Montpellier ***

Agro c i rad
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Mémoire de fin d'études

Présenté pour l'obtention du Diplôme de MASTER 2

Option : Agronomie et Agroalimentaire STIDAD
Spécialité : Semences et Plantes Méditerranées et Tropicales - SEPMET

Contribution à l'étude de la diversité Génétique du manioc

cultivé (Manihot esculenta) en Afrique Centrale (Zone CEMAC)

Par Clotilde ABESSOLO MEYE

Année de soutenance : 2013

Mémoire préparé sous la direction Organisme d'accueil : CIRAD/ UMR/AGAP

de : Muriel TAVAUD

Par le Jury:
Jean Luc Regnard, Président du Jury Maître de stage : Marie France DUVAL
Vincent Ranwez, enseignant rapporteur
Yves VIGOUROUX, rapporteur
extérieur(IRD)
Remerciements

Je remercie mon maître de stage, Mme Marie France DUVAL, Généticienne et Chargée de

recherches responsable de l 'équipe Amélioration des Plantes à Multiplication Végétative (APMV)

au CIRAD, qui m'a offert d ' effectuer ce stage dans le cadre du projet PRASAC et pour toute la
connaissance et la rigueur dans la rédaction de ce mémoire. Mes remerciements vont également à
l ' endroit de Mr Steeve JOSEPH pour sa disponibilité dans la conduite des travaux en laboratoire. Je
n'oubl ierai pas Ronan et Hélène !
A Mme Muriel TA VAUD, professeur et chercheur à SupAgro pour son encadrement qui a donné
un plus pédagogique et scientifique à ce rapport.
Merci à tous les collaborateurs du projet PRASAC qui ont travail l é en amont pour la collecte des
échantillons de manioc.
Merci à Mme Christine Moinard de la Coopération Française au Gabon.
Un grand merci aux dames Maija et Gisèle pour vos conseils et attentions spéciales.

A Monsieur Jean Luc REGNARD qui a rendu possible cette formation que j 'ai eu du mal à intégrer
Ma formation n'aurait pas été possible sans le dévouement col lectif des enseignants prédisposés à
partager leurs connaissances. Pour chacun(e) d'eux toute ma gratitude.
Merci à tous mes amis (Dan ielle, Patrick, Liliane, Coretta . . . ) qui m ' avez encouragée à mener à
bien ce projet de formation
Vanesse ! Que le Seigneur te bénisse abondamment pour tout!
Ablanvi, l ' ouvrière de la dern ière heure, merci !
Un grand merci à ma fami lle élargie pour vos soutiens moral, matériel et spirituel qui ont contribué
pour la réussite de cette formation.
A mon époux de sang Jonathan ABESSOLO MEYE, mes neuf enfants et ma petite-fille merci
pour ce gros sacrifice commun, je sais combien mon absence nous a fait du tort à tous.
A TOI revient toute la Gloire mon Dieu !

3
4
 Liste des tableaux

Tableau n° 1 : Production mondiale du Manioc

Tableau n° 2 : Production africaine du manioc

Tableau n° 3 : Production du manioc dans les pays de la CEMAC

Tableau n °4 : Caractéristiques des 28 marqueurs microsatellites utilisés.

Tableau n°5 : Conditions d'amplification PCR des ADN étudiés

Tableau n° 6 : Paramètres génétiques pour chacun des locus

Tableau n°7 : Accessions avec des génotypes identiques mais d'origine et de noms différents.

Tableau n°8 : Accessions avec des génotypes différents mais de noms identiques ou similaires

Tableau n°9 : Diversité génétique entre les deux groupes selon la méthode de Weir et Cockrham
1 984.

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6
 Liste des illustrations

Figure n° l : Image (organes sexués et tubercules) et photo d'un plant de Manihot esculenta Crantz.

Figure n°2 : Représentation de la diversité d'un échantil lon de 3 3 8 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC Dendrogramme selon la méthode de Neighbour Joining en fonction des

noms des accessions

Figure n°3 : Représentation de la diversité génétique d'un échantillon de 253 accessions de manioc
cultivé dans la zone CEMAC. Dendrogramme selon la méthode de Neighbour Joining en fonction

des noms des accessions par pays

Figure n°4 : Représentation de la diversité génétique d'un échanti llon de 253 accessions de manioc
cultivé dans la zone CEMAC. Analyse factorielle à partir de la matrice des dissimilarités en
fonction des pays

Figure n°5 : Représentation de la diversité génétique d' un échantillon de 253 accessions de manioc
cultivé dans la zone CEMAC. Analyse factorielle à partir de la matrice des dissimilarités par zones
agro-cl imatiques

Figure n°6 : Représentation de la structure d ' un échanti l lon de 253 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC. Assignation des populations par Structure par le modèle admixture des 253

accessions formant deux groupes

Figure n°7 : Représentation des K=2 « populations » identifiées par Structure(a) ; Représentation
des accessions du Gabon et du Tchad (b)

F igure n°8 : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction des critères
Goût(a) et couleur(b) du tubercule.

Figure n°9 : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction des critères
« couleur de la feuille»(a) et « couleur du pétiole »(b ).

F igure n°10 : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction du critère « port
de la plante »

7
8
 Abbreviations et acronyms

-$. FAO : Organi sation des Nations Un ies pour l 'alimentation et l ' agriculture
UMR/AGAP : U nité mixte de recherche/ Amélioration Génétique et Adaptation des
Plantes méditerranéennes et tropicales
CMD : CassavaMosaic Disease
CBB : Cassava Bacterial Blight

CBSD : Cassava Brown Streak disease

.,.. DGRST : Délégation Générale à la Recherche Scientifique et Technologique
AFP : Agence Française de Presse
_. SNP : Single Nucleotid Repeat
RDC : Républ ique Démocratique du Congo
AFLP : Ampl ified Fragment Length Polymorphism
ADN : L'acide désoxyribonucléique
ClAT : Centre International d'Agriculture Tropicale
'* PRASAC : le Pôle Régional de Recherche Appl iquée au Développement des systèmes
Agricoles d' Afrique Centrale
CIRAD : Centre international de la Recherche Agronomique et du développement
CEMAC : Communauté Economique et Monétaire de l ' Afrique Centrale
EMBRAP A : Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria
liTA : International Institute of Tropical Agriculture
-$. IRAF : Institut de Recherches Agronomiques et Forestières
ITRAD : Institut Tchadien de recherche Agronomique pour le Développement
CNRA : Centre National de Recherche Agronomique
SSR : Simple Sequence Repeat
'* RCA : République Centrafricaine
U V : Ultra V iolet
PCR : Polymerase Chain Reaction

9
10
 Glossaire

Accessions :

Clone : copie obtenue par multiplication végétative d'une plante (c'est-à-dire d ' un génotype), ou
en biologie moléculaire, copie d'un gène obtenu par dupl ication

Monoïque : possède des fleurs mâles et femel les en des endroits différents d'un même pied

Allogamie : système de reproduction à fécondation croisée (entre deux individus différents)

Carte génétique : représentation graphique de l 'arrangement des gènes ou des marqueurs

moléculaires d'un génome en tenant compte de leurs distances génétiques.

Allèles : gènes homologues présents à un même locus et ayant la même fonction mais avec des
effets différents

Dicotylédone : En général, les dicotylédones présentent une plantule à deux cotylédons

Hybridation naturelle : a presque toujours lieu entre espèces du même genre, le plus souvent
présentes dans un même mi lieu.

Séquence flanquante : régions bordant la séquence microsatel l ites en 5' et 3 '

Consanguinité : reproduction entre individus apparentés

Diploïde : une plante dont toutes les cellules possèdent deux gènes homologues, sauf les gamètes,
qui sont haploïdes

Distance génétique : distances entre locus liés(génétique formelle, degré de dissemblance

génétique entre deux populations(génétique des populations)

Domestication : adaptation « inconsciente » par l ' homme des plantes à ses besoins

Gène : séquence d' ADN codant pour un ARN, qui est ensuite traduit ou non en protéine

Génome : au sens large, ensemble de gènes d'une espèce ; au sens restreint, ensemble des gènes
d'un individu

Génotype : ensemble de gènes d ' un individu à un ou quelques locus particul iers

Homologue : gènes situés sur le même locus, donc avec la même fonction

Locus : position d'un gène sur le génome

11
12
Marqueur moléculaire : sorte d'étiquette sur la chaîne d'ADN qui peut être révélé au laboratoire
après extraction de l'ADN et traitement par des outils de la biologie moléculaire

Microsatellite ou séquence microsatellite est une séquence d'ADN formée par une répétition

continue de motifs composés de 2 à 10 nucléotides.

Panmixie : système de reproduction dans une population de grande taille dans laquelle la rencontre
des gamètes mâles et femelles se fait au hasard, sans sélection, sans mutation et ni migration. A un
locus, i l conduit à la loi de Hardy-Weinberg qui établie que la composition génotypique de la
population est stable d' une génération à une autre

Pollen : gamétophyte mâle qui donne le gamète mâle.

Variété : population artificielle, à base génétique plus ou moms étroite, reproductibles et de

caractéristiques agronomiques bien défmies.

13
14
 Table des matières

Remerciements................................................................................................................................... 3

Liste d e s table a u x ............................................................................................................................... 5

Liste d e s i l l ustrations .......................................................................................................................... 7

Abbre viation s et a cro nyms................................................................................................................. 9

Glossa i re ........................................................................................................................................... 11

Table d e s matières............................................................................................................................ l5

Introd uction généra le ....................................................................................................................... l7

1. Synthèse bibl iogra phique ......................................................................................................... 2 1

1.1. Im p o rtance éco n o m i q u e d u m a n ioc ................................................................................ 2 1

1.1.1. Le m a n ioc d a n s le m o n d e ......................................................................................... 2 1

1.1.2. Le m a n ioc en Afriq ue ................................................................................................ 2 1

1.2. Le m a n ioc (figu re nol) ...................................................................................................... 23

1.2.1. Com position et util isations ....................................................................................... 25

1.2.2. Ma l a d i e s et ravageurs .............................................................................................. 25

1.3. Origine, d o mestication et d iffu sion (fig u re n o3) ............................................................... 29

1.3.1. Origine et d o me stication du m a n ioc cu ltivé ............................................................ 29

1.3.2. La d iffu sio n en Afriq u e.............................................................................................. 3 1

1.4. La d i ve rsité génétique d u m a nioc..................................................................................... 3 1

1.4.1. La d i versité génétique du m a nioc en Amérique ....................................................... 3 1

1.4.2. La d i versité génétique du m a nioc en Afriq u e ........................................................... 33

1.5. Ca ractérisation et gestion d e s resso u rces génétiq ues ..................................................... 35

1.6. P rése ntation de la zo ne de l 'étu d e: la zone CE MAC en Afriq ue Centra l e ....................... 37

1.6.1. La situation géogra phiq ue et la population (carte a n nexe n ol) ............................... 37

1.6.2. Les zon e s agro-éco logiq ues (carte a n nexe n o2) ....................................................... 37

1.6.3. Le système d 'agricu l t u re ........................................................................................... 37

1.7. Contexte et p roblématique d e l 'étude ............................................................................. 39

2. Maté riel et Méthodes............................................................................................................... 4 1

