdes
ovariens ........................................................................................................................ 74
 xii

3.9 Impact du traitement stéroïde sur la phosphorylation des isoformes et des cibles
d’Akt ............................................................................................................................ 78
3.10 Validation du modèle de vieillissement ovarien induit par le 4-vinylcyclohexène
diépoxide (VCD) .......................................................................................................... 81
3.11 Effets du VCD sur l’expression protéique, l’activation des isoformes d’Akt et
sur l’expression de la caspase-3 clivée......................................................................... 84
3.12 Régulation de l’expression des ARNm des isoformes d’Akt par le VCD ................... 89
3.13 Impact du VCD sur l’expression d’Akt total, sur l’expression et la phosphorylation
des cibles d’Akt ............................................................................................................ 91

CHAPITRE IV
DISCUSSION ....................................................................................................................... 94
4.1 Les isoformes d’Akt sont différemment exprimées dans les compartiments et
structures ovariens ........................................................................................................ 94
4.2 La localisation, l’intensité et l’activation des isoformes d’Akt varient de manière
isoforme-spécifique au cours du cycle œstral .............................................................. 97
4.3 La déficience d’Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique folliculaire ........ 101
4.4 L’effet de la déficience d’Akt3 sur l’ovulation ............................................................ 103
4.5 La déficience en Akt3 entraine la diminution du volume ovarien ............................... 104
4.6 Les isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa ovarienne et leur régulation
par les stéroïdes ovariens ............................................................................................. 105
4.7 Régulation des isoformes d’Akt dans le vieillissement ovarien induit par le VCD..... 109
4.8 Les cibles d’Akt dans le vieillissement ovarien et leur régulation par les stéroïdes
ovariens ........................................................................................................................ 112
4.9 Limitations méthodologiques ....................................................................................... 114

CHAPITRE V
CONCLUSION ET PERSPECTIVES .............................................................................. 116
5.1 Conclusion ................................................................................................................... 116
5.2 Perspectives .................................................................................................................. 119
5.2.1 Perspectives à court terme ................................................................................ 120
5.2.2 Perspectives à long terme ................................................................................. 121

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .......................................................................... 123

ANNEXE
LES DONNÉES SUPPLÉMENTAIRES DU CHAPITRE II ET III .............................. 138
 LISTE DES FIGURES

Figure Page

1.1 Anatomie macroscopique des organes reproducteurs. A) humains, B) souris ........... 2

1.2 Schémas illustrant différentes structures dans une coupe microscopique de

l’ovaire ........................................................................................................................ 3

1.3 Différentes catégories folliculaires dans l’ovaire ....................................................... 6

1.4 Cinétiques des hormones durant le cycle menstruel féminin ..................................... 8

1.5 Représentation schématique de la perte folliculaire, de la qualité ovocytaire et

des différents événements reproductifs en fonction de l’âge de la femme ................. 16

1.6 Représentation schématique des isoformes d’Akt ...................................................... 27

1.7 Représentation schématique des cibles moléculaires d’Akt impliquées dans

l’ovaire ........................................................................................................................ 30

1.8 Profil hormonal sérique durant les différentes phases du cycle œstral chez la souris .. 41

3.1 Les isoformes d’Akt s’expriment différemment dans les structures et

compartiments ovariens .............................................................................................. 57

3.2 Localisation subcellulaire, intensité et activation des isoformes d’Akt au travers

du cycle œstral chez les souris C 57 BL/6J de type sauvage âgées de 100 jours ....... 63

3.3 Validation de l’élimination d’Akt3 ............................................................................. 64

3.4 La déficience en Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique folliculaire ..... 68

3.5 Effet de l’élimination d’Akt3 sur le corps jaune, la fertilité et le volume ovarien ..... 72

3.6 Validation du modèle des cellules de la granulosa ovarienne .................................... 73

3.7 Régulation de l’expression et localisation des isoformes d’Akt par les stéroïdes
ovariens ....................................................................................................................... 77

3.8 Impact du traitement stéroïdien sur Akt total, la phosphorylation de ses isoformes
et celle de ses cibles .................................................................................................... 80
 xiv

3.9 Compte de follicules et validation du modèle de vieillissement ovarien induit

par le 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD) ............................................................. 83

3.10 Effets du 4-vinylcyclohexène diépoxide (VCD) sur l’expression protéique,

l’activation des isoformes d’Akt et sur l’expression de la caspase-3 clivée................ 87

3.11 Localisation et intensité des isoformes d’Akt à la suite du traitement avec le VCD ... 89

3.12 Régulation de l’expression des ARNm des isoformes d’Akt par le

4-vinylcyclohexène diépoxide (VCD) ........................................................................ 90

3.13 Le 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD) induit la réduction d’expression

d’Akt total, de l’expression et de l’inactivation de ses cibles..................................... 93

5.1 Représentation schématique de principales implications des isoformes d’Akt et

de leur signalisation dans l’ovaire .............................................................................. 119

Sup.1 Différentes phases du cycle œstral ............................................................................. 138

Sup.2 Ovaires représentatifs des contrôles négatifs des anticorps dirigés contre les
isoformes d’Akt .......................................................................................................... 139
 LISTE DES ABRÉVIATIONS, SIGLES ET ACRONYMES

AMH Hormone antimüllérienne

AMP Assistance médicale à la procréation

AMPc Adénosine monophosphate cyclique

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

AR Androgen receptor

ARN Acide ribonucléique

ARNm ARN messager

ATM Ataxie-téléngiactasie

Bad BCL-2 associated agonist of cell death

BMP Bone morphogenic protein

CBP CREB binding protein

CG Cellules de la granulosa

CNX43 Connexine 43

CRISPR Courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées

D Diestrus

DHT Dihydrotestostérone

E Œstrus

E2 Œstradiol

ERα/β Récepteurs alpha/bêta des œstrogènes

FMR Fragile X mental retardation

FOXO3a Forkhead box O3a

FSH Follicle-stimulating hormone

 xvi

FSH-RBI FSH receptor binding inhibitor

bFGF basic fibroblast growth factor

GDF Growth differentiation factor

GnRH Gonadotropin Releasing Hormone

GSK3β Glycogen synthase kinase 3 bêta

HT-HP Hypothalamo-hypophysaire

ICC Immunocytochimie

IGF Insulin growth factor

IHC Immunohistochomie

IGFBP Insulin growth factor binding protein

INHB Inhibine B

IOP Insuffisance ovarienne prématurée

KGF Keratinocyte growth factor

KL Kit Ligand

KO Knock out

LIF Leukemia inhibiting factor

LH Luteinizing Hormone

M Metestrus

mTOR Mammalian target of rapamycin

OMI Oocyte Maturation Inhibitor

P Proestrus

p Phosphorylé

p27 Protéine 27

PBS Phosphate Buffer saline

PDGF Platelet-derived growth factor

 xvii

PFA Paraformaldehyde

PDK1 3-phosphoinositide-dependent kinase 1

PH Pleckstrine Homology domain

PIP2 Phosphatidylinositol (4, 5)-biphosphate

PIP3 Phosphatidylinositol (3, 4, 5)-triphosphate

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PTEN Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten

RO Réserve ovarienne

RTK Récepteurs à tyrosine Kinase

SDF1 Chemo attractive cytokine Stromal derived factor 1

SOPK Syndrome des ovaires polykystiques

SST Somatostatine

UI Unité internationale

VCD 4-vinylcyclohexène diépoxyde

VO Vieillissement ovarien

WB Western blot

WT Wild type
 CHAPITRE I

INTRODUCTION

1.1 Anatomie et régulation endocrinienne de l’ovaire

L’appareil reproducteur féminin de la femme, tel qu’illustré en figure 1.1, est composé de
plusieurs organes internes et externes. Les organes génitaux externes constituent la vulve qui est
composée du vestibule vaginal, du clitoris, des lèvres et des glandes annexes ainsi que du mont
de pubis. Ces organes externes sont situés en dehors de la cavité abdomino-pelvienne; ils jouent
un rôle dans la copulation et permettent l’entrée du sperme dans les voies génitales féminines (1).
Les organes génitaux internes sont situés dans le pelvis féminin et sont constitués du tiers
supérieur du vagin, de l’utérus, des trompes de Fallope et des ovaires (2). Le vagin, l’utérus et
les trompes forment les voies génitales féminines et jouent un rôle important dans le passage des
spermatozoïdes. Elles permettent également la rencontre et la fusion d’un de ces derniers avec
l’ovule lors du processus appelé fécondation qui se déroule au niveau du tiers externe des
trompes. L’utérus va ensuite servir de lieu d’implantation et de développement de l’embryon et
va jouer un rôle dans le processus de la parturition (2, 3). Étant donné l’étendue de la matière et
la complexité de ces organes, nous allons nous concentrer seulement, dans les lignes qui suivent,
à la description de l’ovaire qui est au cœur de notre sujet d’intérêt.
 2

A) B)

Figure 1.1 Anatomie macroscopique des organes reproducteurs. A) humains, B) souris.

(Tirée de [Link] et DOI :10.1016/[Link].2019.07.004)

1.1.1 Anatomie macroscopique et microscopique de l’ovaire

Les ovaires constituent les glandes génitales féminines principales à l’opposé des glandes
génitales annexes relevées ci-dessus. Ils jouent une fonction biologique complexe et double qui
consiste en la sécrétion hormonale comme celle des androgènes, des œstrogènes et de la
progestérone (fonction endocrine), et en la production cyclique des ovules (fonction exocrine).
De ce point de vue, les ovaires sont des organes déterminants de la fertilité féminine (2).
C’est grâce aux sécrétions hormonales venant de ces ovaires que dépendent en grande partie la
physiologie féminine. Sur le plan anatomique, les ovaires sont qualifiés, avec les trompes,
d’annexes utérines. Cependant, leur rôle est plutôt principal. Les ovaires, au nombre de deux,
sont localisés dans le pelvis féminin, en général dans la fossette para-utérine derrière le ligament
large grâce à différents ligaments. Ils sont des organes complexes notamment en raison de la
dynamique qui s’y déroule. En effet, ils changent non seulement de position, mais également de
volume selon les phases du cycle menstruel, la parité, l’état gravidique et l’âge de la femme,
et ce, dans un contexte physiologique (2).

Sur le plan microscopique, cette complexité se manifeste par le polymorphisme de sa

structure. L’ovaire est recouvert d’un épithélium et est formé de deux zones : une centrale,
la médullaire et l’autre périphérique, la corticale. Cette corticale est constituée du stroma dans
 3

lequel se trouvent les follicules à différents stades de maturité ou de croissance comme illustrés
sur la figure 1.2 ci-dessous.

8 9 10 12

13

14

Figure 1.2 Schémas illustrant différentes structures dans une coupe microscopique de
l’ovaire.
(1) Follicule primordial. (2) Follicule secondaire. (3) Follicule mature.
(4) Follicule rompu et libération de l’ovule. (5) Corps jaune. (6) Corps fibro-
hyalin. (7) Capillaires. (8) Liquide folliculaire. (9) Granulosa. (10) Vitrée.
(11) Thèque interne. (12) Thèque externe. (13) Corticale. (14) Médullaire.
(Tirée et adaptée de Kamina, 2002.)

Nous reviendrons plus loin sur ces différents follicules dans la section réservée à la
dynamique folliculaire. Notons que les follicules sont des structures grossièrement sphériques
et répartis en ordre croissant en primordiaux, primaires, secondaires et matures. Il y a aussi des
follicules en atrésie.

Un follicule primordial est constitué en son centre d’un ovocyte primordial qui possède
un noyau peu volumineux ayant un nucléole apparent et un réseau chromatique délicat,
 4

un cytoplasme ayant de fines granulations et présentant près du noyau une structure arrondie
appelée corps vitellin. Outre l’ovocyte, le follicule primordial est entouré d’une seule couche de
cellules aplaties. Le follicule est qualifié de primaire lorsque cette assise cellulaire devient
cubique ou cuboïdale. Son ovocyte s’agrandit, double ou triple de volume et son cytoplasme
contient en plus des granulations fines, des granulations réfringentes de nature graisseuse (2, 4).
Le follicule devient secondaire lorsque plus d’une couche de cellules entoure l’ovocyte.
Son ovocyte devient de plus en plus large. Le follicule va devenir tertiaire ou antral quand il
croît grâce à la prolifération des cellules de la granulosa, la croissance de l’ovocyte, et la
constitution ainsi que le développement progressif d’une cavité centrale remplie de fluide,
appelée antrum. Pendant ce temps, les cellules stromales entourant l’ovocyte et la granulosa se
différencient en une couche double appelée la thèque (5).

1.1.2 Microscopie et dynamique fonctionnelle des follicules

Le follicule constitue l’unité fonctionnelle de l’ovaire et se trouve noyé dans le stroma

ovarien. Ce stroma est un tissu conjonctif constitué d’éléments cellulaires fusiformes disposés
en faisceaux, de fines fibres collagènes, de vaisseaux sanguins et lymphatiques, de nerfs ainsi
que des composants ovariens spécifiques comme les cellules souches ovariennes. Il assure le
renouvellement du contingent cellulaire en constant remaniement et sert de support structural et
biochimique aux différentes cellules (2, 6).

Comme mentionné ci-dessus et repris dans la figure 1.3 ci-dessous, le follicule comprend
une cellule germinale qu’est l’ovocyte entouré dans son stade mature de deux types de couches,
la granulosa et la thèque. La granulosa entoure directement l’ovocyte. La thèque est externe et
se continue avec le stroma. Le follicule mature possède également une cavité centrale appelée
antrum. La thèque est alors divisée en deux couches, la thèque interne et la thèque externe.
La thèque et la granulosa sont séparées par une couche bien distincte, la membrane propria ou la
membrane basale. Ces différentes couches folliculaires possèdent une histologie et des fonctions
bien distinctes (7). En effet, les cellules de la granulosa sont des cellules aplaties dans les
follicules primordiaux, cubiques dans les follicules avancés. Puis, poursuivant le processus de
 5

différenciation, elles auront un aspect des cellules épithéliales alors que les cellules de la thèque
sont d’aspect fibroblastiques.

Les cellules de la thèque vont également se différencier plus tard et prendre un aspect
épithélioide pour la thèque interne. Au stade primaire, les gaps jonctions (jonctions
communicantes constituées entre autres des connexines dont la CNX 43) apparaissent entre les
cellules de la granulosa et facilitent la communication ainsi que les échanges entre elles.
D’un autre côté, toujours au stade primaire, les cellules de la granulosa envoient des
prolongements cytoplasmiques pour communiquer avec l’ovocyte (2, 5). C’est à partir du stade
de follicule secondaire que le follicule est irrigué par une ou deux artérioles. Cette irrigation
vasculaire permet ainsi que le follicule soit exposé aux molécules et substances qui circulent
dans le sang comme les hormones en plus des molécules sécrétées localement (2). Dans le follicule
antral mature, la granulosa est d’aspect mince au niveau du pôle superficiel du follicule, et à son
pôle opposé elle forme un amas de cellules contenant l’ovule et qui est appelé cumulus oophorus.
La granulosa joue un rôle sécrétoire dans la synthèse entre autres de l’hormone antimüllérienne
(AMH), et des œstrogènes grâce à l’aromatisation des androgènes venus de la thèque interne.
Elle sert également de support métabolique, de signalisation et d’apport nutritionnel pour la
croissance et la maturation de l’ovocyte. Elle détient ainsi un rôle clé dans le destin du follicule
entier. Le destin folliculaire est présidé de concert entre l’ovocyte qui en assure le rôle central et
les autres cellules formant le follicule (granulosa, thèque) (8, 9). En ce qui concerne la thèque,
la thèque interne contient des cellules polyédriques, de nombreux capillaires sinusoïdes et
sécrète la folliculine, les androgènes, et aussi en partie les œstrogènes (2, 7). La thèque externe,
qui présente un aspect membraneux conjonctif feuilleté, contient un réseau vasculaire qui
permet de fournir les capillaires à la thèque interne. Dans l’ensemble, la thèque joue également
un rôle dans le maintien de la structure du follicule (9).

Outre la sécrétion des hormones sexuelles féminines qui constitue leur fonction endocrine,
les ovaires possèdent une fonction exocrine. Celle-ci consiste en l’ovulation, c’est-à-dire à la
libération cyclique d’un ovule en vue d’une éventuelle fécondation. Après l’ovulation,
le follicule se transforme en corps jaune qui va se mettre à sécréter de façon prépondérante la
progestérone.
 6

Figure 1.3 Différentes catégories folliculaires dans l’ovaire.

(Adaptée de [Link]

1.1.3 Régulation fonctionnelle hypothalamo-hypophysaire (HT-HP) et interne de

l’ovaire

L’ovaire est le siège d’interactions complexes qui aboutissent à la régulation de la

croissance, de la sélection d’un nombre déterminé de follicules à ovuler selon les espèces,
ainsi qu’à une sécrétion hormonale adéquate. Ces interactions se font entre l’ovaire et le système
hypothalamo-hypophysaire dans le cadre de la régulation neuroendocrine. Elles se déroulent
également entre les cellules de différents compartiments ovariens dans le cadre de la régulation
paracrine. Enfin, elles concernent les sécrétions de certaines cellules sur elles-mêmes dans le
cadre de la régulation autocrine.

Au sein de l’ovaire, la régulation de la sécrétion de la plupart des substances se fait de

manière autocrine et paracrine notamment en ce qui concerne l’inhibition de la synthèse des
œstrogènes. En effet, la sécrétion des œstrogènes est inhibée par plusieurs molécules sécrétées
localement dont les androgènes, l’inhibine (INHB), la prolactine, la FSH-RBI (FSH-Receptor
Binding Inhibitor) et la progestérone. Ces molécules agissent en bloquant l’activité de
l’aromatase, et envoient les follicules en atrésie par accumulation des androgènes. Ce mode de
régulation met en évidence les rôles de substances intra- ovariennes dans la dynamique
folliculaire (7). En dehors de la sécrétion des hormones, d’autres processus sont également
régulés par cette double modalité de régulation, autocrine et paracrine : la maturation ovocytaire
qui est bloquée in vivo au stade diplotène de la première division méiotique par l’Oocyte
Maturation Inhibitor (OMI) et l’Adénine monophosphate cyclique (AMPc) jusqu’à la décharge
 7

pré-ovulatoire de LH. Ce modèle est simplifié et plusieurs autres voies de signalisation sont
aussi impliquées. La rupture de la paroi folliculaire lors de l’ovulation et la formation du corps
jaune qui ne se réalisent qu’après la synthèse locale de prostaglandines (PG) et de la relaxine
ainsi que de diverses enzymes protéolytiques. La synthèse de PG, de la relaxine et de ces
diverses enzymes est consécutive à la décharge de la LH (7).

En ce qui concerne la régulation neuroendocrine de l’ovaire, son fonctionnement est sous

le contrôle de l’hypophyse antérieure grâce notamment à la sécrétion de gonadotrophines qui
sont des hormones glycoprotéiques. Il s’agit de la FSH et de la LH qui sont sécrétées de manière
pulsatile chez les mammifères femelles. La FSH permet le développement folliculaire en
agissant sur les cellules de la granulosa via ses récepteurs. Sa présence y entraine entre autres
l’expression des récepteurs de la LH afin de favoriser la sécrétion des stéroïdes ovariens.
La LH quant à elle agit aussi au niveau de la thèque, et après l’ovulation, sur le corps jaune pour
favoriser également la sécrétion des stéroïdes ovariens (7, 10). Ces deux hormones agissent
continuellement de manière synergique particulièrement au milieu du cycle où elles atteignent
leurs pics de sécrétion. Ce qui permet le déclenchement de l’ovulation. En dehors de ce pic,
leurs quantités demeurent relativement faibles dans la circulation générale. La sécrétion de ces
deux gonadotrophines est stimulée et modulée par la sécrétion pulsatile d’une autre hormone
hypothalamique, la Gonadolibérine ou la Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH).
La fréquence et l’amplitude de cette sécrétion pulsatile de GnRH sont elles-mêmes sous le
contrôle de stéroïdes ovariens. L’hypothalamus reçoit ainsi des influences nerveuses et
chimiques, puis va à son tour réguler la sécrétion des gonadotrophines. Cette pulsatilité de la
sécrétion de la GnRH est très importante dans la modulation de la sécrétion des gonadotrophines
tout au long du cycle. En effet, une administration continue de la GnRH entraine le phénomène
de désensibilisation connu sous le terme de down-regulation. Celle-ci consiste pour une cellule,
à la suite d’une stimulation externe, au blocage de ses canaux calciques nécessaires à la sécrétion
d’une hormone, et en la diminution de l’expression des récepteurs hormonaux du stimulus
(7, 10). Ce phénomène résulte, en ce qui concerne la GnRH, en l’inhibition de la sécrétion des
gonadotrophines dans l’hypophyse. La sécrétion de GnRH détermine aussi le rapport entre les
quantités de deux gonadotrophines. En effet, si la fréquence de sécrétion de GnRH diminue,
le rapport LH/FSH diminue aussi, c’est-à-dire, il y a plus de sécrétion de FSH que de LH.
 8

En fait, c’est ce qui se produit dans la première moitié du cycle menstruel avant l’ovulation.
Dans la deuxième moitié du cycle, le phénomène est inversé. La sécrétion de GnRH est régulée
de deux manières. La première manière, par le phénomène de feed-back, où les taux circulants
des stéroïdes sexuels ovariens contrôlent la sécrétion de gonadotrophines généralement en sens
inverse dans le cadre du feed-back négatif. En effet, des taux élevés de ces stéroïdes dans la
circulation plasmatique vont freiner la sécrétion de GnRH. Lorsque leur taux diminue,
la sécrétion de GnRH est stimulée. La sécrétion de LH semble être essentiellement contrôlée par
celle de la progestérone et de l’E2 alors que celle de la FSH est en plus contrôlée par les INHB
et les activines sécrétées au niveau ovarien. Comme leurs noms l’indiquent, les INHB (complexe
de protéines) s’opposent à la libération de la FSH tandis que les activines la stimule. L’INHB
est sécrétée par les follicules en croissance notamment pour l’INHB B et permet de réguler le
taux de FSH. Ces deux hormones représentent donc des marqueurs de la RO. Ainsi, un taux
d’INHB bas entraine le développement prématuré de follicules et est le témoin d’une perte
importante de la RO. La baisse du taux d’INHB va se refléter également par un taux élevé de
FSH. Il sied de signaler que dans le système reproducteur, il existe un phénomène de feed back
positif, qui se produit au milieu du cycle menstruel. Dans ce cas, des niveaux élevés
d’œstrogènes entrainent une stimulation de la sécrétion des gonadotrophines (10, 11).
Ces différentes régulations établissent une cinétique bien coordonnée des hormones au cours du
cycle menstruel comme relevé dans la figure 1.4 ci-dessous.

Figure 1.4 Cinétiques des hormones durant le cycle menstruel féminin.

P : progestérone, E2 : œstradiol/ œstrogènes, LH : Luteinizing hormone,
FSH : Follicle-stimulating hormone. (Tirée de Williams, 2008.)
 9

Ainsi, au cours de la première phase du cycle menstruel ou la phase pré-ovulatoire,

il y a sécrétion croissante des œstrogènes sous l’action de la FSH. La croissance folliculaire peut
alors s’intensifier au niveau des ovaires grâce à la prolifération de cellules de la granulosa.
Les œstrogènes sécrétés agissent aussi au niveau de l’endomètre et y entrainent la croissance et
la prolifération cellulaires. Au milieu du cycle menstruel, lorsque le taux des œstrogènes atteint
un niveau élevé (200 picogramme/l) pendant une durée de deux jours, il y aura une décharge
ovulante lors du pic de la sécrétion de gonadotrophines. La décharge de gonadotrophines
(particulièrement la LH) provoque alors la rupture du ou des follicules dominant selon l’espèce
animale et l’ovulation. Après la rupture du ou des follicules dominants, dans la phase post-
ovulatoire du cycle ou la phase lutéale, il y a baisse des œstrogènes. À la suite de l’ovulation,
le follicule dominant se transforme en corps jaune dont les cellules sécrètent de la progestérone.
Durant cette deuxième phase du cycle menstruel, le corps jaune ovarien produit également des
œstrogènes. Ayant une durée de vie déterminée, le corps jaune va dégénérer; ce qui conduit à
une chute du taux de la progestérone et des œstrogènes. La chute de ces deux hormones a pour
conséquence la desquamation de l’endomètre et l’apparition des règles. Du point de vue
hormonal, cette baisse d’œstrogènes et de la progestérone va entrainer l’élévation de la sécrétion
des gonadotrophines essentiellement de la FSH en début du cycle et un autre cycle recommence
(10, 11).

Outre la régulation neuroendocrine, il sied de relever une deuxième manière de réguler la

sécrétion de la GnRH. En effet, le système nerveux central, grâce aux nombreuses connexions
nerveuses dont dispose l’hypothalamus avec les différentes régions du système nerveux,
peut aussi réguler la GnRH. C’est ce qui explique que la libération et la sécrétion de la GnRH
sont aussi contrôlées par des substances comme les prostaglandines, la dopamine, l’endorphine
ainsi que par de nombreuses autres substances. C’est également par le moyen du système
nerveux que s’explique le rôle des émotions, du stress, de la nutrition et des substances
psychotropes dans la reproduction en influençant la sécrétion de la GnRH (10, 11).
 10

1.2 Réserve ovarienne et dynamique de la croissance folliculaire

Il a été longuement admis que les mammifères femelles naissent avec un nombre
prédéterminé de follicules ovariens en stock. Une controverse existe cependant puisque des
études réalisées par Johnson en 2004 ont montré l’existence chez la souris de cellules germinales
en mitose (12, 13). Le débat n’est pas clos étant donné le caractère contradictoire de ces
publications. Néanmoins, à un moment donné de leur vie, les mammifères femelles disposent
d’un nombre de follicules au repos, et ce sont ces follicules au repos qui constituent ce qu’on
appelle la réserve ovarienne (RO) (4, 5). Cette RO se constitue déjà depuis la vie intra-utérine
chez les grands mammifères. Chez la souris elle se poursuit un peu après la naissance. La RO
est constituée par les follicules primordiaux et les petits follicules primaires. En effet, des études
ont montré que chez les bovins 60 % de follicules transitoires restent présents et marqués par la
Bromo-deoxyuridine (un marqueur de la réplication de l’ADN) plusieurs mois après l’injection
de celle-ci (4); ce qui suggère le caractère quiescent de cette catégorie de follicules. Aussi,
un autre argument de ce caractère quiescent des follicules petits primaires est l’expression élevée
du facteur de transcription FOXO3, qui bloque l’activation des follicules. En revanche,
l’expression de FOXO3 chute drastiquement dans les follicules grands primaires (4, 14).
Cette RO s’épuise continuellement depuis la vie intra-utérine par l’atrésie folliculaire par
apoptose. L’atrésie constitue ainsi le mécanisme majeur de l’épuisement de follicules,
car 90 % des follicules s’épuisent par cette voie. De plus, ce phénomène se poursuit durant toute
la vie de la femelle et concernera les follicules de différents âges. L’atrésie des follicules plus
jeunes est difficile à détecter sur le plan morphologique. Celle de follicules plus avancés peut
l’être notamment par la vacuolisation du cytoplasme de l’ovocyte, son aspect éosinophilique et
l’aspect pycnotique des noyaux de cellules de la granulosa (15, 16). À l’étape finale, l’apoptose
aboutit à la dégradation des cellules avec constitution des corps apoptotiques qui vont être
phagocytés par les macrophages (15). Un autre mécanisme d’épuisement de la RO est le
phénomène de la croissance et de la maturation de follicules qui aboutissent à l’ovulation de
façon cyclique. Cette deuxième voie d’épuisement est mineure, car chez la femme par exemple,
seulement environ 400 follicules ovuleront durant toute sa vie (4). Ce deuxième mécanisme,
également appelé folliculogenèse, témoigne de cette dynamique folliculaire complexe qui se
déroule dans l’ovaire. Comme mentionné plus haut, un follicule est qualifié de primordial
lorsqu’il est constitué de l’ovocyte entouré d’une couche de cellules de la granulosa aplaties;
 11

il est dit transitoire lorsque cette couche contient un mélange de cellules aplaties et cuboïdes.
Il devient primaire lorsque cette couche unique de cellules de la granulosa contient des cellules
cuboïdes. Ces follicules de la réserve peuvent être gardés au repos pendant de nombreuses années
grâce à l’action de l’AMH sécrétée par les follicules en croissance bien qu’in vitro dans les
cultures cellulaires certains auteurs rapportent des effets contraires pour l’AMH. L’AMH
s’oppose à l’action de Kit Ligand et bloque l’activation de la croissance des follicules
primordiaux, préservant ainsi de l’épuisement les follicules du stock de la réserve (5, 17, 18).

L’épuisement de la RO dépend de l’équilibre entre le renouvellement de cellules

germinales et le phénomène d’atrésie, de la croissance et la maturation folliculaires selon que
l’on considère la théorie de la multiplication, ou simplement de l’épuisement du stock folliculaire
prédéterminé depuis la vie intra-utérine. Selon cette dernière théorie largement admise, le stock
de follicules constitué durant la vie intra-utérine est de 6 millions chez le fœtus humain de
3 mois. À la naissance, à la suite de l’atrésie, ce stock chute à 2 millions. Chez l’humain,
il ne restera qu’environ 300 000 follicules à la puberté, 100 000 à l’âge de 20 ans, moins de
10 000 à 40 ans et lorsque la ménopause survient, il en reste entre 10 et moins de 1000 (19-21).
À partir de cette réserve, chaque follicule est appelé à connaitre une des deux destinées comme
signalé ci-haut : la croissance et la maturation ou l’atrésie. Ces deux phénomènes sont hautement
régulés sur le plan moléculaire et nous y reviendrons dans les lignes qui suivent dans une section
réservée.