2.1. La co l lecte et l 'écha nt i l l o n nage d u matériel végéta l ........................................................ 4 1

2.2. Les méthodes.................................................................................................................... 41

2.2.1. L'e xt raction d 'ADN .................................................................................................... 41

2.2.2. Le cho i x d e s m a rq ue u rs m icrosate l l ites ................................................................... 43

2.2.3. Les m éthodes d 'a n a lyse ............................................................................................ 45

15
 2.2.4. L'a na lyse statistique des d o n nées ............................................................................ 49

3. Résultats et Disc u ssio n .

................................................................................... ......................... 55

3.1. Résultats ........................................................................................................................... 55

3.1.1. La q u a l ité des résultats . ..

................................................... .................... . .............. .... 55

3.1.2. La richesse a l lé l iq ue et la d ive rsité génétiq ue de l'échantil l o n (a n n e xe n o 14) ........ 55

3.1.3. Ana lyse de la d ive rsité génétique ............................................................................. 57

3.1.4. Struct u re de la d i ve rsité ........................................................................................... 63

3.2. Discu ssion ......................................................................................................................... 71

Concl usio n et Perspectives ............................................................................................................... 81

Activités réa l isées p e n d a nt le stage ................................................................................................. 83

Références bibl iogra p hiq u e s ............................................................................................................ 85

16
Introduction générale

Le manioc est cultivé dans les pays subtropicaux et tropicaux. Sa production annue l le de tubercules
s'élève à plus de 250 m i llions de tonnes, et se répartit entre l ' Afrique (56%), l ' Asie (3 0%) et
l 'Amérique latine ( 14%), (FAO, 20 1 1 ). Selon la FAO (20 1 0), Je manioc occupe Je quatrième rang
mondial des productions alimentaires végétales derrière le maïs, le riz et le blé. Cependant, c'est
seulement quelque 1 0% de la production mondiale de manioc qui fait l 'objet d'échanges

internationaux.

Cette plante constitue l ' aliment de base pour plus de 500 millions de personnes dans les régions
tropicales et subtropicales (EL-Sharkawy, 2004). E l le est cultivée de manière traditionnel le,
maj oritairement pour ses racines tubéreuses, mais aussi pour ses feuil les. Ses rendements moyens
sont de 20% de ceux obtenus en conditions optimales, il est tolérant à la sécheresse et aux sols

dégradés (FAO, 2008).

Le manioc demeure stratégique pour la sécurité alimentaire et la réduction de la pauvreté dans les
pays producteurs, et la demande pour ses produits dérivés ne cesse d'augmenter. A cela s'ajoute la
demande croissante du continent européen pour l'amidon, les cassettes et la farine. Toutefois, cette

plante cannait plusieurs contraintes abiotiques et biotiques qui limitent sa production effective dans
les zones de production. De ce fait, de nombreux programmes d'amél ioration variétale du manioc
sont développés visant notamment à répondre à l'émergence des bioagresseurs détruisant les
cultures, à l ' adaptation aux conditions abiotiques, à l'augmentation des rendements et à réduire Je

taux en composés cyanogéniques. A cet effet, la connaissance de la diversité génétique du manioc

par l ' utilisation des outil s moléculaires s' avère importante pour mieux cerner les gènes qui sont
impliqués dans les caractères d'intérêt agronomique.

Fort des opportunités à la fois scientifiques, économiques al imentaires et commerciales qu' offre
cette plante , Je Pôle Régional de Recherche Appliquée au Développement des systèmes Agricoles
d'Afrique Centrale (PRASAC) a développé un projet de recherche/Développement financé par la

CEMAC et l ' Union Européenne dans Je cadre du FSTP (Food Security Thematic Program)
EuropeAid : « Production durable du manioc en Afrique Centrale et Intégration aux marchés ». Les
différents partenaires sont le CIRAD (France) et des Centres de recherches nationaux et
Universités des pays membres de la Communauté Economique et Monétaire de l ' Afrique Centrale
(CEMAC) : la DGRST(Congo), I'IRAF(Gabon), l 'U niversité de Bangui (RCA), l ' Université de
N' Gaoundéré (Cameroun), I' ITRAD (Tchad), l ' liTA (Nigeria) est partenaire associé. Le projet

F STP vise à accroître durablement la productivité du manioc et développer l ' accès des producteurs
aux marchés.

17
18
Pour atteindre cet objectif général, plusieurs objectifs spécifiques ont été définis, dont celui qui
nous intéresse, à savoir « la connaissance et la valorisation des variétés cultivées localement ».
Toutes les activités menées dans cette visée permettront de disposer de banques de germoplasme et
de bases de données sur les variétés afin de mettre en place des programmes d 'amélioration et de
création variétale (rapport PRASAC, 20 1 0).
Le stage s'est déroulé au sein de l ' équipe Amélioration des Plantes à Multipl ication Végétative de
I'UMR/ AGAP au C IRAD. Il avait pour objet l ' étude de la diversité génétique du manioc cultivé

dans cinq pays d'Afrique Centrale : le Cameroun, le Congo, le Gabon, la Républ ique
Centrafricaine et le Tchad. Dans la première partie sera présentée une synthèse bibliographique des

connaissances sur le manioc. Après une description des matériels et méthodes uti l isés pour l ' étude
de la diversité génétique, les résultats seront présentés et discutés. Ce travail se terminera par une
conclusion et des perspectives envisagées.

19
Afrique 140 966 470 56%
Amérique 34 3 62 675 14%
Asie 76 68 1 4 5 1 30%
Océanie 193 1 73 0,08%

Total mondial 252 203 769 100%

Tableau n° 1 : Production mondiale du Manioc (Source : F AOSTAT, 2011 )

AFRIQUE CENTRALE 36 255 226 25 .2%

AFRIQUE DE L'EST 28 648 555 20.32%

AFRIQUE DE L'OUEST 76 062 689 53 .96%

Total 140 966 470

Tableau n° 2 : Production Africaine du manioc (Source : FAOSTAT, 2011)

20
 1. Synthèse bibliographique

1.1. Importance économiq ue du manioc

1 . 1 . 1 . Le manioc dans le monde

La production mondiale de manioc en 2011 est estimée à 252 millions de tonnes de

racines, selon les données de l'Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et

l'Agriculture (FAO). Le tableau n°l montre que 140 millions de tonnes de manioc sont
produites en Afrique, qui reste le principal producteur mondial avec une production en

augmentation (environ 13 millions de tonnes entre 2010 et 2011). Depuis le début des
années 70, le manioc est devenu un produit d'exportation notamment demandé par 1 'Union
Européenne qui en a importé 5,5 millions de tonnes en 2005, sous forme de tapioca et
surtout de farine pour l'alimentation du bétail. Le principal pays exportateur reste la

Thaïlande (95% du total mondial) avec 7 millions de tonnes vendues principalement en

Europe, au Japon et en Israël. L'Indonésie et la Chine suivent, avec moins de 300 000
tonnes. L'Afrique exporte peu le manioc.

1 .1.2. Le manioc en Afrique

Selon le tableau n°2 des statistiques de la FAO (20 1 1 ), 1 ' Afrique de 1 'Ouest est la région la plus
productrice, avec le Nigeria premier producteur mondial de manioc (52 403 500 T). Deux autres
pays africains d ' Afrique Centrale, la République Démocratique du Congo ( 1 5 570 000 T) et
l 'Angola ( 1 4 3 3 3 5 00T) sont respectivement second et troisième producteurs. En Afrique le manioc
est maj oritairement produit dans des systèmes de culture traditionnels et constitue une culture
vivrière largement autoconsommée. La consommation de manioc par habitant était de 1 1 5 kg par
habitant en 20 1 0 dans les pays africains contre 1 8 kg dans le reste du monde. Sa vente dans les
marchés urbains constitue une source de revenus non négligeable. Dans un rapport en 2006, la
FAO affirme que de nombreux pays en développement pourraient renforcer leurs économies, et
ainsi accroître les revenus des agriculteurs, en consacrant une plus grande partie de cette culture
bon marché en amidon à valeur ajoutée. L'avenir économique du manioc semble prometteur pour
développer la fi lière internationale. L'évolution de l'alimentation an imale dans les pays industriels

par l ' utilisation des cassettes de manioc et l ' amidon dans les produits alimentaires semblerait
devoir favoriser ce destin. Toutefois, 1 'augmentation des productions devraient prioritairement
répondre aux besoins des populations locales.

21
Cameroun 3 900 000 6 1 .5%

Congo 1 1 50 000 1 8. 1 %

Gabon 292 4 1 5 4.6%

Guinée Equatoriale 66 000 1%

Républ ique Centrafricaine 706 1 1 1 1 1.1%

Tchad 230 000 3 .6%

Total 6 344 526 100%

Tableau n° 3 : Production du manioc des pays de la CEMAC (Source : FAOSTAT, 20 1 1 )

F igure 1 : Image (organes sexués et tubercules) et photo d 'un plant de Manihot esculenta Crantz.

22
 1.1.3. Le manioc en Afrique Centrale

Le manioc est avant tout une culture de subsistance cultivée pour l'autoconsommation. L'Afrique
Centrale participe seulement pour 26% de la production africaine de manioc. Elle devrait au fil du
temps et en fonction des opportunités, acquérir une dimension commerciale transfrontalière voire
continentale.

Dans cette zone, les pays de la CEMAC ont une production non significative d'environ 6 millions
de Tonnes (tableau 3 ), avec le Cameroun comme premier pays producteur de la région (6 1 %).

1.2. Le manioc (figure n°l)

Dans la fami lle des Euphorbiacées, le genre Manihot comprend 98 espèces classées en 1 9 sections
selon la classification taxonomique proposée par Rogers et Appan ( 1 973) d'après une analyse

multivariée des caractères botan iques des spécimens en herbier. Une seule espèce est cultivée,
Manihot escu/enta Crantz. Le manioc est une dicotylédone monoïque, al logame à 2n=36
chromosomes et dont l'hybridation naturelle donne rarement des plantes polyploïdes (2n=3X=54
chromosomes, 2n= 4X= 72 chromosomes) (Hahn et al., 1 990 ; Sardos et al., 2008). Le manioc est
un arbuste qui mesure de 1 à 6 rn de hauteur, avec plusieurs types architecturaux l iés à ses modes
de ramification, à feu i lles pétiolées et à fleurs jaunes en grappes et aux racines tubéreuses riches en
amidon. La tubérisation de ses racines se fait sur des cycles de culture de six mois à trois ans
suivant la variété et le milieu. La plante est adaptée à des conditions environnementales et des
modes de culture très diversifiés et manifeste une forte variabilité dans les caractères
agromorphologiques. Certaines plantes ne fleurissent pas au cours du cycle cultural, par contre,
d'autres entrent plusieurs fois en floraison au cours d'une année suivant les conditions abiotiques

(Matthews et Hunt, 1 994). Bien que la plante soit fertile, la culture du manioc se fait par
multiplication végétative dans les systèmes de cultures par le bouturage de ses tiges (Charrier,

1 997). L'autre forme de propagation est la multiplication sexuée. Le manioc a gardé sa capacité à
fructifier et à produire des graines viables qui vont à maturité s'éclater et se d isperser dans le
champ, puis sont enfouies par les fourmis. Elles entrent en dormance pendant toute la période de la
jachère. De jeunes plants de manioc apparaissent au moment d'une nouvel le plantation. Selon les
contextes des agriculteurs, ces plants spontanés vont connaître des traitements différents : leur
introduction dans le nouveau champ, qui augmente la diversité, ou leur arrachage (El ias, 200 1 ,
Del être, 20 1 0).