La croissance et la maturation folliculaires impliquent deux phénomènes concomitants qui

sont la folliculogenèse et l’ovogenèse. La folliculogenèse concerne la croissance et la maturation
d’un nombre déterminé de follicules, selon les espèces, depuis leur réserve jusqu’à l’ovulation,
par des vagues successives. Elle est divisée en 4 étapes principales : l’initiation; la croissance;
la sélection et dominance d’un follicule ou de plus selon les espèces dans le pool de follicules
sélectionnables; puis la maturation pré-ovulatoire des follicules sélectionnés (5). L’ovogenèse,
consiste en la croissance et la maturation de l’ovocyte au sein du follicule. Ici nous insisterons
essentiellement sur les aspects morphologiques de la folliculogenèse étant donné que ceux de
l’atrésie folliculaire ont été abordés ci-dessus; les aspects moléculaires de ces phénomènes
seront abordés dans une section plus loin.
 12

L’initiation de la croissance folliculaire débute, chez l’humain, lorsque le noyau de

l’ovocyte du follicule primordial atteint une taille de 19 µm. L’activation de la croissance et sa
poursuite jusqu’au stade préantral sont indépendantes de la FSH, et seraient sous la dépendance
du Kit Ligand (5). Dès cette activation, le follicule entre dans la phase de la croissance basale.
Il croît à la fois par la multiplication du nombre de cellules de la granulosa et aussi,
par l’augmentation de la taille de l’ovocyte. Le premier stade de follicule croissant est le follicule
primaire où il se développe entre les cellules de la granulosa des gap-jonctions. Celles-ci
permettent aux différents nutriments, ions organiques, petits métabolites et seconds messagers
de passer d’une cellule à l’autre grâce aux canaux. Progressivement, le follicule devient
secondaire. Il est alors formé de deux ou plusieurs couches de cellules de la granulosa qui
entourent l’ovocyte. À partir de ce moment, le follicule est irrigué par une artériole qui se
termine en anastomose sur le follicule. Cette vascularisation permet au follicule d’être exposé
aux substances qui circulent dans le sang. C’est également pendant cette phase que les cellules
stromales autour du follicule se mettent à se différencier pour constituer la thèque folliculaire.
La thèque va également se différencier en thèque interne et externe au fur et à mesure que le
follicule croît (5). Les cellules de la thèque interne vont prendre un aspect épithélioide, alors que
celles de la thèque externe garderont un aspect fibroblastique, sans trop de différence avec le
reste des cellules stromales. À ce moment, les follicules deviennent préantraux et constituent
selon certains auteurs le premier stade de follicules en croissance sur le plan de la classification
morphologique. Avec la croissance, va apparaitre au sein du follicule une cavité appelée antrum
qui va se remplir de liquide folliculaire dont la composition est proche de celle du sérum.
Ce follicule est appelé antral précoce. La croissance va continuer par la multiplication des cellules
de la granulosa et de la thèque, mais aussi par l’augmentation de l’antrum due à l’accumulation
de liquide. Dès que le follicule atteint une taille entre 2 et 5 mm, il devient sélectionnable pour
évoluer et éventuellement ovuler. Chez l’humain, le temps nécessaire pour qu’un follicule
atteigne le stade antral précoce est estimé à environ 2 à 3 mois. Il faut autour de 70 jours
supplémentaires pour atteindre le stade de follicule dominant (2 à 5 mm) (5). Ces observations
sont soutenues par des données cliniques des transplantations des ovaires réalisées chez
les patientes (22). Pendant que les cellules de la granulosa et de la thèque se multiplient et
prolifèrent, l’ovocyte aussi croît. Chez l’humain, son diamètre passe de 40 µm dans le follicule
grand primaire à un diamètre autour de 100 µm dans le follicule antral précoce.
 13

Delà, cette croissance rapide va ralentir et à terme, dans le follicule pré-ovulatoire, il atteint un
diamètre de 140 µm. En dehors de cette croissance, l’ovocyte reste bloqué au stade diplotène de
la prophase de la première division méiotique tout au long de la folliculogenèse. L’ovocyte va
contrôler la croissance folliculaire grâce à ses différentes sécrétions comme détaillé ci-dessous.
La sélection et la dominance vont suivre cette deuxième phase de la folliculogénèse. En effet,
les follicules dominants qui sont visibles dans toutes les phases du cycle menstruel verront leur
nombre et leur qualité augmenter dans la phase lutéale tardive. Ces observations sont appuyées
par différentes études réalisées chez l’humain et le singe (23, 24). L’augmentation du nombre et
de la qualité des follicules fait suite à l’élévation du taux de FSH, elle-même due à la destruction
du corps jaune. Le nombre de ces follicules est variable notamment selon les espèces,
mais décroît avec le VO. Les follicules évoluent en groupe et constituent des cohortes.
C’est parmi ces follicules que ceux ou celui destiné(s) à ovuler dans le cycle suivant émergeront
d’une de cohortes (23, 25). Ces follicules destinés à ovuler deviendront très sensibles aux
changements hormonaux sanguins alors que les follicules antraux précoces ne le sont pas.
La prolifération de cellules de la granulosa de follicules de la cohorte qui a émergé s’accroît
considérablement durant cette phase. Les follicules les plus larges de la cohorte qui sont très
sensibles au taux le plus faible de FSH vont demeurer. Ils vont émerger dès le début de la phase
folliculaire pour continuer la croissance afin d’ovuler. C’est ce phénomène qui est appelé la
dominance. Après ce stade, le(s) follicule(s) dominant(s) va/vont entrer dans la phase de
maturation pré-ovulatoire. Il(s) va/vont rapidement augmenter de taille notamment par une
prolifération de cellules de la granulosa. En effet, chez l’humain, la taille du follicule dominant
va passer d’une moyenne de 6,9 mm à 18,8 mm du début de la phase folliculaire à la phase
folliculaire tardive. Pendant ce temps, le follicule va posséder de 5 millions à jusqu’à
100 millions de cellules de la granulosa. Dès ce moment, les follicules sont prêts à ovuler sur le
plan morphologique. Cependant, plusieurs modifications sur le plan moléculaire doivent
s’opérer. En ce qui concerne l’ovocyte, la poursuite de sa méiose (une étape cruciale de sa
maturation) ne se fera qu’après le pic ovulatoire de la LH. Plusieurs moyens ou tests sont utilisés
pour évaluer la RO. Ils peuvent être répartis en deux groupes : les tests statiques et les tests
dynamiques1. Les tests statiques sont réalisés sans administration préalable d’un médicament;

1
Les différentes valeurs des tests reprises dans ce paragraphe représentent les seuils considérés comme normaux
chez la femme en âge de procréer.
 14

ils reflètent la taille de la réserve folliculaire. Ce groupe comprend les tests directs comme
le compte de follicules antraux (CFA) (≥ 4-6 follicules de 2-5 mm de diamètre par ovaire) et
la détermination du volume ovarien (volume ovarien moyen ≥ 3 cm3) réalisés grâce à
l’échographie endovaginale. Il comprend également les tests directs qui font partie du dosage
sérique des marqueurs endocriniens, car ils sont produits par des follicules en croissance :
le taux basal de l’AMH (˃ 1,2 µg/l), d’INHB (˃ 45 pg/ml) et d’E2 (< 80 mg/ml). Enfin, dans les
tests statiques, il y a le test indirect, soit le dosage sérique basal de la FSH (≤ 10-15 UI/l)
(26, 27). Ce sont les tests statiques les plus pratiqués en clinique, et ils sont réalisés entre le
deuxième et le cinquième jour du cycle menstruel. Il sied nécessaire de relever deux autres tests
statiques couramment pratiqués dans le cadre de la recherche, notamment le compte de follicules
de la RO après histologie ovarienne et l’étude du flux ovarien par doppler grâce à l’échographie
(26, 28). Bien que le compte de follicules à l’histologie demeure la référence de ces tests, en
clinique, le taux d’AMH est considéré comme le meilleur marqueur. Un prélèvement d’un ovaire
entrainerait le bris du tissu. En effet, le taux de l’AMH montre une bonne corrélation avec le
CFA et les différents paramètres d’évaluation des issues cliniques en assistance médicale à la
procréation (AMP) (28, 29). Les tests dynamiques sont réalisés après administration des
médicaments (FSH, GnRH ou citrate de clomifène). Ils sont basés sur la variation du taux sérique
de la FSH et/ou d’E2 après cette stimulation médicamenteuse. Une élévation exagérée de la FSH
ou une sécrétion insuffisante d’E2 témoignent d’une mauvaise RO. Selon plusieurs auteurs,
ces tests dynamiques, tout en étant très laborieux, n’apportent pas une valeur prédictive
supplémentaire par rapport au précédent groupe de tests. Ils sont de ce fait de plus en plus
abandonnés au profit du premier groupe de tests (26, 28). Ce groupe contient 3 tests dont le test
au citrate de clomifène ou clomiphene citrate challenge test (CCC Test), le test à la FSH exogène
ou exogenous FSH ovarian reserve test (EFORT) et le test à la GnRH ou GnRH stimulation test
(GAST). Le CCC Test consiste en la mesure de la FSH au J3 du cycle menstruel avant
administration, et au J10 du cycle menstruel après administration de 100 mg/j de citrate de
clomifène (du J5 au J9 du cycle). L’EFORT consiste au dosage sérique de la FSH et d’E2 de base
et 24 heures après administration intramusculaire au J3 du cycle menstruel de 300 UI de FSH.
Le GAST consiste au dosage d’E2 avant et après administration entre J2-3 du cycle menstruel
d’un agoniste de la GnRH (26, 28).
 15

Aucun de ces tests ne possède à lui seul une sensibilité et une spécificité à 100 %.
Chacun d’eux possède certains avantages. Par exemple, le taux basal de la FSH est considéré
comme un indicateur précoce de la diminution de la RO; le CCC test permet de refléter mieux
la chance de conception chez les patientes âgées au-delà de la trentaine. Ils souffrent tous des
difficultés de comparaison de leur efficience à cause des résultats controversés de différentes
études. Bien que certains auteurs recommandent de les combiner pour améliorer leur
performance, une méta-analyse n’a cependant pas montré le bénéfice de cette approche en
comparaison avec certains marqueurs pris isolément comme le CFA. Cette observation a été
faite par exemple pour leur capacité de prédiction d’une bonne réponse en AMP (26, 30).

1.3 Vieillissement ovarien, infertilité et ses autres conséquences

Le vieillissement reproductif chez la femme est en grande partie dû aux changements liés
à l’âge au niveau de l’ovaire. Ces changements ovariens liés à l’âge constituent le VO qui est en
réalité un processus dont le point final est la ménopause. Ce processus de vieillissement
détermine la durée de la vie reproductive de la femme. Il est variable selon les femmes et il
détermine la fertilité féminine. En effet, certaines femmes demeurent naturellement fertiles
jusqu’à leur cinquantaine pendant que d’autres deviennent sous fertiles à leur mi-trentaine (21).
C’est la diminution du nombre de follicules et la baisse de la qualité ovocytaire qui en est la base.
Elles sous-tendent toutes les modifications de la plupart des changements observés lors du VO.
Les résultats de différentes études montrent que c’est la perte des follicules primordiaux, qui se
déroule graduellement depuis la vie intra-utérine, qui est la principale cause de ce VO. De plus,
avec l’avancement en âge, le taux de l’atrésie folliculaire augmente et au-delà de la trentaine,
la perte s’accélère comme on peut le voir sur la figure 1.5 ci-dessous (21).
 16

Figure 1.5 Représentation schématique de la perte folliculaire, de la qualité ovocytaire

et des différents événements reproductifs en fonction de l’âge de la femme.
(Tirée de Broekmans, 2009.)

Comme mentionné plus haut, au cours du vieillissement de l’ovaire, le stock de follicules

primordiaux de la femme s’épuise avec l’âge, ou le taux de l’atrésie folliculaire dépasse celui du
renouvellement folliculaire. En plus de cette décroissance en nombre des follicules, la qualité de
l’ovocyte aussi décroît considérablement avec le vieillissement, et ce, à partir d’environ
l’âge de 30 ans. La perte de la qualité de l’ovocyte est essentiellement la conséquence de la
non-disjonction méiotique et elle résulte en un accroissement du taux d’aneuploïdie chez les
femmes âgées. On pense que les mécanismes à la base de la non-disjonction méiotique seraient
dus aux changements survenus au niveau de cellules de la granulosa, au fait que l’ovocyte reste
pendant de nombreuses années en quiescence, ou à l’accumulation des dommages subis par
l’ovocyte (21).

Les modifications du nombre des follicules et de la qualité ovocytaire ne se manifestent

pas pendant de nombreuses années. C’est vers la mi-trentaine et la quarantaine que ces
modifications vont commencer à se manifester. L’irrégularité du cycle menstruel et la
ménopause sont les manifestations les plus évidentes du VO. Les autres signes comme la
sous-fertilité et les dysovulations sont plus discrets et surviennent avant la ménopause.
 17

En effet, à la suite de la diminution des follicules, les ovulations deviendront rares et cela
aboutira à l’élongation de la durée de cycles menstruels ainsi qu’à leur irrégularité. Parallèlement
à cette baisse des ovulations, la fertilité aussi diminue. Cette période correspond à la transition
ménopausique et s’observe autour de 46 ans en moyenne avec des variations plus ou moins entre
35 ans et 54 ans (31-34). À la ménopause, l’étape finale de ce processus, la femme a alors perdu
la quasi-totalité de ses follicules; il y a arrêt des menstruations qui arrive vers l’âge de 51 ans
avec des variations qui se situent entre 40 ans et 60 ans (29, 34, 35). Sur le plan
endocrinologique, un des premiers signes de ce VO est l’élévation du taux sanguin de FSH.
Celle-ci est consécutive à la baisse du nombre des follicules qui aboutit à une baisse du taux à
la fois de l’INHB A et des stéroïdes sexuels. La baisse de stéroïdes et de l’INHB lève ainsi leur
mécanisme de feed-back négatif. Cette élévation du taux de FSH précède même l’apparition
clinique de l’irrégularité des cycles menstruels. Cette augmentation du taux de FSH va croître
avec la perte de follicules. L’élévation de FSH va aboutir dans un premier temps au
raccourcissement des cycles menstruels à cause de la sélection précoce des follicules; puis les
cycles vont devenir longs avec la rareté et l’épuisement de follicules sensibles au taux de FSH et
des anovulations vont avoir lieu. La ménopause sera accomplie avec l’épuisement des follicules
sélectionnables, et elle a comme signe majeur, une aménorrhée d’au moins 12 mois. Durant cette
période, le peu de follicules restants va garder une activité synthétique des stéroïdes comme en
témoigne le taux basal d’E2 chez ces femmes. Chez les rongeurs, on pense que c’est plus la perte
de la réponse au feed-back positif de l’E2 qui serait à la base de l’arrêt des ovulations.
Cependant, des follicules fonctionnels persistent encore à des âges avancés chez les rongeurs.
L’âge de la survenue du VO est variable, mais il est qualifié de précoce quand il survient avant
40 ans d’âge chez la femme comme cela arrive dans le cas d’IOP. L’IOP se manifeste par la
perturbation de marqueurs de la RO, notamment la baisse du taux sérique de l’AMH et de
l’INH B ainsi que l’élévation du taux de la FSH sous des seuils admis comme mentionnés
précédemment.

Le VO s’accompagne des conséquences sur la santé de la femme, surtout s’il survient très
tôt comme dans le cadre de l’IOP. Ces conséquences sont de deux ordres sur le plan clinique :
les conséquences immédiates dues à la dysovulation ou l’anovulation, et les conséquences
tardives dues à l’hypoestrogénie (28). Parmi les conséquences immédiates, il y a essentiellement
 18

l’infertilité à cause du trouble de l’ovulation. Chez les femmes jeunes atteintes d’IOP, cela peut
représenter un drame lorsqu’elles désirent concevoir. D’autres conséquences corollaires à ces
troubles de l’ovulation et à la baisse de la qualité ovocytaire et de la folliculogénèse sont la baisse
de la réponse ovarienne à la stimulation lors de la prise en charge en AMP, la diminution du taux
de grossesse chez ces femmes, ainsi que l’augmentation du taux d’avortements (28, 36).
Les conséquences tardives sont représentées par l’ostéoporose (avec ses lots de conséquences,
notamment les fractures pathologiques), l’augmentation des maladies cardiovasculaires par des
lésions endothéliales, les maladies coronariennes, l’infarctus du myocarde et les dyslipidémies
(37). Aussi sont évoqués, le risque d’altération de la vie sexuelle et les troubles psychiatriques
comme la dépression, l’anxiété, bien que certaines études affirment une association moins
forte (37).

Sur le plan des déterminants de l’âge de la survenue du VO naturel (ménopause),

plusieurs facteurs sont reconnus, notamment les facteurs environnementaux, le style de vie
comme l’utilisation de la contraception hormonale, le tabagisme et la parité. En effet,
la contraception hormonale et la multiparité paraissent retarder la survenue de la ménopause bien
que les données semblent parfois contradictoires et même contraires à cette hypothèse (35, 38).
En revanche, il est bien établi que le tabagisme accélère la survenue de la ménopause (35, 39).
En dehors de ce groupe de facteurs, des facteurs génétiques interviennent et on suggère qu’ils
peuvent contrôler jusqu’à 80 % l’âge de la survenue de la ménopause. Plusieurs arguments sont
avancés, à savoir l’existence d’un lien entre l’âge de la ménopause de la mère et de la fille et
aussi entre les sœurs. Concernant l’IOP, qui est une forme de survenue précoce du VO,
les données étiologiques démontrent qu’il y a plusieurs causes possibles parmi lesquelles les
causes iatrogènes (la chirurgie ovarienne mutilatrice, la chimiothérapie et la radiothérapie),
infectieuses (Herpes zoster, cytomégalovirus et virus des oreillons), auto-immunes (syndrome
polyglandulaire auto-immun, Autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal
dystrophy syndrome), génétiques et idiopathiques (21). Les causes génétiques revêtent un intérêt
particulier, car elles permettent de comprendre les mécanismes du contrôle génétique de la
ménopause. Elles regroupent diverses perturbations qui peuvent être chromosomiques
autosomales ou sexuelles (liées à X). Parmi les anomalies liées à X, on peut citer le syndrome de
Turner (45 X0), le syndrome de l’X fragile avec la prémutation du gène FMR1 ainsi que les
 19

mutations de divers autres gènes localisés sur le chromosome sexuel X qui jouent un rôle connu
dans le développement de l’ovaire ou dans la dynamique folliculaire (BMP15, DIAPH2, POF2,
DACH2, POF1B, BHLHB9, FMR2). Les mutations autosomales concernent également les
gènes qui ont des fonctions particulières sur l’ovaire comme le récepteur de la LH, le récepteur
de la FSH, Inhibin-A, FOXL2, DAZL1, GALT, CYP 17, FSH ß, EIF2B, CYP19, POLG,
Noggin, LH, AIRE, ESR1, CYP1B1-4, NOBOX, DMC1, EIF5B, FIGLA, GDF9, GPR3,
TGFBR (13, 21).

Ces différentes étiologies agissent par deux mécanismes majeurs qui déterminent
l’équilibre entre les mitoses et l’atrésie des follicules (40). Il s’agit premièrement des IOP qui
surviennent par déplétion folliculaire. Celle-ci peut consister en un déficit initial des follicules
ou en un déficit accéléré. Le déficit initial de follicules arrive notamment par l’arrêt de la méiose
des ovogonies au stade zygotène/pachytène comme on l’observe dans la mutation du gène ATM
responsable du syndrome portant le même nom (40). Cette observation a été validée par des
modèles animaux (41). Le déficit folliculaire accéléré arrive par une atrésie exagérée des
follicules normalement constitués comme dans les cas des anomalies chromosomiques et
diverses mutations génétiques du chromosome sexuel, ainsi que dans les causes iatrogènes et
infectieuses (40). Le deuxième mécanisme est le dysfonctionnement folliculaire qui consiste
en un blocage de la maturation folliculaire à un stade ou un autre comme dans le cas de la
mutation du gène FSH, GDF-9 (40). Tous ces mécanismes de contrôle de la survenue du VO
revêtent des aspects moléculaires abordés dans le point suivant.

1.4 Aspects moléculaires de la formation de la réserve ovarienne, la dynamique

folliculaire, du vieillissement ovarien et implication de la voie PI3K/Akt

Lors de la constitution de la RO, les cellules germinales primordiales formant des kystes
d’ovocytes, après leur intense division, seront appelées à se séparer. C’est la rupture de ces
kystes qui permet de libérer des ovocytes individuels. Ces ovocytes vont alors s’entourer des
cellules aplaties pour former des follicules primordiaux (42). Lors de la formation de cette RO,
plusieurs molécules jouent des rôles spécifiques. En effet, la rupture de ces kystes est sous le
contrôle de facteurs comme l’activine, la BMP-15 selon des résultats obtenus par les études sur
 20

des souris transgéniques (42). Des études in vitro ont montré que l’œstrogène, en régulant
l’expression de l’activine, s’opposerait à la rupture de ces kystes (43-45). Après la rupture des
kystes, d’autres facteurs de transcription interviennent pour la formation du follicule primordial.
Il s’agit de Factor in the germline α (FIGLA) qui code, via un autre facteur de transcription,
basic helix-loop-helix (bHLH), des gènes de la formation de la zone pellucide (42). Il y a
également FOXL2 et FoxO3 qui participent à la formation du follicule primordial. Plusieurs
études réalisées sur des souris transgéniques ayant subies de KO de gènes de ces facteurs ainsi
que leurs mutations observées chez l’humain démontrent leur implication. Ces observations sont
relevées dans une revue de la littérature publiée par Richards et Pangas (42).

La dynamique folliculaire ainsi que le VO sont des processus hautement régulés qui
impliquent l’action de plusieurs hormones. En effet, la FSH, l’AMH, les stéroïdes ovariens ainsi
que d’autres molécules de signalisation paracrine et autocrine agissent sur les différentes
composantes folliculaires dans ces deux processus (4, 46-48). Ces différentes hormones et
molécules vont agir sur les cellules folliculaires et l’ovocyte par différentes voies de
signalisation à la suite de la liaison à leurs récepteurs. Dans la première phase de la dynamique
folliculaire, le gène Kit qui encode pour la protéine Kit, un récepteur présent au niveau des
cellules de la thèque et de l’ovocyte et le gène Mgf codant pour le Kit ligand sont d’importants
régulateurs de l’ovogenèse et de la folliculogénèse. En effet, ils induisent l’activation de
l’initiation de la croissance folliculaire bloquée jusque-là au stade primaire. Cependant,
les mécanismes à la base de cette activation restent encore méconnus à ces jours. Le C-kit
s’exprime aussi sur les cellules de la granulosa et de la thèque interne chez l’humain (5).
Le C-kit est un récepteur tyrosine kinase ; et la liaison de Kit ligant au C-kit active la voie de
signalisation sous-jacente notamment la voie PI3K qui active plusieurs protéines kinases dont
Akt. Une fois Akt activé, comme nous le verrons dans le point suivant, Il y a induction de la
prolifération cellulaire et l’inhibition de l’apoptose ainsi que l’activation de voies métaboliques
nécessaires à la croissance cellulaire (4). Akt agit en phosphorylant diverses protéines pour soit
les inhiber ou les activer. En effet, Akt inhibe par exemple les facteurs de transcription FOXO3
et p27, car ces deux dernières sont inhibitrices de l’activation de la croissance folliculaire.
En revanche, l’activation de la voie de signalisation d’Akt permet l’activation de la croissance
folliculaire en médiant l’action d’autres molécules présentes aussi bien dans l’ovocyte comme
 21

platelet-derived growth factor (PDGF) et basic fibroblast growth factor (bFGF), que dans les
cellules de la thèque comme keratinocyte growth factor (KGF), bien que KGF passe d’abord par
la stimulation de KL. Beaucoup d’autres études in vitro sur des ovaires entiers ont montré le rôle
activateur de croissance des molécules comme bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) venant
du stroma ovarien, et de la BMP-7 secrétée par la thèque des follicules antraux, ainsi que du
Growth differenciation factor 9 (GDF-9) et du leukemia inhibiting factor (LIF) produits par
l’ovocyte (4). L’initiation de la croissance folliculaire est régulée ou inhibée par d’autres
molécules afin d’éviter une entrée massive des follicules en croissance et l’épuisement précoce
de la RO. En effet, des études ont montré que l’AMH bloque l’activation de follicules au repos
en inhibant l’expression de C-kit, de KL, du récepteur 1 de bFGF et de KGF. En dehors d’AMH,
qui est reconnue comme la principale protéine inhibitrice de la croissance, d’autres molécules
sont aussi impliquées dans l’inhibition de la croissance comme le facteur de transcription
FOXL2 qui est présent dans les cellules de la granulosa aplaties, le SDF1 (chemoattractive
cytokine stromal derived factor-1) ovocytaire et la somatostatine (SST) (5, 42).

Dans la deuxième phase de la dynamique folliculaire qui est la croissance, jusqu’à l’étape
de follicules préantraux de 2 mm chez l’humain, ce sont essentiellement les facteurs locaux qui
interviennent. Cette première partie de la croissance est ainsi qualifiée de basale (5). Parmi ces
facteurs, il y a le GDF-9 et la BMP-15 qui sont produits par l’ovocyte en croissance.
La différenciation des cellules de la thèque interne à partir du stroma qui entoure le follicule est
contrôlée principalement par la LH. D’autres facteurs comme KL, GDF9 et epidermal growth
factor (EGF) sont aussi impliqués dans le développement de la thèque (49-51). L’IGF-I agit
aussi comme facteur de différenciation de cellules de la thèque interne des follicules préantraux
en augmentant l’expression des récepteurs de la LH. La prolifération des cellules de la granulosa
durant la croissance basale est lente. Plusieurs facteurs régulent cette prolifération. Il s’agit entre
autres de l’activine A et l’AMH qui sont produites par les follicules préantraux larges et antraux
précoces, et qui contrecarrent l’effet de la FSH. À ce stade, les cellules de la granulosa sont non
différenciées puisqu’elles n’expriment pas l’aromatase, les enzymes de synthèse de la
progestérone et les récepteurs de la LH (51-53). Cela est dû aux différents facteurs locaux
susmentionnés (GDF9, BMP-15, EGF et FGF2) ainsi qu’à d’autres (TGF-α, KGF) qui
 22

permettent la prolifération, mais qui inhibent la différenciation induite par la FSH. La croissance
ovocytaire est essentiellement sous le contrôle du KL qui lui-même est contrôlé par GDF-9 (50).
Dans la troisième phase, quand le follicule devient sélectionnable, lorsqu’il atteint et
dépasse 2 mm chez la femme, il est exposé et devient sensible aux différentes molécules qui
circulent dans le sang, notamment la FSH. La FSH va ainsi agir sur les follicules sélectionnables
pour induire la prolifération et la différenciation de cellules de la granulosa en induisant
l’expression des enzymes nécessaires à la stéroïdogenèse. Les IGFs dont IGF-II, sécrétées par les
cellules de la granulosa de follicules pré-ovulatoires, jouent également un rôle crucial dans ces
processus en médiant l’action de la FSH sur les follicules sélectionnables. En effet, la FSH va
induire la synthèse d’une protéase d’IGFBP-4 (chez l’humain, il s’agit du pregnancy-associated
plasma protein-A, (PAPP-bA). La protéase va dégrader l’IGFBP-4, libérer ainsi l’IGF-II et le
rendre biologiquement disponible pour agir. Des modèles KO d’IGF-II ont montré une
croissance folliculaire normale jusqu’au stade sélectionnable avant d’y être bloquée. La FSH,
pour agir, va se lier à son récepteur membranaire et activer l’adénylate cyclase qui va générer la
synthèse de l’AMPc dans la cellule. L’AMPc va alors activer la protéine kinase A (PKA).
La FSH active aussi d’autres voies de signalisation comme la voie PI3K qui va phosphoryler et
activer Akt pour assurer la prolifération et la différenciation des cellules de la granulosa tel que
mentionné ci-dessus (42, 54).

Dans la quatrième phase, celle de la maturation, plusieurs changements moléculaires

s’opèrent ou s’accentuent. Les follicules acquièrent une grande activité stéroïdogénique,
notamment la production des androgènes par les cellules de la thèque interne grâce à l’action de
l’INHB A qui stimule la P450c17α/lyase. Au niveau de cellules de la granulosa, l’aromatase est
stimulée par la production croissante de l’IGF-II. Et le NGF stimule la production de l’E2 et
l’expression de récepteurs de FSH. L’E2 et l’activine vont contribuer à accroître l’action de la
FSH. En effet, l’activine active les facteurs de transcription SMAD2/3 et SMAD4 qui régulent
plusieurs gènes induits par la FSH et impliqués dans le cycle cellulaire et la stéroïdogenèse dont
le gène de l’aromatase et le CCND2 (42). L’accumulation croissante du taux d’E2 et d’INHB B
vont inhiber le taux circulant de FSH par feed-back négatif comme décrit ci-dessus. Les cellules
de la granulosa seront alors capables de lier la LH. Ainsi, le pic de la LH au milieu du cycle va
agir pour continuer la différenciation des cellules de la granulosa. Après ce pic, la prolifération
 23

des cellules de la granulosa s’arrête, et l’équipement enzymatique est essentiellement dirigé vers
la production de la progestérone. Les cellules de la granulosa expriment les récepteurs de la
progestérone, bien que certaines controverses existent quant à l’expression de ces récepteurs de
la progestérone sur des follicules de stades plus jeunes (5). En effet, Gava et al. ont rapporté
dans une étude sur les souris l’expression des récepteurs B de la progestérone dans les cellules
de la granulosa et les cellules de la thèque interne dans les follicules du stade primaire jusqu’aux
follicules antraux et corps jaunes (55). En revanche, d’autres études ne révèlent cette expression
seulement que dans les follicules pré-ovulatoires en dehors des corps jaunes (56, 57).

La LH induit d’autres parts le déclin de l’expression des protéines de jonctions

communicantes, aboutissant ainsi à une dissociation du complexe cumulo-ovocytaire.
Cette dissociation est l’effet de facteurs locaux produits par les cellules de la granulosa et
l’ovocyte en réponse directe ou indirecte à la présence de la LH (5). Parmi ces facteurs,
il y a l’amphireguline et l’épireguline, des membres de la famille des EGF, la prostaglandine E
(PG E) et également BMP-15 et GDF-9 qui stimulent la synthèse de la cyclooxygénase 2 (5, 42).
L’activation d’Akt joue un rôle important dans ces dernières phases de la dynamique folliculaire
et l’ovulation ainsi que dans la formation du corps jaune (58). En effet, le rôle de la voie PI3K est
bien établi dans les cellules de la granulosa bien que leur régulation paraisse complexe et pourrait
être spécifique et varier selon les stades folliculaires (58). Fan et al. Ont démontré dans leur
étude chez les souris déficientes conditionnelles en PTEN (la phosphatase and tensin homolog
deleted on chromosome 10) dans les cellules de la granulosa et les cellules lutéales, que
l’activation d’Akt dans ces cellules aboutit à une stimulation de la croissance folliculaire et de
l’ovulation ainsi qu’à l’accumulation de corps jaunes (58, 59).

L’atrésie folliculaire quant à elle, comme mentionné plus haut, est sous-tendue par
l’apoptose qui implique également des aspects moléculaires très complexes. Deux mécanismes
sont à la base de la survenue de l’apoptose : le premier, appelé la voie bextrinsèque, est activé
par la liaison des molécules de la mort cellulaire aux récepteurs cellulaires de surface (récepteurs
de la mort); tandis que le second, appelé la voie intrinsèque, est activé par des signaux
intracellulaires et passe par la mitochondrie. Concernant le premier mécanisme, l’apoptose est
initiée par la liaison à leurs récepteurs des molécules diverses comme Fas, Tumor necrosis factor
 24

(TNF), interféron (IFN) et TNF-related apoptosis- inducing Ligand (TRAIL). Ce qui conduit,
via des death domains de ces récepteurs, au recrutement et à l’activation des caspases qui vont
initier et exécuter l’apoptose dans une réaction en cascade. Pour le deuxième mécanisme,
les signaux cellulaires de mort (stress cellulaire, dommage à l’ADN, agent toxiques et défaut dans la
réparation de l’ADN) permettent aux protéines pro-apoptotiques mitochondriales de la famille de
Bcl2 dont Bax, Bak et Bad de se dimériser sur la membrane mitochondriale. Cette dimérisation
modifie la perméabilité mitochondriale et permet ainsi la sortie vers le cytoplasme du cytochrome
C. Ce dernier va s’associer à l’apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1) et lier la caspase 9,
constituant ce qu’on appelle l’apoptosome. L’apoptosome va alors initier l’activation en
cascade des caspases et conduire ultimement à la mort cellulaire (15). L’initiation de l’atrésie
dépendra de la balance entre plusieurs molécules pro-apoptotiques (TGF-b, interleukin-6,
androgènes, reactive oxygen species, Bax, Fas, p53, TNF et les caspases) et anti-apoptotiques
(gonadotrophines, insulin-like growth factor-1, interleukin-1b, EGF, bFGF, TGF-a, Bcl-2,
Bcl-xlong). Elle dépend également des diverses voies de régulation de ces deux mécanismes
d’initiation de l’apoptose dont dispose la cellule.

Enfin, la voie PI3K/Akt est impliquée dans le processus du VO dont le mécanisme de base
implique l’apoptose et la croissance folliculaire, deux processus dans lesquels Akt est impliquée.
En effet, Akt régule l’apoptose des cellules de la granulosa qui constituent un véritable soutien
nutritionnel de l’ovocyte et, président ainsi au destin folliculaire (60). Akt participe aussi à
l’activation de la folliculogenèse et, ainsi, interfère dans la gestion de la RO. Des études
établissent que les délétions des gènes de la voie PI3K/Akt aboutissent au VO prématuré.
En effet, la délétion des cibles d’Akt comme le FOxO3a, mais aussi des molécules en amont
d’Akt comme 3-phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1) et PTEN entraine le VO
prématuré (61-63). Il a donc été rapporté que des souris déficientes en Foxo3a (Foxo3-/) exhibent
un niveau d’infertilité et d’IOP avant la maturité sexuelle par activation excessive de la
folliculogenèse et la déplétion subséquente de la RO (61). Selon ces études, la délétion de
Foxo3a lève son inhibition ovocytaire de l’activation de la folliculogenèse. Dans les modèles
où Foxo3a est constitutivement actif au niveau des ovocytes, la croissance folliculaire est
perturbée (retardée) pour les follicules au-delà du stade de follicule primaire (64).
Cette observation est soutenue par des études concernant la délétion ovocytaire de PTEN,
 25

un régulateur négatif de l’activation de la voie PI3K/Akt, qui donne un tableau clinique similaire
à celui de la déficience en Foxo3a (61). Concernant PDK1, sa déficience au niveau de l’ovocyte
aboutit à l’inactivation d’Akt et à la rétention nucléaire de Foxo3a, à l’accroissement de
l’apoptose ovocytaire, ainsi qu’au blocage de la croissance folliculaire (61).

1.5 Voie de signalisation PI3K/Akt

La voie de signalisation PI3K/Akt est à ce jour reconnue comme une des voies clés
dans la signalisation cellulaire, étant donné ses diverses implications dans les phénomènes
biologiques vitaux pour la cellule. En effet, elle médie au niveau cellulaire l’action de certains
facteurs de croissance comme décrit plus haut (65). Elle constitue une cascade de signalisation
qui implique des kinases ayant des cibles précises dépendantes du type et de l’état de cellules.
PI3K est une kinase située dans le cytoplasme et qui s’amarre aux récepteurs transmembranaires
des facteurs de croissance possédant une activité tyrosine kinase. Cet amarrage permet la
modification conformationnelle de PI3K et l’activation de sa sous-unité catalytique.
Ladite activation est responsable de la phosphorylation sur le groupement hydroxyle du carbone
en position 3 des phospholipides membranaires, notamment le phosphatidylinositol-4,
5-bisphosphate (PIP2) (65, 66). PIP2 va ainsi être transformé en phosphatidylinositol-3, 4,
5-trisphosphate (PIP3), et c’est grâce à ce dernier que les protéines qui possèdent le domaine
d’homologie à la pleckstrine (PH) vont être recrutées pour interagir. Il s’agit, entre autres,
d’Akt qui est au centre de notre recherche et pour laquelle nous décrivons dans les lignes qui
suivent la structure, la biosynthèse, la régulation, les isoformes ainsi que les cibles moléculaires
reconnues comme fréquemment impliquées dans la physiologie ou la pathologie ovariennes.
Cette voie de signalisation est régulée négativement à ce niveau par PTEN qui déphosphoryle
PIP3 en PIP2. PTEN assure ainsi le contrôle de l’activation d’Akt, et évite les effets néfastes
pouvant découler de l’activation permanente des cibles de PI3K (46, 65). Par exemple, pour
l’ovaire, un excès d’activation folliculaire peut aboutir à un épuisement de la RO (4).
 26

1.5.1 Structure, isoformes, activation et régulation d’Akt

Akt, également appelé protéine kinase B (PKB), est une protéine kinase qui existe sous
trois isoformes codées par trois gènes différents. Il s’agit d’Akt1 ou PKBα, Akt2 ou PKBβ et
Akt3 ou PKBγ (65). Les gènes qui codent pour Akt1, Akt2 et Akt3 sont respectivement localisés
sur les bras longs des chromosomes 14, 19 et 1 (67). Ces trois isoformes d’Akt possèdent une
forte homologie structurale qui peut atteindre 80 % selon l’espèce. Comme le montre la
figure 1.6 ci-dessous, leur structure est constituée de trois domaines, soit le domaine PH,
le domaine catalytique et le domaine hydrophobique (65). Chacun de ces domaines est crucial
pour le rôle de la protéine. En effet, le PH domaine est très important pour la liaison avec les
phosphoinositides spécifiquement PIP3 pour les isoformes d’Akt. Il joue un rôle dans leur
localisation au niveau de la membrane, et permet ainsi leur interaction avec différentes autres
molécules. Le domaine catalytique est intéressant, car, comme son nom l’indique, sa fonction
est de permettre aux isoformes d’Akt d’induire des modifications sur leurs cibles. Le domaine
catalytique contient des sites de phosphorylation spécifiques pour l’activation de chaque
isoforme (un site par isoforme). Le domaine hydrophobique contient aussi des sites spécifiques
de phosphorylation (également un par isoforme) pour la régulation de la protéine. Ainsi, pour leur
activation, ces isoformes possèdent un site thréonine et un site sérine critiques. Akt1 exhibe son
site de phosphorylation de la thréonine à la position 308 (T308) dans son domaine catalytique et
son site de phosphorylation sur la sérine dans le domaine hydrophobique à la position 473
(S473). Pour ce qui est d’Akt2, il est phosphorylé sur la thréonine 309 et sur la sérine 474. Akt3
est phosphorylé sur la thréonine 305 et la sérine 472 (65, 67).
 27

Figure 1.6 Représentation schématique des isoformes d’Akt.

Elle montre les différents domaines et les sites de phosphorylation critique.
PH (Pleckstrine homology), HM (Hydrophobic motif). (Tirée de Fabi et al.,
2014.)

La forme inactive d’Akt est cytosolique et non phosphorylée. Le recrutement d’Akt au

niveau membranaire grâce au PIP3 se produit à la suite de l’activation de PI3K. La liaison d’Akt
avec PIP3 résulte en sa modification conformationnelle qui permet alors sa phosphorylation sur
des résidus spécifiques, comme mentionné plus haut, par des kinases appropriées. Une de ces
kinases est la PDK1 recrutée, comme Akt, grâce à son domaine PH par le PIP3 pour être par la
suite phosphorylée et activée. PDK1 va phosphoryler Akt sur le résidu thréonine de son site
catalytique, T308, T309 et T305 selon qu’il s’agit respectivement d’Akt1, Akt2 ou Akt3.
Pour une activation complète, le résidu sérine doit être aussi phosphorylé. Cette deuxième
phosphorylation se réalise par une autre kinase, mechanistic target of rapamycin complex 2
(mTORC2) (46, 65). Une fois phosphorylé et activé, Akt peut être transporté dans différents
compartiments cellulaires pour agir en phosphorylant ses nombreuses cibles moléculaires que
nous développerons dans des lignes plus loin. Nous nous concentrerons sur les cibles impliquées
dans l’ovaire et qui jouent un rôle dans les aspects développés dans cette thèse. Il s’agit
notamment de FoxO3a, Bad, GSK3β et mTOR. Il semble avec les données émergentes que la
présence de PIP3 soit nécessaire au site d’action d’Akt pour y assurer la stabilité de sa forme
 28

phosphorylée. La présence de PIP3 au site d’action d’Akt suggérerait l’existence des membranes
biologiques dans ces sites (68). La phosphorylation des cibles d’Akt résulte soit en leur activation
pour certaines, soit en leur inactivation pour d’autres. La phosphorylation de cibles spécifiques
permet à Akt de jouer ses différentes fonctions reconnues comme la survie cellulaire, l’évasion
de l’apoptose, la prolifération cellulaire, la différenciation et la régulation métabolique (69-73).

Bien qu’elles possèdent 80 % d’homologie structurale, les isoformes d’Akt jouent des
rôles spécifiques à côté des redondances dans les processus physiologiques et pathologiques.
Ces observations ont été démontrées par diverses études réalisées sur des souris transgéniques
ou encore in vitro. Les souris déficientes en Akt1 présentent une mortalité néonatale élevée ainsi
qu’une réduction de la masse corporelle (74). Celles déficientes en Akt2 développent un
dysmétabolisme glucidique, une discrète réduction de la masse corporelle, mais aucune
malformation majeure n’est visible (75). Les souris déficientes en Akt3 exhibent une réduction
de la taille du cerveau (76). De plus, de doubles combinaisons de KO des isoformes d’Akt ont
révélé leurs redondances fonctionnelles. En effet, le double KO d’Akt1 et 2 résulte en une
altération majeure de la peau, des muscles ainsi qu’en des troubles de l’adipogenèse.
Ces troubles entrainent la mort des souris peu de temps après leur naissance (77). Les souris
déficientes en Akt1 et 3 meurent au douzième jour de vie intra- utérine en raison de troubles du
développement, d’anomalies cardiovasculaires et du système nerveux (78). Pour ce qui est des
souris déficientes en Akt2 et 3, elles présentent des désordres au niveau du métabolisme
glucidique, une réduction de la masse corporelle, des testicules et du poids cérébral, mais sont
viables (79). D’autres études comme celles de Veillette et al. (80) menées dans notre laboratoire
ont établi l’implication spécifique d’Akt3 lors de l’implantation embryonnaire in vivo chez le
rat. En effet, elles ont démontré que seul Akt3 était impliqué dans la phosphorylation de
l’endomètre au J5 de la grossesse, et que cette phosphorylation était nécessaire à la poursuite de
la grossesse. Des études réalisées in vitro, dont celle menée également au sein de notre
laboratoire ont établi qu’il y a une réduction significative d’Akt1 et 2 lors de l’induction de la
décidualisation des cellules stromales endométriales humaines immortalisées. En effet, durant la
décidualisation induite, l’expression protéique ainsi que la phosphorylation de ces deux isoformes
d’Akt décroissent. Cependant, la surexpression des isoformes d’Akt entraine une diminution du
processus de décidualisation objectivée par la baisse de ses marqueurs, soit l’insulin-like growth
 29

factor binding protein 1 (IGFBP1) et la prolactine (PRL) (69). La spécificité fonctionnelle des
isoformes d’Akt peut aller jusqu’à des oppositions fonctionnelles. En effet, Linnerth et al. (81),
ont relevé in vivo chez la souris que l’inhibition d’Akt1 réduisait la prolifération cellulaire dans
le cancer ovarien tandis que celle d’Akt2 augmentait la croissance tumorale.

L’inactivation d’Akt résulte de l’action de PTEN qui va aboutir à la baisse de l’affinité

d’Akt à l’égard des phospholipides membranaires, et à sa délocalisation ainsi qu’à sa
modification conformationnelle. Ces différents événements empêchent l’exposition des sites
d’activation d’Akt (70). D’autres phosphatases comme PH domain and Leucine rich repeat
Protein Phosphatase (PHLPP) peuvent déphosphoryler directement Akt (66). C’est ce qui assure
la régulation de l’action d’Akt sur ses cibles moléculaires.

1.5.2 Cibles moléculaires d’Akt impliquées dans la dynamique folliculaire, la réserve

ovarienne et le vieillissement ovarien

L’action d’Akt se réalise dans l’ovaire au travers de ses principales cibles comme illustrée
dans la figure 1.7 ci-dessous.

a) FOXO3a

Foxo3a appartient à une famille des facteurs de transcription appelée FOXO qui comprend
trois protéines, dont Foxo3a qui joue un rôle bien établi dans la physiologie ovarienne.
Sa localisation nucléaire est nécessaire pour l’accomplissement de sa fonction. Les FOXO
permettent la transcription de plusieurs gènes qui contrôlent le destin de la cellule, notamment
des gènes codant pour des protéines pro-apoptotiques et des gènes codant pour des protéines
capables de bloquer le déroulement du cycle cellulaire (71). Lorsque Akt est activé, il va alors
phosphoryler FOXO3a sur des sites thréonine et sérine spécifiques (T32, S253 et S315).
Cette phosphorylation va permettre l’exportation nucléaire de FOXO3a et sa séquestration
cytosolique grâce à la protéine 14-3-3. La phosphorylation de FOXO3a amène donc son
inhibition, et l’empêche de réaliser sa fonction de facteur de transcription. Il va en résulter le
blocage de l’apoptose.
 30

Figure 1.7 Représentation schématique des cibles moléculaires d’Akt impliquées dans
l’ovaire.
Elle montre les actions d’Akt sur ses cibles et les effets principaux qui en
résultent.

b) BAD

BAD fait partie de protéines de la famille Bcl-2 dont les membres jouent un rôle dans la
régulation de l’apoptose et possèdent un domaine caractéristique, le BH3-only. Ce domaine est
très important dans l’action apoptotique de ces protéines (82). Certains membres de cette famille
sont pros tandis que d’autres, anti-apoptotiques (83, 84). BAD fait partie des membres
promoteurs de l’apoptose. Il se lie aux mitochondries et se dimérise avec Bcl-2 ou Bcl-XL.
Ce qui aboutit à la formation des canaux sur les membranes mitochondriales, et à la libération
du cytochrome C, capable d’activer des facteurs qui déclencheront l’apoptose (82).
Akt phosphoryle directement BAD sur sa sérine 136 et l’inhibe. En effet, cette phosphorylation
amène BAD à se lier à la protéine 14-3-3 et le sépare de ses cibles (71), ce qui prévient la survenue
de l’apoptose.
 31

c) GSK3β

GSK3β est aussi une sérine/thréonine kinase comme Akt. Il existe un autre isoforme de
GSK3 qui est le GSK3α. Également comme Akt, les deux isoformes de GSK3 possèdent une
homologie structurale, des redondances fonctionnelles, mais également des spécificités (85).
Sous sa forme non phosphorylée, GSK3 est active et capable de phosphoryler ses cibles.
Sa phosphorylation par Akt sur sa sérine 9 pour GSK3β, entraine son inactivation. En effet,
cette phosphorylation diminuerait l’accessibilité des substrats de GSK3 à son site catalytique.
Les substrats de GSK3 participent pour la plupart au métabolisme cellulaire et à la prolifération
cellulaire. GSK3 est également reconnu pour avoir la capacité d’inhiber la protéine pro survie
Bcl-2 (71). En plus, GSK3 phosphoryle les cyclines notamment D et E qui sont reconnus jouer
un rôle central dans la transition de la phase G1 à S du cycle cellulaire. La phosphorylation de
ces cyclines par GSK3 les conduit à la dégradation par le protéasome. Ainsi, la phosphorylation
inhibitrice de GSK3 par Akt permet d’éviter la dégradation de ces cyclines et de ce fait,
de promouvoir l’entrée des cellules dans le cycle cellulaire, et leur prolifération (71).

d) mTOR

mTOR représente une confluence des voies de signalisation pour la prolifération cellulaire
et est en réalité un complexe protéique. Il perçoit, entre autres, la disponibilité des nutriments
pour la cellule et le niveau d’énergie cellulaire. Deux complexes de mTOR existent dans la
cellule, le mTORC1 et le mTORC2. Le mTORC1 est composé de mTOR, du regulatory
associated protein of mTOR (Raptor), de proline rich Akt/PKB substrate protein (PRAS40),
du death domain containing mTOR interacting protein (Deptor) et du mammalian lethal with
SEC13 protein 8 (mLST8). Lorsque Akt est activé, il permet à mTORC1 de participer à la
biosynthèse protéique et à la croissance cellulaire. En effet, une fois phosphorylé, Akt va
phosphoryler tuberous sclerosis complex 2 (TSC2) et c’est TSC2 qui va participer à l’activation
de mTORC1 en le phosphorylant (86, 87). L’activation de mTORC1 induit la phosphorylation
de eIF4E binding protein (4EBP1) et permet ainsi la déstabilisation du complexe 4EBP1-eIF4E.
Une fois libérée de 4EBP1, eIF4E stimulera la traduction des ARNm coiffés et, ensuite,
la phosphorylation nécessaire pour l’activation de la p70 ribosomal S6 kinase (p70S6K) sur sa
thréonine 389. p70S6K est une protéine qui possède comme substrat principal la protéine
 32

ribosomale S6. Cette dernière représente une composante essentielle de la sous-unité ribosomale
40S. L’activation de la protéine S6 aboutit à la synthèse protéique (87-89). Le mTORC2,
lui est nécessaire pour l’activation d’Akt comme précédemment relevé et est composé de mTOR,
mLST8, raptor independent companion of mTOR (rictor), mammalian stress-activated protein
kinase interacting protein 1 (mSIN1) et de Protor-1 (protein observed with rictor-1) (87).

1.6 Interaction entre la voie PI3K/Akt et les hormones régulant les fonctions endocrines
de l’ovaire

Comme relevé ci-dessus, la voie PI3K/Akt est une des voies centrales dans la survie,
la prolifération ainsi que la dynamique folliculaire. Elle se trouve dans la croisée des chemins de
l’action de différentes hormones qui agissent sur l’ovaire. Il y a d’une part les gonadotrophines
hypophysaires (FSH et LH), dont nous avons relevé les aspects moléculaires dans les
paragraphes antérieurs. En dehors de ces hormones, il y a celles produites au niveau ovarien qui
entrent en interaction avec la voie PI3K/Akt. Dans le cadre de notre étude, nous allons aborder
essentiellement les interactions entre cette voie et les androgènes ainsi que les œstrogènes.
En effet, ces différents stéroïdes influencent Akt, et Akt à son tour les influence, ce qui établit
une véritable communication croisée.

Akt, les œstrogènes et les récepteurs aux œstrogènes : les œstrogènes exercent leurs effets
biologiques en se liant et en activant leurs récepteurs cytoplasmiques qui migrent ensuite dans
le noyau, et agissent comme facteur de transcription. En plus, cette liaison d’œstrogènes avec
leurs récepteurs induit des effets non génomiques. L’action des œstrogènes est très complexe.
Outre la voie de liaison avec ses récepteurs cytoplasmiques qui aboutissent à des actions
génomiques et non génomiques, les œstrogènes possèdent des actions issues de leur liaison
directe avec leurs récepteurs membranaires (90). Plusieurs études démontrent ainsi que les
œstrogènes sont capables de générer des actions rapides par leur interaction avec un nombre
limité de récepteurs membranaires d’œstrogènes. Cette interaction résulte en l’activation,
entre autres, de la voie PI3K/Akt. En effet, les œstrogènes, après liaison à leurs récepteurs
membranaires, vont activer la phosphorylation d’Akt. Cette activation se fait soit directement
en activant PI3K, soit indirectement en stimulant les récepteurs de facteurs de croissance comme
 33

l’insulin-like growth factor receptor (IGFR) et l’epidermal growth factor receptor (EGFR)
(90, 95-97). Akt activé phosphoryle ERα et crée ainsi une communication croisée avec
les œstrogènes. En effet, Akt phosphoryle ERα sur des sites spécifiques (sérine 167).
La phosphorylation d’ERα permet l’augmentation de son activité translationnelle,
la transcription de ses gènes cibles même en l’absence des œstrogènes (90, 91). Des études
in vitro sur des lignées cellulaires ont montré que cette phosphorylation d’ERα sur la sérine 167
accroît le niveau protéique d’ERα en inhibant sa dégradation par le protéasome (92).
Par conséquent, Akt contribue à l’augmentation de l’action des œstrogènes via leurs récepteurs.
En dehors de ces effets liés à la phosphorylation des sites spécifiques, il a été démontré que
l’activation constitutive d’Akt diminuait la liaison des ERα avec l’ADN (93). Akt influence aussi
le récepteur bêta des œstrogènes (ERβ). En effet, des études sur les souris ont démontré que la
phosphorylation d’ERβ sur la sérine 255 était capable d’inhiber son activité transcriptionnelle
en inhibant son interaction avec son cofacteur, le CBP (94).

Akt, les androgènes et les récepteurs des androgènes : Comme pour ER, les récepteurs aux
androgènes (AR) interagissent aussi avec la voie de signalisation impliquant Akt. Des études
in vitro et cliniques ont démontré qu’Akt phosphoryle AR sur les sérines 213 et 791. Ce qui
aboutit à la réduction de la transactivation, de la stabilité d’AR ainsi qu’à la réduction de la
traduction de ses gènes cibles (91). Certaines études ont montré l’existence d’une synergie entre
Akt et AR en dehors de la voie de phosphorylation (98). En effet, Xin et al. ont démontré que le
cancer de la prostate était progressif aussi bien chez les mutants qui manquent ces sites de
phosphorylation spécifique d’AR par Akt que chez les souris de type sauvage (98). AR à son
tour, influence l’activité d’Akt. En effet, AR permet la stabilisation de la protéine FKBP5 qui
est une chaperonne de la phosphatase d’Akt, la PHLPP. La PHLPP induit la déphosphorylation
d’Akt. Celle-ci aboutit à l’inactivation d’Akt. En stabilisant la chaperonne de la PHLPP,
AR contribue à maintenir la PHLPP active, et à participer ainsi à l’inactivation d’Akt (99, 100).

1.7 Les traitements hormonaux chez la femme et leur impact sur l’ovaire

Divers traitements hormonaux sont utilisés en thérapeutique gynécologique dans la prise

en charge des diverses pathologies. En pratique courante, 5 types de substances sont utilisées à
 34

cette fin avec des buts variés. Ce sont les œstrogènes, les progestatifs, les agonistes de la GnRH,
les stimulateurs d’ovulation et de façon moins fréquente, les androgènes. Dans le cadre de notre
étude, nous allons aborder essentiellement les œstrogènes et les androgènes bien que les
stimulateurs d’ovulation et les agonistes de la GnRH ont un effet sur l’ovaire et la dynamique
folliculaire. Ces deux groupes d’hormones stéroïdiennes sont couramment utilisés en thérapie
chez la femme, et leurs effets sont très variables. Ils possèdent des récepteurs qui appartiennent
à la famille des récepteurs stéroïdiens. Ces derniers sont principalement localisés au niveau
cytoplasmique, et migrent dans le noyau après leurs liaisons avec les ligands, et agissent comme
facteur de transcription. Ils stimulent de ce fait la synthèse des ARNm des gènes cibles (7).

1.7.1 Les œstrogènes

Les œstrogènes sont couramment utilisés en thérapeutique et leur chef de file est le
17 β-E2. Sur le plan physiologique, leurs actions sont étendues sur l’organisme étant donné
l’expression de leurs récepteurs dans divers organes. Ces récepteurs s’expriment au niveau du
tissu adipeux, de l’os, de l’hypothalamus, de l’hypophyse, du sein, de l’utérus, du vagin et de
l’ovaire ainsi que dans d’autres organes. Il existe principalement deux types des récepteurs aux
œstrogènes comme signalé ci-haut, et c’est leur répartition qui permet la résultante des actions
au sein d’un tissu. Notre étude étant ciblée sur l’ovaire, il sied de signaler qu’au sein de l’ovaire,
ERα est plus exprimé au sein des cellules de la granulosa, alors que les cellules thécales
expriment plus ERβ. Chacune des isoformes d’ER possède des effets spécifiques. En effet,
ERα serait plus impliqué dans la prolifération alors qu’ERβ dans la différenciation (7).

En thérapeutique, les œstrogènes sont principalement utilisés en contraception dite

hormonale, le plus souvent en combinaison œstroprogestative chez les femmes en âge de
reproduction (101, 102). Chez les femmes ménopausées et les femmes atteintes d’IOP, ils sont
essentiellement utilisés comme traitement substitutif pour prévenir les complications de la
carence hormonale (103, 104). Cela se réalise le plus souvent en utilisation locale (au niveau
vaginal par exemple) quand ils sont utilisés seuls. Ils sont associés avec les progestatifs quand
ils sont utilisés par voie générale pour prévenir leurs effets secondaires multiples (104).
Au niveau de l’ovaire, leur utilisation bloque la maturation folliculaire et l’ovulation, et ce,
 35

indirectement par la suppression de la sécrétion de gonadotrophines (102). Certains auteurs ont

associé l’utilisation de la contraception œstroprogestative avec la survenue tardive de la
ménopause tandis que d’autres ne retrouvent pas cette association (105). Les effets directs du
traitement œstrogénique sur l’ovaire, comme l’inhibition de la formation des follicules
primordiaux, de la croissance folliculaire sont de plus en plus reconnus. Cependant,
les mécanismes sous-jacents quant à eux, restent encore peu connus (106). Les effets dépendent
aussi du moment de l’exposition aux œstrogènes. En effet, chez les rongeurs, une exposition
néonatale aboutit à une inhibition de la formation des follicules primordiaux, à une
augmentation des follicules multi-ovocytaires, et finalement à une baisse du nombre des
follicules primordiaux (106). Une exposition plus tardive aux œstrogènes aboutit à des
perturbations de la dynamique folliculaire comme l’arrêt de la croissance folliculaire, et à la
formation de kystes (106).

1.7.2 Les androgènes

Les androgènes sont également utilisés en thérapeutique chez la femme bien que de façon
limitée par rapport aux œstrogènes. Leurs actions chez les femmes sont diversifiées et dépendent
de la localisation de leurs récepteurs. Ces derniers sont localisés au niveau du bulbe pilo-sébacé,
des muscles squelettiques, du cortex cérébral, du sein, de l’utérus et de l’ovaire (7). Le nombre
de ces récepteurs varie suivant plusieurs paramètres ou facteurs, notamment le tissu concerné,
le type cellulaire et au sein d’une cellule, selon l’âge de la femme. Dans la plupart des tissus
cibles chez la femme, la testostérone, le chef de file des androgènes, est transformée en sa forme
active qui est la DHT.

Les androgènes voient leur utilisation thérapeutique chez la femme s’élargir de plus en
plus. En effet, la déhydroepiandrosterone (DHEA) est utilisée en clinique pour améliorer la
fertilité chez les femmes qui présentent une RO diminuée comme publié dans l’étude de
Gleicher et celle de Sunkara (36, 107). Dans ces deux études, bien qu’ayant peu de cas et peu
de contrôles, les auteurs ont trouvé que le taux de fausses couches était réduit chez les femmes
qui avaient reçu une supplémentation en DHEA. Elles rapportent également une augmentation
du taux de grossesses et de naissances vivantes. Lors de la fécondation in vitro (FIV),
 36

la supplémentation en androgènes permet de diminuer la quantité de gonadotrophines

normalement utilisée. Cependant, l’excès des androgènes est délétère pour la reproduction
féminine comme en cas du syndrome SOPK tel que développé dans la section suivante.
Outres les effets centraux (au niveau du cerveau) des androgènes, leurs effets directs
(périphériques) sur l’ovaire sont aussi rapportés. Les effets périphériques consistent en la
perturbation de la sélection du follicule à ovuler, et en la prévention de l’apoptose ainsi qu’en la
perturbation de la croissance folliculaire (108). Comme pour les œstrogènes, les mécanismes qui
sous-tendent ces observations demeurent peu élucidés, et méritent d’être étudiés.

1.8 Pathologies ovariennes retentissant sur la folliculogénèse et impliquant la voie

PI3K/Akt : cas du SOPK

En dehors de l’IOP, la perturbation de la voie PI3K/Akt résulte également en plusieurs

autres pathologies bénignes, mais qui ont un impact sur la fertilité féminine comme
l’endométriose, la myomatose utérine et le SOPK. Étant donné que notre étude est centrée sur
l’ovaire, nous allons nous focaliser à développer essentiellement cette dernière pathologie en
ressortant l’importance de la voie PI3K/Akt. Le SOPK représente la pathologie endocrinienne
la plus fréquente chez la femme en âge de procréer. Il est caractérisé par un nombre élevé des
follicules préantraux, un arrêt de la maturation folliculaire ainsi que des troubles de sélection du
follicule dominant. Ces troubles résultent ainsi en une dys- ou anovulation chronique (60).
Sur le plan hormonal, il y a une hyperandrogénie à la suite d’un excès de stimulation de la thèque
par la LH. L’augmentation de la LH est consécutive à une augmentation de la sécrétion pulsatile
de la GnRH. Dans le SOPK, il y a également un hyperinsulinisme secondaire. Cet excès
d’insuline agit sur l’ovaire puisque les cellules de la granulosa et de la thèque possèdent des
récepteurs à l’insuline (60). Les androgènes agissent sur la croissance cellulaire et possèdent une
activité anti-apoptotique. Ces actions sont médiées par l’activation de la voie PI3K/Akt et celle
de MAPK. Il est, en outre, reconnu que la voie PI3K/Akt accroît les effets anti-GnRH de l’IGF-I.
L’élévation de l’insuline au niveau folliculaire active l’expression de PTEN dans les cellules de
la granulosa, et résulte en une inactivation d’Akt (109). De plus, les résultats de certaines études
suggèrent que l’ovulation induite par la metformine, un antidiabétique oral utilisé en cas de
SOPK, se produit grâce à la phosphorylation d’Akt via les récepteurs de l’insuline (110).
 37

Ces différentes données indiquent que le SOPK et la voie PI3K/Akt sont liés, et que les
mécanismes à la base de ce lien sont complexes. Ce qui démontre l’importance de bien étudier
Akt au sein de l’ovaire comme nous allons l’aborder dans cette thèse.

1.9 Problématique, hypothèses et objectifs de la recherche

L’ovaire, comme d’autres organes qui font partie de la sphère gynécologique, est très
dynamique et sa régulation exige des mécanismes très complexes. Cette complexité concerne
aussi bien la protection de la RO, la dynamique folliculaire, l’ovulation que le VO. Ces différents
processus biologiques exigent l’implication des voies moléculaires de signalisation. La voie
PI3K/Akt en occupe une place centrale, et est très critique en raison de son implication dans
les processus de prolifération, croissance et apoptose cellulaires qui sous-tendent les divers
processus biologiques ovariens susmentionnés. L’étude de cette voie de signalisation revêt de ce
fait une importance capitale et une meilleure compréhension de cette voie de signalisation à
travers les isoformes de Akt permettra de concevoir de nouvelles thérapies pertinentes aux
pathologies découlant de la perturbation de ces processus.

Les pathologies ovariennes ayant un lien avec la voie PI3K/Akt sont parmi les causes
fréquentes de l’infertilité féminine. Cette dernière représente un problème de santé publique
important étant donné sa prévalence qui varie autour de 16 % dans les pays industrialisés
(111, 112). Parmi ces pathologies, le VO prématuré ou la diminution de la RO constituent des
problèmes à investiguer. En effet, au cours de ces dernières années, la prévalence de la diminution
de la RO comme facteur d’infertilité n’a cessé d’augmenter avec l’augmentation du nombre de
femmes qui cherchent à avoir leur premier enfant au-delà de 35 ans. Conséquemment,
en Amérique du Nord, jusqu’à 20 % de femmes ont leur première grossesse au-delà de 35 ans
(113). Différents traitements sont utilisés pour contrer l’infertilité féminine. Au cours des
dernières années, de plus en plus d’études ont été réalisées sur l’utilisation de traitements qui
ont un impact sur la RO. Par exemple, l’utilisation de le DHEA est croissante. La réserve
ovarienne ne peut jamais augmenter. Le traitement au DHEA a pour effet d’augmenter le
développement d’ovocytes à partir des ovocytes primaires qui constituent la RO. Il y a aussi des
traitements qui ont un lien avec Akt comme l’utilisation d’œstrogènes et d’androgènes,
 38

mais dont les mécanismes restent à élucider (36, 114). Concernant le VO, l’accent est
actuellement mis sur le développement de thérapies (115). Le développement de thérapies
appelle avant tout à l’élucidation des mécanismes de survenue de la pathologie. Par ailleurs,
du point de vue physiologique, beaucoup de choses restent à comprendre sur le plan mécanistique
concernant le rôle de certains types cellulaires dans le follicule. En effet, en dépit du rôle central
des cellules de la granulosa au sein du follicule et sur son destin, la régulation moléculaire et la
caractérisation de différentes voies de signalisation dans ces cellules ne sont pas clairement
connues (9).