23
Figure 2 : Les usages A limentaires et industriels du manioc

24
 1 .2.1. Composition et utilisations

La racine est composée en maj orité d ' hydrates de carbone (91 %), dont 84 à 87% d 'amidon et 4%
de sucres ; ceux-ci apportent 3 S OKcal pour 1 OOg de matière sèche (Sylvestre et Arreaudeau, 1 983),
les feuil les, quant à elles sont plus riches en protéines. Le manioc qui est surtout destiné à
l ' al imentation humaine contient aussi des glucosides cyanogéniques toxiques (la linamarine et la
lotaustraline) qui, sous l'effet d'une enzyme, la l inamarase (une �-glucosidase spécifique présente
dans tous les organes), l ibèrent de l ' acide cyanhydrique et une cétone ( Nartey, 1 969 ; Narstedt,
1 98 8 in Charrier 1 997). Les variétés de manioc cultivées sont c lassées en deux types selon leur
teneur en composés cyanogéniques présents dans les différentes parties de la plante: le manioc
amer (taux supérieur à 80- 1 00ppm) et le manioc doux (taux inférieur à 80- 1 00ppm). Les tubercules
de manioc sont périssables et nécessitent d 'être traités dans les 3 à 4 jours.

La transformation du manioc dépend du type de manioc util isé. Le manioc amer est impropre à la
consommation s ' i l n ' est pas préalablement détoxifié, et les racines séchées sont transformées par
exemple en Tapioca, en cassave ou en farine. La farine de manioc est aussi uti lisée comme substitut
à la farine de froment (F AO, 2008). Le rouissage, le broyage ou râpage et le gri llage des racines
sont également utilisés pour produire la chikwamgue, le gari et l ' attiéké en Afrique. Les racines de

manioc doux peuvent être directement consommées en les faisant bouillir à l'eau, mais peuvent
aussi servir à la préparation des mêmes denrées que le type amer. Les feuilles de manioc sont pilées
et utilisées comme légume dans différents types de préparations.

Le manioc est également uti lisé pour l 'alimentation animale et l ' industrie (amidon, carburant). Les
pays asiatiques comme la Thaïlande produisent en majorité le manioc pour l ' amidon et quelques
pays africains comme le Nigéria et l ' Afrique du Sud emboitent ce pas. L'amidon de manioc est de
bonne qualité par rapport aux amidons issus de la plupart des autres plantes, il est très digestible,
l impide, plus visqueux, avec une grande stabilité dans les aliments acides. D'après Danilo Mejia,
(FAO, 2008), il a aussi d'excellentes propriétés pour les produits non alimentaires
(pharmaceutiques, films thermoplastiques). Les cassettes sont uti lisées comme aliment pour bétail
(Charrier et al, 1 997 ; Dahouda et al., 2008).

1 .2.2. Maladies et ravageurs

B ien que le manioc présente une grande faculté d 'adaptation à d ifférentes conditions écologiques,
les dégâts causés par les maladies et les ravageurs constituent des contraintes énormes qui baissent
fortement la production.

25
26
 1 .2.2 . 1 . Les maladies virales

li est sujet à plusieurs maladies dont la mosaïque africaine, est de loin la plus répandue. Apparue

d' abord en Afrique à la fin du 1 9è siècle (Warburg, 1894 in Fargette, 1 985), elle est véhiculée par
des mouches blanches (Bemisia Tabaci) qui prolifèrent en début des saisons de pluies. Cette
mouche attaque tous les cultivars et se rencontre dans toutes les aires de production du manioc.
Actuel lement, le manioc est menacé par un virus en expansion d ' Est en Ouest à travers le continent
africain. L'ennemi, la striure brune du manioc (CBSD en anglais, pour Cassava Brown Streak
disease), est sournois car à peine visible des fermiers: « Les feuilles paraissent saines mais les
racines (la partie comestible) sont noires, nécrosées, rendant la plante impropre à la
consommation, même animale» (chercheur C laude Fauquet à l 'AFP, 20 1 3 DirectMatin.fr).

1 .2.2.2. Les maladies bactériennes

La bactériose vasculaire ou Cassava Bacterial Blight (CBB) dont la bactérie pathogène

Xanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam) provoque différents symptômes comme des taches
fol iaires anguleuses, des exsudats sur les tiges, des flétrissements des feu i lles et des tiges. En cas
d'attaque grave la plante meure.

1 .2.2.3. Les maladies fongiques

El les sont principalement :

../ L'anthracnose est causée par un champignon qui s'attaque à la surface des tiges et des
feuilles de manioc .
../ La cercosporiose provoque d' importantes défoliations et diminue considérablement la
surface photo-active. I l existe trois espèces de champignons responsables de la
cercosporiose du manioc les principales étant Cercospora henningsii et C. vicosae (Z.
Ambang et al., 2007).

1 .2.2.4. Les ravageurs

Selon Braima et al(2000), les ravageurs attaquent les feUilles, les tiges et les racines de manioc
causant ainsi des dommages importants sur la plante qui peuvent générer des pertes importantes
pour le paysan.
Les ravageurs des feu i lles et des tiges de manioc les plus répandus sont :
../ La cochenille du manioc, Phenacoccus manihoti, apparaît sur les extrémités de tiges de
manioc, donnant un aspect buissonnant ou "bunchy top" Deux autres types de cochenilles
au manioc. Il s'agit de la cochenille verte, Phenacoccus madeirensis et de la cocheni l le à
raies (Ferrisia virgata,

27
 F igure n°3 : Carte de dispersion du manioc dans le monde

Fig. 2 : Dispersi<>n du manioc dans le monde.

28
 ./ L'acarien vert du manioc, Mononychellus tanajoa
./ Le criquet puant (Zonocerus variegatus), Il mâche les feuil les, les pétioles et les tiges
vertes, il cause plus de dégâts sur les plantes plus âgées et en saison des pluies,
./ L'aleurode (Aleurodicus dispersus) secrète une abondante cire qui favorise le
développement des moisissures charbonneuses sur la plante,
./ La mouche blanche (Bemesia tabaci les mouches sucent la sève des feuil les sans causer de
dommages physiques à la plante, mais sont vectrices de maladies virales dont la mosaïque
et la striure brune du manioc,

Les termites, les cocheni lles et les vertébrés sont les principaux ravageurs des tiges et des
racines Principalement on a :
./ Les insectes : les termites, la cochenille de la racine (Stictococcus vayssierri), la cochen i l le
blanche du manioc (Aonidomytilus a/bus),
./ Les vertébrés : souvent ce sont les oiseaux, les rongeurs et les smges. L'agouti
( Thryonomys swinderianus) est le rongeur qui cause le p lus de dégâts.

1 .3. Origine, domestication et diffusion (figu re n°3)

1.3.1. Origine et domestication du manioc cultivé

Manihot esculenta est originaire de l 'Amérique latine. Léotard en 2009, dans son étude sur la
phylogéographie et l'origine du manioc stipule que l'origine du manioc cultivé n'est pas claire bien

que plusieurs études récentes ont abordé cette question (Fregene et al, 1 994; Olsen and Schaal,
1 999, 200 1 ; Elias et al, 2000; Olsen, 2004). Rogers et Appan ( 1 973) ont postulé que le manioc était
le résultat d'événements d'hybridation entre plusieurs espèces, parmi lesquels Manihot aesculifolia
(Kunth) Pohl, une espèce endémique d'Amérique Centrale. Par contre, Allem émet l'hypothèse

d'une seule espèce, Manihot esculenta issue de deux sous-espèces sauvages: Manihot esculenta ssp.
jlabellifolia (Pohl) Ciferri et Manihot esculenta ssp. peruviana (Muell. Arg) Allem (AI Iem, 1 994 ;
Allem et al, 200 1 ). Ces taxons sauvages couvrent une large zone écologique qui part du sud-ouest
de l'Amazonie aux savanes des Guyanes. Des études moléculaires ont favorisé ce dernier scénario,
et montrent que le manioc n'a été domestiqué qu'une seule fois, en Amérique du Sud, sans aucune
contribution des espèces méso-américaines, ou du moins de M aesculifolia (Roa et al, 1 997, 2000;
Olsen et Schaal, 1 999, 200 1 ; Olsen, 2004). L'étude de Duputié en 2007 sur sept autres espèces
Mésoaméricaines montrent que toutes n'ont qu'un rapport lointain avec le manioc, excluant la
possibilité d'une domestication du manioc en Amérique Centrale. Léotard (2009) a ainsi réalisé

d'autres études phylogénétiques et de diversité moléculaire afin de compléter les précédentes qui
présentaient certaines limites notamment, le faible échantillon et les zones de collecte du matériel

29
30
végétal peu représentatives de la zone de distribution du manioc qui couvre un arc encerclant
partiellement le bassin Amazonien, de la Bolivie orientale vers l'ouest à l'est du Brésil Central, et
dans les Guyanes et l'est du Venezuela vers le nord. Les résultats moléculaires sur les haplotypes
ont soutenu l 'existence d ' un seul événement de domestication du manioc au Sud-Ouest de
l ' Amazonie depuis 7000 ans où la diversité de Manihot esculenta ssp.jlabellifolia est la plus é levée
et décroit vers l ' Est et le Nord.

1 .3.2. La diffusion en Afrique

è
Le manioc a été introduit en Afrique au 1 6 rne siècle par les portugais (Jones, 1 959 in Carter et al.,
1 992 ) le long de la côte dans de nombreux ports de commerce, notamment en 1 6 1 1 dans 1' ancien
royaume de Loango. Plusieurs introductions sont mentionnées dans les ports de commerce établis
par les portugais, les plus anciennes en Angola et au Congo entre 1 6 1 1 et 1 640, en Guinée
Equatoriale et Sao Tomé entre 1 682 et 1 700. La culture a été répandue par les Africains à
1 ' intérieur des terres depuis quatre cents ans. En Afrique Centrale, il a été diffusé d'Angola en

Zambie et jusque dans la région des grands lacs. Plus rapidement sa diffusion par les migrations
s'est faite le long du fleuve Congo j usqu'à la République Centrafricaine. D'autres introductions ont

été faites le long des côtes de l 'Afrique de l ' Ouest, de la Sierra Léone j usqu'au Nigéria entre le
1 7 èrne et le 1 8 ème siècle (Carter et al., 1 992). Son introduction en Afrique de l ' Est a donné lieu à des
hypothèses contradictoires, mais semble provenir toujours des Portugais à travers leurs ports du
è
Mozambique ( 1 6 rne s) et sa diffusion dans les terres basses le long de la vallée du Zambèze et
probablement j usqu'à l ' Est de la région des grands lacs. Selon Alpers ( 1 975, in Carter et al. , 1 992),
la diffusion s ' est faite à partir de Madagascar et les îles mozambicaines au 1 8ème siècle. Au 20ème
siècle les gouvernements d'Afrique de l 'ouest ont fait la promotion de cette culture et ont
développé des infrastructures routières qui ont favorisé les migrations (Carter et al., 1 992).