Malgré l’abondance de connaissances qui montrent l’implication d’Akt dans l’ovaire

comme abordé dans les différentes sections précédentes, la plupart de ces connaissances
demeurent d’ordre général. Comme Akt a trois isoformes qui sont reconnues pour avoir des
rôles spécifiques et même parfois opposés, l’étude des trois isoformes d’Akt pourra permettre
de comprendre de manière plus spécifique le rôle d’Akt dans la physiologie de l’ovaire.
Des travaux réalisés dans notre laboratoire et aussi par d’autres équipes ont montré la spécificité
d’action et la redondance de fonction des isoformes d’Akt. Ces travaux concernent
l’implantation embryonnaire in vivo, la décidualisation in vitro, le trouble du métabolisme
glucidique et l’évolution du cancer de l’ovaire (69, 80, 81). La plupart des médicaments qui
visent la stimulation d’Akt et qui sont utilisés pour la conception chez les femmes infertiles sont
limités en usage in vitro par manque de sélectivité de leur action sur les isoformes d’Akt.
Ces médicaments possèdent ainsi beaucoup d’effets secondaires. Cependant, leurs effets sur la
stimulation de la croissance folliculaire et l’induction d’ovulation in vitro en FIV sont
démontrés, notamment pour pallier l’infertilité chez les femmes atteintes d’IOP désireuses de
concevoir (116, 117).

Eu égard à tout ce qui précède et malgré cette implication d’Akt dans l’ovaire, il n’existe
cependant pas des travaux à notre connaissance qui investiguent les rôles des isoformes d’Akt
en rapport avec les processus normaux, le VO ou la RO. Il nous a paru ainsi opportun de mener
cette étude dans le but de comprendre le lien entre ces différents processus et les isoformes
d’Akt. Les résultats de cette étude pourront ouvrir la voie à des perspectives thérapeutiques plus
spécifiques, et d’espérer réduire l’effet secondaire de traitements affectant Akt et réduire
l’impact grandissant des conséquences de différentes pathologies.
 39

1.10 Choix du modèle expérimental, correspondances avec la femme et éléments

spécifiques du cycle œstral

a) Choix du modèle expérimental et correspondances avec la femme

L’étude approfondie sur les ovaires du point de vue morphologique et de la signalisation

cellulaire nécessite la disponibilité des matériels biologiques. Le recours à des modèles
expérimentaux, notamment animaux, rend possibles de telles études. Parmi ceux-ci, les rongeurs
sont couramment utilisés (voir la structure des organes génitaux interne de la souris à la
figure 1.1). Dans la réalisation de notre thèse, nous avons eu recours aux souris comme modèle.
En effet, nous avons utilisé des souris de type sauvage et Akt3 KO dans nos différentes
expérimentations. L’étude du VO induit a été réalisée grâce à une double approche in vivo et
in vitro. Ceci nous a permis d’avoir une bonne perspective des phénomènes tout en étant
complémentaires quant aux lacunes de chacune d’elles. En plus, pour l’étude des effets des
androgènes sur les isoformes d’Akt, nous avons utilisé un modèle moins complexe des cellules
de la granulosa que nous avons isolées à partir des ovaires des souris de type sauvage.

Bien que ce modèle revête quelques limitations, notamment le fait de posséder une certaine
variabilité, beaucoup d’auteurs s’accordent quant à son utilisation. Cette dernière concerne la
physiologie et la pathologie ovariennes, notamment dans les aspects abordés dans cette thèse
comme la RO, la dynamique folliculaire et le VO (119). Une telle utilisation se justifie pour
plusieurs raisons, à savoir :

• Un grand recul d’utilisation des souris sur plusieurs décennies, et qui couvre des
aspects aussi variés de la pathologie ovarienne.

• Les souris expriment un bon mimétisme avec la femme en modèle spontané, et surtout
en modèle du VO induit par le VCD. Ce mimétisme concerne plusieurs aspects aussi
bien morphologiques, moléculaires qu’hormonaux, nonobstant certaines spécificités
liées à l’espèce.

• La flexibilité de générer des modèles spécifiques, notamment par le KO des gènes en

plus de la reproductivité élevée.
 40

En vue de faciliter la compréhension de nos résultats, et les différentes approches utilisées

ainsi que leur application ou extrapolation à l’espèce humaine, nous avons trouvé utile de
rappeler quelques similitudes et différences chez les souris par rapport à la femme. Nous allons
aborder ces aspects sur trois points de vue, notamment sur le plan du cycle d’activité ovarienne,
sur le plan hormonal et du déroulement des événements reproductifs ainsi que de la
durée de vie.

• Sur le plan du cycle d’activité ovarienne : ce cycle d’activité se révèle chez la

femme par les menstruations alors que chez la souris, il se manifeste par un
comportement d’œstrus en vue de l’accouplement. Il n’existe pas de menstruation chez
la souris. Ainsi, chez la femme, on parle du cycle menstruel alors que chez la souris du
cycle estrien ou œstral. L’œstrus et les menstruations marquent les débuts des cycles,
respectivement estrien chez la souris et menstruel chez la femme. Dans les deux
espèces, normalement les cycles se succèdent toute l’année sauf en cas de gestation.
L’ovulation a lieu au début du cycle estrien alors que pour le cycle menstruel, elle a lieu
en son plein milieu (120). En ce qui concerne la durée du cycle, chez la souris, elle est
de 4-5 jours alors que chez la femme, elle est en moyenne de 28 jours. Chez la souris,
la phase folliculaire dure environ 2 à 3 jours alors que chez la femme, elle dure en
moyenne 14 jours. La phase lutéale qui succède à l’ovulation dure chez la souris entre
1-2 jour, alors que chez la femme, elle est de 14 jours (120). Chez la femme, au niveau
ovarien, le cycle est divisé en deux phases, soit la phase folliculaire avant l’ovulation,
et la phase lutéale après celle-ci. Chez la souris, il y a 4 phases dans le cycle,
notamment le proestrus (P) avant l’ovulation et l’œstrus (E) au soir duquel se produit
l’ovulation, suivie du metestrus (M) et de diestrus (D) (118). Cette succession de
plusieurs phases dans un temps court chez la souris rend parfois complexes les études
au niveau ovarien et hormonal. Enfin, la souris est une espèce poly-ovulante alors que
la femme est mono-ovulante. Aussi, du fait du temps court du cycle estrien, et de la
régression lente des corps jaunes même s’ils ne sont plus fonctionnels, plusieurs
populations de corps jaunes et de follicules matures coexistent dans l’ovaire des souris
(120). Les aspects anatomiques macroscopiques et microscopiques des ovaires
abordés précédemment sont similaires dans les deux espèces. Ces similitudes
 41

concernent également la microscopie et la dynamique fonctionnelle des follicules,

seulement les durées sont différentes (120).

• Sur le plan hormonal : en vue de circonscrire notre propos, nous allons aborder cet
aspect essentiellement sur le plan ovarien. Dans la phase folliculaire chez la femme,
il y a sécrétion prédominante de E2 et en phase lutéale, de la progestérone (120).
Chez la souris, durant la phase P du cycle, les follicules antraux qui croissent sous
l’influence de la FSH, secrètent les œstrogènes, notamment l’E2. Cette production
croissante d’E2 va atteindre son pic, et provoquer la décharge ainsi que le pic de LH au
niveau hypophysaire, induisant ainsi l’ovulation. L’ovulation correspond à
l’apparition de l’œstrus. Avec la constitution du corps jaune, la sécrétion de la
progestérone va devenir prédominante durant le M et le D comme le montre la
figure 1.8 ci-dessous. Elle illustre par ailleurs les différentes variations hormonales
durant le cycle œstral au niveau sérique (121).

Figure 1.8 Profil hormonal sérique durant les différentes phases du cycle œstral
chez la souris.
(Tirée de The Guide to Investigation of Mouse pregnancy.)

• Sur le plan du déroulement chronologique des événements reproductifs : ici nous

voulons relever certains aspects de la vie reproductive des souris comparativement à
ce qui se passe chez la femme. Chez la souris, la maturité sexuelle est atteinte
 42

notamment avec les premières ovulations visibles autour de 40 jours après la naissance
(121), alors que chez la femme la puberté s’établit autour de 12-13 ans, et les
premières ovulations vont s’établir quelques années plus tard (122). La ménopause,
qui correspond à la cessation de l’activité ovarienne à la suite de l’épuisement des
follicules et des ovulations, survient chez la femme autour de 50 ans. Si chez la femme,
en postménopause, les taux circulants d’œstrogènes deviennent indétectables; chez les
souris, bien que les ovulations cessent, l’ovaire garderait encore une certaine activité
dans la production de l’E2 (119). Les irrégularités du cycle œstral chez la souris,
notamment l’allongement de la durée du M, apparaissent autour de 9-12 mois d’âge.
Cette étape qui correspond à peu près à la périménopause chez la femme a lieu aux
environs de 40-45 voire 50 ans (119). C’est à l’âge de 16-18 mois que les souris
exhibent l’état d’anœstrus persistant qui correspond à la postménopause de la femme
(119).

b) Quelques éléments spécifiques du cycle œstral chez la souris

Avant de clore ce point relatif à notre modèle, nous avons trouvé utile de relever quelques
éléments propres au cours du cycle œstral chez la souris en plus de ceux épinglés précédemment.

• Concernant la dynamique folliculaire, les follicules primordiaux apparaissent

1 à 2 jours après la naissance. Les follicules primaires sont présents 3 jours en
postnatal. Au septième jour de vie, les follicules secondaires apparaissent. La majorité
de follicules sont primordiaux comme chez la femme, et à la naissance leur nombre est
estimé à 8000. Ce nombre décline à 2500 déjà au septième jour de vie à la suite de
l’atrésie (121). Il faut approximativement 16 jours pour qu’un follicule atteigne le
stade pré-ovulatoire. Après l’ovulation, les corps jaunes chez la souris persistent
jusqu’à 4 cycles après sa régression fonctionnelle.

• Concernant le cycle d’activité ovarienne, les souris sont très réactives aux différents
stimuli externes, notamment le stress social associé à la compétition. Ce dernier
apparait souvent dans les hébergements des souris en surpopulation dans les cages,
et conduit à des irrégularités des cycles œstraux comme l’augmentation de la durée de
 43

la phase D du cycle. Un autre facteur qui influence le cycle œstral est la luminosité
environnementale (121). En effet, une exposition lumineuse continue induit une
absence d’ovulation, une formation des kystes ovariens et par conséquent,
un allongement du cycle œstral.

Notre travail s’est d’abord intéressé à caractériser les isoformes d’Akt dans l’ovaire au
travers du cycle œstral, un processus biologique dynamique et complexe sur le plan
endocrinologique et de la morphologie cellulaire. Nous nous sommes attelés à étudier, dans les
quatre phases du cycle œstral chez la souris C57 BL/6J, la compartimentalisation, l’expression
et l’activation de chaque isoforme d’Akt, ainsi que leurs variations spécifiques dans ce contexte
physiologique. Cette caractérisation est très importante étant donné que peu d’informations
existent sur la régulation des isoformes d’Akt au travers du cycle œstral. Cette information aura
des implications qui permettront de cibler l’isoforme d’Akt à étudier en fonction du type
cellulaire ou des structures ovariennes ainsi que des effets potentiels des hormones qui
prédominent dans chaque phase du cycle œstral.

Par la suite, nous avons focalisé notre intérêt sur la régulation des isoformes d’Akt par
les stéroïdes ovariens en les étudiant dans un modèle moins complexe que sont les cellules
de la granulosa. Ces cellules président ensemble avec l’ovocyte au destin folliculaire,
mais plusieurs auteurs reconnaissent que les voies de signalisation dans ces cellules ont été peu
étudiées (9). Elles possèdent des récepteurs pour différentes hormones et molécules qui régulent
leur destinée, et celle de l’ovocyte. Il a été monté que certaines isoformes d’Akt étaient
impliquées dans des pathologies hyperandrogéniques comme le SOPK ou la maturation des
follicules est bloquée par l’excès d’androgènes et les follicules immatures s’accumulent,
sans follicule dominant. Il en est de même pour l’utilisation de la DHEA pour l’amélioration
clinique de la fertilité chez les femmes qui présentent une RO diminuée. En considérant ces
observations, il nous est paru utile d’étudier l’impact du traitement androgénique sur les
isoformes d’Akt étant donné que les mécanismes de ces traitements ne sont pas clairement
élucidés. D’autre part, les œstrogènes abondamment utilisés dans la contraception orale comme
décrit précédemment ne peuvent pas rester en dehors de notre champ d’études. Pour toutes ces
raisons nous nous sommes penchés sur l’étude de la régulation des isoformes d’Akt au sein d’un
 44

modèle de culture des cellules de la granulosa isolées à partir des ovaires des souris C57 BL/6J
de type sauvage.

Ensuite, nous avons conduit des expériences pour explorer les possibles rôles d’Akt3 sur
la RO, la dynamique folliculaire et l’ovulation. Le choix de l’étude d’Akt3 au sein de l’ovaire
par rapport aux autres isoformes d’Akt s’explique par plusieurs raisons. D’abord, cette isoforme
est la moins étudiée concernant la physiologie ovarienne. En effet, des données existent sur les
effets de l’élimination des autres isoformes d’Akt dans l’ovaire, notamment celle d’Akt1 (118).
L’élimination d’Akt1 résulte, entre autres, en une diminution des follicules primordiaux.
En revanche, ces données étaient manquantes pour Akt3. Ensuite, le développement de
l’élimination d’Akt3 n’exige pas un KO conditionnel, que le modèle était disponible et les souris
déficientes en Akt3 sont viables. De plus, des données récentes révèlent que l’inhibition d’Akt3
résulte en une augmentation de la croissance du cancer ovarien (81). Cette observation révèle
qu’Akt3 pourrait jouer un rôle dans la physiologie ovarienne. Étant donné l’implication
reconnue d’Akt d’une manière générale dans divers processus ovariens, et que très peu d’études
abordent les rôles d’Akt3, nous avons étudié l’effet du KO spécifique d’Akt3 sur ces différents
processus.

Finalement, notre attention s’est orientée sur l’étude des isoformes d’Akt dans le VO ou
l’épuisement de la RO. Une telle étude nécessiterait le développement d’un modèle de KO
conditionnel et spécifique aux ovaires qui génère de simples, doubles et triples KO des isoformes
d’Akt. Le développement d’un tel modèle nécessiterait un temps matériel considérable qui
dépasserait le cadre de notre doctorat. C’est ainsi que nous avons préféré analyser l’expression
de ces isoformes dans un modèle de VO induit en utilisant le VCD, grâce à une double approche
in vitro et in vivo.

Les hypothèses principales étudiées dans notre thèse sont les suivantes :

1) Les isoformes d’Akt sont différemment régulées dans l’ovaire au travers du cycle
œstral.

2) Les stéroïdes ovariens ainsi que le VCD régulent Akt de manière isoforme- spécifique.
 45

3) Il existe une spécificité dans l’implication des isoformes d’Akt dans le processus du
VO malgré les redondances possibles.

4) Akt3 pourrait jouer un rôle possible dans divers processus biologiques ovariens,
particulièrement dans la préservation de la RO, la dynamique folliculaire et
l’ovulation.

5) Akt joue un rôle crucial dans la protection de la RO et, de ce fait, pourrait être un
élément de régulation dans la prévention de son épuisement précoce.

Au total, nous avons pu caractériser l’implication des isoformes d’Akt dans divers
processus physiologiques ovariens et déterminer les mécanismes de leur régulation par les
androgènes, les œstrogènes et le VCD. Nous avons également dévoilé des rôles particuliers
d’Akt3 dans la régulation de la RO, la dynamique folliculaire, l’ovulation et du volume ovarien.
Nos résultats jettent des bases pour des études plus approfondies cliniques afin d’utiliser ces
résultats pour mieux cibler les thérapies pouvant impliquer les isoformes d’Akt. Ils pourront
servir au développement des thérapies pour les femmes à risque du VO précoce et désireuses de
maternités.
 CHAPITRE II

MATÉRIEL ET METHODES

2.1 Animaux et procédures d’étude

Les souris C57BL/6J de type sauvage ou wild type (WT) âgées de 60 jours ont été achetées
chez Charles River Laboratories. Tandis que les souris Akt3-/-, de même souche et âge que les
souris de type sauvage, ont été obtenues, à l’origine, du Dr M. Birnbaum (University of
Pennsylvania). Les souris ont été hébergées et croisées pour obtenir des générations
subséquentes dans l’animalerie de l’Université du Québec à Trois-Rivières (UQTR). Les souris
étaient gardées dans des conditions standard d’élevage. Elles étaient nourries avec les
nourritures commerciales et l’eau ad libitum. L’hébergement respectait un cycle de 14 h
d’obscurité et 10 h de lumière. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d’éthique
et de bons soins aux animaux de l’UQTR. Les souris femelles étaient gardées, et à l’âge de
45 jours et 100 jours, elles étaient euthanasiées selon la phase du cycle œstral désirée suite au
résultat du frottis vaginal. L’euthanasie était réalisée par dislocation cervicale après anesthésie
à l’isoflurane (Santa Cruz Animal Health). Immédiatement après l’euthanasie, les ovaires étaient
récupérés, puis fixés avec le paraformaldéhyde (PFA) 4 % dans du Phosphate Buffer Saline
(PBS) pour 16-18 heures ou durant toute la nuit à 4 °C. Ensuite, les ovaires étaient déshydratés
par des incubations dans des bains de concentration progressive d’alcool (70 %-95 %-100 % et
de NeoClear®). Chaque incubation avait une durée de 20 minutes. Par la suite, les ovaires étaient
enrobés dans la paraffine pour l’histologie. Pour les autres analyses, notamment le western blot
(WB) et la réaction en chaine de la polymérase (PCR), les ovaires étaient récupérés et traités
directement comme décrit ci-dessous dans les sections concernées.

Les souris de type sauvage utilisées dans le projet d’induction du VO étaient âgées de
21 jours à leur arrivée à l’animalerie, et gardées pendant une semaine pour accommodation avant
le début du traitement. Deux types d’expérimentation ont été réalisés. Le premier type, in vitro
comprenait 20 souris réparties en deux groupes de 10 souris chacun, un groupe contrôle et
 47

un groupe traitement. Le deuxième type a été conduit in vivo, et comprenait la même répartition
des souris.

En ce qui concerne les expériences relatives à la culture des cellules de la granulosa

ovarienne, les souris utilisées étaient également de type sauvage, immatures, et âgées de
21-23 jours. Elles étaient issues des croisements dans l’animalerie de l’UQTR de souris
génitrices qui provenaient de Charles River, ou elles étaient achetées directement du même
laboratoire.

2.2 Isolation et culture des cellules de la granulosa ovarienne

L’isolation de cellules de la granulosa a été faite en se référant aux publications

antérieures, notamment celle de Tian et al. (9). Brièvement, les ovaires étaient recueillis sur la
glace dans un milieu froid constitué de L-15 supplémenté avec 1 mg/ml de BSA (bovine serum
albumin), 100 mg/ml de streptomycine et 100 UI/ml de pénicilline. Ensuite, ils étaient
débarrassés de la graisse sous un stéréo microscope (de marque Zeiss, Stemi 305) et nettoyés
avant la dissection mécanique réalisée en utilisant des aiguilles G25. Les ovaires étaient ainsi
sectionnés, les follicules étaient perforés, et les cellules de la granulosa étaient séparées les unes
des autres. La manipulation était faite en respectant les mesures d’asepsie. Les cellules de la
granulosa étaient alors recueillies dans des tubes de 15 ml, centrifugées à 1200 rpm pendant
5 minutes à l’aide d’une centrifugeuse de marque Sorvall ST 40R (Thermo Scientifc, Canada).
Les cellules de la granulosa étaient par la suite suspendues dans le milieu de McCoy’s 5α.
Ce dernier était supplémenté de 5 % FBS (Fetal Bovin Serum), de 100 mg/ml de streptomycine,
de 100 UI/ml de pénicilline, gentamicine, et de 10-7 M d’androstènedione. Les cellules viables
étaient comptées à la suite de la coloration au bleu de trypan, et à l’aide d’un hémacytomètre.
Les cellules de la granulosa étaient cultivées dans des plaques de 6 puits (900.000 cellules/puits)
avec des volumes appropriés du milieu de culture McCoy’s 5α supplémenté comme décrit
ci-dessus. Les plaques étaient par la suite placées dans des incubateurs sous une atmosphère
humide, à 37 OC et 5 % de CO2 pendant 24 heures afin de permettre leur adhérence avant de
débuter les différents traitements.
 48

2.3 Induction du vieillissement ovarien par le 4-vinylcyclohexène diépoxyde

2.3.1 Expérimentation in vitro

À l’âge de 28 jours, les souris de type sauvage ont été assignées de façon aléatoire à l’un
ou l’autre groupe expérimental. Après acclimatation d’une semaine à l’animalerie, les souris ont
été directement euthanasiées, et les ovaires étaient récupérés de façon aseptique sous la hotte et
maintenus en culture dans des plaques de 6 puits sur le Millicel®. Le milieu de culture était fait
du α-MEM supplémenté avec 5 ng/ml de transferrine, 5 ng/ml de sélénium, 10 % de FBS,
100 mg/ml de streptomycine et 100 UI/ml de pénicilline. La culture a été réalisée dans des
incubateurs dans une atmosphère humide à 37 OC et 5 % de CO2 pendant quatre jours.
Dans le groupe traitement, 60 µM de VCD était ajouté au milieu de culture, alors que dans le
groupe contrôle seul le milieu de culture était maintenu. Le milieu de culture et le traitement
étaient renouvelés au deuxième jour de culture. À l’issue de ces 4 jours de traitement, les ovaires
étaient récupérés pour les différentes analyses.

2.3.2 Expérimentation in vivo

Quant à l’expérimentation in vivo, 20 souris également âgées de 28 jours ont été réparties
en deux groupes de 10, un groupe traitement qui recevait le VCD, et un groupe contrôle qui
recevait le diluant (huile de sésame). Le traitement consistait en l’administration intrapéritonéale
du VCD (160 mg/kg/j) dilué dans l’huile de sésame pendant 15 jours, alors que le groupe
contrôle ne recevait que l’huile de sésame (20 µl/g/j). Les souris étaient pesées tous les jours avant
l’injection afin de réajuster la quantité des produits à administrer. À la suite des injections,
les souris étaient surveillées et pesées régulièrement. Quarante-deux jours après la dernière
injection, elles ont été euthanasiées comme décrit ci-dessus. Puis, les ovaires étaient récupérés
pour procéder aux différentes analyses, notamment l’immunohistochimie (IHC), la coloration à
l’hématoxyline-éosine (HE), le WB et la PCR.
 49

2.4 Traitements avec les stéroïdes ovariens réalisés sur les cellules de la granulosa

Après 24 heures de culture des cellules de la granulosa comme décrit plus haut, le milieu
de culture était renouvelé, et le traitement était appliqué pour 48 heures. Ce traitement était fait
du 17 β-E2 (2 mg/ml) versus le contrôle (où il n’y avait pas de traitement) dans le premier groupe
expérimental. Dans le second groupe, le traitement était fait avec la 5α-DHT (50 µM) versus le
contrôle. Dans chaque groupe d’études, et pour chaque expérimentation, un minimum de
3 souris pour le sous-groupe traitement et de 3 également pour le sous-groupe contrôle ont été
inclus. À l’issue du traitement, les cellules étaient collectées pour les différentes analyses
réalisées.

2.5 Frottis vaginal pour détermination des phases du cycle œstral

La détermination des phases du cycle œstral a été réalisée grâce à des frottis vaginaux
journaliers. En bref, après soulèvement de la queue des souris, un embout de pipette 20 µl était
placé au début de l’ouverture vaginale, et avec du PBS 1X, un lavage était réalisé. Le liquide du
lavage vaginal était ensuite déposé sur une lame, séché puis coloré avec le Bleu de Méthylène,
et examiné sous microscope de marque Olympus IX70. Ces frottis ont été classifiés dans une
de 4 phases du cycle œstral comme publié précédemment (118), et montré dans la figure
supplémentaire 1 en annexe. On reconnait le P lorsque le frottis contient des cellules épithéliales
allongées et nucléées, l’E lorsqu’il y a prédominance des larges cellules épithéliales cornifiées;
le M en cas de coexistence de cellules épithéliales nucléées, aplaties et des leucocytes,
et le D en cas de frottis qui contenait essentiellement des leucocytes.

2.6 Histologie ovarienne, compte de follicules, de corps jaunes et calcul du volume

ovarien

2.6.1 Compte de follicules ovariens et de corps jaunes

Les ovaires enrobés dans la paraffine ont été sectionnés longitudinalement à une épaisseur
de 5 µm. Afin d’éviter de compter doublement des follicules, chaque cinquième section a été
colorée avec l’HE. Pour chaque ovaire, un total de cinq sections a été pris en compte, et pour
 50

chaque souris, la moyenne de deux ovaires était retenue. Pour chaque groupe de traitement ou de
génotype, un nombre minimal de 3 souris est inclus dans les analyses statistiques. Les images
ont été acquises avec le microscope de marque OPTIKA B-290TB. Le compte de follicules et
de corps jaunes a été réalisé sous le grossissement 400 X. Les follicules de différents stades
ainsi que les corps jaunes ont été comptés pour en déterminer le nombre. Un follicule était
considéré comme primordial s’il contenait une seule assise de cellules aplaties, ou avait moins
de 8 cellules cubiques qui entourent l’ovocyte; primaire lorsque cette seule couche qui entoure
l’ovocyte contenait uniquement des cellules cubiques, ou en contenait plus de 8 cellules;
secondaire lorsqu’il possédait plusieurs couches de cellules cubiques, et n’avait pas de cavité
antrale évidente. Les follicules étaient considérés antraux débutants et antraux, lorsqu’il y avait
respectivement un début de présence d’une cavité antrale ou une cavité antrale bien constituée.
Seuls les follicules qui possédaient un ovocyte bien visible, et en bon état morphologique ont
été pris en compte. Dans la présente étude, la RO était définie par la somme des follicules
primordiaux et primaires.

2.6.2 Calcul du volume ovarien

Nous avons calculé le volume ovarien sur des sections d’ovaires enrobés dans la paraffine,
de 5 µm d’épaisseur et après coloration à l’HE. Chaque cinquième section était ainsi colorée, et
pour chaque ovaire, un total de cinq sections était pris en compte. Pour chaque souris,
la moyenne de deux ovaires était retenue. Pour chaque génotype, un nombre minimal de 3 souris
âgées de 100 jours est inclus dans les analyses statistiques. Les images ont été acquises comme
décrit ci-dessus sous grossissement 40 X. Nous nous sommes appuyés sur les publications
antérieures pour la détermination du volume ovarien (123, 124). Brièvement, nous avons
d’abord calculé la surface de chaque section d’ovaire à l’aide du logiciel image J. En effet,
en circonscrivant chacune de section et à l’aide d’une référence de valeur connue, la surface est
ainsi calculée. Ensuite, le volume ovarien était déterminé selon la formule suivante :

Volume ovarien (millimètres cubes) = somme de sections (millimètres carrés) x

0,005 mm x 5. Dans cette formule, 0,005 représente l’épaisseur de chaque section et 5, le nombre
de sections prises en compte par ovaire. Pour diminuer le nombre de décimales et assurer une
commodité de présentation, nous avons ensuite multiplié les résultats obtenus par un facteur 10.
 51

2.7 Immunohistochimie et immunocytochimie

L’IHC a été réalisée sur des sections de 5 µm des tissus ovariens enrobés dans la paraffine,
et montées sur des lames chargées positivement. Les tissus ont été déparaffinés et réhydratés
avec des bains successifs de NeoClear®, d’alcool et finalement d’eau distillée. Ensuite,
le démasquage des sites antigéniques a été réalisé en incubant les lames dans une solution de
citrate de sodium (100 mM sodium citrate, pH = 6,5 % Tween 20) à 95-98 °C, pendant
30 minutes. Les lames ont bénéficié d’un lavage avec de l’eau distillée, puis le blocage des
peroxydases a été réalisé dans un bain avec le peroxyde d’hydrogène 3 % (H202) pendant
10 minutes. Les lames ont été lavées avec de l’eau distillée puis avec du TBST 1X (Tris Buffer
solution tween) après le blocage des peroxydases. Le blocage des sites antigéniques non
spécifiques a été réalisé en incubant les lames dans une solution de 5 % du sérum de chèvre dans
du TBST 1X pendant 1 heure à la température de la pièce. Par la suite, les lames ont été incubées
avec les différents anticorps primaires dans la solution de 5 % du sérum de chèvre dans du TBST
1X pendant toute la nuit à 4 °C. Les lames ont été lavées avec du TBST 1X, puis incubées avec
du Signal Stain® Boost Detection (# 8125, cell signaling). Par la suite, les lames ont été,
de nouveau, lavées avec du TBST 1X, puis incubées avec du Signal Stain® DAB (#11725, cell
signaling) pour la révélation. Les lames ont par la suite été lavées avec de l’eau distillée puis
contre-colorées avec l’hématoxyline, et couvertes par des lamelles à l’aide d’un milieu de
montage (Immu-Mount, # 9 990 402 de Thermo scientific). L’acquisition des images a été
réalisée comme décrit plus haut. Les anticorps primaires anti-Akt1 (# 75692; dilution :1/150),
Akt2 (# 17609-1-AP; dilution :1/200), Akt3(# 21641-1-AP; dilution : 1/100), Akt total (# 4691;
dilution :1/150) utilisés provenaient respectivement de Cell Signaling pour Akt1, Akt total et de
Proteintech (Rosemont, IL, USA) pour Akt2 et 3.

Pour l’immunocytochimie (ICC), les cellules de la granulosa ovarienne étaient cultivées

dans des plaques de 12 puits sur des lamelles circulaires. À l’issue de 48 heures de traitement
comme décrit ci-dessus, le milieu de culture a été retiré, et les cellules ont été lavées une fois
avec du PBS froid. Les cellules étaient par la suite fixées avec du PFA 4 %, puis lavées avec du
PBS, et perméabilisées avec du 0,1 % TritonX-100/PBS. Les peroxydases ont été bloquées avec
du peroxyde d’hydrogène 3 % après un lavage avec du PBS. Pour diminuer le marquage non
 52

spécifique, les cellules ont été incubées dans une solution de 5 % du sérum de chèvre dans du
PBS. Ensuite, une incubation a été réalisée avec les différents anticorps (les mêmes que ceux
utilisés en IHC) à 4 OC toute la nuit (anti-Akt1 : dilution de 1/150; anti-Akt2 : dilution de 1/150;
anti-Akt3 : dilution de 1/100). Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées à la
température de la pièce pendant 30 minutes avec la même solution d’anticorps secondaire que
celle utilisée en IHC. Comme dans le cas d’IHC, les cellules ont été lavées (ici, avec du PBS)
puis incubées avec du Signal Stain® DAB, et la contre-coloration a été réalisée. Les lamelles
ont été montées sur des lames, et nous avons procédé à l’acquisition des images comme décrit
précédemment.

2.8 Immunofluorescence

L’immunofluorescence a été utilisée pour l’identification des cellules de la granulosa afin

de valider notre modèle de culture cellulaire. C’est également après 48 heures de culture dans des
plaques de 12 puits comme décrit ci-dessus, et sur des lamelles circulaires que les cellules de la
granulosa ont été fixées. La fixation était faite le jour de l’analyse, avec du PFA 4 % pendant
10 minutes à la température de la pièce. Ensuite, les cellules étaient perméabilisées avec du 0,1 %
Triton X-100 dans le PBS. Après l’incubation avec l’anticorps primaire (anti-FSH-R,
# 22665-1-AP de Proteintech; dilution : 1/200) toute la nuit à 4 °C, les cellules sur les lamelles
ont été lavées 3 fois avec du PBS. Puis, elles ont été incubées avec l’anticorps secondaire
conjugué avec Alexa Fluor 555 (Thermo Fischer, dilution :1/800) pendant 90 minutes à l’abri
de la lumière, et à la température de la pièce. Ensuite, les lames ont été lavées avec du PBS.
La contre-coloration des cellules a été réalisée avec du Hoechst 33342 (Invitrogen H3570)
pendant 5 minutes à la température de la pièce et à l’abri de la lumière. Puis, nous avons réalisé
le montage des lamelles sur lames en utilisant le même milieu de montage qu’en cas d’IHC.
La visualisation et l’acquisition des images ont été réalisées à l’aide d’un microscope confocal
de marque Leica TCS SP8 (Leica Microsystems).
 53

2.9 Extraction de protéines et Western blot

Immédiatement après l’euthanasie, les ovaires ont été récupérés, débarrassés de maximum
possible de la graisse qui les entoure, et lavés avec du PBS. Par la suite, ils ont été cisaillés
dans le PBS, puis lysés avec un tampon fait de RIPA (pH = 7,4, 150 nM NaCl, 0,1 % SDS,
0,5 % sodium deoxycholate, 1 % NP-40 dans le PBS). Le tampon de lyse contenait
également un cocktail inhibiteur de protéases et de phosphatases (CompletedTM and PhosSTOP
de Roche Applied Science). Pour terminer la lyse des cellules, les tissus ont subi une sonication
de 10 secondes. Les tissus sont par la suite centrifugés (13000 x g pendant 20 min à 4 °C) pour
en débarrasser des matériels insolubles. Les surnageants ont été récupérés. Le dosage de protéine
y a été réalisé en utilisant le kit Bio-Rad DC protein assay et, le matériel a été conservé à -20 °C
jusqu’à l’analyse. Pour la réalisation des WB, des quantités égales de protéines (20 µg) de
chaque traitement ou phase du cycle œstral ont été séparées sur un gel SDS-PAGE. Les protéines
ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose à l’aide d’un système de transfert
semi-liquide (Bio-Rad, Hercules, CA). Les membranes ont par la suite été bloquées avec une
solution de 5 % lait écrémé dans du PBS contenant 0,05 % Tween-20 pendant une heure à la
température de la pièce. Les membranes ont par la suite été incubées avec des anticorps primaires
respectifs à 4 °C pendant toute la nuit. Après cette incubation, les membranes ont bénéficié de
3 lavages avec du PBS-0,05 % Tween-20. Les membranes ont été ensuite incubées pendant
45 minutes à la température ambiante avec l’anticorps secondaire lié au HRP (Horseradish
peroxydase) dans la même solution de blocage. Les membranes étaient ensuite lavées 3 fois avec
du PBS-0,05 % Tween-20, et une fois avec du PBS. La révélation a été faite par la détection de
l’activité peroxydase grâce à un kit spécifique SuperSignal West FemtoTM substrate (Thermo
Scientific, Rockfort, IL) en suivant les instructions du fabricant. La visualisation du signal a été
faite à l’aide du Biolmaging System (UVP, CA, USA). La bêta-actine a été utilisée comme
contrôle de charge. Les anticorps primaires suivants étaient utilisés : anti-Akt1 (# 75692,
dilution :1/1000), Akt3 (# 14982, dilution : 1/1000), Akt total (# 4691, dilution : 1/1000), pAkt1
(S 473, # 9018, dilution : 1/1000), pAkt2 (S 474, # 8599, dilution : 1/1000), Foxo3a (# 12829,
dilution : 1/1000), pFoxo3a (# 9466, dilution : 1/1000), GSK3β (# 12456, dilution : 1/1000),
pGSK3β (# 5558, dilution : 1/1000), mTOR (# 2983, dilution : 1/1000), pmTOR (# 5536,
dilution : 1/1000), pBad (# 9292, dilution : 1/1000), pBad (# 4366, dilution : 1/1000) et
caspase-3 clivée (# 9661, dilution : 1/1000) qui étaient achetés chez Cell Signaling
 54

(Danvers, MA). Tandis que celui dirigé contre Akt2 (# Ab-131 162, dilution : 1/1000) provenait
de Abcam (Cambridge, UK). L’anticorps secondaire anti-rabbit conjugué au Horseradish
peroxydase (# 7074, dilution : 1/40 000) était fourni par Cell Signaling (Danvers, MA),
et l’anticorps anti-bêta-actine conjugué avec la peroxydase (A-3854) provenait de Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO).

En ce qui concerne les cultures cellulaires, à l’issue du traitement, les cellules ont été
collectées, et lysées en utilisant le même tampon de lyse que ci-haut. Ensuite, 3 cycles de
congélation-décongélation ont été réalisés pour mieux briser les cellules. La solution a été
centrifugée (13 000 X g, 20 minutes, à 4 oC) et le surnageant, collecté. La suite de la procédure
a été réalisée comme décrit pour les ovaires entiers. Toutes les expérimentations ont été répétées
au moins trois fois.

2.10 Extraction de l’ARN et RT-qPCR

Pour la mesure de la transcription, les ovaires récoltés étaient conservés directement dans
le RNA later (# R0901, Sigma Aldrich) à – 80 °C jusqu’à l’extraction de l’ARN. L’extraction
de l’ARN a été faite à l’aide du Ribozol TM RNA (N580, VWR Life Science). L’ARN total a
été isolé en utilisant le Kit Direct Zol TM RNA mini prep de Zymo research (R-2050, USA) en
suivant les instructions du fabricant. Un total de 400 ng d’ARN dans un mélange de 20 µl de
réaction a été utilisé pour synthétiser l’ADNc en utilisant le kit qScript cDNA Supermix
(Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Nous nous sommes conformés également aux
instructions du manuel du fabricant. Les conditions de la réaction réalisée à l’aide du
thermocycleur C1000 Touch (Bio-Rad, Canada) étaient : 25 °C pendant 5 minutes, 42 °C
pendant 30 minutes, 85 °C pendant 5 minutes, et enfin la température était maintenue à 4 °C.

L’ADNc était ensuite amplifié en utilisant les amorces spécifiques pour chaque gène
cible. L’expression de l’ARNm de chaque isoforme d’Akt (Akt1, Akt2, Akt3) pour notre étude
a été mesurée. Les amorces suivantes ont été utilisées : 5′-TCGTGTGGCAGGATGTGTAT-3′
(forward) et 5′-ACCTGGTGTCAGTCTCAGAGG- 3′(reverse) pour Akt1, 5′-
ATACCAGGCACCCCTTCCT-3′(forward) et 5′- CACAAAGCATAGGCGGTCA-
 55

3′(reverse)pour Akt2, 5′- GTGGACCACTGTTATAGAGAGAACAT-3′(forward) et

5′-TTGGATAGCTTCCGTCCACT-3′(reverse) pourAkt3, 5′-
CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3′(forward) et 5′-ACCAGAGGCATACAGGGACA-
3′(reverse) pour β-Actine. Nous avons utilisé la β-Actine comme contrôle interne pour
normaliser l’expression de nos gènes d’intérêt. Chaque mélange (avec un volume final de 25 µl)
de réaction pour la qPCR a été réalisé en utilisant le kit Perfecta SYBRGreen Supermix Low
Rox (Quanta Biosciences, Beverly, MA, USA) selon les instructions du fabricant.
La quantification a été réalisée à l’aide de l’appareil Mx3000P system (Agilent Technologies,
Mississauga, Ontario, Canada). Une courbe standard a été générée pour chaque gène d’intérêt
afin de déterminer le rendement de la réaction. Nous avons utilisé la méthode de Pfaffl pour
mesurer l’expression relative de chaque gène. Chaque RT-qPCR a été réalisée en Duplicata, et
dans au moins trois expériences indépendantes pour chaque gène.

2.11 Analyses statistiques

Toutes les expérimentations qualitatives ont été répétées au moins 3 fois de manière
indépendante. Dans chaque groupe expérimental, concernant les données quantitatives,
plus de 3 souris étaient incluses. Les données quantitatives sont exprimées comme moyenne ±
écart type, à moins que cela ne soit autrement indiqué. La comparaison entre les groupes a été
réalisée en utilisant le test t de Student ou Anova selon le cas, et la valeur de P inférieure à 0,05
était considérée comme statistiquement significative. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.
Tous les tests statistiques ont été réalisés en utilisant le logiciel GraphPad PRISM, version 6.0
(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

2.12 Considérations éthiques

Les différentes études réalisées dans la présente thèse ont reçu l’approbation du comité
éthique et de bons soins aux animaux de l’UQTR avant le démarrage des expérimentations.
L’euthanasie des souris a été réalisée par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane
suivant les recommandations en vigueur du comité de bons soins aux animaux.
 CHAPITRE III

RÉSULTATS

3.1 Expression des isoformes d’Akt dans les différents compartiments et structures
ovariens

Comme décrit précédemment, l’ovaire est un organe complexe qui possède différents
structures et compartiments. Dans la présente thèse, nous avons voulu dans un premier temps
analyser l’expression des isoformes d’Akt dans ces différents compartiments. Pour y parvenir,
nous avons réalisé des IHC avec des anticorps spécifiques pour les différentes isoformes d’Akt
sur des ovaires des souris de type sauvage âgées de 100 jours, et donc sexuellement mâtures.
Les isoformes d’Akt ont montré des niveaux d’expressions différents dans les compartiments
ovariens. En effet, au niveau du stroma, nous avons détecté la présence d’Akt1 et Akt2,
tandis qu’Akt3 apparaissait nul. En revanche, les trois isoformes d’Akt sont exprimées
dans les follicules ovariens de toutes les catégories (des primordiaux aux antraux) (Figure 3.1A,
i, ii et iii). Au sein du follicule, l’expression des isoformes d’Akt variait suivant le type cellulaire.
Akt1 et 2 montraient une expression moindre et éparse au niveau de la thèque, alors qu’Akt3 y
était quasi nul. Dans les cellules de la granulosa et dans l’ovocyte, Akt1 et Akt2 étaient détectés
tout au long du cycle œstral (Figure 3.1B, Figure 3.2A et B). Cependant, Akt3 était présent dans
les cellules de la granulosa de follicules de toutes les catégories sauf en D où il est absent dans
les petits follicules (primordiaux, primaires et secondaires) (Figure 3.2C). Les trois isoformes
d’Akt sont aussi exprimées dans les corps jaunes bien qu’Akt3 est très faible. Enfin, ces résultats
montrent qu’Akt3 est l’isoforme la moins exprimée dans l’ovaire. Les contrôles négatifs (Ig G)
des anticorps sont représentés dans la figure supplémentaire 2 en annexe.
 57

Figure 3.1 Les isoformes d’Akt s’expriment différemment dans les structures et
compartiments ovariens.
Les IHC ont été réalisées sur les coupes des ovaires des souris C 57 BL/6J
de type sauvage âgées de 100 jours (n = 3).
A) Expression dans l’ovaire entier : les 3 isoformes d’Akt sont exprimées dans les
follicules de tous les stades et dans les corps jaunes. L’expression d’Akt1 et 2 est
faible et éparse dans le stroma, tandis que celle d’Akt3 y est quasi nulle (i, ii et iii).
B) Expression au sein du follicule : les trois isoformes sont présentes dans les
cellules de la granulosa et l’ovocyte. Akt3 apparait être faiblement exprimé
comparativement aux deux autres isoformes. Akt1 et 2 sont présents au niveau de
la thèque alors qu’Akt3 y est absent. Les ovaires représentatifs sont en D
pour la figure 3.1A; et en P pour la figure 3.1B. F : follicule, CJ : corps jaune,
S : stroma, CG : cellules de la granulosa, O : ovocyte et Th : thèque. 1o : follicule
primordial, 1 : follicule primaire, 2 : follicule secondaire et 3 : follicule antral.
Barre = 250 µm.
 58

3.2 Localisation subcellulaire, intensité et activation des isoformes d’Akt au cours du

cycle œstral

Il est généralement admis que les isoformes d’Akt occupent différentes localisations
subcellulaires selon les types et status cellulaires (125). Afin de mieux comprendre le rôle d’Akt
et de ses différentes isoformes, il est donc judicieux d’analyser leurs localisations subcellulaires
dans les différentes phases du cycle œstral. Pour ce faire, nous avons réalisé des IHC dans les
différentes phases du cycle œstral sur des ovaires des souris de type sauvage âgées de 100 jours.
Par exemple, l’analyse des follicules antraux débutants et antraux a montré que la localisation
et l’intensité des isoformes d’Akt variaient de manière isoforme spécifique au sein des cellules
de la granulosa tout au long du cycle œstral. En ce qui concerne Akt1, nos résultats montrent
qu’il est localisé dans le noyau (flèche rouge) et le cytoplasme (cercle rouge) tout le long
du cycle œstral (Figure 3.2D, i et Figure 3.2A). Pour Akt2, nos résultats montrent une
localisation cytoplasmique basale (cercle noir) et quelque peu membranaire (flèche noire) en P,
cytoplasmique et périnucléaire (carré rouge) dans les autres phases du cycle œstral (Figure 3.2B
et Figure 3.2D, ii, iii). Concernant Akt3, nos résultats montrent une localisation cytoplasmique
en E et P bien qu’une localisation nucléaire ait été observée dans quelques cellules spécialement
dans les follicules antraux. En M, Akt3 avait une localisation cytoplasmique (Figure 3.2C et
Figure 3.2D, iv, v). Dans l’ovocyte, la localisation était essentiellement cytoplasmique pour
toutes les isoformes d’Akt au travers du cycle œstral. Dans les cellules de la thèque de ces
follicules, Akt1 avait le même patron d’expression que dans les cellules de la granulosa, et ce,
tout au long du cycle œstral (Figure 3.2D, i). Dans le cas d’Akt2, il y avait le même patron
d’expression que les cellules de la granulosa dans trois phases du cycle œstral excepté en P où
son expression était très faible (Figure 3.2D, ii, iii). Concernant le niveau d’intensité
d’expression, essentiellement dans les cellules de la granulosa de follicules antraux débutants et
antraux, les résultats ne montrent pas de grandes variations des isoformes d’Akt. Cependant,
Akt1 avait une expression un peu plus forte en P alors qu’elle diminuait en E, M; et amorçait sa
remontée en D (Figure 3.2A). Akt2 avait une expression un peu plus élevée en E, et qui diminuait
dans les autres phases du cycle, surtout en P où elle gardait une expression cytoplasmique basale,
et un peu membranaire (Figure 3.2B). L’expression d’Akt3 était légèrement plus forte
en P et E. Par la suite, le marquage diminuait en M et s’annulait en D dans les petits follicules
(primordial, primaire et secondaire) (Figure 3.2D, vi et Figure 3.2C).
 59

Afin de déterminer si des changements dans l’activité des protéines Akt s’opéraient au
cours du cycle œstral, nous avons réalisé une analyse biochimique sur les ovaires entiers.
En effet, nous avons étudié l’expression protéique d’Akt1, 2 et 3; et nous avons déterminé leur
activité (phosphorylation) tout au long du cycle. Ainsi, nous avons réalisé des WB sur les
protéines totales extraites des ovaires des souris de type sauvage âgées de 100 jours durant les
différentes phases du cycle œstral. Une analyse densitométrique a été réalisée pour quantifier
l’expression et la phosphorylation de chaque isoforme d’Akt en utilisant le logiciel image J.
Nous avons utilisé la bêta-actine comme contrôle de charge. La différence d’expression était
statistiquement significative seulement pour Akt2 et Akt3 (p = 0,0012 et 0,0021 respectivement)
(Figure 3.2.E.1). En effet, nos résultats ont montré qu’Akt2 avait une forte expression en P et E.
Puis, il diminuait de manière significative en M, et amorçait son augmentation en D.
Akt1 et 3 avaient un niveau d’expression plus élevé en E. Akt3 diminuait de manière
significative en M et D, puis il remontait également de manière significative en P. Akt1 montrait
une tendance à diminuer en M, D; il amorçait l’augmentation en P. La différence observée n’était
pas significative. La phosphorylation des isoformes d’Akt est directement liée à leur niveau
d’activation, soit à leur activité de protéines kinases. Ainsi, la protéine phosphorylée de chacune
d’elles reflète, de ce fait, le niveau de leur activité kinase respective. Dans la présente étude,
en utilisant les anticorps spécifiques actuellement disponibles dirigés contre les formes
phosphorylées d’Akt (Akt1 et 2), nous avons analysé leur niveau de phosphorylation durant le
cycle œstral. Nos résultats ont montré qu’Akt1 était activé en P, avait atteint le pic en E et
ensuite décroissait en M et D. Cependant, pAkt2 montrait son niveau le plus élevé en E et D
tandis que ce niveau était bas dans les autres phases du cycle œstral. Bien que ces différences
n’étaient pas statistiquement significatives, ces résultats suggèrent qu’il existe une modulation
dans l’activité d’Akt1 et Akt2 au cours du cycle œstral (Figure 3.2.E.2). Le fait que les différences
observées ne soient pas significatives pourrait s’expliquer par le fait que nous avons utilisé
l’ovaire entier qui contient d’autres compartiments tissulaires en dehors des follicules.
Par ailleurs, en analysant les patrons d’expression protéique des isoformes d’Akt en
comparaison à ceux de leur phosphorylation, nous avons observé qu’Akt1 montrait le même
patron dans toutes les phases du cycle œstral entre son expression et son activation. Tandis que
pour Akt2, il y avait concordance seulement dans trois phases (E, M et D).
60
61
62
 63

Figure 3.2 Localisation subcellulaire, intensité et activation des isoformes d’Akt au

travers du cycle œstral chez les souris C 57 BL/6J de type sauvage âgées
de 100 jours.
L’expression des isoformes d’Akt a été analysée par IHC (n = 3 pour chaque
phase du cycle). La localisation et l’intensité d’expression varient de manière
isoforme-spécifique au sein des cellules de la granulosa. A) Akt1 montre une
localisation nucléaire et cytoplasmique tout le long du cycle. Son intensité est forte
en P et D, diminue en E et M. B) AKt2 montre une localisation essentiellement
basale cytoplasmique et membranaire en P, pendant que dans les autres phases du
cycle sa localisation est cytoplasmique, périnucléaire et quelque peu nucléaire.
Son intensité en E est faible. C) Akt3 exprime une localisation cytoplasmique
en P, E et M, et en plus quelques cellules montrent une localisation nucléaire
 64

en E et P. Son intensité est forte en E, et nulle en D. D) Fort grossissement montrant

la localisation subcellulaire des isoformes d’Akt. Cercle rouge : localisation
cytoplasmique; flèche rouge : localisation nucléaire; carré rouge : localisation
périnucléaire; flèche noire : localisation membranaire; cercle noir : localisation
basale cytoplasmique. Barre = 250 µm. E) Les protéines de l’ovaire entier étaient
extraites, et les WB réalisés en utilisant les anticorps : (E.1) anti-isoformes d’Akt,
(E.2) anti-phospho-Akt1 (S 473) et anti-phospho-Akt2 (S 474). La bêta-actine est
utilisée comme contrôle de charge. Les densitométries de protéines sont
représentées comme moyenne ± écart type. Pour la comparaison dans les
différentes phases, le test d’ANOVA One-way suivi du test de Tukey’s
(quand cela était nécessaire) était utilisé. L’astérisque représente la significativité
de la différence entre deux groupes (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001).

3.3 Validation du Knock out d’Akt3 dans notre modèle

Bien que les souris Akt3-/- existent depuis plusieurs années, le rôle d’Akt3 dans l’ovaire
n’a pas été clairement et profondément étudié. L’utilisation de ces souris Akt3-/- nous a permis
d’analyser directement le rôle d’Akt3 dans l’ovaire en étudiant l’impact de son élimination sur
la RO, la dynamique folliculaire et l’ovulation. Différentes études ont démontré que les souris
déficientes en Akt3 sont viables et peuvent se reproduire. Ces études ont montré que ces souris
présentaient essentiellement une réduction de la taille du cerveau (76, 126). Avant de réaliser
notre étude, nous avons d’abord validé l’élimination d’Akt3 chez les souris que nous avons
utilisées en étudiant l’expression de la protéine dans leurs ovaires. Comme le montrent les
résultats des WB (Figure 3.3), la détection d’Akt3 était nulle chez les souris déficientes.
Cette confirmation a permis la validation de notre modèle.

Figure 3.3 Validation de l’élimination d’Akt3.

 65

WB de protéines totales des ovaires de souris de type sauvage (ou WT) et

déficientes en Akt3 pour la détection d’Akt3. Les résultats confirment que les
souris Akt3-/- n’expriment pas Akt3. Akt total a été utilisé pour la confirmation de
l’expression des autres isoformes d’Akt. La β-actine a été utilisée comme contrôle
de charge.

3.4 La déficience en Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique folliculaire

Comme mentionné ci-dessus, le rôle d’Akt3 dans l’ovaire n’a pas encore été clairement et
profondément étudié. Certains chercheurs ont montré précédemment que la délétion d’Akt1
résultait en une diminution du nombre de follicules primordiaux (118). Nous avons profité de
l’avantage d’avoir en main des souris déficientes en Akt3, pour analyser l’effet de l’absence
d’Akt3 sur l’ovaire au cours du cycle œstral. Nous avons utilisé des souris qui étaient en début
de la maturité sexuelle (âgées de 45 jours), et des souris âgées de 100 jours. Nous avons réalisé
des comptes de follicules selon leurs catégories respectives après coloration à l’HE. Comme le
montre la figure 3.4 chez les souris âgées de 45 jours, la déficience en Akt3 était
significativement accompagnée d’une diminution des follicules de la RO (en P, E et M avec
respectivement p = 0,02; 0,0193 et 0, 0145) (Figure 3.4A et Figure 3.4B, i, ii, iii). Nous avons
observé une tendance en ce sens dans l’autre phase du cycle (D), bien que le seuil de
significativité n’ait pas été atteint (Figure 3.4B, iv). Contrairement à la RO, cette déficience en
Akt3 résultait en une augmentation significative du nombre de follicules secondaires en
P, E et D (p = 0,019; 0,0191 et 0,0008 respectivement) (Figure 3.4A et Figure 3.4C, i, ii, iv).
Bien que non significatif, une tendance à l’augmentation de follicules secondaires était
également observée en M (p = 0,14) (Figure 3.4C, iii). Pour les follicules antraux et le nombre
total de follicules (soit la somme totale qui inclut toutes les catégories de follicules), aucune
différence n’était statistiquement significative (Figure 3.4D et E). Chez les souris âgées de
100 jours, les différences n’étaient pas significatives pour les différentes catégories de follicules.
Cependant, les mêmes tendances étaient observées en ce qui concerne la RO et les follicules
secondaires comme à 45 jours (Figure 3.4F, G, H et I). Pris ensemble, nos résultats sur la RO et
la dynamique folliculaire suggèrent un effet bien spécifique d’Akt3 lié à l’âge. Puisque nos
résultats montrent que l’absence d’Akt3 entraine un épuisement de la RO, Akt3 jouerait donc un
rôle dans le maintien de la RO. Celui-ci passerait par le contrôle de la sortie des follicules du
pool de la RO vers un stade supérieur chez les souris âgées de 45 jours.
66
67
 68

Figure 3.4 La déficience en Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique

folliculaire.
Les ovaires des souris WT et Akt3-/- enrobés dans la paraffine ont été sectionnés
en des coupes de 5 µm, et chaque 5e section a été colorée avec l’HE pour la
visualisation des follicules. Pour chaque ovaire, un total de 5 sections a été utilisé
pour faire le compte des follicules. Pour chaque souris, la moyenne des
deux ovaires était retenue. Dans chaque phase du cycle et dans chaque groupe
(n = 5-9) chez les souris âgées de 45 jours et 100 jours, les follicules de la
RO (primordiaux et primaires), les follicules secondaires, les follicules antraux et
le nombre total de follicules ont été analysés.
(A) Ovaires représentatifs qui montrent les follicules de la RO (flèche noire) et
les follicules secondaires (étoile noire) chez les souris âgées de 45 jours.
(B) Décompte de follicules de la RO à 45 jours; (C) décompte des follicules
secondaires à 45 jours; (D) décompte des follicules antraux à 45 jours; (E) nombre
total des follicules à 45 jours; (F) décompte de follicules de la RO à 100 jours;
(G) décompte des follicules secondaires à 100 jours; (H) décompte des follicules
antraux à 100 jours; (I) nombre total des follicules à 100 jours. Les données
représentent les moyennes ± écart types. Pour la comparaison entre les
deux génotypes, le test t de Student était utilisé. Barre = 500 µm. L’astérisque
représente la différence significative entre les deux groupes (*, P < 0,05; ***,
P < 0,001).
 69

3.5 L’élimination d’Akt3 est accompagnée de la diminution des corps jaunes et du

volume ovarien

a) La diminution des corps jaunes

En vue de déterminer l’effet de l’élimination d’Akt3 sur l’ovulation et la formation du

corps jaune, nous avons également réalisé la coloration à l’HE sur des coupes d’ovaires de souris
âgées de 100 jours. Puis, nous avons compté le nombre des corps jaunes. Par la suite, nous avons
comparé leur nombre avec le nombre de corps jaunes observés chez les souris de type sauvage.
La figure 3.5 montre que le nombre des corps jaunes était significativement diminué chez les
souris Akt3-/- par rapport aux souris de type sauvage en M et D (p = 0,01 pour les deux phases)
(Figure 3.5A et B). Dans les deux autres phases du cycle, la différence n’était pas significative
(Figure 3.5C). Ce résultat suggère un possible rôle pour Akt3 dans l’ovulation et la formation
du corps jaune. En effet, Akt3 promouvrait l’ovulation et la formation de corps jaunes. Dans le
même ordre d’idée, nous avons aussi constaté la même tendance bien que non significative dans
le nombre des souriceaux dans les portées. En effet, les souris Akt3-/- avaient un nombre moyen
faible de souriceaux comparativement aux souris de type sauvage (Figure 3.5D).

b) La diminution du volume ovarien

Nous avons constaté, comme le montrent les figures 3.4A et 3.5D, une grande différence
de grosseur entre les ovaires des souris de type sauvage et les souris déficientes en Akt3.
Les ovaires des souris Akt3-/- paraissaient petits. Ce constat nous a poussés à analyser le volume
ovarien. Ainsi, à partir des coupes d’ovaires de souris âgées de 100 jours, et après coloration à
l’HE, comme expliqué dans la section matériel et méthodes, nous avons calculé le volume
ovarien dans les deux groupes. Puis, nous avons réalisé les comparaisons dans les différentes
phases du cycle œstral. Les résultats montrent que le volume ovarien était significativement
diminué chez les souris Akt3-/- par rapport aux souris de type sauvage dans toutes les phases du
cycle (p = 0,045; 0,049; 0,003 et 0,022 respectivement en P, E, M et D) (Figure 3.5E).
Ce résultat suggère qu’Akt3 joue un rôle dans la régulation du volume ovarien.
70
71
 72

Figure 3.5 Effet de l’élimination d’Akt3 sur le corps jaune, la fertilité et le volume
ovarien.
(A-C) Décompte de corps jaunes dans les quatre phases du cycle œstral :
les ovaires de souris WT et Akt3-/- enrobés dans la paraffine ont été sectionnés en
des coupes de 5 µm, et chaque 5e section a été colorée avec l’HE pour la
visualisation des corps jaunes. Pour chaque ovaire, un total de 5 sections a été
utilisé pour faire le compte de corps jaunes. Pour chaque souris, la moyenne des
deux ovaires était prise en compte dans chaque phase du cycle œstral et dans
chaque groupe (n = 5-6) chez les souris âgées de 100 jours. (D) Analyse de la
fertilité des souris WT et Akt3-/- : des souris femelles Akt3-/- ont été hébergées
individuellement puis accouplées à l’âge de 60 jours avec des mâles de type
sauvage dont la fertilité est prouvée. Des femelles de type sauvage ont été utilisées
comme témoins (n = 5 dans chaque groupe). Le nombre de souriceaux par portée
a été enregistré pour chaque souris. Pour chaque souris, un minimum de 4 portées
a été considéré. (E) Comparaison du volume ovarien dans les quatre phases du
cycle œstral entre les souris WT et Akt3-/-. i) volume ovarien en P; ii) volume
ovarien en E; iii) volume ovarien en M) iv) volume ovarien en D. Les données
représentent les moyennes ± écart types. Pour la comparaison entre les
deux génotypes, le test t de Student a été utilisé. (*, P < 0,05; **, P < 0.01).
Les flèches montrent les corps jaunes.
 73

3.6 Validation du modèle de cellules de la granulosa

Dans l’ovaire, les cellules de la granulosa contiennent des récepteurs de différentes

hormones dont ceux des stéroïdes ovariens et de la FSH. Ainsi, elles représentent un moyen
moins complexe pour étudier la régulation de l’expression des isoformes d’Akt par les
androgènes et les œstrogènes. Afin de mieux cerner le rôle des différentes isoformes d’Akt dans
les cellules de la granulosa, nous avons isolé ces cellules et déterminé qu’elles étaient bien des
cellules de la granulosa. L’expression des récepteurs de la FSH (FSH-R) dans l’ovaire est
caractéristique des cellules de la granulosa, et de ce fait, ils peuvent être utilisés comme
marqueurs pour confirmer leur identification. Ainsi, nous avons analysé l’expression de la FSH-R
par immunofluorescence dans nos cellules pour confirmer leur nature et leur pureté en utilisant
l’anticorps spécifique. Comme le montre la figure 3.6A, la grande majorité de nos cellules sont
positives à cet anticorps. Ce résultat confirme la nature de nos cellules et un bon degré de pureté
de notre culture. De façon additionnelle, le WB réalisé à 24 h et 48 h après culture montre la
stabilité de l’expression de FSH-R comme le montre la figure 3.6B.

Figure 3.6 Validation du modèle des cellules de la granulosa ovarienne.

 74

Les cellules de la granulosa ont été cultivées pendant différents temps et la

quasi-totalité des cellules expriment le FSH-R. Cette expression confirme la
nature des cellules. (A) Détection du FSH-R par immunofluorescence avec l’aide
d’un anticorps anti-FSH-R après 48 heures de culture. (B) Analyse des protéines
totales des cellules de la granulosa après 48 heures de culture par WB en utilisant
un anticorps contre le FSH-R. La β-actine a été utilisée comme contrôle de charge.

3.7 Expression et localisation des isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa

Akt est une des protéines abondamment exprimées dans les cellules, et se retrouve parmi
les protéines ubiquitaires. Plusieurs études établissent la spécificité de ses isoformes en fonction
des organes et des cellules comme démontré précédemment et dans la présente étude (65, 74).
Les cellules de la granulosa représentent un des éléments importants dans la gestion du destin
folliculaire. Malgré leur importance, les voies de signalisation cellulaire qui y participent en leur
sein sont peu caractérisées. Dans un premier temps, nous avons estimé opportun de caractériser
la localisation et l’expression des différentes isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa
avant de procéder à différents traitements. Pour ce faire, nous avons utilisé l’ICC. Les résultats
de la présente étude montrent, comme nous l’avons observé dans l’étude in vivo, que les
trois isoformes d’Akt sont différemment localisées au sein des cellules de la granulosa même si
elles possèdent certaines similarités (Figure 3.7A et C, dans les groupes contrôles). En effet,
Akt1 a montré une nette double localisation nucléaire et cytoplasmique bien que l’intensité
nucléaire semble prédominante. Pour ce qui est d’Akt2, il est localisé dans le cytoplasme des
cellules. Akt3 quant à lui présente aussi une localisation cytoplasmique, et en très petite quantité,
une localisation nucléaire. Ces ICC confirment la faible intensité d’expression d’Akt3 dans ces
cellules.