1 .4. La diversité génétique du manioc

La diversification du genre Manihot résulte de plusieurs processus actifs à des époques différentes
en l ien avec les changements bioclimatiques, (Vuilleumier, 197 1 in Charrier 1985), les migrations
humaines (Nassar, 1 978 in Charrier 1 985) et les échanges géniques intra et inter spécifiques.

1 .4.1 . La diversité génétique du manioc en Amérique

Le manioc est cultivé par multiplication végétative par les Amérindiens qui l ' ont domestiqué
depuis près de 7000 ans. Les études menées par Elias (200 1 ) dans un village Makushi en Guyana

31
32
ont montré une forte diversité génétique comparable à celle des variétés provenant de la collection
mondiale du C IA T. Les approches pluridisciplinaires ont montré que la propagation clonale et les
mutations somatiques n ' expl iquaient pas seules cette diversité, mais qu'il existait un système de
culture mixte chez les amérindiens où le brassage sexué génère en continu de nouveaux génotypes
recombinants, incorporés par les paysans dans leurs stocks de variétés cultivées (Elias, 200 1 ). Le
plus souvent ces jeunes plantules sont attribuées à une variété déjà existante, et très rarement
reconnues comme de nouvel les variétés. Ces plantules sont issues des croisements entre variétés
existantes, et parfois d' hybridations interspécifiques (Duputié et al., 2007). La sélection pratiquée
par les agriculteurs, les échanges de variétés entre les agriculteurs et l'incorporation de repousses
d'origine sexuée sont les principaux mécanismes responsables de la grande diversité observée
(Elias., 200 1 ).

1 .4.2. La diversité génétique du manioc en Afrique

L'Afrique qui est la première zone d' introduction du manioc hors Amérique est aujourd 'hui le plus
grand producteur mondial du manioc. L'liTA et les centres de recherche nationaux ont conduit
beaucoup de travaux touchant divers aspects du manioc (Fregene et al., 2003 ; Kisito et al ., 2005 et
2007; Bhattacharjee et al., 20 1 2 ; Kawuki et al., 20 1 3 ). De nombreuses variétés amél iorées ont été
créées par 1 ' liT A, certaines en collaboration avec le C IA T (Centro lnternacional de Agricultura
Tropical) en Colombie. Des études ont été réalisées dans plusieurs pays pour déterminer la
diversité génétique du manioc. Certaines ont portées sur des comparaisons entre les variétés de
l 'Amérique latine et cel les locales des pays africains (Fregene et al, 2003 ; Kizito et al, 2005);
d' autres sur la détermination de cette diversité des variétés locales chez les paysans ou dans les
collections des stations de recherche (Herzberg et al., 2004 ; Turyagyenda et al., 20 1 2 ; Kawuki et

al., 20 13).

Des études sur la diversité fonctionnelle ont également été réalisées, concernant notamment la
résistance aux maladies et ravageurs (Lokko et al ., 2005 ; Omongo et al., 20 1 2) et la création des
variétés avec des taux faibles en composés cyanhydriques (Whankaew et al ., 2 0 1 1 ). La dernière
née peut avoir j usqu' à 6-7 tubercules au lieu des 2-3 tubercules de base avec des rendements de
3 0% plus é levés, tout en résistant aux maladies. Les produits de tous ces travaux font l 'objet d ' une
diffusion à travers l ' Afrique. Ces diffusions de variétés nouvel les expliqueraient-elles sa diversité
génétique? et sa place de premier producteur mondial du manioc? Bien que peu d 'études soient
faites sur les modes de diversification du manioc en Afrique, il semblerait qu'elle n'a pas hérité
lors de l ' introduction des savoirs (détoxification), des pratiques et du mode de gestion concernant
les plantes de manioc issues de graines tel que pratiqué par les amérindiens. (Manu-Aduening et al,
2005, Del être, 20 1 0 ; Kombo 20 1 2). Quel est le mode de gestion par les africains de la diversité
génétique du manioc?

33
34
En Afrique Centrale, le peu d'études réalisées sur le manioc sont restées à l ' échelle d'un pays. Au
Gabon, les travaux menés par Del être en 20 1 0 ont combiné des approches historiques,
sociologiques, ethnobotaniques et de génétique moléculaire, en étudiant les relations entre les
modèles régionaux de la diversité génétique du manioc au Gabon et des réseaux d'échange de
semences. Ces études ont montré que les discontinuités géographiques de la diversité génétique du
manioc étaient liées aux frontières ethnolinguistiques, avec un système matrilinéaire « sud »

caractérisé par des niveaux élevés de diversité variétale et un système patrilinéaire « nord »

caractérisé par une faible diversité variétale. De plus, il a montré dans ces travaux des
comportements différents des agriculteurs, dont certains arrachent systématiquement les plants

spontanés issus de la reproduction sexuée, tandis que d' autres les introduisent en bouturage dans
l eurs plantations. Au Congo, Kombo a évalué en 20 1 2 la diversité de 86 variétés locales et sa
gestion traditionnelle dans le département de Bouenza. Cette étude a révélé que la majorité des
producteurs ne prennent pas en considération la reproduction sexuée dans la diversification du
manioc et l' impact de la mosaïque du manioc sur sa productivité.

1 .5. Caractérisation et gestion des ressources génétiques

La description du manioc se fait pour différents critères génétiques par l'utilisation de marqueurs
moléculaires mais aussi par des critères morphologiques, agronomiques et physiologiques en
utilisant des descripteurs (Emperaire et al, 2003 ). Les microsatellites et les marqueurs AFLP ont été
utilisés pour caractériser les collections de base de manioc. Les analyses moléculaires et
morphologiques ont été effectuées sur les collections de référence pour déterminer leur structure
génétique, évaluer leur composition et proposer des stratégies pour amél iorer la couverture de la
diversité. Les caractéristiques morphologiques sont :

../ la couleur et la forme de la feuille, la longueur et la couleur du pétiole .

../ la couleur de la tige : la couleur, la proéminence des cicatrices pétiolaires et le nombre de
c icatrices sur 3 0 cm
../ L' architecture du port, la couleur et la rugosité du tubercule, la couleur de la pulpe .
../ La date et le nombre des floraisons.

Le CIA T en Colombie possède 6500 accessions et une core col lection de 630 accessions ( Hershey
et al, 1 994, base des données sur le manioc du CGlAR/CIA T). D'autres core col lections existent
dans d' autres pays tels que le Brésil à I ' EMBRAPA établie par Cordeiro et al en 1 995, le Nigéria,
le Kenya et le Cameroun (Bhattacharjee et al., 20 1 2).

L 'llTA maintient en champ une collection de 2544 accesswns en provenance de 28 pays

(Bhattacharjee et al., 20 12). Cette collection est constituée aussi bien de variétés locales que de

35
36
variétés améliorées, localisée sur deux sites à Ibadan ( 1 766) et Ubiaja ( 1 890), dont 1 503 accessions
en doublon sur les deux sites. Des collections nationales existent dans les CNRA (Centres
Nationaux de Recherches Agronomiques). D'autre part, les paysans possèdent des accessions qui
viennent parfois compléter les collections officielles. Ces collections sont entretenues au champ et
comportent des cultivars traditionnels, des variétés développées par certains pays, et des variétés
amél iorées, maj oritairement introduites par l ' liT A. On peut estimer que globalement la diversité

génétique des collections nationales de manioc s'améliore même si, qualitativement, certaines
variétés locales ont disparu à la fois dans des collections et chez les paysans (Kombo et al., 20 1 2).

1.6. P résentation de la zone de l'étude : la zone CEMAC en Afrique

Centrale

1 .6.1. La situation géographique et la population (carte annexe n°l)

S ituée, entre le Nigeria, le Niger, la Lybie, le Soudan, la République Démocratique du Congo et

l 'océan Atlantique, la zone CEMAC couvre une superficie de 30 600 1 40 km2, avec une population
de 44 3 82 000 habitants, soit 1 , 45 Hab/ km2, selon les données de la F AO (20 1 1 ). L'activité
agricole occupe environ 70% de la population totale, notamment les femmes.

1 .6.2. Les zones agro-écologiques (carte annexe n°2)

La CEMAC couvre un territoire sur lequel les terres arables et les cultures pérennes n ' occupent que
20 millions d' ha. La région bénéficie cependant d'une grande disponibilité de réserve en eau
(surtout dans les grandes plaines inondées du Congo et de la RCA, ainsi que les importantes nappes
souterraines du Tchad) et les écosystèmes sont largement dominés par la forêt, les terres arables et
les pâturages (65 mi llions d'ha). Les pays mentionnés ci-dessus se caractérisent par une grande
diversité climatique (climats tropicaux humides et équatoriaux sur la plus grande partie, mais aussi
climats soudano-sahélien, sahélien et saharien). Il en résulte ainsi une grande diversité agro­
écologique du sud au nord : (i) la zone de forêt tropicale humide semi-décidue et sempervirente; (ii)
la zone de forêt tropicale hum ide décidue; (iii) la zone de savanes arbustives humides, et (iv) la

zone de savanes soudanienne.

1 .6.3. Le système d'agriculture

La diversité agro-écologique et climatique et la grande disponibilité en terres arables engendrent

une diversité de systèmes de production : agriculture itinérante sur brû l is en savane arborée sur de
vastes étendues dans la majeure partie des pays. Les exploitations pratiquant une polyculture
associée dominée par les cultures vivrières intégrant plus ou moins l ' élevage et les boisements,
plantations de café, de cacao, palmier à huile, ceinture maraîchère périurbaine de production
intensive.

37
38
Ce système d'agriculture favorise le maintien de la variabil ité génétique grâce à certaines pratiques,
telles que les échanges de boutures entre paysans reposant sur différentes motivations. Délêtre dans
son étude au Gabon (20 1 0), montre que selon la tradition, au Nord du Gabon la femme reçoit des
boutures de sa belle-mère tandis qu'au sud elle les ramène de chez sa mère. Certains agriculteurs
ont un intérêt constant pour la nouveauté ou la nécessité d'obtenir du matériel végétal performant
pour assurer la prochaine plantation (Kombo et al ., 20 1 2).

1.7. Contexte et problématique de l ' étude

L'Afrique Centrale est la première zone de diffusion du manioc en dehors du continent américain .
Depuis le XYlème siècle le manioc y est traditionnellement cultivé à partir des cultivars locaux
descendants de ces premières introductions multipliées végétativement par boutures. Depuis
quelques décennies des variétés améliorées issues des programmes des institutions de recherche ont
été introduites (Mbailao., 2002). Aujourd' hui, cette agriculture est caractérisée par l ' utilisation
simultanée des cultivars locaux et de variétés améliorées. Dans le cadre de notre étude, les cinq
pays prospectés présentent une variabi lité des maniocs cultivés localement à partir des analyses
morphologiques réalisées et des noms des variétés recensés au cours des missions d' enquêtes
réalisées dans chaque pays. L'étude de la diversité génétique des variétés cultivées au niveau de
1 'Afrique Centrale, plus précisément dans la zone CE MAC est cruciale avant la mise en place des
programmes de conservation et d'amélioration variétale, sachant que les études de diversité
reportées dans la littérature sont quasiment inexistantes pour cette zone.
Pour répondre à cette problématique les marqueurs microsatel l ites seront utilisés pour caractériser
la diversité génétique existant au sein de la région et tenter de comprendre son origine et sa
structure. Ces marqueurs, développés depuis les années 80 (Mba et al., 200 1) sont des séquences
répétées en tandem ou Simple Sequence Repeat(SSR). Chaque microsatel l ite est bordé par des
séquences uniques qui lui sont propres et tendent à être conservées à l ' intérieur de l ' espèce. Leur
intérêt réside dans le fait qu'ils sont répartis sur tout le génome des eucaryotes, ont des motifs
courts, une taille attendue du fragment, sont stables, spécifiques, reproductibles, abondants, co­
dominants et polymorphes (Mba et al ., 200 1 ; Kawuki et al, 2009. Rabbi et al., 20 1 2).
Ainsi, le but principal d e notre étude est d e déterminer la diversité génétique du manioc cultivé des
pays de la CEMAC. La diversité morphologique observée est-el le aussi génétique? Une
structuration géographique existe-el l e en fonction des pays ou des zones agroclimatique?