3.8 Régulation de l’expression et de la localisation des isoformes d’Akt par les stéroïdes
ovariens

Dans le but d’étudier les effets des stéroïdes ovariens, spécialement des androgènes et des
œstrogènes, nous avons traité pendant 48 heures les cellules de la granulosa avec la 5α-DHT
comme androgène d’une part. D’autre part, nous avons utilisé le 17β-E2 comme œstrogène pour
le traitement. À l’issue des traitements, nous avons réalisé des ICC ainsi que des WB pour étudier
 75

l’effet des traitements sur la régulation de l’expression de chaque isoforme. Les résultats obtenus
par WB (Figures 3.7B et 3.7D) montrent que ces deux stéroïdes n’affectent pas de façon
significative l’expression des isoformes d’Akt.

Cependant, les résultats des ICC tendent à montrer que leurs effets sur certaines isoformes
d’Akt sont opposés. Par exemple, lors du traitement avec la DHT, l’intensité d’expression
d’Akt1 paraissait diminuée, alors que celle d’Akt2 paraissait augmentée. Le traitement avec la
DHT semble n’avoir aucun effet spécifique sur la localisation des isoformes d’Akt
(Figure 3.7A). Ces tendances concernant la régulation de l’expression des isoformes d’Akt par
la DHT ont été également observées dans les WB, mais les différences ne sont pas significatives.
Dans le WB, la DHT a aussi tendance à diminuer l’expression d’Akt3. Contrairement à l’action
de la DHT, lors du traitement avec l’E2, l’intensité d’expression paraissait augmentée pour Akt1,
et diminuée pour Akt2 sur les ICC. Pour Akt3, l’action d’E2 était moins évidente.
Cette modification d’intensité des isoformes d’Akt avec l’E2 ne semblait pas affecter la
localisation d’Akt1 et d’Akt2. En ce qui concerne Akt3, sa localisation nucléaire semblait
augmentée (Figure 3.7C). Les résultats des WB concernant l’E2 montrent la même tendance pour
Akt1, et les différences ne sont pas significatives comme pour le cas de la DHT.
76
 77

Figure 3.7 Régulation de l’expression et localisation des isoformes d’Akt par les
stéroïdes ovariens.
Les cellules de la granulosa ovarienne ont été cultivées et traitées pendant
48 heures dans deux expériences indépendantes, soit avec la DHT (50 µM),
soit avec l’E2 (2 µg/ml). (B et D) : les WB réalisés sur les protéines totales qui ont
été isolées à l’issue de différents traitements. (A et C) : l’ICC qui a été réalisée sur
des cellules de la granulosa à l’issue de différents traitements. La même quantité
de protéine a été déposée dans chaque puits. Les densitométries représentent les
moyennes ± écart types, et la β-actine a servi de contrôle de charge.
Pour la comparaison entre les groupes de contrôles et les groupes de traitements,
le test t de Student a été utilisé. Chacune de ces expériences a été répétée au moins
trois fois.
 78

3.9 Impact du traitement stéroïde sur la phosphorylation des isoformes et des cibles
d’Akt

Dans le but de voir l’impact du traitement des stéroïdes ovariens sur l’activité des
isoformes d’Akt, nous avons réalisé également des WB en étudiant leur phosphorylation.
Pour cette étude, nous avons utilisé deux anticorps spécifiques actuellement disponibles dirigés
contre pAkt1 (S 473) et pAkt2 (S 474). Nous avons analysé aussi la phosphorylation de quelques
cibles d’Akt que nous avons mentionné précédemment, notamment Bad, Foxo3a, GSK 3β et
mTOR. Les résultats montrent que la phosphorylation d’Akt1 et 2 sont influencées de façon
évidente par ces deux traitements de manière inverse. En effet, le traitement avec la DHT
diminuait le niveau de leur phosphorylation quoiqu’une différence significative n’était observée
que pour pAkt1 (p = 0,0201). Le traitement avec l’E2 augmentait quant à lui sensiblement le
niveau de la phosphorylation bien que cela n’ait été significatif que pour pAkt2 (p = 0,0134)
(Figure 3.8A et 3.8B). La phosphorylation des cibles moléculaires d’Akt impliquées dans la voie
anti-apoptotique (Bad et Foxo3a) était diminuée par la DHT quoique la différence n’était
significative que pour pBad (p = 0,0295) (Figure 3.8C.1 et 2). Cependant, leur phosphorylation
était augmentée par l’E2 bien que la différence ne fût significative que pour pFoxo3a (p = 0,0130)
(Figure 3.8D.1 et 2). En revanche, la phosphorylation des cibles impliquées dans la croissance
et le métabolisme cellulaires (GSK 3β et mTOR) paraissait augmentée par les deux traitements
de façon plus marquée et significative que pour mTOR (Figure 3.8C et 3.8D).

Par ailleurs, nos résultats ont montré que les niveaux de formes non phosphorylées d’Akt
total et de ses cibles n’étaient pas influencés par le traitement avec la DHT (Figure 3.8C) ni par
celui avec l’E2 (Figure 3.8D).
79
 80

Figure 3.8 Impact du traitement stéroïdien sur Akt total, la phosphorylation de ses
isoformes et celle de ses cibles.
Les cellules de la granulosa ont été cultivées, et traitées pendant 48 heures avec
50 µM de DHT. Dans une autre expérience indépendante, elles ont été traitées
avec 2 µg/ml d’E2. À l’issue des traitements, les protéines totales étaient extraites,
et les WB ont été réalisés pour analyser l’expression d’Akt total ainsi que la
phosphorylation de ses isoformes et celle de ses cibles en utilisant des anticorps
spécifiques : (A) anti-pAkt1 (S 473), (B) anti-pAkt2 (S 474), (C et D) anti-Akt
total, anti-pBad, anti-pFoxo3a, anti-pGSK 3β et anti-pmTOR, ainsi que les
anticorps dirigés contre leurs formes non phosphorylées. La densitométrie a été
utilisée pour la quantification de la phosphorylation d’Akt1 et d’Akt2.
Les données quantitatives sont présentées comme moyennes ± écart types.
La β-actine a été utilisée comme contrôle de charge. Le test t de Student a été
utilisé pour la comparaison entre les groupes de contrôles et les groupes de
traitements. Les expériences ont été répétées trois fois. L’astérisque représente la
différence significative entre les deux groupes (*, P < 0,05; **, P < 0,01).
 81

3.10 Validation du modèle de vieillissement ovarien induit par le 4-vinylcyclohexène

diépoxide (VCD)

Le VO est défini par la diminution des follicules de la RO, essentiellement les follicules
primordiaux et les follicules primaires. Différentes études ont montré que le traitement au VCD
représentait un bon modèle pour étudier le VO (119, 127). Dans la présente étude, nous avons
induit le VO à l’aide du VCD selon une double approche. Dans le volet in vitro, nous avons mis
en culture des ovaires, et avons analysé l’effet d’un traitement au VCD sur le vieillissement de
ces derniers. Ainsi, nous avons euthanasié les souris C57 BL/6J de type sauvage à l’âge de
28 jours. Ensuite, nous avons récupéré leurs ovaires pour les traiter durant 4 jours avec le VCD
(60 µM) versus contrôle (milieu de culture seul). En vue de valider notre modèle de VO sur des
cultures d’ovaires, nous avons réalisé la coloration à l’HE sur des coupes de ces ovaires.
Comme le montre l’expérimentation in vitro (Figure 3.9.A.1), en comparaison avec les ovaires
contrôles, les follicules de la RO étaient rares dans le groupe traitement. Ainsi, la RO et,
par conséquent, le nombre total de follicules étaient significativement diminués dans le
groupe traitement par rapport au groupe contrôle (p = 0,0023 et P = 0,049 respectivement)
(Figure 3.9.A.2). Les follicules secondaires et antraux n’ont pas été impactés par le traitement
avec le VCD. Dans le volet in vivo, des souris de même âge ont reçu par injection
intrapéritonéale du VCD dilué dans l’huile de sésame (160 mg/kg/j pendant 15 jours) versus
contrôle (huile de sésame seul). Quarante-deux jours après la dernière injection, les souris ont
été euthanasiées et leurs ovaires, collectés. À la suite du traitement, nous avons observé une
diminution des follicules de la RO. Nous avons observé aussi une diminution de toutes les autres
catégories de follicules, notamment les follicules secondaires, antraux et par conséquent,
le nombre total de follicules (p = 0,0088; 0,0336; 0,0175 et 0,0007 respectivement pour les
follicules de la RO, secondaires, antraux et le nombre total de follicules) (Figure 3.9.B.1 et 2).
82
 83

Figure 3.9 Compte de follicules et validation du modèle de vieillissement ovarien induit

par le 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD).
 84

Le VO a été induit par le VCD selon une double approche. In vitro, les ovaires des
souris âgés de 28 jours ont été récupérés pour être traités durant 4 jours avec le
VCD versus contrôle (milieu de culture seul). Dans le volet in vivo, les souris de
même âge ont reçu par injection intrapéritonéale du VCD dilué dans l’huile de
sésame versus contrôle (huile de sésame seul). À l’issue des expériences,
les ovaires collectés ont été préparés pour les différentes analyses histologiques
(coloration à l’HE), et les follicules ont été comptés comme décrit dans matériel
et méthodes. (A.1) Le VCD induit l’effondrement des follicules de la RO et le
nombre total de follicules in vitro. (B.1) in vivo, on note l’effondrement de toutes
les catégories de follicules. Le compte de follicules confirme de façon
significative ces observations : (A.2) in vitro et (B.2) in vivo. Les données
quantitatives sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Le test t de
Student a été utilisé pour la comparaison entre les groupes de contrôles et les
groupes de traitements. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; n = 3 dans
chaque groupe. Les flèches indiquent les follicules de la RO (primordiaux et
primaires). La barre d’échelle = 200 µm.

3.11 Effets du VCD sur l’expression protéique, l’activation des isoformes d’Akt et sur
l’expression de la caspase-3 clivée

Nos expériences ont montré que le traitement au VCD était efficace autant in vivo que
in vitro puisque les coupes des deux types d’ovaires montraient une diminution marquée du
nombre de follicules primordiaux et primaires.

Il est connu qu’Akt est impliqué dans le processus du VO, mais l’implication spécifique
de ses isoformes dans ce processus n’a jamais été étudiée. Puisque chaque isoforme d’Akt joue
des fonctions spécifiques, mais aussi redondantes nous avons trouvé important d’étudier leur
comportement au cours du VO. Nous avons induit le VO et étudié l’expression de chacune des
isoformes d’Akt chez les ovaires en culture et in vivo chez l’animal. L’analyse des protéines
d’ovaires en culture par WB, dans notre étude in vitro, montre que la quantité des trois isoformes
d’Akt était réduite par l’administration du VCD. Cette différence est significative pour Akt1 et
Akt2 (p respectivement = 0,0065 et 0,0045) (Figure 3.10.A.1). Les résultats de l’étude in vivo
montrent que, comparativement au groupe contrôle, seule la quantité d’Akt1 était réduite dans
le groupe traitement. Cependant, la différence observée n’était pas significative. Akt2 et 3 ne
semblaient pas affectés dans le groupe traitement par rapport au groupe contrôle
(Figure 3.10.B.1). Nous avons ensuite analysé l’activation de ces isoformes en étudiant leur
phosphorylation grâce à deux anticorps spécifiques dirigés contre pAkt1 (S 473) et pAkt2
 85

(S 474). Nos résultats montrent qu’in vitro, la phosphorylation d’Akt1 et Akt2 était
significativement réduite dans le groupe traitement par rapport au groupe contrôle
(p respectivement =0,0053 et 0,0011) (Figure 3.10.A.2). Cependant, in vivo, comme dans le cas
de l’étude de la quantité de protéines non phosphorylées, aucune différence n’a été observée.
En plus, aucune tendance n’y est observée (Figure 3.10.B.2). Ces résultats mis ensemble
montrent que le VCD affecte aussi bien l’expression protéique que l’activation des isoformes
d’Akt in vitro mais non in vivo. Les résultats in vivo et in vitro étant différents, ils suggèrent que
Akt ne joue pas un rôle prépondérant dans la survenue du VO.

Comme le traitement au VCD est connu pour détruire les follicules primordiaux et
primaires, nous avons analysé l’expression de la caspase-3 clivée pour déterminer le type de
mort cellulaire que le VCD induisait. In vitro, nos résultats montrent une augmentation
significative de l’expression de caspase-3 clivée dans le groupe traitement comparativement au
groupe contrôle (p = 0,0016) (Figure 3.10.A.3). Ce résultat suggère que le VCD induit la mort
par apoptose. In vivo, la caspase-3 clivée, n’a pas été détectée dans les deux groupes
(Figure 3.10.B.3) nous avons donc été dans l’impossibilité de déterminer le type de mort
cellulaire impliqué dans la diminution des follicules dans l’expérience in vivo.
86
 87

Figure 3.10 Effets du 4-vinylcyclohexène diépoxide (VCD) sur l’expression protéique,

l’activation des isoformes d’Akt et sur l’expression de la caspase-3 clivée.
Le VO a été induit par le VCD selon une double approche. In vitro, les souris de
type sauvage C57 BL/6J ont été euthanasiées à l’âge de 28 jours. Puis, leurs ovaires
étaient récupérés pour être traités durant 4 jours avec le VCD (60 µM) versus
contrôle (milieu de culture seul). Dans le volet in vivo, les souris de même âge
ont reçu par injection intrapéritonéale du VCD dilué dans l’huile de sésame
(160 mg/kg/j pendant 15 jours) versus contrôle (huile de sésame seul).
Quarante-deux jours après la dernière injection, les souris ont été euthanasiées,
et leurs ovaires ont été collectés. Les protéines totales des ovaires ont été
 88

analysées par WB. (A.1) Niveau d’expression protéique des isoformes d’Akt
in vitro et (B.1) in vivo. (A.2) Niveau d’activation d’Akt1 et Akt2 par l’étude de
leur phosphorylation respective in vitro et (B.2) in vivo en utilisant des anticorps
spécifiques. (A.3) Niveau d’expression protéique de la caspase-3 clivée in vitro et
(B.3) in vivo. La bêta-actine a été utilisée comme contrôle de charge.
La densitométrie a été utilisée pour la quantification. Les données quantitatives
sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été
utilisé pour la comparaison entre les groupes. *, P < 0,05; **, P < 0,01; n = 3 dans
chaque groupe.

Fort des résultats qui ont montré la réduction in vitro des isoformes d’Akt par les WB
à la suite du traitement avec le VCD, nous avons trouvé opportun de voir l’influence de
cette régulation sur la localisation de chacune de ces isoformes. En effet, nous avons réalisé des
IHC avec des anticorps spécifiques. La réduction de l’expression protéique de toutes les
isoformes d’Akt est confirmée in vitro. Apparemment, il n’y a pas de sélectivité de l’action du
VCD sur les isoformes d’Akt en fonction des compartiments ovariens. Comme dans les WB,
les résultats in vivo ne montrent pas de différence nette entre le groupe qui a reçu le VCD et le
groupe contrôle (Figure 3.11).
 89

Figure 3.11 Localisation et intensité des isoformes d’Akt à la suite du traitement

avec le VCD.
La régulation de la localisation et de l’intensité des isoformes d’Akt ont été
analysées dans l’ovaire après administration du VCD chez les souris C57 BL/6J
de type sauvage âgées de 28 jours. Les ovaires ont été enrobés dans la paraffine,
puis sectionnés en des coupes de 5 µm pour l’analyse de l’expression des
isoformes d’Akt par IHC (n = 3 pour chaque groupe).
(A) in vitro, les ovaires ont été cultivés pendant 4 jours de traitement avec
60 µM de VCD par rapport au groupe contrôle sans traitement : il y a une
réduction de l’intensité de toutes les isoformes d’Akt dans le groupe de traitement
comparativement au groupe contrôle. Aucun compartiment ovarien n’est
spécifiquement visé. (B) in vivo, les souris ont reçu en intrapéritonéale pendant
15 jours le VCD versus huile de sésame dans le groupe contrôle, puis les ovaires
ont été récupérés 42 jours après le traitement : il n’y a pas de différence nette entre
les deux groupes. CJ : corps jaune, F : follicule, S : stroma.

3.12 Régulation de l’expression des ARNm des isoformes d’Akt par le VCD

Nous avons évalué l’expression relative des ARNm des isoformes d’Akt dans nos modèles
in vitro et in vivo. Il en ressort qu’en comparaison au groupe contrôle, in vitro, il y avait
diminution de l’expression relative des ARNm pour Akt1 et Akt3. Le seuil de significativité
n’est atteint que pour Akt1 (p = 0,0042) (Figure 3.12.A). Cependant, in vivo, comme dans le cas
des protéines, aucun résultat n’est significatif (Figure 3.12.B). Mis ensemble, les résultats
 90

obtenus in vitro, suggèrent que le VCD régulerait les isoformes d’Akt d’une manière sélective
au niveau transcriptionnel et non au niveau protéique.

Figure 3.12 Régulation de l’expression des ARNm des isoformes d’Akt par le
4-vinylcyclohexène diépoxide (VCD).
Le VO a été induit par le VCD selon une double approche. In vitro, les souris
C57 BL/6J de type sauvage ont été euthanasiées à l’âge de 28 jours. Leurs ovaires
ont été récupérés pour être traités durant 4 jours avec le VCD bb (60 µM) versus
contrôle (milieu de culture seul). Dans le volet in vivo, les souris de même âge
ont reçu par injection intrapéritonéale du VCD dilué dans l’huile de sésame
(160 mg/kg/j pendant 15 jours) versus contrôle (huile de sésame seul).
Quarante-deux jours après la dernière injection, les souris ont été euthanasiées.
Les ovaires ont été collectés, et l’ARN a été extrait. (A) Les RT-qPCR pour
l’analyse des transcrits des isoformes d’Akt ont été réalisés in vitro et (B) in vivo.
La bêta-actine a été utilisée comme gène de référence, et les échantillons ont été
réalisés en duplicata. Les données quantitatives sont exprimées sous forme de
moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison entre
les groupes. *, P < 0,05; **, P < 0,01; n = 3 dans chaque groupe.
 91

3.13 Impact du VCD sur l’expression d’Akt total, sur l’expression et la phosphorylation
des cibles d’Akt

Nous avons investigué également l’impact du traitement avec le VCD sur l’expression
d’Akt total et la phosphorylation de certaines cibles moléculaires d’Akt actuellement reconnues
comme impliquées dans différents processus biologiques du VO. Ainsi, nous avons réalisé des
WB pour étudier Akt total, l’expression protéique et la phosphorylation de certaines de ses
cibles, notamment Bad, Foxo3a, GSK3β et mTOR. Le niveau protéique d’Akt total était
fortement réduit par le VCD in vitro. En revanche, in vivo, ce niveau n’était pas influencé.
Le VCD avait induit la réduction drastique significative de l’expression et de la phosphorylation
de toutes ses cibles précédemment citées in vitro (Figure 3.13A) (p = 0,01; 0,0001; 0,0013;
0,0004 respectivement pour Bad, Foxo3a, GSK3β et mTOR) et (p = 0,02; 0,0002; 0,0018; 0,036
respectivement pour Bad, Foxo3a, GSK3β et mTOR). Comme nous pouvions nous y attendre
étant donné les résultats obtenus pour Akt et Caspase 3 clivé, in vivo, ces réductions des
différents acteurs pro-apoptotiques n’ont pas été observés.
92
 93

Figure 3.13 Le 4-vinylcyclohexène diépoxyde (VCD) induit la réduction d’expression

d’Akt total, de l’expression et de l’inactivation de ses cibles.
À l’issue du traitement, les ovaires ont été récupérés, et la protéine totale a été
extraite pour réaliser des WB en utilisant les anticorps spécifiques pour Akt total
et la forme phosphorylée et non phosphorylée de chacune de ses cibles étudiées
(Bad, Fox03a, GSK3β et mTOR). La bêta-actine a été utilisée comme contrôle de
charge, et chaque expérience a été répétée au moins trois fois. Les résultats
montrent que l’expression d’Akt total, l’expression et la phosphorylation de ses
cibles sont sensiblement réduites spécialement in vitro.
(A) in vitro, les ovaires des souris âgées de 28 jours ont été cultivés pendant
4 jours de traitement avec 60 µM de VCD par rapport au groupe contrôle sans
traitement. (B) in vivo, les ovaires de souris âgées de 28 jours ont été recueillis
42 jours après la dernière dose d’administration intrapéritonéale de VCD
(160 mg/kg/j) pendant 15 jours. La densitométrie a été utilisée pour la
quantification. Les données quantitatives sont exprimées sous forme de moyenne
± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour la comparaison entre les
groupes. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; n = 3 dans chaque groupe.
 CHAPITRE IV

DISCUSSION

La voie de signalisation PI3K/Akt est reconnue pour jouer un rôle crucial au sein de
l’ovaire dans les divers processus biologiques qui s’y produisent. Elle joue aussi des rôles dans
le développement de pathologies comme relevé dans notre introduction (42, 60, 110).
Akt représente une des protéines centrales dans cette voie de signalisation cellulaire. La famille
Akt est composée de trois isoformes, et les rôles de chacune d’elles n’ont pas encore été
totalement élucidés, particulièrement dans l’ovaire. L’étude des trois isoformes d’Akt a
constitué la base des travaux qui font l’objet de cette thèse. En effet, dans un premier temps,
par l’utilisation de différentes techniques et modèles expérimentaux, nous avons caractérisé la
régulation de l’expression, de la localisation et de l’activation des différentes isoformes d’Akt
au travers du cycle œstral chez la souris. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la
régulation de ces isoformes par les stéroïdes ovariens au sein des cellules de la granulosa.
Puis, dans un troisième temps, nous avons étudié les rôles spécifiques d’Akt3 dans la RO,
la dynamique folliculaire et l’ovulation. Enfin, nous avons analysé l’importance des isoformes
d’Akt au cours du VO induit par le VCD.

4.1 Les isoformes d’Akt sont différemment exprimées dans les compartiments et
structures ovariens

L’ovaire, avec ses fonctions complexes, possède deux compartiments qui possèdent des
fonctions particulières : le parenchyme ovarien, qui contient les follicules et les corps jaunes;
et le stroma, considéré généralement comme un tissu de soutien (6). Le parenchyme participe à
la sécrétion des hormones et à la libération cyclique de l’ovule mature. Des études antérieures se
sont penchées à investiguer l’expression d’Akt dans l’ovaire chez la plupart d’espèces (48, 54,
128, 129). Cependant, ces études ont analysé Akt de façon générale. Dans notre étude,
nous avons analysé l’expression des différentes isoformes d’Akt de façon indépendante.
L’expression différentielle des isoformes d’Akt dans les différents compartiments ovariens nous
 95

parait claire. Nos résultats montrent ainsi une compartimentalisation des isoformes d’Akt dans
l’ovaire. En effet, nous avons détecté l’expression des 3 isoformes d’Akt au niveau du
parenchyme et celle d’Akt1 et 2 au niveau du stroma. Cette compartimentalisation suggère des
rôles particuliers ou redondants des isoformes d’Akt selon qu’elles sont exprimées
concomitamment ou pas. Au niveau du stroma, nos résultats suggèrent essentiellement des rôles
pour les isoformes 1 et 2. En effet, en dehors du rôle de tissu de soutien, le stroma ovarien
contient différents types cellulaires comme les fibroblastes et les cellules immunitaires.
Les cellules immunitaires jouent divers rôles lors de l’ovulation en dehors de leurs rôles de
défense, car une augmentation du nombre de cellules immunitaires s’opère autour de l’ovulation
(6). La présence d’Akt1 et 2 dans le stroma leur suggère des rôles au sein de ces cellules,
particulièrement dans les processus inflammatoire et protéolytique qui se déroulent lors de
l’ovulation. Au niveau des follicules, qui représentent les unités fonctionnelles de l’ovaire,
ou des corps jaunes, les trois isoformes d’Akt ont certainement des rôles à jouer. En effet,
les follicules (cellules de la granulosa et de la thèque) et les corps jaunes sont des structures qui
synthétisent des hormones, soit des stéroïdes ovariens. Ces hormones sont cruciales pour le
développement des follicules, des corps jaunes et pour la reproduction féminine. L’implication
de ces hormones dans diverses maladies est pleinement établie (130). Les cellules de la thèque
produisent principalement les androgènes. Ces derniers sont aromatisés en œstrogènes dans les
cellules de la granulosa. Le corps jaune, quant à lui, produit en prépondérance de la progestérone.
Les études établissent l’implication d’Akt dans la prolifération des cellules de la granulosa, dans
l’augmentation de la taille de l’ovocyte et dans la synthèse des stéroïdes ovariens.
Par conséquent, les isoformes d’Akt sont impliquées dans les fonctions dévolues aux structures
du parenchyme ovarien (4, 5). En effet, Chen et al. ont montré dans une étude in vitro avec les
cellules de la granulosa bovine que l’activation d’Akt par le brain-derived neurotrophic factor
(BDNF) jouait un rôle dans l’initiation de la synthèse de la progestérone, outre ses effets connus
sur la prolifération (131). Dans cette même étude, les résultats montrent que l’activation d’Akt
n’affecte pas la synthèse d’E2. Cependant, une autre étude réalisée également in vitro par Li
et al., mais avec les cellules de la granulosa porcine, a montré que l’activation d’Akt par un
flavonoïde abondamment retrouvé dans les fruits, l’isorhamnetine, entrainait une augmentation
de la biosynthèse d’E2 (132). En ce qui concerne les androgènes, Ortega et al. (133) ont montré,
dans une étude in vitro avec les cellules de la thèque des rats, que le resvératrol entrainait la
 96

réduction de la synthèse des androgènes. Cette action de resvératrol passe par l’inhibition d’Akt.
Ces résultats montrent l’importance d’Akt dans ses actions au niveau ovarien, et poussent
davantage à investiguer les mécanismes associés à ce pléomorphisme d’effets d’Akt.
Les trois isoformes d’Akt sont exprimées dans les follicules de toutes les catégories. Au sein du
follicule, les trois isoformes d’Akt sont présentes au niveau de la granulosa et dans l’ovocyte.
Akt3 est l’isoforme la plus faiblement exprimée dans ces cellules. Seulement Akt1 et 2 sont
présentes au niveau de la thèque. Nos résultats suggèrent ainsi l’implication des trois isoformes
d’Akt dans la synthèse des œstrogènes, dans le développement folliculaire et la croissance
ovocytaire, vu leur présence dans les cellules de la granulosa et l’ovocyte. Quant à la synthèse
des androgènes, nos résultats suggèrent l’implication d’Akt1 et 2 seulement. Nos résultats
concernant Akt3 sont en accord avec les conclusions de différentes études réalisées
antérieurement par d’autres chercheurs (118, 126). En effet, Tschopp et al. ont observé que chez
la souris, Akt3 était faiblement exprimé dans certains organes, dont l’ovaire (76). En plus de son
usuel faible niveau d’expression décrit plus haut, nos résultats montrent qu’Akt3 est absent
en D dans les cellules de la granulosa des follicules primordiaux, primaires et secondaires.
Cette absence d’Akt3 dans les petits follicules nous semble en lien avec une éventuelle
régulation d’Akt3 par la progestérone qui est l’hormone prépondérante en D. En effet,
selon certains chercheurs, l’expression des récepteurs à la progestérone (PR), surtout PR A,
dans ces catégories de follicules est controversée (134). De ce fait, notre hypothèse est la
suivante : comme la progestérone n’agit pas sur les petits follicules, ceci peut conduire à la chute
d’expression d’Akt3. En ce qui concerne l’expression d’Akt au niveau du corps jaune,
nos résultats ont montré la présence des trois isoformes d’Akt dans cette structure.
Chez l’humain également, Akt est présent dans les corps jaunes. En effet, Goto et al. ont observé
l’expression d’Akt dans les cellules de la granulosa lutéinisées (129). La présence d’Akt dans
les corps jaunes ne parait cependant pas un phénomène ubiquitaire. En effet, une étude réalisée
par Meng et al. avec le porc montre l’absence d’Akt dans les corps jaunes (128). En comparaison
avec nos résultats, cette absence d’expression d’Akt au niveau du corps jaune dans cette étude
de Meng et al. pousserait à investiguer de façon plus approfondie la spécificité d’expression
d’Akt selon les espèces. Pris ensemble, nos résultats appuient également la notion de la variation
de l’abondance et de la spécificité d’expression d’Akt selon le type cellulaire comme publié
précédemment (76, 78, 79).
 97

Toutefois, bien qu’étant issus des études observationnelles, nos résultats suggèrent un lien
entre les isoformes d’Akt et les fonctions dévolues aux différents compartiments et structures
ovariens. Pour Akt3, certains rôles émergent comme nous avons montré dans nos résultats,
et nous allons le discuter plus loin. Les liens suggérés par nos résultats entre les fonctions des
isoformes d’Akt dans ces différents compartiments et structures ovariens doivent être confirmés
par des études plus approfondies. Il sera ainsi possible de disséquer les rôles de chaque isoforme
dans ces différents processus. Une meilleure compréhension des fonctions des isoformes d’Akt
permettrait d’envisager des avenues thérapeutiques intéressantes. Celles-ci concerneront des
pathologies qui impliquent la perturbation des différents stéroïdes ovariens comme développés
en introduction, par exemple dans les cas du SOPK, d’IOP et d’endométriose.
Plus spécifiquement, il devient nécessaire d’étudier les rôles des trois isoformes d’Akt dans les
cellules de la granulosa, le corps jaune, et des isoformes 1 et 2 dans la thèque et aussi dans le
stroma. En développant de nouveaux modèles d’étude, soit des KO conditionnel ou de
Knock-down en usant des technologies existantes comme celle de l’ARN interférant, il sera
possible de disséquer les rôles spécifiques de chaque isoforme et aussi de mieux comprendre
leurs fonctions redondantes ou uniques. Avec de tels modèles qui permettent d’inhiber les
isoformes d’Akt de façon contrôlée, il sera possible d’étudier entre autres l’effet de leur activation
sur la production de différents stéroïdes. Étant donné certaines différences observées selon les
espèces animales utilisées, il faudra répéter les expériences dans différentes espèces avec les
mêmes modèles. Ce qui permettra d’étudier la spécificité d’expression et des voies de
signalisation cellulaire liées aux espèces pour certaines protéines comme Akt, ou pour leurs
isoformes. De tels modèles permettront également l’étude de l’effet compensatoire de chaque
isoforme d’Akt en l’absence de ses autres isoformes.

4.2 La localisation, l’intensité et l’activation des isoformes d’Akt varient de manière

isoforme-spécifique au cours du cycle œstral

Plusieurs études ont montré que les isoformes d’Akt ont des localisations cellulaires
spécifiques. De plus, il est aussi reconnu que cette localisation d’Akt varie en fonction de leur
activation pour affecter des cibles bien déterminées (65, 125). En effet, Santi et al. ont trouvé,
dans plusieurs lignées de cellules cancéreuses et de cellules non cancéreuses du sein et du col
 98

utérin, qu’Akt1 et 2 étaient principalement localisés de façon diffuse dans le cytoplasme.