39
40
 2. Matériel et Méthodes

2.1. La collecte et l 'échantillonnage du matériel végétal

L'étude a porté sur 3 7 1 accessions collectées dans 5 pays de la CEMAC. Les prospections ont été
effectuées dans le cadre du projet PRASAC dans les sites d'études choisis dans chacun des cinq
pays (Carte des sites de collecte annexe n°3). Ces derniers sont des bassins de production choisis
dans différentes zones agro-climatiques. Les prospections ont été faites en col laboration avec les
responsables locaux, qui ont facilité le contact avec les paysans dans les villages. Dans chacun des
sites, dix villages sont ciblés. La méthode adoptée dans cette phase de l ' enquête est le « focus
group ». En arrivant dans chaque village, les enquêteurs-col lecteurs organisent une réunion avec

les paysans dont les objectifs sont de recueillir les informations sur le village, faire l ' inventaire des
variétés de manioc cultivées et des variétés abandonnées et de présenter les protocoles d'enquête.
Une autre enquête sur les exploitations et les variétés est réalisée au champ. Dans chaque v illage
sont choisis quinze ménages producteurs de manioc afin de connaitre les exploitations de manioc,
la description des variétés cultivées, les techniques et les usages (les pratiques cul inaires et
médicinales). Lors de la collecte du matériel cultivé sa description morphologique et le traitement
des feuil les sont faits suivant le protocole en annexe n°4.

Seulement, 365 accessions étaient exploitables pour l 'extraction de l ' ADN génomique. Les
sites de collecte sont au nombre de 2 1 : quatre sites du Cameroun ( 1 04 accessions), trois du Congo
(90 accessions), deux du Gabon ( 48 accessions), trois de la RCA ( 1 02 accessions), complétés par
des accessions déjà en col lection pour un total de 20 accessions, et cinq du Tchad (2 1 accessions).
Le Tableau de toutes ses accessions avec les caractéristiques morphologiques sont présentés en
annexe n°5 .

2.2. Les méthodes

2.2.1. L'extraction d'ADN

On a extrait de l ' ADN génomique des 3 65 accessions selon le protocole de Risterucci et al ( 2000)
adapté (annexe n°6). La concentration de l'ADN génomique est estimée par quantification sur gel
d'agarose à 1 % (annexe n°7) et par fluorimétrie (Fluoroskan Ascent) pour une meilleure précision
de la concentration (protocole annexe n°8). Les ADN ont ensuite été dilués à 5ng/ll l .

41
42
 2.2.2. Le choix des marqueurs microsatellites

Pour garantir des résultats satisfaisants de notre étude de diversité, la sélection des microsatel lites a
été faite en trois étapes. Une recherche bibliographique de ceux qui ont été cartographiés (Mba et
al., 200 1 ; Kunkeaw et al., 20 1 0 ; Sraphet et al., 20 1 1 ; Whankaew et al., 20 1 1 ; Rabbi et al., 20 1 2) et
qui ont une bonne répartition sur les 1 8 groupes de liaison du génome cartographié du manioc
(Prochnik et al., 20 1 1 ). Puis, une identification de ceux qui ont déjà été util isés pour une étude de
la diversité génétique (Kawuki et al., 20 1 3 ) et qui avaient présenté un polymorphisme élevé. Une
troisième étape a été de privilégier les microsatel l ites déjà utilisés au CIRAD pour des travaux de
diversité génétique sur le manioc par Kosh-Komba et Moyib (20 1 0). Finalement, 28 microsatel lites
ont été choisis, dont les caractéristiques sont dans le tableau n°4.

43
 marqueurs G roupe de liaison Motif Ta(0) utilisée Left primer Right Primer Taille (pb)
E M E I 77 1 O(w), 6(k) (CAA)4 59 ATACAGAGGCATCCTTCCC GCAGTCGTCATTGTTGTGTC 1 80

EME20 3(k) (ATG)9 55 CAGCACCAGTCAACATTCCTG CCTTCTGGCAATGAGCTCATG 240

EME222 4(s) (GAT)6 59 CCCACTCTCTGTCCACTTC CTTCGACTCTTCTTTACGGG 1 90

EME260 5(k,s,w) (AT) 1 4 50 GTTGGAGTTGTAGTTGCTGC CATGGGCTGTGAAAATGAACT 1 60

EME303 1 (w), 3(s), 7(k) CT I I 50 ATTGGGAAGCATTGGTGTAGAA CACAAACAAAACCCTGTGACCT 1 80

EME33 1 1 2(k,s,w) GCA5 50 GAAGAGCATCAGGGCAAATC GATTGTAGGGATTGACGGCT 1 60

EME353 l (k) (TGGTGA)4 55 GATACTCCCCAAAACCAACAAG ACCTGCCTGAAACTCTTGCTAA 1 70

EME373 3(w) (TGG)7 50 GAAGAGCATCAGGGCAAATC GATTGTAGGGATTGACGGCT 1 60

EME4 1 2 l (k,s) (AG) 1 2 50 GCATTACGAACACATACAGTG GGCAACGCAATTCTACTGCT 1 60- 1 90

EME637 6(k) (AG) 1 4 55 ATCTATCGCCTCCTGAAACCTT CAAACCAAACTCTCATATCGCC 200

SSRY I OO 2(k,s,w) (CT) 1 7TT(CT)7 50 ATCCTTGCCTGACATTTTGC TTCGCAGAGTCCAATTGTTG 210

SSRY I O I 9(k,s,w) (GCT) 1 3 55 GGAGAATACCACCGACAGGA ACAGCAGCAATCACCATTTC 213

SSRY 1 2 1 1 (k) (CA) 1 9 55 AACTGTCAAACCATTCTACTTGC GCCAGCAAGGTTTGCTACAT 266

SSRY I 69 1 (m ) (GA ) I 9A3GAA2 50 ACAGCTCTAAAAACTGCAGCC AACGTAGGCCCTAACTAACCC 1 00

SSRY I 70 6(k) (TA)5(N)7 1 (CT)24 55 TCTCGATTTGGTTTGGTTCA TCATCCTTGTTGCAGCGTTA 299

SSRY 1 9 1 4(w) (CT)8(CA) 1 8 55 TGTAAGGCATTCCAAGAATTATCA TCTCCTGTGAAAAGTGCATGA 214

SSRY30 5(k,s,w) (CT)22 50 CCATCCACTAGAAACTTTAAAAGCA CAACTCAGCGGAGCTTTTTC 220

SSRY38 l (m) (CA) 1 7 55 GGTGTTCGTGATCCTTATTAAC GTAGTTGAGAAAACTTTGCATGAG 1 22

SSRY45 3(k,s) (CT)27 55 TGAAACTGTTTGCAAATTACGA TCCAGTTCACATGTAGTTGGCT 228

SSRY55 2(k,s,w) (GA ) I 6 50 GCAATTTGCAAAGACATACCA TGTGGAGCTTGATTTTGCAG 1 45

SSRY6 1 1 1 (s,w) (CA) 1 2 55 GGCTGCTTTACCTTCTACTCAGA CAAGAACGCCAATATGCTGA 233

S S RY63 1 1 (w) (GA) 1 6 55 TCAGAATCATCTACCTTGGCA AAGACAATCATTTTGTGCTCCA 290

SSRY64 3(k,s) (CT) 13CG(CT)6 55 CGACAAGTCGTATATGTAGTATTCACG GCAGAGGTGGCTAACGAGAC 1 94

SSRY78 1 4(w) (CT)22 55 TGCACACGTTCTGTTTCCAT ATGCCTCCACGTCCAGATAC 248

SSRY8 1 1 1 (k,s,w) (GA)22 55 TTCCTTTCATTCATCCTGGC AGAACTTCATGCACACAAGTTAAT 203

SSRY82 1 0(k,s,w) (GA)24 55 TGTGACAATTTTCAGATAGCTTCA CACCATCGGCATTAAACTTTG 211

SSRY9 l (m) (GT) 1 5 55 ACAATTCATCATGAGTCATCAACT CCGTTATTGTTCCTGGTCCT 278

SSRY9 1 1 6(w) (GA) I 6 55 GTCTGCATGGCTCGATGAT TGCCTGCTTCATATGTTTTTG 300

Tableau n°4: Caractéristiques des 2 8 marqueurs microsatel lites uti l isés. S S RY par Mba et al, 200 1 ; EME par Kunkeaw et al., 20 1 0

rn : Mba et al, 200 1 ; k : Kunkeaw et al., 20 1 0 ; s : Straphet et al., 20 I l ; w : Whenkeaw et al., 20 1 0 Ta= Température d ' ampli fication

44
 2.2.3. Les méthodes d'analyse

2.2.3 . 1 . L'amplification par PCR

Pour amplifier spécifiquement chaque locus, les 3 65 accessions ont été réparties dans des plaques
3 84. Dans chacune des plaques on a ajouté deux ADN de référence d' accessions obtenues de
1 ' liTA ( Ibadan, Nigeria) étudiées précédemment au CIRAD (TMS 1 997032 et TM S 1 960860). Le

plan de plaque est en annexe n°8.

Chaque amorce spécifique du marqueur microsatel l ite est prolongée à son extrémité 5 ' forward par

une queue universelle M 1 3 (5'-CAC GAC GTT GTA AAA CGA C-3 ') sur laquel le se fixeront les
fluorochromes (6-FAM, NED, VIC ou PET) qui fluorescent lorsqu' ils sont excités à une certaine
longueur d' onde.
Les réactions de PCR sont réal isées dans un volume final de I OJ..L I contenant 25ng d'ADN, du
tampon PCR l X, O,SmM de MgCb, 200J..L M de chacun des dNTP, 0,08J..L M de l 'amorce spécifique
contenant la séquence M 1 3 , O, I J..L M de la seconde amorce spécifique, O, I J..LM de queue M 1 3
marquée par un fluorochrome (6-FAM, NEC,VIC ou PET), et 2 U de Taq polymérase.
Les températures d'amplification ont été adaptées pour chaque marqueur microsatel lite entre 50 et
59°C suivant le tableau en annexe n°9.
Les conditions de PCR ont été comme indiquées dans le tableau n°5.