Akt2 montrait en plus une localisation périnucléaire. Akt3 avait une localisation principalement
nucléaire (125). Cependant, dans cette même étude, les chercheurs ont montré que dans les
cellules embryonnaires rénales (HEK-293), Akt1 était localisé dans toute la cellule (cytoplasme
et noyau), alors qu’Akt2 et 3 étaient principalement nucléaires. Nos résultats sont en accord avec
ces observations. Nos résultats révèlent en plus des variations de localisations des isoformes
d’Akt au sein d’un même type cellulaire tout au long du cycle œstral, avec parfois des spécificités
et des similarités. En effet, dans les cellules de la granulosa par exemple, Akt1 gardait une
localisation nucléaire et cytoplasmique tout le long du cycle œstral. Tandis qu’Akt2,
qui en P montrait une localisation cytoplasmique basale et quelque peu membranaire, présentait
une localisation cytoplasmique et périnucléaire dans les autres phases du cycle. Akt3, quant à
lui, démontrait une localisation cytoplasmique dans 3 phases du cycle, et une expression
cytoplasmique et nucléaire en E dans certains ilots des cellules. Ces différentes localisations des
isoformes d’Akt sont probablement liées aux variations hormonales spécifiques à chaque phase
du cycle œstral. En effet, Kayisli et al. (135) ont démontré aussi bien in vitro qu’in vivo que l’E2
augmentait la fraction nucléaire de phospho-Akt dans les cellules endométriales humaines.
Une observation similaire de l’effet d’E2 sur la localisation nucléaire d’Akt a été faite in vivo sur
les cardiomyocytes humains et murins par Camper-Kirby et al. (136). Il est connu que les
hormones FSH, E2 et LH sont capables d’induire l’activation d’Akt; ce qui résulte en la
translocation nucléaire d’Akt (91, 114, 137). Au regard de ces résultats, dans l’ovaire,
la localisation nucléaire d’Akt notamment en P pourrait être liée à son activation par des
hormones qui agissent durant cette phase, soit l’E2, la FSH. En E, le pic de LH pourrait jouer
également un rôle sur la localisation d’Akt. Les différences dans la localisation cellulaire des
isoformes d’Akt sont certainement importantes quant à leur spécificité fonctionnelle. En effet,
comme relevé en introduction, la localisation d’une protéine joue un rôle important dans sa
fonction (65). Il est clair que ces changements de localisation, notamment pour Akt2 et 3,
leur confèrent des rôles variés au travers du cycle œstral. En ce qui concerne Akt1, sa double
localisation à travers tout le cycle œstral indique qu’il joue un rôle dans la signalisation au niveau
du cytoplasme et du noyau au cours du cycle œstral. Cependant, en raison des modifications
hormonales qui ont lieu au cours du cycle œstral, les fonctions qu’Akt2 joue au niveau du
cytoplasme et au niveau du noyau peuvent varier.
 99

Nos études biochimiques ont montré que l’expression des isoformes d’Akt varie au cours
du cycle œstral. Akt1 et 3 avaient le même patron de variation d’intensité tout au long du cycle
œstral, bien que le résultat ne fût significatif que pour Akt3. En effet, Akt1 et 3 montraient une
expression plus élevée en P et E comparativement en M et D. Leur pic d’expression était observé
en E. Akt2 montrait une expression forte en P et E, puis celle-ci décroissait en M avant de
remonter significativement en D. Plus intéressant encore, les niveaux d’activation d’Akt1 et
Akt2 étaient également différents le long du cycle œstral. En effet, Akt1 était plus phosphorylé
en P, atteignait le pic en E comparativement en M et D bien que ces différences n’étaient pas
significatives. Pour Akt2, son niveau d’activation élevée était observé en E et D; de faibles
variations d’activation étaient observées entre les autres phases du cycle œstral. Comme dans le
cas de la localisation cellulaire, nos résultats concernant l’expression et l’activation des
isoformes d’Akt laissent suggérer que dans chaque phase du cycle, elles jouent des rôles
particuliers. Elles régulent ainsi de façon spécifique différents événements cellulaires.
Les isoformes d’Akt ne montrent pas toujours la même coordination entre leur expression et
activation dans les différentes phases du cycle œstral, notamment pour Akt2. Comme mentionné
précédemment, des hormones peuvent activer ou inhiber Akt, et de ce fait, modifier leur niveau
d’activation, de localisation et/ou d’expression. Par exemple, en P et E, avec l’action de la FSH
et de l’E2, Akt est phosphorylé, et de ce fait activé. Une fois activé, Akt migre dans le noyau et
induit la prolifération des cellules de la granulosa ainsi que la synthèse hormonale (114).
En E, l’effet bien connu du pic de LH sur l’activation d’Akt vient s’ajouter à ceux de
deux précédentes hormones (137). Ce qui corrobore les résultats sur la localisation nucléaire
d’Akt1 en P et E, d’Akt3 ainsi que la localisation périnucléaire d’Akt2 en E. En M et D, avec la
décroissance des œstrogènes, le niveau de phosphorylation d’Akt diminue aussi. Malgré cette
baisse de phosphorylation, Akt1 et 2 conservent leur patron de localisation. Ce qui peut
s’expliquer par le fait que ces baisses de niveau de phosphorylation d’Akt ne sont pas
significatives pour induire des modifications détectables. Cependant, ces modifications, quoique
faibles, ont probablement de conséquences fonctionnelles. Dans ces deux phases du cycle œstral
(M et D), Akt3 a essentiellement une localisation cytoplasmique probablement suite à la baisse
de phosphorylation. La différence de coordination entre le niveau d’expression et de
phosphorylation d’Akt a également été observée par d’autres auteurs sur différentes lignées
cellulaires, dont certaines étaient ovariennes (138). En effet, Wang et al. dans leur étude sur
 100

certaines lignées cellulaires ovariennes avaient observé que le niveau d’expression d’Akt2 y était
élevé, tandis que celui de sa phosphorylation était faible (138). Ces chercheurs ont suggéré
plusieurs mécanismes qui peuvent expliquer cette discordance entre l’expression et l’activation
d’une protéine. Par exemple, l’activité des kinases en amont de cette protéine pourrait entrainer
son expression à un certain moment dans la cellule et sa phosphorylation pourrait avoir lieu dans
un second temps. À la suite de sa phosphorylation, de sa translocation pour jouer son rôle au
niveau de substrats spécifiques, les phosphatases procèdent à la déphosphorylation de la
protéine. En ce qui concerne les isoformes d’Akt, la spécificité de la fonction peut, en effet,
être en partie sous le contrôle des phosphatases. Puisque la déphosphorylation d’Akt2 et 3
apparait être réalisée par PHLPP1, tandis que celle d’Akt1 et 3, par PHLPP2. Pour ce qui est de
la spécificité de substrats, certaines protéines comme AS160 et myosine 5a sont
préférentiellement régulées par Akt2 dans les adipocytes (139). Ces mécanismes doivent être
étudiés afin de comprendre le lien entre la présence de différentes hormones (androgènes,
œstrogènes et progestérone) et l’activité des isoformes d’Akt. La compréhension de ce lien
pourra mettre en lumière des actions sélectives des différentes hormones dans les phases du
cycle œstral. D’une meilleure compréhension de la relation entre les différentes hormones,
l’activité des isoformes d’Akt et une connaissance de leurs cibles, il pourrait être possible
d’établir des cibles thérapeutiques spécifiques. Par exemple, pour certaines maladies où ces
hormones sont perturbées comme dans le SOPK qui est caractérisé par une augmentation de
pulses de LH et l’hyperandrogénie, il serait possible d’identifier les isoformes d’Akt impliquées
et de proposer une thérapie ciblée (110). Les résultats concernant l’action de ces hormones,
notamment des stéroïdes ovariens, sur l’expression et l’activation des isoformes d’Akt dans un
modèle moins complexe de culture cellulaire sont discutés dans un autre point plus loin.

Au-delà des spécificités fonctionnelles, la similarité du patron d’expression d’Akt1 et 3

durant le cycle œstral, et celle de l’activation d’Akt1 et 2 en E supportent l’hypothèse de leurs
redondances fonctionnelles. Or, l’expression et l’activation des isoformes d’Akt sont en lien
avec les différents événements cellulaires et biologiques au sein de l’ovaire. Ainsi, en se basant
sur nos résultats qui concernent ces aspects, nous pouvons suggérer que les rôles d’Akt1 et 3 dans
la survie, la prolifération, la croissance et la différenciation des cellules folliculaires soient plus
investigués. L’accroissement du niveau d’expression de ces trois isoformes, et surtout
 101

l’accroissement de l’activation d’Akt1 et 2 en E suggèrent que leur participation est requise dans
l’ovulation et la formation du corps jaune. L’activation d’Akt2 en D plaiderait en faveur de son
rôle métabolique et dans la différenciation cellulaire, nécessaires dans le fonctionnement et le
maintien du corps jaune.

Nous avons trouvé utile, avant de clore ce point, de relever le fait que les phases du cycle
œstral se déroulent dans un temps court (5 jours). Cela entraine parfois des intrications entre
certaines phases au cours d’un même jour. Ce fait peut rendre complexe l’interprétation de
certains résultats comme les variations des niveaux d’expression ou d’activation entre les
différentes phases. En effet, ces variations parfois petites d’une phase à l’autre sur le plan de la
quantification, peuvent ne pas correspondre à un impact fonctionnel réel. En plus, ces variations
peuvent être différentes selon les stades folliculaires. Dans la dynamique folliculaire, comme
expliquée dans l’introduction, Akt joue un rôle dans toutes les étapes (de l’activation de la
folliculogenèse jusqu’à l’ovulation et la formation du corps jaune). Ainsi, la détermination des
variations des niveaux d’expression, d’activation, et de la fonction des isoformes d’Akt dans les
différents stades folliculaires devrait être étudié. Ce qui permettrait de déterminer une piste
intéressante pour voir à quels stades une isoforme est importante pour la dynamique folliculaire,
la différenciation des cellules de la granulosa et la synthèse hormonale. Une telle étude
nécessiterait des modèles de culture de follicules entiers qui sont disponibles, bien que
complexes (140). En effet, l’âge de l’animal donneur, le stade du follicule à étudier,
la composition du milieu ainsi que les objectifs à atteindre sont des paramètres à prendre en
compte dans le développement d’un tel modèle (140).

4.3 La déficience d’Akt3 impacte la réserve ovarienne et la dynamique folliculaire

Akt3 est l’isoforme la moins exprimée dans plusieurs organes et de ce fait, le plus souvent
la moins étudiée comme nous l’avons mentionné ci-dessus. Les données établissent qu’Akt en
général est impliqué dans la folliculogenèse. Ces études établissent aussi les rôles spécifiques
d’Akt1 et d’Akt2 au niveau de l’ovaire en particulier, et de la reproduction en général. En effet,
comme mentionné en introduction, l’élimination d’Akt1 entraine, entre autres, une diminution
des follicules primordiaux et une subfertilité (118). L’élimination d’Akt2 résulte en une
 102

apparition de kystes ovariens sévères chez les souris âgées, et en une augmentation de la sévérité
de la formation du SOPK chez les souris jeunes (141). Les données issues de doubles KO des
isoformes d’Akt, dont les souris sont viables comme le double KO d’Akt2 et 3 révèlent un
impact sur les ovaires. En effet, les souris déficientes concomitamment en Akt2 et 3 présentent
une réduction de la taille de l’ovaire et de la taille de leur portée (79). De plus en plus,
dans l’ovaire certains rôles pour Akt3 émergent. En effet, il a été observé qu’Akt3 joue un rôle
dans la progression du cancer ovarien (81) comme nous l’avons relevé plus haut dans cette thèse.
Dans le cancer, l’ovaire augmente de volume, devient hypervascularisé; sa surface devient
irrégulière à cause de multiples excroissances dues à une multiplication désordonnée de cellules
cancéreuses. Akt3 inhiberait l’expansion du cancer ovarien (81). L’utilisation des souris Akt3
déficientes (Akt3-/-) nous a permis de montrer, qu’à l’âge de 45 jours, la RO est significativement
diminuée chez les souris Akt3-/- comparativement aux souris de type sauvage. Nous avons
observé également une augmentation significative des follicules secondaires chez les souris
Akt3-/-. Ceci expliquerait l’effet corollaire que la délétion d’Akt3 conduise à l’activation de la
croissance folliculaire, et ainsi à la réduction de la RO et l’augmentation du nombre de follicules
secondaires. Cependant, chez les souris âgées de 100 jours, ces différences n’étaient plus
significatives bien que les mêmes tendances étaient conservées. Ceci pourrait s’expliquer par le
fait que dans les ovaires de ces souris Akt3-/- plusieurs follicules primaires sont entrés en
croissance et que la RO n’en produit plus assez; ou par le fait que cette action d’Akt3 s’estompe
progressivement avec l’augmentation de l’âge. Ces résultats suggèrent qu’Akt3 exercerait un
frein à la croissance folliculaire du pool de la réserve vers le stade avancé. L’action de frein sur
la croissance folliculaire que nous attribuons à Akt3 au sein de l’ovaire ne serait pas isolée ou
limitée à la folliculogenèse. En effet, dans une étude in vivo sur les souris, Linnerth et al. (81)
avaient démontré que l’inhibition d’Akt3 résultait en une augmentation de la croissance du
cancer ovarien. Cette observation révèle ainsi qu’Akt3 exercerait une inhibition de la croissance
des cellules tumorales. Ces différents résultats révèlent que malgré sa faible expression dans
l’ovaire et probablement dans d’autres organes, Akt3 joue d’importants rôles physiologiques et
serait impliqué dans le développement des pathologies. Plusieurs autres études sont nécessaires
pour améliorer notre compréhension sur les mécanismes par lesquels Akt3 agit dans ces
processus. En effet, notre étude étant de nature descriptive, corrélative et non causative, appelle
à des études complémentaires, notamment des études de surexpression d’Akt3 dans l’ovaire afin
 103

d’observer le phénotype qui en découlerait. Nonobstant cette observation de limitation,

cela n’altère pas à nos yeux les conclusions de la présente étude qui vient ressortir un rôle
potentiel d’Akt3.

4.4 L’effet de la déficience d’Akt3 sur l’ovulation

Le développement folliculaire a pour finalité d’aboutir à une ovulation. Après celle-ci,

la formation du corps jaune est mise en place et en constitue le témoin. Ce corps jaune est un
organe important pour le développement d’une éventuelle grossesse, étant donné sa fonction
endocrine avec la sécrétion de la progestérone (hormone nécessaire au maintien de la grossesse)
(42, 142). Nous avons trouvé que les souris Akt3 -/- présentaient une réduction significative du
nombre de corps jaune comparativement aux souris de type sauvage particulièrement en
M et D. Ces résultats laissent suggérer un possible rôle d’Akt3 dans l’ovulation et la formation
du corps jaune. En effet, la perturbation de l’ovulation résulte en une diminution du processus
de la formation du corps jaune dans certains modèles animaux comme celui déficient en Nuclear
receptor subfamily 5 group A member 2 (NR5A2) (42). Comme relevé plus haut dans la section
résultats, le nombre des souriceaux est également réduit chez les souris Akt3-/- comparativement
aux souris de type sauvage. Bien que ce résultat était non significatif, cette tendance supporte
notre interprétation de l’impact d’Akt3 sur l’ovulation. En effet, il est connu dans la littérature
que le nombre de souriceaux dans une portée est en corrélation avec le nombre de follicules qui
ont ovulé. Ainsi, toute anomalie d’ovulation aboutit à une subfertilité ou à une infertilité comme
en cas du SOPK (110). La non-significativité des différences des corps jaunes en P et en E
nous semble s’explique par le fait que les corps jaunes sont des structures qui involuent avec le
temps. Comme le P et l’E sont des phases éloignées de l’ovulation, et au fur et à mesure des
cycles, les corps jaunes régressent et disparaissent. Ainsi, les différences entre les deux groupes
peuvent s’atténuer. Elle peut également s’expliquer par la petite taille de notre échantillon qui
n’a pas pu ressortir la significativité de ces différences.

En mettant en perspective ce résultat sur l’ovulation et le nombre des corps jaunes avec ceux
de la RO et du nombre de follicules, une contradiction apparente peut sembler s’observer.
En effet, la logique aurait voulu que l’augmentation du nombre de follicules secondaires résultât
 104

conséquemment en une augmentation du nombre de corps jaunes. En réalité, cette corrélation

n’est pas aussi directe et simple tel que relevé dans une revue de la littérature publiée par Gershon
et Dekel (143). En effet, certains chercheurs ont observé l’absence d’ovulation chez certaines
femmes infertiles malgré une folliculogénèse normale (144). Quoique la folliculogénèse
ait pour finalité l’obtention d’un follicule mature prompt à ovuler, les mécanismes hormonaux
et moléculaires qui régulent la folliculogénèse et l’ovulation sont différents (143).
Comme développé dans la partie introductive de cette thèse, la folliculogenèse implique des
hormones comme la FSH, les œstrogènes qui réalisent leur signalisation cellulaire par des voies
moléculaires appropriées (114). Puis, l’ovulation et la formation des corps jaunes sont
consécutives au pic de LH (137). Cette disparité entre la dynamique folliculaire et l’ovulation
ainsi que la formation du corps jaune est aussi remarquable et frappante en clinique, notamment
comme on le note en cas du SOPK. Dans cette pathologie des follicules dont la maturation est
bloquée au stade antral s’accumulent anormalement. Ce dysfonctionnement aboutit ainsi à des
anovulations chroniques (60). Le LUF syndrome (Luteinized unruptered follicle) ou le syndrome
du follicule lutéinisé non rompu est une autre pathologie anovulatoire qui montre cette
disparité. Celle-ci fait voir l’implication particulière au niveau de l’ovulation des protéines
comme la cyclooxygénase 2 et le granulocyte colony-stimulating factor 3 (144). Dans cette
pathologie, même si le follicule est arrivé au stade mature, l’ovulation ne se produit pas.
Le follicule s’accroît excessivement, ce qui va aboutir à l’infertilité si le phénomène est répétitif
à travers des cycles menstruels (145). Ce qui est intéressant est que les molécules aussi bien
centrales que locales incriminées dans la survenue de ces pathologies anovulatoires comme la
LH, les œstrogènes, les androgènes, ou des prostaglandines ont un lien avec la voie de
signalisation d’Akt comme décrit en introduction.

4.5 La déficience en Akt3 entraine la diminution du volume ovarien

Des études antérieures déterminent le rôle d’Akt3 dans la régulation du volume du

-/-
cerveau. En effet, Tschopp et al. (76) ont rapporté que les souris Akt3 présentaient une
réduction de la taille du cerveau. Dans notre étude, nous avons observé que les souris Akt3-/-
présentent une réduction significative du volume ovarien tout le long du cycle œstral.
Cette observation révèle l’implication d’Akt3 dans la régulation du volume ovarien.
 105

En plus, avec les données de l’étude de Tschopp et al., elle suggère que cette fonction d’Akt3
peut concerner d’autres organes. Pour l’ovaire, certaines données de la littérature appuient cette
observation de l’implication de la voie PI3K/Akt dans la régulation de la taille de l’ovaire.
Une fois de plus, ces données de la littérature restent d’ordre général. En effet, Zhao et al.
(146) ont rapporté sur le rat, dans un modèle in vivo du SOPK, la réduction du volume ovarien
induit par Heqi san, un médicament traditionnel chinois ainsi que par la metformine,
un antidiabétique oral. Ils ont démontré que cette réduction du volume ovarien passait par la voie
PI3K/Akt, notamment en altérant l’activation ou l’expression de diverses protéines comme Akt,
GSK3β et PTEN. Notre étude vient dévoiler l’implication spécifique d’Akt3 dans la régulation
du volume ovarien dans le contexte physiologique. Ce rôle parait redondant avec celui que joue
Akt2 comme nous l’avons relevé dans le point précédent avec l’étude sur les souris double KO
d’Akt2 et [Link] étude ouvre en même temps un questionnement sur l’effet réel du KO d’Akt2
sur le volume ovarien, et elle pousse comme nous le suggérons dans les perspectives à étudier
cette question. Notre observation pousse à investiguer davantage le rôle d’Akt3 dans divers
contextes pathologiques où le volume ovarien est perturbé comme en cas du SOPK. En plus,
la réduction du volume ovarien induite par Akt3 peut être mise sous le compte du processus du
VO. En effet, en mettant en perspective l’impact de l’élimination d’Akt3 sur la RO et le volume
ovarien qui sont de marqueurs du VO, nous pouvons en comprendre le lien. Car, il est établi
qu’avec la perte folliculaire et la survenue du VO, le volume ovarien aussi diminue (28,29).

4.6 Les isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa ovarienne et leur régulation par
les stéroïdes ovariens

Les cellules de la granulosa sont très importantes pour le destin folliculaire.

Leur participation dans la physiologie de la RO et la dynamique folliculaire nécessite la
participation de plusieurs voies de signalisation cellulaire, dont celle d’Akt. Cette dernière en
occupe un rôle principal (8, 145). Ces cellules de la granulosa constituent une cible privilégiée
de plusieurs substances endogènes et exogènes qui ont un impact sur la RO et la dynamique
folliculaire et par le fait même, sur la fertilité féminine (8). Parmi les substances qui agissent sur
les cellules de la granulosa, les androgènes et les œstrogènes sont abondamment utilisés dans la
thérapeutique, mais leurs effets sur les isoformes d’Akt ne sont pas clairement connus.
 106

En revanche, il est établi que les isoformes d’Akt peuvent jouer des rôles spécifiques,
voire opposés. Les effets de ces divers traitements se manifestent sur diverses voies de
signalisation. Ainsi, nous avons étudié l’influence des deux stéroïdes ovariens sur les isoformes
d’Akt in vitro en utilisant les cellules de la granulosa. Les résultats issus de ces expériences ont
montré d’abord que les isoformes d’Akt sont différemment exprimées et localisées au sein des
cellules de la granulosa ovarienne. Chaque isoforme possède une localisation spécifique en plus
de certaines similarités. En effet, Akt1 a montré une nette double localisation nucléaire et
cytoplasmique tandis qu’Akt2 une localisation plus cytoplasmique; pour Akt3, la localisation est
en prédominance cytoplasmique, et quelque peu nucléaire. Ces différentes localisations des
isoformes d’Akt sont en accord avec le fait que les isoformes d’Akt jouent des rôles spécifiques
et aussi redondants. Il est établi que la localisation d’une protéine favorise l’accès à des cibles et
détermine ainsi son action au sein de la cellule comme nous l’avons discuté précédemment.
Nos résultats montrent qu’Akt3 est l’isoforme la moins exprimée au sein des cellules de la
granulosa comme précédemment relevé dans l’ovaire entier dans notre étude in vivo et par
d’autres chercheurs (126, 147,148). Concernant la localisation de ces isoformes, les résultats
in vitro sont en majeure partie en accord avec les constatations de ceux rapportés précédemment
in vivo dans notre thèse. Les petites différences notamment concernant la localisation d’Akt2
nous semblent liées probablement à l’influence d’interactions moléculaires complexes qui
existent in vivo, et agissent sur Akt.

Les tendances qui se dégagent de ces expériences montrent que la DHT et l’E2 régulent de
façon opposée les isoformes d’Akt, bien que les effets observés sur l’expression protéique
ne sont pas majeurs. En effet, nous avons observé que le traitement avec l’E2 tend à augmenter
l’intensité de l’expression d’Akt1 selon nos résultats de WB et des ICC. Cependant, en se basant
sur les ICC, le traitement avec l’E2 tend à diminuer l’expression d’Akt2. Ce traitement n’a pas
d’effet apparent sur l’expression d’Akt3. Dans un cadre thérapeutique d’infertilité chez les
patientes qui souffrent de troubles de la folliculogénèse et de l’ovulation, ce résultat parait
intéressant dans le développement des médicaments comme les stimulateurs d’Akt. En effet,
des études ont montré que l’E2 induit la croissance folliculaire par la prolifération des cellules de
la granulosa (149). Les résultats de notre étude suggèreraient un rôle prépondérant pour Akt1 dans
la croissance folliculaire que peut induire l’E2. Ce qui pousserait à cibler plus Akt1 dans les
 107

stratégies thérapeutiques pour les pathologies qui ont lien avec l’E2. Les différentes thérapies à
base de stimulateurs d’Akt ne sont pas utilisées en clinique en raison de leur manque de
spécificité (115). Il en est également le cas des inhibiteurs de la voie PI3K/Akt. Ils ont été
proposés dans le traitement de beaucoup de pathologies gynécologiques, dont les cancers
endométriaux et mammaires, voire comme cibles thérapeutiques dans l’endométriose et le
myome utérin (150-154). Par exemple, l’endométriose (localisation ectopique de l’endomètre)
se caractérise par une augmentation de la phosphorylation d’Akt. Celle-ci aboutit à la promotion
de la prolifération, à l’inhibition de l’apoptose ainsi qu’à la réduction de l’expression de PR des
cellules endométriosiques. L’utilisation de MK 2206, un inhibiteur d’Akt, comme traitement
dans l’endométriose, augmente l’expression des PR, et réduit de ce fait la viabilité de cellules
endométriosiques (153). Ces dernières années, des efforts sont constamment faits pour améliorer
la spécificité de ces médicaments comme en témoignent plusieurs essais thérapeutiques qui sont
en cours de réalisation (150-154). Notre étude apporte ainsi une contribution dans ce sens en
suggérant des relations potentielles entre les hormones et les isoformes d’Akt. Contrairement au
traitement avec l’E2, le traitement avec la DHT tendait à baisser le niveau d’expression d’Akt1
et Akt3 selon nos résultats de WB, et à augmenter celui d’Akt2. Nos résultats sont en partie en
accord avec ceux d’une étude menée par Nekoonam et al. en 2016 (155). Ces chercheurs ont
observé une élévation de l’expression d’ARNm d’Akt1 et Akt2 au sein des cellules de la
granulosa lutéinisées des patientes hyperandrogéniques atteintes du SOPK. Ils ont ainsi établi
une corrélation entre l’hyperandrogénie et l’élévation de ces deux isoformes d’Akt. Ce qui parait
intéressant est la corrélation entre Akt2 et l’hyperandrogénie qui corrobore notre observation.
La différence entre notre résultat d’avec celui de l’étude de Nekoonam et al. pourrait provenir
du modèle expérimental utilisé. En effet, dans leur étude, Nekoonam et al. ont utilisé les cellules
de la granulosa lutéinisées qui sont en fait en pleine transformation. En effet, 12 à 24 heures déjà
après le pic de LH ou l’induction de l’ovulation avec hCG, les cellules de la granulosa arrêtent
leur prolifération. Elles s’hypertrophient, et commencent à sécréter de façon prédominante de la
progestérone ainsi que des protéases (144). Ce processus résulte en des modifications partielles
et progressives de l’expression des différentes protéines (par exemple : Cyclooxygénase 2,
cytokines, Star, Cyp 11A1) impliquées dans la synthèse de ces molécules ou dans cette
transformation (144). Un autre fait observé dans notre étude est que le niveau protéique d’Akt
total n’augmente pas avec ces deux traitements. Mais nous observons comme une régulation
 108

inverse des isoformes Akt1 et Akt2 par ces deux stéroïdes ovariens alors qu’Akt3 est moins
régulé par l’E2 que par la DHT. En effet, comme décrit ci-haut, le traitement avec la DHT
a tendance à baisser l’expression d’Akt1, mais à augmenter celle d’Akt2 selon les résultats des
WB et des ICC. En revanche, le traitement avec l’E2 tend à augmenter l’expression d’Akt1.
Ceci laisse penser que les isoformes Akt1 et Akt2 joueraient des rôles opposés au sein des
cellules de la granulosa ovarienne, et pourraient être différemment ciblées pour des objectifs
précis.

De façon intéressante, nos résultats ont montré que les effets de ces deux stéroïdes
ovariens se manifestent beaucoup plus et de façon significative sur la phosphorylation des
isoformes d’Akt. Nos résultats ressortent ainsi le fait que la phosphorylation des isoformes d’Akt
revêt une importance capitale plus que leur expression protéique seule. Ce constat est vrai,
notamment en ce qui concerne leur régulation par les stéroïdes ovariens au sein de cellules de la
granulosa. En effet, nous avons démontré que la DHT réduit sensiblement le niveau de
phosphorylation des deux isoformes d’Akt étudiées (Akt1 et 2) bien que la différence n’ait été
significative que pour pAkt1. En revanche, l’E2 augmente sensiblement le niveau de
phosphorylation de ces deux isoformes bien que cela n’ait été significatif que pour pAkt2.
Il ressort de ces observations que concernant l’activation des isoformes d’Akt, l’action de ces
deux stéroïdes ovariens nous paraît non sélective. En ce qui concerne l’activation d’Akt en
général par ces deux stéroïdes, nos résultats corroborent ceux rapportés par de précédentes études
(114, 156, 157). Notre étude apporte une nouveauté en précisant la non-spécificité de cette
activation ou inhibition d’Akt par les stéroïdes ovariens. En revanche, une étude réalisée par
Nekoonam avait montré un niveau élevé de phosphorylation d’Akt dans les cellules de la
granulosa lutéinisées humaines chez les patientes qui souffrent du SOPK après stimulation avec
la GnRH (155). Les patientes qui souffrent du SOPK sont souvent hyperandrogéniques, et par
conséquent, elles devraient avoir un niveau bas de phosphorylation dans les cellules de la
granulosa. Nous pensons que dans l’étude de Nekoonam, le niveau élevé de phosphorylation
d’Akt dans les cellules de la granulosa est attribuable à l’action de la GnRH qui est parvenue à
renverser les effets de l’hyperandrogénie. La GnRH induit la libération de la FSH, et la FSH
induit l’activation d’Akt afin de permettre la prolifération et la différenciation de cellules de la
granulosa (114).
 109

4.7 Régulation des isoformes d’Akt dans le vieillissement ovarien induit par le VCD

Le VO est un processus majeur dans la vie d’une femme. Il est normal quand il survient
autour de la cinquantaine. Dans le cas de certaines pathologies comme l’IOP, le VO survient de
façon précoce, soit avant l’âge de 40 ans (6). La survenue du VO précoce implique plusieurs
voies de signalisation, dont celle d’Akt. Dans l’arsenal thérapeutique concernant la prise en
charge de l’infertilité qui en découle, les molécules qui stimulent Akt occupent une place
centrale dans l’élaboration de thérapies. Cependant, les molécules utilisées pour l’activation des
isoformes d’Akt sont non isoformes-spécifiques; ce fait complique leur utilisation chez les
patientes (6b). La famille des protéines Akt est composée des kinases versatiles qui possèdent
plusieurs cibles moléculaires. Leurs implications dans les mécanismes qui sous-tendent le VO
sont bien établies. Cependant, malgré ces connaissances, les rôles des isoformes d’Akt
demeurent moins clarifiés. Pourtant, elles possèdent des spécificités sur le plan fonctionnel
comme relevé tout le long de cette thèse.