Phases

Dénaturation initiale
Cycles Température

94°C
Durée

5 minutes
'
Toucbdown 94°C 45 secondes

X l ü cycles 64°C, -.5°C par cycle 1 minute

noe 1 minute 1 5 sec

Amplification 94°C 45 secondes

X 25 cycles 59°C 1 minute

55°C
50°C

noe 1 minute

Elongation finale noe 3 0 m inutes

Maintien I 5 °C Fin

Tableau n°5 : Conditions d'amplification PCR des ADN étudiés

45
46
Le système ABI permet de détecter cinq fluorescences différentes à cinq longueurs d'onde. Nous
avons multiplexé les produits PCR obtenus par les différents marqueurs microsatel lites en fonction
de la tail le des allèles et selon le marquage des amorces par l ' un des quatre colorants : FAM, NED,
VIC, ou PET. Pour faire le choix des couleurs et des amorces à marquer, on util ise l'application
WEB Grouper sur le site intranet du CIRAD. Pour cela, nous avons préparé un tableau dans Excel
contenant les informations suivantes : Nom du marqueur, taille minimum et taille maximum des

al lèles. On spécifie le nombre de marqueurs que l 'on veut par groupe, puis le minimum de distance
de 1 5 pb entre l 'allèle de tai l le maximale du premier marqueur et l ' allèle de tai lle minimale du
deuxième marqueur. Web Grouper tri et distribue les marqueurs dans des groupes en fonction de
tous ces critères afin d'éviter le chevauchement lors de la lecture sur le logiciel GeneMapper. Au
final, nous avons quatre panels de sept marqueurs.

2.2.2.2 . L'analyse microsatellite par électrophorèse capillaire

E l le permet d' évaluer la tail le des fragments d ' ADN amplifiés. 1 Of.ll du marqueur de tail le
Genescan600-LIZ S ize-standard V2.0 sont ajoutés à 2f.ll d'aliquot du mélange des produits
d'amplification (protocole annexe n° 1 0). Les ADN amplifiés sont ensuite dénaturés à l 'aide d'un
thermocycleur (94°C pendant 5 minutes), puis soumis à l'électrophorèse capillaire sur séquenceur
ABI 3 5 00XL (Applied Biosystems). Le principe de fonctionnement du séquenceur est expliqué en
annexe n ° l l .

2.2.2.3. Lecture des profils sur GeneMapper (Protocole annexe n°12).

Le logiciel Genemapper® (Applied Biosystems 2007) est utilisé pour obtenir les génotypes des

accessions. On télécharge sur le logiciel les fichiers d' images fournis par le séquenceur ABI. On
crée un projet contenant le nom des marqueurs, le nom des fluorochromes avec lequel ils ont été
amplifiés et les tailles minimale et maximale de chaque marqueur. Ces données sont regroupées
sous forme de panels. Dans notre cas, nous avions quatre panels pour chaque plaque ABI qui
contenait tous les ADN. Sur la grille nommée échantillons on renseigne la méthode d' analyse, le
type de run, et le nom du panel auquel appartient chaque groupe d' individus. Avant la création des
allèles, il faut vérifier l ' interprétation du marqueur de tai lle et le corriger si nécessaire. Pour
accepter les pics observés, une étape d'affectation des bins est réalisée (emplacement prédéfini sur
l ' électrophorégramme, où le logiciel est censé détecter un allèle). La distance entre les bins
respecte la tail le du motif du microsatel l ite. Les pics hors des bins, des profils i l l isibles et de tai l le
très faible sont refusés. Dans le cas où les profils sont illisibles, les analyses (PCR et

électrophorèse) sont répétées. On récupère en sortie un fichier donnant les tai lles d'allèles pour

47
48
chaque individu pour le marqueur étudié. Ces fichiers sont exportés dans un tableur Excel et sont
concaténés pour obtenir une matrice allélique par locus et par individu.

2.2.4. L'analyse statistique des données

2.2.4.1 . Estimation des paramètres descriptifs d e l a diversité

Les données statistiques de la diversité génétique au sein de l ' échantil lon (les cinq pays) de manioc
ont été calculées. Sur l'ensemble des groupes de génotypes, nous avons calculé cinq paramètres
pour décrire la diversité génétique de notre échantil lon: le nombre moyen d'allèles par locus (A), le
taux moyen d ' hétérozygotie observée (H0), le taux moyen d'hétérozygotie attendue (He), le taux
moyen d'hétérozygotie attendue non biaisée (Hnb) et le F is. Ils sont estimés pour chaque locus et la
moyenne est prise sur l 'ensemble des loci. Le logiciel CREATE nous a permis de mettre en forme
les tableaux d'analyse pour les logiciels FSTAT et GENETIX qui ont été utilisés pour ces analyses.

Le nombre moyen d'al lèles par locus (A), est calculé selon la formule : A = IaJL,
où a = le nombre d'allèles à un locus et L = le nombre de loci étudiés.

Le Taux d'hétérozygotie observé (Ho) est la proportion d'individus hétérozygotes au locus K

comme dans la formule : Ho = Œk�t p ij)IL

où Pii = l 'estimation de la fréquence du génotype ij au locus k et ak� le nombre d'allèles au locus k.

Le Taux d'hétérozygote attendu (He ) est calculé, sous l 'hypothèse d'équilibre de Hardy-Weinberg,
à partir des fréquences alléliques déterminées pour chaque locus à l'aide de la formule : He = 1-
I(pi)2 où Pi est la fréquence du ième allèle à ce locus.

Nous uti l isons l 'estimation non biaisée (Hnb) de Nei ( 1 978) qui s'obtient selon la formule : Hnb =
(2ni(pi)2)/(2n-1) où n est le nombre d' individus étudiés.
Le F is mesure l 'écart de l ' hétérozygotie par rapport à l 'équilibre Hardy-Weinberg (EHW). Il est

défmi par la relation : Fis = (He-Ho)/He. Cet indice mesure la réduction éventuelle de
l 'hétérozygotie des individus à l' intérieur de l 'échantillon .

Les fréquences alléliques et l e nombre d'allèles rares, définis comme ceux ayant une fréquence
inférieure à 0.05 ont aussi été calculées pour chaque locus.

49
50
 2.2.4.2. L'Analyse de la diversité génétique

L ' indice de clonalité de l ' échanti l lon a été calculé suivant la formule IC =GIN G=nombre de
génotypes observés N= nombre d'accessions analysées. Plus i l est proche de 1 , plus la population
tend vers un système de reproduction sexuée, plus il est proche de 0, plus il tend vers un système
strictement clonai .

Les données génotypiques obtenues ont permis de calculer des dissimilarités entre accessions. Ce
calcul est fait à partir de l ' indice simple matching selon la formule :

Dij = (1 - 1/L) L�=l (mljn) .

Dij = dissimilarité entre les individus i et j ; L= nombre de loci ; TI = ploidie et m l = nombre
d'allèles matchés par locus. Cinq cents bootstraps ont été effectués pour établir la robustesse de
l ' arbre. Ces bootstraps sont réalisés à partir de l ' arbre initial obtenus des indices simple match ing.
Son principe est qu'il réassocie les individus au hasard avec remise afin d'estimer le nombre de fois
qu'une arête de l ' arbre est tirée sur le nombre de tirages choisis.

Une matrice des dissimilarités est générée de ces indices et permet de réaliser deux représentations

complémentaires mais avec des approches différentes pour représenter graphiquement la structure
de la diversité génétique : la PCoA (Principal Coordinates Analysis) et le dendrogramme par la

méthode Neighbour Joining en utilisant le logiciel DARWIN version 5.0 (Perrier et al ., 2006).

1) Le Dendrogramme est construit par la méthode du Neighbour Joining (Saitou et Nei

1 987) sur la matrice des dissimilarités. Pour les valeurs de dissimi larités obtenues DARwin
assigne chaque individu de l ' analyse à un génotype. Ces génotypes sont ensuite placés dans
l ' arbre les uns par rapport aux autres en fonction de la distance génétique qui les sépare.
Des groupes génétiques peuvent ainsi se former ainsi que les répétitions de génotypes.

2) L'Analyse Factorielle (PCoA), elle permet de voir la structure d'ensemble des données
dans un espace défini suivant les distances entre les individus deux à deux selon la
formule : l:(dij-8ij)2 dij = distance observée entre i et j ; ùij = distance entre les projections
de i et j sur l'axe l , le deuxième axe perpendiculaire au premier exprime l ' indépendance
entre les individus.

La structure de la diversité est testée par l 'application d' une méthode Bayésienne de regroupement
avec le logiciel STRUCTURE version 2.3 (Pritchard et al., 200 1 ) en uti lisant le modèle

51
52
d'admixture. Ce modèle bayésien suppose l 'hypothèse de la panmixie dans chaque k population.
Initialement, la longueur de la période de run de la chaine de Markov Monte Carlo (MCMC) est de
1 0.000 répétitions pour K al lant de 1 à 1 0 (Nombre de populations présumées dans le modèle) avec
dix répétitions, afin de trouver la meilleure partition. La statistique �K, qui est basée sur un taux de
variation de la probabil ité de log des données entre les valeurs successives de K, a ensuite été
utilisée pour détecter le nombre réel des populations K dans l ' ensemble de données (Evanno et al.,
2005). Les populations déterminées K ont été reprogrammées pour un run avec un MCMC de
1 00.000 répétitions pour vérifier sa cohérence. Un coefficient d'adhésion de Q >0,8 a été util isé
tout au long de l' analyse.

53
Tableau n° 6: Paramètres génétiques pour chacun des locus

Nombre Allèles
Locus Ho He H(nc) Fis
Allèles rares
SSRY 1 70 8 2 0 . 89 0.8 1 0.82 -0.099

SSRY 1 69 5 2 0.50 0.47 0.47 -0.065

SSRY I 0 1 6 1 0.88 0.70 0.70 -0.252

SSRY9 1 3 0 0.74 0.63 0.63 -0. 1 86

SSRY82 7 4 0.84 0.70 0 . 70 -0.203

SSRY78 5 1 0.72 0.71 0.72 -0.003

SSRY64 6 0 0.93 0.8 1 0.8 1 -0. 1 56

SSRY63 4 1 0.52 0.5 1 0.5 1 -0.022

SSRY6 1 4 1 0.50 0.50 0.50 -0.008

SSRY45 6 1 0.88 0.78 0.78 -0. 1 22

SSRY3 8 3 2 0.03 0.03 0.03 -0.0 1 0

SSRY30 3 1 0.48 0.49 0.49 0.010

SSRY 1 9 8 3 0.88 0.77 0.78 -0. 1 3 8

SSRY 1 2 5 1 0.63 0.66 0.66 0.041

SSRY9 6 1 0.75 0.7 1 0.7 1 -0.053

EME637 4 0 0.72 0.68 0.68 -0.068

EME3 5 3 4 2 0.4 1 0.40 0.40 -0.045

EME33 1 2 0 0.4 1 0.3 8 0.38 -0.082

EME303 3 0 0.67 0.63 0.63 -0.073

EME260 6 3 0.70 0.69 0.69 -0.026

EME222 4 2 0.36 0.33 0.33 -0.096

EME 1 77 2 0 0.42 0.34 0.34 -0.23 8

EME20 6 3 0.55 0.49 0.49 -0. 1 1 7

TOTAL 1 09 32 1 4.43 1 3 .2 1 1 3 .23 -2. 0 1

Moyenne 4.74 0.627 0.574 0.575 -0.087

54
 3. Résultats et Discussion

3.1 . Résultats

3. 1 . 1 . La qualité des résultats

Sur les 3 65 accessions génotypées avec 28 marqueurs, 27 avaient 1 00% de données manquantes et
ont été exclues de l ' analyse. Les conditions de conservation lors de la collecte de matériel végétal
ont influencé la qualité des feuil les séchées et celle de l ' ADN extrait. Sur les 28 marqueurs, 5
(SSRY5 5, SSRY l OO, EME4 1 2, SSRY8 1 , EME3 73) ont été éliminés avec des profils i l l isibles

Seuls 23 présentaient des données bien lisibles (Annexe n ° 1 3).

3.1 .2. La richesse allélique et la diversité génétique de l'échantillon (annexe

n°1 4)

Les 23 marqueurs ont permis de détecter 1 09 allèles pour l 'ensemble des loci soit un nombre
moyen d'allèles par locus de 4.74. Le nombre d'al lèles varie entre 2 pour les marqueurs EME33 1 et
EME 1 77 et 8 pour les marqueurs SSRY 1 70 et SSRY 1 9; 9 marqueurs ont plus de 6 allèles. Les
fréquences alléliques vont de 0.00 1 5 pour le SSRY30 à 0.98 pour le locus SSRY3 8 qui présente un
fort taux d' homozygotes. Le taux des allèles rares est de 29.3 %, ils apparaissent sur la majorité des
loci (tableau n°6) à l 'exception des SSRY9 1 , SSRY64, EME 1 77, EME303, EME3 3 1 et EME637,
qui ne présentent aucun allèle rare.
L ' hétérozygotie Ho moyenne observée sur l ' ensemble des locus est de 0.627, l ' hétérozygotie
moyenne attendue (He) vaut 0.574. Le H(nb) est identique au He pour l 'ensemble des loci et sa
moyenne est de 0.575. A l 'exception des SSRY3 0 et SSRY 1 2 qui ont des Fis positifs, tous les
autres locus ont des Fis négatifs, et le Fis moyen indique que notre échanti l lon présente un excès
d ' hétérozygotes et une situation de non équi libre de Hardy Weinberg. Le test sur permutations

( 1 000) des allèles à l ' intérieur de la population sous l 'hypothèse nulle Ho : Fis>= 0 a donné un Fis
sign ificatif de -0.087 à 95% d'intervalle de confiance (-0 . 1 0969- -0.07824] .

55
 QI------< 0. 1

Figure n°2 : Représentation de la diversité d'un échantillon de 3 3 8 accessions de manioc cultivé

dans la zone CEMAC. Arbre construit par Neighbour Joining par nom à partir de la matrice des
dissimilarités (seules les valeurs de bootstrap >50% apparaissent ainsi que les noms des
accessions).

56
3.1 .3. Analyse de la diversité génétique

Le dendrogramme construit par la méthode de Neighbour joining à partir de la matrice des

dissimilarités (figure n°3) nous a permis d' observer les accessions avec des génotypes identiques. I l
apparaît que sur 3 3 8 variétés analysées 85 sont des doublons, c e qui réduit le nombre d e génotypes
à 253, soit 25% de clones (Tableau n°7). L ' indice de clonal ité calculé est de 253/3 3 8, soit 0.75 .
Nous notons que la RCA présente particulièrement plus de génotypes identiques que les autres
pays. Nous observons diverses situations sur ces accessions :

Cas n ° 1 : des accessions de même génotype mais avec des noms différents. Ces accessions peuvent
avoir été collectées dans des vil lages différents du même site comme les accessions Mauritanie et
Madama collectées sur le site de Loudima au Congo, l ' une au village Soulou et l 'autre à
Kihoungou ; ou dans des sites différents, par exemple Lisette et Ngali Moré col lectées
respectivement dans les sites de Béroukou et de Daradja Nadji Kélo au Tchad.
Certains génotypes ont également été collectés dans plusieurs pays, par exemple l ' accession
connue sous le nom de Moudelepakou, col lectée dans le village Mbougou du site
Loudima (Congo), présente le même génotype que l 'accession Fada retrouvée dans ce même
vil lage. Le même génotype a été trouvé au Gabon dans les villages de Derrière la carrière et de
Mougola sur le même site Tchad, sous les noms de Ditadi et Letidi, et également au Cameroun
sous le nom de Redcasala dans un village inconnu du site d'Ekona, et sous le nom d'Ekobele dans
le village B iyeyem du site « 3 ».

Cas n°2: certains individus qui ont le même génotype ont aussi le même nom c'est le cas de la

variété C laire en RCA, qui a été collectée dans deux villages (Zawa et Bekamone) du site de
Yaloké. Deux autres accessions, Kessembin, collectée dans le village de Ladoumi sur le même site
de Yaloké, et Wango, collectée sur le site de Sibut, présentent également le même génotype.
Les noms peuvent être très légèrement différents. Par exemple les accessions Dimbouana (court) et
Dimbopuana (long) col lectées dans le vil lage de Moundi, site de Loudima (Congo) présentent le
même génotype, bien qu' une caractéristique morphologique différente ait été reportée. Une
troisième accession de même génotype a été collectée à Mpila sur le même site, sous le nom de
Dimbouna.

57
 PAYS INDIVIDUS A GENOTYPES IDENTIQUES

CHAQUE CAMEROUN GANTARANG-NGANFADA-NANA

PAYS MANANG (6MOIS)= MANTONKASSALA

GUEGUERAN3=MANANG = 6MOIS

IC = 0.76 NGOAKELE = GUIFOGUOFOGUE

-
NYLON=MANIOCBLANC=NYLON=MANIOCBLANC= LIKWAMBHETENA

-
MANIOCPATATE=MANIOCSELECTIONNE

CONGO -
BERTILLE- PASTEUR

-
KmGNOUMBA=MOUDOUMA=MOUDOUMA

-
DIKONDI=ONTSOUANI= DlKONDI= DIKONDI

-
MFOUHONDZI= MFOUHONDZ!

IC = 0.77 -
YEKAMA=HOLLE=MFOUTEKE (sont du même village)

-
NCH!KOUKOUNAFEMELLE= TCH!TOULACH!MINOMBA

-
PIACORESUCRE= MATALANA

-
MAURJTANI=MADAMA

DlMBOUANA (court) = KITS lARA= D!MBOUANA (long) = DlMBOUNA

GABON ENDONDO=!ZEZ!E

MAMBIKINI= MAMB!KINI

MAMBIANAMB!A= MBOMAROUGE

IC = 0.85 -
JAUNE=KWATA

-
MANBIKINI = JAUNE

-
MUNZOUMBA= MUNZOUMBA

RCA - KALOUGOUSSOU- KALOUGOUSSOU

- ZAOROUNMBISSEIII=ZAONOUMBISSE

-
BAMBARJII=BAMBARJ

-
OMBELLA=YAKANDJI= OMBELLA

-
RENDRE=TOUBDIARA

IC = 0.65 - ABOUNDOU= KOHONENANG= GOZOBANGUI=MANDEREPAKO

JPN=YAMBA YOU=JPN

P!ACORESUCRE=MFABIALA

GABON=ICRA= ICRAROUGE

ADOU=CIMETIERE

-
BATAMOLENGUE= DONGO=BABOLO

-
MALGARE= ZAGBANG

- GIODOFONDO =CASANONIGERIA

-
W ANGO= CLAIRE=CLAIRE= KESSEMBIN

-
ICRA= BENDOUNGA

- TOUNGUELAG= OBOUNGALE = BOZIZI= ADJETE= 6MOIS

TCHAD -
TmODJIDNK=NDABRA

-
6 MOIS EPBLANCHE= BAGGA

IC = O.S - LISETTE= NGALIMORE

-
YANDRAKONO = VARIETE BEROUKOU

ENTRE -
VICTOIRE (RCA) = KJSSIATA(Congo)

PAYS BASSOLO(cameroun) =AGRICOLE= EKOBELEI =MBOUT =SITA=MEBUND =GlC= SONGLO(Cameroun)

=NGON'OYEM (Gabon) = AKWAMABONG (Cameroun)

-
MFOUDELEPAKOU(Congo)= REDCASALA (Cameroun)= FADA (Congo )=DIT ATl (Gabon)=

LETEDI(Gabon)= REDCASALA (Cameroun)

- NOLA( RCA)= ZETENAMBONGO( RCA )= CIMET!ERE( RCA )= NOLA( RCA) = 6MOIS (cameroun)

-
OMBETE=EXPRESS= BESSANNWE = LABOUR (ombété)

- DITAD! (Gab) = MONDEREPAKO (RCA)

- CAMEROUN (Tchad) = ZAEBOMAJE(CAM)

Tableau n°7: Accesswns avec des génotypes Identiques mais d'ongme et de noms différents. IC=
Indice de c lonalité

58
Ce dendrogramme nous a également permis d' identifier des accessions de même nom ayant des
génotypes différents (tableau n°8). Nous avons relevé 39 cas. Ces accessions peuvent différer par
un allèle c ' est le cas de Ditadi au Gabon, Dikondi et Kingnoumba au Congo dans deux sites
différents. En dehors de ces accessions, le nombre d'allèles qui créent la différence entre ces
homonymes est compris entre 2 et 3 3 . Pour exemple en RCA les accessions Zaoroumbisse et
Zaoroumbisseiii ont 1 5/46 allèles de différence sur 1 5 locus et l 'accession C laire (RCA) présente 5
allèles sur 5 locus de différence. La plus grande différence concerne les accessions « Tinodj i »,

présentes au Tchad, avec 3 7/46 allèles de différence sur 20 locus.

Les accessions ont rarement été collectées dans le même village (4cas 1 39), plus souvent dans des
villages différents du même site pour chaque pays (23 cas /39), parfois dans des sites différents
( 1 3/39) et même dans des pays différents (4/39).