Notre étude a établi que le VO s’accompagne d’une réduction de l’expression et de

l’activation des isoformes d’Akt et de ses cibles. De plus, notre étude est la première à montrer
in vitro que, à l’échelle protéique, l’expression des trois isoformes d’Akt est réduite bien que
cette réponse ne soit significative que pour Akt1 et Akt2. Akt3 est aussi fortement réduit.
Ainsi, sur le plan de l’expression protéique, nos résultats ne suggèrent pas une sélectivité de
l’action du VCD sur les isoformes d’Akt. Partant de cette observation, nous pouvons suggérer
que l’implication des isoformes d’Akt dans le VO ne soit pas spécifique. C’est-à-dire,
les trois isoformes d’Akt seraient impliquées dans les mécanismes qui régulent la survenue du
VO, car nous avons observé la réduction de leur expression. Nos résultats montrent également
que la phosphorylation d’Akt1 et Akt2 est significativement réduite dans le groupe du VO
comparativement au groupe contrôle. Bien que n’ayant étudié que la phosphorylation de ces
deux isoformes par le fait de la non-disponibilité de l’anticorps spécifique pour celle d’Akt3,
notre étude montre la non-sélectivité de l’action du VCD sur la phosphorylation d’Akt.
Comme pour l’expression protéique, notre étude est la première à relever la non-spécificité de
l’inactivation protéique des isoformes d’Akt dans le VO, du moins celui induit par le VCD.
Conformément aux isoformes, le niveau d’expression d’Akt total est également réduit in vitro.
Cependant, in vivo, ces protéines ne montrent pas de réduction évidente. Nous préférons discuter
 110

cet aspect des résultats in vivo dans le point suivant. Contrairement à nos résultats, Keating et al.
en travaillant sur des ovaires de rats in vitro, n’ont pas trouvé la réduction d’Akt total dans le
groupe VCD en comparaison au groupe contrôle (158). Ces différences nous semblent
possiblement être liées aux doses utilisées. En effet, dans leur étude, Keating et al. ont utilisé une
dose inférieure à celle que nous avons utilisée soit 30 µM vs 60 µM. Prises ensemble,
ces observations soulignent l’effet dose-dépendant du VCD sur la voie de signalisation
PI3K/Akt. Ce constat lié à l’effet dose-dépendant du VCD a été aussi observé chez les rats
in vitro par Devine et al. En effet, ils ont observé cette association avec la déplétion folliculaire
et l’expression élevée de caspase 3 en immunofluorescence (158). Par ailleurs, nos résultats ont
montré que le niveau de caspase-3 clivée en WB était élevé dans le groupe traitement, et que le
VCD induirait la mort cellulaire par apoptose. Ces deux faits viennent appuyer nos résultats,
car c’est en effet à des doses plus élevées que 30 µM que cette déplétion paraissait plus
prononcée dans l’étude de Devine. En plus, une étude publiée récemment a montré qu’à des
doses très faibles, de l’ordre de nanomolaire (10 nM), le VCD peut montrer des effets contraires
sur le développement folliculaire (160). En effet, selon cette étude menée sur des souris in vitro
et in vivo, à des doses faibles et pendant une courte exposition de 3 jours, le VCD induisait une
augmentation des follicules primordiaux et petits primaires. En ce qui concerne la réduction de
la phosphorylation, nos résultats sont en accord avec ceux publiés dans une revue de Kappeler
et al. (161), bien qu’une fois de plus, ils n’ont pas étudié les isoformes d’Akt. En effet, ils ont
trouvé dans un modèle in vitro la réduction de la phosphorylation d’Akt dès le deuxième jour du
traitement. Cette réduction de la phosphorylation d’Akt précédait les modifications
transcriptionnelles qui surviennent au J4. Tout en appuyant leurs résultats, notre étude apporte
une lumière de plus en montrant la non-sélectivité de l’action du VCD sur la phosphorylation
des isoformes d’Akt. Nos résultats laissent suggérer qu’au niveau protéique, l’implication de
ces isoformes dans la survenue du VO ne soit pas isoforme spécifique. Notre étude a montré
également que l’effet du VCD est non sélectif sur la diminution des isoformes d’Akt concernant
leurs différentes localisations dans les structures ovariennes. Ce résultat appuie la suggestion
selon laquelle l’action du VCD sur Akt est étendue, et la redondance possible des isoformes
d’Akt dans la survenue du VO. En effet, les différentes fractions d’Akt sont nécessaires pour
atteindre leurs cibles moléculaires pour les phosphoryler afin de les inhiber ou les activer.
Ainsi, la fraction nucléaire d’Akt, après son activation est très importante pour phosphoryler les
 111

cibles pro-apoptotiques d’Akt comme le Foxo3a. Ce dernier est ainsi délocalisé du noyau en vue
de sa dégradation, l’empêchant ainsi de jouer son rôle (71). Aussi, cette fraction nucléaire d’Akt
est reconnue stimuler la transcription de plusieurs molécules anti-apoptotiques (71, 73).
Les autres fractions cytoplasmiques peuvent cibler d’autres protéines comme Bad, GSK3β et
mTOR (71) pour une action coordonnée et puissante du VCD.

À l’échelle transcriptionnelle, nous avons également observé la réduction notable des

transcrits d’Akt1 et d’Akt3. Ces observations révèlent un fait très intéressant, que le VCD agirait
sur les isoformes d’Akt probablement à deux niveaux, protéique et transcriptionnel. En effet,
pour Akt2 au niveau transcriptionnel, l’effet du VCD est non visible pendant qu’au niveau
protéique, il est notable. Cependant, pour Akt1 et 3, des effets aux niveaux protéique et
transcriptionnel sont observés. Il en ressort que l’effet du VCD est sélectif sur la transcription
des gènes des isoformes d’Akt. Ces résultats suggèrent que le VCD aurait une action directe sur
la transcription des gènes de certaines isoformes (Akt1 et 3). Nos résultats sont en accord avec
ceux de Keating et al. (158) qui ont trouvé également la réduction de l’ARNm d’Akt1 dans le
groupe VCD au J4 du traitement in vitro dans les ovaires des rats. Cependant, dans leur étude,
ils n’ont pas étudié les autres isoformes d’Akt. Notre étude est la première à investiguer toutes
les isoformes d’Akt au niveau transcriptionnel dans un tel modèle du VO. Ces trouvailles
nécessiteront des études plus approfondies dans le but de disséquer la part de l’effet à ces
deux échelles pour Akt1 et Akt3, notamment en étudiant l’implication du protéasome. En effet,
nos résultats, tout en étant clairs, viennent soulever quelques questions, dont celle de la
compréhension de l’action du VCD sur les disparités entre le niveau protéique et transcriptionnel
des isoformes d’Akt. Un autre argument qui pousse à étudier cette piste du protéasome est la
baisse concomitante des formes phosphorylées et non phosphorylées des isoformes d’Akt et de
leurs cibles. Aussi, il faudra disséquer l’implication du protéasome ou des miARN dans la
réduction des isoformes d’Akt, essentiellement pour Akt2. Ensuite, il faut chercher à éclairer le
mécanisme qui suggère la régulation transcriptionnelle du VCD. Il est connu que la réduction
du niveau protéique d’une isoforme quand le niveau de son ARNm est normal peut être due à sa
dégradation par le protéasome ou à l’inhibition de sa traduction par les miARN. Concernant le
protéasome, il sera par exemple nécessaire d’user en préincubation dans le milieu de culture des
inhibiteurs de leur activité. Cela permettra de voir l’impact d’une telle action sur l’effet du VCD
 112

sur les isoformes d’Akt au niveau de l’expression protéique. Pour l’autre piste à étudier,
celle des miARN, il est connu que ceux-ci peuvent diminuer la traduction des ARNm sans
nécessairement provoquer leur dégradation. Ce fait résulterait en une diminution de niveau
protéique. Ces microARN (miARN) sont des petits ARN qui comprennent 21 à 25 nucléotides,
sont retrouvés chez les eucaryotes, et sont non codants. Ils font partie de la famille des ARN
interférents qui possèdent la capacité de réguler négativement la traduction d’ARN qui leur sont
cibles, et de contrôler ainsi l’expression des gènes (162 -164). Nos résultats concernant Akt2
plaident en faveur de la vérification de ce deuxième mécanisme, car le taux d’ARNm est le même
que dans le groupe sans traitement ou sans VO. Pour ce faire, les expériences d’hybridation in
situ des ARNm et du Co-marquage des protéines nécessaires à l’assemblage du miARN et de
son ARNm cible, comme le GW182 permettront d’atteindre cet objectif en confirmant leur
localisation (162). D’autant plus que les données récentes de la littérature révèlent des profils
intéressants qui montrent les miARN impliqués dans le VO dont les gènes cibles appartiennent
à la voie PI3K/Akt (165). En effet, dans leur étude sur les souris, Schneider et al. ont trouvé
l’existence des 5 tops miARN exprimés dans l’ovaire, et qui ciblaient les gènes impliqués dans
la croissance cellulaire et l’apoptose. Ces miARN étaient différemment exprimés entre les souris
qui présentent un VO et celles normales. Ce constat leur avait permis de conclure à l’implication
possible de la gestion du VO par les miARN. Parmi ces miARN dont les rôles émergent dans la
régulation de la survenue du VO, il y a miR-17, miR-20a, miR-92a et miR-145 (165).

4.8 Les cibles d’Akt dans le vieillissement ovarien et leur régulation par les stéroïdes
ovariens

a) Les cibles moléculaires d’Akt dans le vieillissement ovarien induit par le VCD

Notre étude a montré la réduction in vitro de l’expression protéique et de la

phosphorylation de 4 cibles d’Akt étudiées (Foxo3a, Bad, GSK3β et mTOR) dans le groupe des
ovaires en culture à la suite de l’administration du VCD. Notre étude confirme ce que d’autres
chercheurs comme Keating et al. (158) ont trouvé en ce qui concerne l’activation d’Akt et de
ses cibles. Ces résultats suggèrent aussi que l’action du VCD sur l’inactivation protéique des
isoformes d’Akt est non sélective. De plus, l’action du VCD concernerait d’autres voies de
signalisation confluentes impliquées dans la survie cellulaire, dont celle de MAPK comme l’a
 113

suggéré Kappeler dans sa revue (161). En plus, en induisant la réduction des formes non
phosphorylées des cibles et des isoformes d’Akt, le VCD conduit possiblement au moins en
partie à la réduction de leurs formes phosphorylées. Ces constats suggèrent un effet potentiel du
VCD sur la dégradation protéique dans la voie PI3K/Akt en plus de l’inactivation comme
observé par d’autres chercheurs et relevé précédemment.

b) Les effets du VCD sur les isoformes d’Akt et leurs cibles in vivo

In vivo nous n’avons pas observé les différents effets du VCD, notamment sur l’expression
protéique, l’activation, l’ARNm des isoformes d’Akt, et sur leurs cibles. Nos résultats
corroborent les trouvailles de Keating et al. ainsi que celles d’autres chercheurs (158, 161).
En effet, Hu et al. (166) ont démontré, in vivo sur les rats, que l’effet du VCD sur les protéines
pro-apoptotiques Bad, Bax et Bcl-xL est visible jusqu’à quatre heures après la dernière dose.
En revanche, 15 jours après, ils n’avaient observé aucune différence entre le groupe contrôle et
celui qui a reçu le VCD. Une des explications est que le VCD agit essentiellement sur la
destruction des follicules de la RO (primordiaux et primaires) (161). Les autres follicules des
stades supérieurs continuent leur croissance et maintiennent le fonctionnement de l’ovaire.
Une autre explication qui peut être avancée est le fait que les mécanismes de suppléance sont mis
en œuvre pour assurer la survie de l’ovaire chez l’animal encore vivant. Malgré cette suppléance,
la destruction des follicules primordiaux étant irréversible, la RO ne peut être restaurée par la
suite. Ainsi, Kappeler dans sa revue, relève le fait que, in vivo sur les rongeurs, le niveau sanguin
de LH et FSH (comme témoins de la ménopause) ne monte que jusqu’à 240 jours après la fin de
l’administration du VCD.

Cependant, la destruction des follicules de la RO est observée plutôt (161). Ce fait révèle
la particularité de l’action du VCD in vivo qui est de mimer la ménopause naturelle et
progressive. Cette particularité fait du VCD un excellent outil pour créer des modèles du VO par
rapport aux autres modèles (ovariectomie bilatérale, utilisation des anticancéreux par exemple)
qui induisent le VO sans la phase de transition. L’utilisation du double modèle d’induction du
VO permet de comprendre que le VCD induit la destruction des follicules primordiaux comme
démontré in vitro avec la conservation des follicules des stades plus avancés. Il s’en suit
l’effondrement des restes de follicules avec le temps à la suite d’ovulations successives comme
 114

le montrent les résultats in vivo. Ce constat est en accord avec les données antérieures publiées
dans la littérature (127). Cette action du VCD sur l’expression et l’activation d’Akt et de ses
cibles au sein des follicules de la RO est précoce et directe. Par la suite, l’expression et
l’activation des isoformes d’Akt sont restaurées pour assurer la survie de l’ovaire chez l’animal
vivant.

c) La régulation de cibles moléculaires d’Akt par les stéroïdes ovariens

Notre étude menée sur les cellules de la granulosa en culture a montré que la DHT et l’E2
agissaient de façon inverse sur la phosphorylation des cibles d’Akt principalement impliquées
dans l’apoptose (Bad et Fox03a). La DHT réduit leur niveau de phosphorylation, tandis que l’E2
l’augmente. Ce résultat suggère que la signalisation par Foxo3a et Bad au sein des cellules de la
granulosa est importante pour médier les effets des stéroïdes sur l’apoptose dans l’ovaire.
En effet, la phosphorylation de Fox03a et de Bad joue un rôle anti-apoptotique puissant.
Cette phosphorylation révèle le rôle que joue l’E2 dans la survie cellulaire au sein de l’ovaire.
Comme relevé précédemment dans cette thèse, plusieurs études soulignent l’implication de
Foxo3a dans la survenue du VO. Des souris KO de Foxo3a présentent un VO prématuré
(63, 167). Notre étude vient renforcer ce constat, et révèle l’importance des cellules de la
granulosa et des stéroïdes ovariens dans le destin du follicule. À ce jour, peu d’études existent
concernant le rôle au niveau de l’ovaire des autres cibles d’Akt comme GSK3β et mTOR.
En plus, les pathologies caractérisées par l’hyperandrogénie comme le SOPK sont associées à un
arrêt de croissance folliculaire probablement à cause de la diminution de phosphorylation d’Akt
et, par conséquent, de celle de ses cibles. Cependant, dans le SOPK, cet arrêt de croissance
folliculaire n’est pas associé à un accroissement de l’apoptose folliculaire (155, 168).
Cette discordance entre l’arrêt de la croissance folliculaire et le non-accroissement de l’apoptose
folliculaire en cas du SOPK nous semble liée à la suppléance d’autres voies de survie cellulaire
comme celle de MAPK.

4.9 Limitations méthodologiques

Les résultats de nos différentes expérimentations montrent bien les rôles des isoformes
d’Akt ainsi que de la voie PI3K/Akt dans l’ovaire. Nous avons relevé ces rôles aussi bien dans
 115

les processus physiologiques, comme la dynamique folliculaire et l’ovulation, que dans le

processus pathologique, tel que le VO. Au sein de l’ovaire, ces isoformes d’Akt démontrent des
spécificités ainsi que des similarités ou des redondances. Celles-ci concernent leur localisation,
leur expression ainsi que leur régulation tout au long du cycle œstral, par les stéroïdes ovariens
et dans le VO induit par le VCD. Toutefois, en observant bien ces données, certaines questions
subsistent, et d’autres émergent. Notre travail a permis de révéler beaucoup d’aspects concernant
ces isoformes d’Akt et d’en caractériser d’autres. En ce qui concerne leur expression,
essentiellement l’intensité des isoformes d’Akt au travers du cycle œstral, nos données restent
descriptives. Elles ne permettent à ce titre que de suggérer de liens entre ces variations et les
effets des hormones au niveau ovarien étant donné le modèle animal utilisé. Mais cela ne remet
pas en cause la pertinence de notre travail, car la complexité du modèle animal murin le rapproche
de la femme. En effet, le modèle murin permet de comprendre ce qui se passe dans les différentes
phases du cycle concernant les isoformes d’Akt. Pour pallier cet écueil, le développement des
modèles moins complexes et bien contrôlés comme les cultures cellulaires est la solution.
Nous avons exploité cette piste, notamment dans l’effet des stéroïdes sur les isoformes d’Akt.
Elle mérite d’être étendue pour les autres aspects qui impliquent les isoformes d’Akt afin
d’envisager de liens causatifs de différentes hormones sur les isoformes d’Akt.

Une autre limitation est la multiplicité des phases du cycle (4 phases) dans un intervalle
court de temps (5 jours). Ce fait a rendu parfois l’analyse complexe, et les différences qui étaient
parfois minimes, difficiles à mettre en évidence. Cela a paru comme une limitation à souligner,
à côté d’une certaine variabilité liée au modèle murin et à la petite taille de notre échantillon.
Cette variabilité et la petite taille de notre échantillon, dans certains cas, n’ont pas permis de
ressortir la significativité des différences existantes. Mais qu’à cela ne tienne, nos données
conservent une bonne validité interne dans la mesure où nos résultats conservaient les mêmes
tendances quoique le seuil de signification n’était pas atteint pour certaines phases du cycle
œstral. Ainsi, notre travail permet d’ouvrir des avenues pour des études sur les humains avec des
données fondamentales. Ces études permettront d’étayer des hypothèses et de faire avancer la
recherche dans des pistes prometteuses en proposant des perspectives pour consolider nos
résultats.
 CHAPITRE V

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

5.1 Conclusion

Les isoformes d’une protéine sont ses différentes formes qui peuvent être générées par
différents processus, dont la transcription de différents gènes comme il en est le cas des
isoformes d’Akt. Elles peuvent l’être aussi par l’épissage alternatif des ARNm à partir d’un seul
gène (65, 169). Elles constituent une des manières pour les cellules de diversifier la fonction
d’une seule protéine, et de lui permettre d’être versatile. Ces isoformes peuvent jouer des rôles
redondants ou spécifiques, voire opposés au sein d’un même type cellulaire selon des stimuli
divers (65, 81, 169, 170). Ces constatations sont aussi vraies pour les isoformes d’Akt dans
divers organes, mais concernant l’ovaire ces données étaient manquantes. L’objectif général de
cette thèse était d’élucider la régulation et les rôles des isoformes d’Akt dans la physiologie
ovarienne. Nos travaux ont apporté une contribution dans ce sens pour une meilleure
compréhension du sujet.

Grâce aux IHC réalisées sur des ovaires des souris C57 BL/6J de type sauvage et
sexuellement matures, nous avons pu caractériser l’expression et la localisation des isoformes
d’Akt au sein de l’ovaire. Nous avons établi, en effet, que les follicules ovariens, les corps jaunes
sont des structures qui expriment de façon nette les 3 isoformes d’Akt. Akt3 est l’isoforme la
moins exprimée. Le stroma ovarien est le compartiment qui exprime moins et de façon éparse
Akt1 et 2. L’expression d’Akt3 y est quasi nulle. Ces isoformes démontrent également une
expression différentielle au sein des différents types cellulaires qui composent les follicules.
Si leur expression est permanente dans les cellules de la granulosa et l’ovocyte, elle variait dans
les cellules de la thèque. Ces IHC nous ont permis également d’établir que les localisations
subcellulaires de ces différentes isoformes d’Akt sont spécifiques, mais avec parfois quelques
similarités. Akt1 montre une localisation nucléaire et cytoplasmique, notamment au sein des
cellules de la granulosa. Akt2 montre une localisation cytoplasmique basale et quelque peu
 117

membranaire. Akt3 montre une localisation cytoplasmique et parfois nucléaire. Les localisations
subcellulaires d’Akt2 et 3 subissent certaines variations le long du cycle œstral. Grâce à des WB
réalisés dans les différentes phases du cycle œstral, nous avons observé que l’intensité
d’expression et d’activation des isoformes d’Akt varie de façon isoforme-spécifique. Cependant,
nous avons observé une similarité dans le patron d’expression protéique d’Akt1 et 3.
Ces différentes variations de localisation, d’expression et d’activation des isoformes d’Akt au
travers du cycle œstral suggèrent un éventuel lien de régulation de ces isoformes d’Akt avec les
hormones propres à chaque phase du cycle. Elles suggèrent également d’éventuels rôles qu’elles
jouent de manière spécifique ou redondante.

En utilisant un modèle des souris déficientes en Akt3, nous avons étudié l’impact de cette
élimination d’Akt3 dans la physiologie ovarienne, notamment concernant la RO, la dynamique
folliculaire, le volume ovarien et l’ovulation. Nous avons observé que les souris déficientes en
Akt3 présentent de façon significative une diminution de la RO et une augmentation des
follicules secondaires avant l’âge de la maturité sexuelle. Bien qu’une telle tendance persistât à
l’âge de 100 jours, elle n’était plus significative. En plus, les souris Akt3-/- âgées de 100 jours
démontrent une diminution significative des corps jaunes et du volume ovarien. Ces résultats ont
démontré les rôles d’Akt3 dans l’ovaire bien que son expression y soit moindre. Ces résultats
constituent une première qui vient montrer le rôle potentiel d’Akt3 dans la physiologie
ovarienne, notamment comme frein de la sortie de follicules de la RO chez les souris avant la
maturité sexuelle. Ils montrent aussi qu’Akt3 jouerait un rôle dans la promotion de l’ovulation
et de la formation du corps jaune ainsi que dans la régulation du volume ovarien.

La variation de l’expression des isoformes d’Akt au travers du cycle œstral laisse suggérer
leur régulation probable par des hormones. Nous avons examiné, à cet effet, dans un modèle
moins complexe, l’impact sur les isoformes d’Akt d’un traitement avec les stéroïdes ovariens.
Nous avons étudié in vitro la régulation de l’expression et de l’activation des isoformes d’Akt
par la DHT et l’E2 sur des cellules de la granulosa ovarienne des souris C57 BL/6J de type
sauvage. Cette étude nous a permis d’observer quelques tendances quoique ces effets ne fussent
pas significatifs. Akt1 parait régulé à la hausse par l’E2, tandis qu’Akt2 à la baisse. La DHT
induit l’inverse. Akt3 est l’isoforme qui semble plus influencée par la DHT qui tend à induire sa
 118

diminution. L’action de ces deux stéroïdes n’a également aucune sélectivité sur les localisations
subcellulaires des isoformes d’Akt. Nos données ont confirmé cependant de façon évidente et
significative que ces deux stéroïdes régulent inversement l’activation des isoformes d’Akt. L’E2
augmente leur phosphorylation, alors que la DHT la diminue. Ce résultat laisse suggérer que la
régulation de l’activation des isoformes d’Akt par les stéroïdes ovariens est non spécifique.

Finalement, à l’aide d’une double approche d’induction du VO (in vitro et in vivo) par le
VCD chez les souris de type sauvage, nous avons établi que les isoformes d’Akt sont régulées
à la baisse. Cette régulation est observée à deux niveaux, protéique et transcriptionnel. Au niveau
protéique, la réduction de l’expression, de l’activation et de la localisation de ces isoformes sont
non spécifiques. Cependant, au niveau transcriptionnel, la réduction des isoformes d’Akt nous
parait spécifique. En effet, seuls les transcrits d’Akt1 et 3 sont réduits après administration du
VCD. Aussi, nos résultats suggèrent que le VCD induirait une dégradation protéique et la mort
cellulaire par apoptose. Cette double approche nous a permis de montrer que ces effets du VCD
sur les isoformes d’Akt sont restaurés avec le temps. En effet, les différences observées in vitro
ne sont plus visibles in vivo quoique le VO était induit et persistait.

En considérant toutes ces observations, nous pouvons conclure que les isoformes d’Akt
dans l’ovaire possèdent des similarités, mais aussi des spécificités. Celles-ci concernent leur
expression, leur régulation et probablement leurs fonctions tout au long du cycle œstral ainsi
que leur régulation par les stéroïdes ovariens. Akt3, bien que moins exprimée et apparemment
moins régulée par certains stéroïdes, jouerait un rôle dans la dynamique folliculaire, la RO,
la régulation du volume ovarien et l’ovulation. Les trois isoformes d’Akt sont impliquées dans
le processus du VO aussi bien concernant leur expression que leur activation. En notre
connaissance, cette étude est la première qui établit l’implication des isoformes d’Akt au travers
du cycle œstral et dans le VO. Elle est également la première à relever le rôle d’Akt3
dans la dynamique folliculaire, la régulation du volume ovarien et l’ovulation. Les principales
découvertes de notre thèse sont résumées dans la figure 5.1 ci-dessous.
 119

Figure 5.1 Représentation schématique de principales implications des isoformes d’Akt

et de leur signalisation dans l’ovaire.
Les effets des stéroïdes ovariens, du VCD ainsi que l’influence du cycle œstral sur
les isoformes d’Akt et leurs cibles sont divers. Ces effets sont parfois spécifiques
ou similaires. L’élimination d’Akt3 induit également des conséquences sur
l’ovaire, et révèle des rôles émergents pour cette isoforme d’Akt.
DHT : Dihydrotestostérone, E2 = 17β-Œstradiol, VCD = 4-vinylcyclohexène
diépoxyde.

5.2 Perspectives

Dans cette section, nous tenons à développer certaines perspectives que notre étude ouvre
en plus de celles abordées dans notre discussion précédemment.
 120

5.2.1 Perspectives à court terme

[Link] Détermination du rôle de chacune des isoformes d’Akt dans la survie des cellules
de la granulosa

Notre étude a montré une spécificité des variations des isoformes d’Akt le long du cycle
œstral et une tendance à la spécificité de leur régulation par les stéroïdes ovariens.
Ces observations laissent suggérer des fonctions particulières de chacune d’elles. Des études
montrent que les cellules de la granulosa jouent un rôle déterminant au sein du follicule (8),
et elles s’apprêtent mieux pour une étude moins complexe. Cette donnée parait intéressante
quant aux visées thérapeutiques qui ciblent les isoformes d’Akt. Nous estimons intéressant
d’étudier la survie et la croissance cellulaires ainsi que la compensation des isoformes d’Akt au
sein des cellules de la granulosa. Dans cet ordre, il serait pertinent d’induire dans les cellules de
la granulosa une simple, double ou triple inhibition des isoformes d’Akt en utilisant par exemple
la technologie de l’ARN interférent, ou celle récente et révolutionnaire de CRISPR Cas-9.
Dans cette dernière technologie, l’endonucléase (Cas-9), à l’aide d’un ARN-guide associé aux
séquences CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), peut couper
une séquence précise de l’ADN. Ainsi, grâce aux différents ARN-guide synthétisés
indépendamment, il est possible d’induire efficacement des KO des gènes d’intérêt (171).
Avec un tel modèle, nous pourrons approfondir les connaissances sur les rôles et fonctions des
isoformes d’Akt dans les cellules de la granulosa et partant, sur le destin folliculaire.

[Link] Identifier si les cibles d’Akt sont isoformes spécifiques dans l’ovaire

La détermination de l’implication des isoformes d’Akt comme dans le modèle des cellules
de la granulosa proposé dans le point précédent constituera une première étape. Ensuite,
nous trouvons intéressant, dans le but de comprendre les mécanismes sous-jacents, d’étudier si
les cibles d’Akt sont également activées ou inhibées de manière isoforme- spécifique. L’étude
de la phosphorylation de différentes cibles d’Akt après stimulation de la voie PI3K/Akt dans ce
modèle d’inhibition des isoformes d’Akt permettra d’établir l’effet de chacune d’elles sur leurs
cibles. Ces connaissances permettront d’approfondir l’étude sur la voie de signalisation d’Akt,
et de cerner sa versatilité en vue des visées thérapeutiques.
 121

5.2.2 Perspectives à long terme

[Link] Étude de la compensation et interaction entre les isoformes d’Akt au sein de l’ovaire

La compréhension des rôles et de l’interaction entre les isoformes d’Akt dans l’ovaire
impliquera un approfondissement des études mécanistiques. Celui-ci nécessitera un modèle plus
complexe que les cultures cellulaires. Il sera de ce fait utile de développer un modèle de KO
conditionnel des isoformes d’Akt qui cible particulièrement les ovaires. Un tel modèle de
simple, double et triple KO des isoformes d’Akt sera possible, notamment grâce à la
recombinase-Cre et dont l’expression sera liée à celle des récepteurs de l’AMH. Ce KO
conditionnel permettra d’éviter les effets pervers et étendus de l’élimination permanente des
isoformes d’Akt pour des doubles et triples KO des isoformes d’Akt. Car, il est établi que les
souris qui ont subi de doubles et triples éliminations permanentes des isoformes d’Akt ne sont
pas viables sauf peut-être celles avec une double élimination d’Akt2 et 3 (77-79). Un tel modèle
permettra ainsi d’étudier l’impact de telles déficiences des isoformes d’Akt sur la RO,
la dynamique folliculaire et le destin folliculaire. Il relèvera également les interactions entre les
différentes isoformes d’Akt dans ces processus biologiques. Il permettra aussi de compléter nos
présents résultats en ce qui concerne par exemple la baisse des isoformes d’Akt observée dans
le modèle du VO induit par le VCD.

[Link] Rôles des isoformes d’Akt dans l’ovulation, la formation du corps jaune et la
régulation du volume ovarien

Nous avons observé que l’élimination d’Akt3 impacte le nombre des corps jaunes.
Nous estimons important d’étudier également les rôles d’autres isoformes d’Akt dans le
processus d’ovulation et de la formation du corps jaune. Celle-ci se fera grâce à une étude dédiée
qui va s’étendre sur les différents aspects de ces processus. Une telle étude va se réaliser dans le
modèle susmentionné de KO conditionnel des isoformes d’Akt, et va s’atteler sur divers aspects,
notamment morphologiques, moléculaires, enzymatiques et hormonaux liés à l’ovulation et au
corps jaune. Elle permettra de cerner les effets de chaque isoforme d’Akt et leurs interactions
possibles.
 122

En ce qui concerne le volume ovarien, il s’avère nécessaire d’investiguer les mécanismes

impliqués dans la régulation du volume ovarien par Akt3 en plus de celui abordé dans la
discussion. Il sera utile de mener des études plus approfondies pour investiguer les rôles d’autres
isoformes également avec des modèles de KO disponibles. En plus, il faudra regarder dans le
contexte pathologique avec des modèles du SOPK, l’implication possible d’Akt3.

[Link] Étude translationnelle de l’implication des isoformes d’Akt chez les patientes
atteintes d’IOP ou chez les ménopausées

Toutes ces études devront aboutir à l’élaboration d’une étude translationnelle chez les
patientes atteintes d’IOP ou chez les ménopausées en vue de confirmer ces différentes
trouvailles. Cette étude translationnelle pourra se consacrer à analyser, notamment chez ces
patientes, des modifications éventuelles des gènes d’Akt ou l’expression de ses isoformes au sein
de l’ovaire sur des pièces opératoires. Elle pourra également étudier, sur des prélèvements
sanguins, des marqueurs potentiels de l’IOP. Par exemple, l’étude des microARN qui ont un
lien avec des protéines de la voie PI3K/Akt peut y être approfondie. Toutes les connaissances
qui pourront être accumulées dans ces différentes études auront pour finalité de servir des bases
pour le développement des thérapeutiques. Ces thérapeutiques cibleront les isoformes d’Akt
dans la prise en charge de l’infertilité féminine liée aux perturbations ovariennes comme dans
le cas d’IOP et d’autres troubles d’ovulation (par exemple, le SOPK). Elles pourront servir ainsi
au développement des stimulateurs ou inhibiteurs sélectifs de chaque isoforme d’Akt. Ceux-ci
pourront être utiles dans la prise en charge d’autres pathologies ovariennes comme le cancer,
qui est un fléau pour la femme.
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 ANNEXE

LES DONNÉES SUPPLÉMENTAIRES DU CHAPITRE II ET III

Fig. supplémentaire 1 Différentes phases du cycle œstral.

Les différentes phases du cycle œstral décrites après coloration au bleu
de méthylène sur des frottis vaginaux comme décrit dans matériel et
méthodes. (Tirée de [Link].)
 139

Fig. supplémentaire 2 Ovaires représentatifs des contrôles négatifs des anticorps dirigés
contre les isoformes d’Akt.
Les ovaires des souris enrobés dans la paraffine ont été sectionnés en
des coupes de 5 µm. Ils ont été incubés avec des Ig G en concentrations
équivalentes à celles des différents anticorps utilisés, comme décrit
dans matériel et méthodes. Ils ont servi comme des contrôles négatifs
aux anticorps : (i) pour anti-Akt1, (ii) pour anti-Akt2 et (iii) pour
anti-Akt3.