59
Noms de l'accession Village Pays Nombre d'allèles différents (/46) Nombre de loci concernés(23)

Site

Kingnoumba Kingoualakola Loudima Congo 1 1

K ingnoumba Kihoungou Loudima

Di kandi Ntoula Odziba Congo 1 1

Di kandi Soulou Loudima

Dikondi Kihoungou Loudima

Mumpe NC Ngaoundéré Cameroun 2 1

Mumpe NC Bertoua

Ditadi Derrière la carrière Tchad Gabon 1 1

Ditadi Mbenga Tchad

Claire/ Békamone Yaloké RCA 5 5

Claire l l l Ngawi Yaloké

Manbikini Marée Tchad Gabon 15 12

Manbikini Mandjoyi Tchad

Manbikini Manga Tchad

Ngantsa lm barna Odziba Congo 7 7

Ngantsa Yié Odziba

Ngantsamobali Odziba Odziba

Dimbouana(court)/ Mouindi Loudima Congo 20 15

Dimbounal Mpila Loudima

Dimbopuana(Long) Mouindi Loudima

Dimbouana Lessaras Hinda

Moudelepakou Mbondila Hinda Congo 25 18

Moudelepakou Soulou Loudima

Moudelepakou Mbougou Loudima

Moudelepakou Loumou Odziba

Koloblanc Edeavillagesouglou H Cameroun 13 13

Kolorouge Edeavillagesouglou 1

Ekobele 1 Biyeyem 3 Cameroun 19 18

Ekobele 2 Biyeyem 3

Ekobele 3 Biyeyem 3

Barnbari Békamone Yaloké RCA 26 18

Barnbaril! Bokedi Yaloké

Babouche Konkato Sibut RCA 20 15

Kpabe Sibut

CasanoNigéria Zawa Yaloké RCA 15 14

Bekamone Yaloké

Congo Derrière la carrier Tchad Gabon 18 14

Ngoufanesi 3 Cameroun

Jaune Marée Tchad Gabon 17 14

Manga

Moussala Soulou Loudima Congo 14 13

Moussala Ossiba Loudima

Feufeukassala Santchou NC Cameroun 13 13

Feufeukassala2 Santchou D

lcra Mandja-oto Sibut RCA 23 17

fera Békamone Yaloké

fera Bokede Yaloké

lcrarouge Boubou sibut

Montbelo Lessaras Hinda Congo 19 14

Montbelo Mbougou Loudima

Assa Boya Yaloké RCA 20 14

Assa Békamone yaloké RCA

60
 Nom de l'accession Village Site Pays Nombre d 'allèles différents(46) Nombre de locus concernés(23)

Gabon Bomimi Si but Congo 23 18

Gabon Boubou Sibut Congo

Gabon E fokbilon 3 Cameroun

Maniocblanc NC E Cameroun 18 17

Maniocrouge NC E

Tchikoukounafemelle Djéno Hinda Congo 13 13

Tchikoukounamâle Djéno Hinda

Fantal NC Ngaoundéré Cameroun 22 8

Fanta2 NC Ngaoundéré

Mahabama Soulou Loudima Congo 16 15

Mahabama Soulou Loudima

Mboma Marée Tchad Gabon 22 16

Mboma Man ga Tchad

Mboumba Zawa Yaloké RCA 18 17

Mboumba Bekamone Yaloké

Mokpakaba Boyale Pissa RCA 17 15

Mokpakaba Sabe Pissa

Cameroun Daradjanadjikélo Daradjanadjikélo Tchad 23 17

Cameroun Kanga Hinda Congo

Cimetière Amou Si but RCA 23 18

Cimetière Gbou Sibut

Munzoumba Man ga Tchad Gabon 19 16

Munzoumb Derrière la carrière

Nyama l NC Bert oua 16 14

Nyama2 NC Bert oua

Pas de nom 1 Edeavillagesouglou E Cameroun 17 15

Pas de nom 2 Edeavillagesouglou H

Tinodji K K T NC Kamkoutout Tchad 37 20

Tinodji ONK NC Daradjanadijikélo

Zaoroumbisse Békamone Yaloké RCA 15 15

Zaoroumbisselii Zawa

Kwata Man ga Tchad Gabon 21 18

Kwata Mandjoyi

Mbenga

Si ta Bertoua Cameroun 24 19

Si ta

Yaoundé NC Ekona Cameroun 33 20

Yaoundé Kan ga Hinda Congo

Tableau n°8 : Accessions avec des génotypes différents mais de noms identiques ou similaires

61
Figure n°3 : Représentation de la diversité d'un échantil lon de 253 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC. Arbre construit par Neighbour Joining à partir de la matrice des
dissimilarités (500 bootstraps). Les noms des accessions sont représentées en couleur en fonction
pays (Cameroun= rouge, Congo = bleu, Gabon = vert, RCA =jaune, Tchad = Violet). Les valeurs
de bootstrap >50% sont indiquées en amont des nœuds correspondant.

B;tbouche

,Oanz1
Y.'ongoro

in

Samba ri

62
3.1 .4. Structure de la diversité

3 . 1 .4.1. Le dendrogramme

Pour ces analyses, seules les 253 génotypes sont utilisés.

La représentation radiale du dendrogramme (figure n°3 ), nous montre une figure en étoile ce qui
indique une faible structuration de la diversité. Nous ne notons aucune structuration géograph ique
de l 'échantillon correspondant aux cinq pays étudiés. Cependant, dans certains des groupes formés
et peu validés par les bootstraps, aucune accession Tchadienne n'apparait alors que les accessions

du Gabon y sont fortement représentées. On observe aussi de petits regroupements ( 6-7 accessions)
par pays et parfois par site (Odziba au Congo avec 6 accessions). Les accessions ainsi regroupées
peuvent avoir été collectées dans des sites très proches (cas de 6 accessions de RCA de Sibut,
Yaloké et Bossangoa).

63
Figure n°6 : Représentation de la diversité d'un échantil lon de 253 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC. Analyse factorielle à partir de la matrice des dissimilarités en fonction des
pays (Cameroun= rouge, Congo = bleu, Gabon = vert, RCA = jaune, Tchad = violet)

Factorial analysis: Axes 1 12

Axe 2 . 5.67% )

,C:AM!ROUN
0CONOO
.�.�ROUN
.><A

,COHOO ,GAliON
,C�OUN
,C I!ii.:
� Ro �ROUN

Axe 1 : 7.96%

0CI.MIEROUN

'GABON

'GAliON 00A80N
'cuoN
"TcKAD
'C.t.MI!ROUN
'CONGO
··�

00ABON

CAJIII!ROutl
'GAliON

Figure n°7 : Représentation de la diversité d'un échantillon de 253 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC. Analyse factorielle à partir de la matrice des dissimilarités par zone agro­
climatique (Forêt tropicale humide semi-décidue et sempervirente = bleu, forêt tropicale humide
Factorial analysis: Axes 1 12

Axe 2 : 5.67% l
kN!IER N
CXJ

,CONGO

,o �o �HOO
,c ��� NOO

.�ROIJH ,C�t§OO
,CONGO
.�ou,.

-. ,C:AM!ROUN

,CotiQO ,OMOM

_...
,C � iae- �MEROUN
�

CAMI!
CONGO,
Axe
co...o
1 : 7.96%
25 ° CAMEitOIIN

c0+1o o'

' CAMVtOUN
..�

N
'CAMEROU 'CAM!R.NGO
UN

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&� 'c:Airii!ROUN
TCHAI1
COHGO
'o.uoN 'C�'II.OU,;
00AIION
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'COI.:
�
O
WJI �
N
'oA*:>N
.
'oo��,eoN
.
.... � -o ......
'rcHAD
'CAMEROUN
CONOO' 'cONGO
aoUlON
'

'CONGO
'CONGO
'OA8 •:J.ON
CAMfJI.OUII ...." 'oMoto�
TCHAd'
�CHAD
'GAliON
'CONGO
TCHAd
déc idue = vert, savanes arbustives

humides= jaune, savanes soudanienne = violet, Non Communiqué (NC)= rouge).

64
3.1.4.2. L'analyse Factorielle (PCoA)

Le PCoA (figure n°6) représenté sur les axes 1 et 2 qui expliquent 1 3 .3% de la variation, confirme
que la diversité des accessions des cinq pays ne présente pas de structuration géographique.
Toutefois, nous remarquons que la majorité des accessions du Tchad ne sont pas représentées sur le
quart supérieur droit des deux axes et sont regroupées à gauche. De même les accessions du Gabon
sont plus représentées à droite des deux axes. Les accessions du Congo, du Cameroun et de la RCA
sont dispersées sur les deux axes. L' accession Ngakanrang du Cameroun est iso lée sur l ' axe 2
Le PCoA réalisé par zones agroclimatiques ne présente aucune corrélation structurelle avec les
zones agro-écologiques.

65
Figure n°8: Représentation de la structure d'un échantillon de 253 accessions de manioc cultivé
dans la zone CEMAC. Assignation des populations par Structure par le modèle admixture des 253
variétés formant deux groupes.

100%
• cl usterB

0%
• c l u sterA
.-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1
.-1 N ("() """ o..n I.D ,.... 00 CJ) 0 .-1 N ("() """ o..n I.D ,.... 00 CJ) 0 .-1 N ("() """ o..n
.-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 .-1 N N N N N N

Figure n°9 : représentation des K=2 « popu lations » identifiées par Structure(a)

(Groupe A= B leu, Groupe B = Vert ; admix= noir) ; représentation des accessions du Gabon et du
Tchad(b) : (Gabon= vert, Tchad =Bleu)

66
3.1 .4.3. Analyse de la diversité avec le logiciel Structure

Cette analyse a été réalisée sur les 253 génotypes, les clones ayant été exclus. Les résu ltats de

l 'analyse indiquent deux groupes (cluster A et c luster B) avec un maximum de vraisemblance à K=

2 (figure n°8) et pour une valeur de LV< maximale d' environ 80. 1 1 4 accessions sont attribuées aux
groupes A, 1 04 au groupe B et 35 pour les admixtes avec un seuil de 80%.

Nous avons mis en évidence ces deux groupes sur l 'arbre de dissimilarités de Neighbor Joining (
Figure n°9).

Le dendrogramme confirme la répartition globale des accessions en deux groupes peu séparés.
Chacun de ces deux groupes est constitué d'accessions provenant de toutes les origines. Seulement,

la figure n°9(b) nous montre que la majorité des individus du Tchad ( 1 5 sur 1 7) sont dans le groupe
B et les 2 autres dans le groupe A (Tinodji ONK et 6mois MBR). De même la plupart des
individus du Gabon ( 1 9/ sur 3 0) sont dans le groupe A. Cette répartition des accessions des deux
pays est cohérente avec la représentation donnée par le PCoA (figure n °6). I l est aussi remarqué
que beaucoup d'accessions avec des noms rappelant une variété améliorée (TME225, 941066,
ICRA, 6 mois) semblent se retrouver dans le groupe B (soit, 1 4 accessions/ 1 04).

Le nombre moyen d'allèles par locus est presqu' identique entre les deux groupes : 4,39 et 4, 1 3
respectivement les groupes A et B . La distance génétique de Nei( l 978) sur 1 000 permutations est
de 0. 1 1 2.

Le F statistiques de Wright (Weir et Cockerham 1 984) avec 1 000 permutations a été réalisé sur les
individus analysés avec 23 marqueurs. Les valeurs de Fis égal à -0. 126, une valeur moyenne du Fit
de -0.03 7 et le Fst calculé avec des bootstraps sur loci est égal à 0.08 avec 95% d'intervalle de
confiance [0 .0530 - 0 . 1 1 2] (Tableau n°9), indiquent globalement un excès d'hétérozygotes et une
faible différenciation entre les groupes formés.

Ho He Nombre Fis Fst

moyen
d'allèles

Groupe A 0.5483 0.5508 4.39 -0. 1 45

Groupe B 0.553 8 0.5564 4. 1 3 -0. 1 07
Moyenne 0.5536 0.5536 4.26 -0.126 0.08

Tableau n°9 : Diversité génétique entre les deux groupes selon la méthode de Weir et Cockrham
1 984.

67
Figure n°1 0 : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction des caractères
Goût( a) et couleur(b) du tubercule.

100 100
• NC

80 80
• ROUGE
• NC

60 • FADE
60 • MARRON

• SUCREE

40 40 • JAUNE
• DOUCE

• AMER • BRUNATRE
20
20
• BLANC
0
0 a
GROUPE GROUPE
b
GROUPE A GROUPEB A 8

Figure n° 1 l : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction des critères

« couleur de la feuille»( a) et « couleur du pétiole »(b).

100
a b
NC
90 NC
90
violet
• Vert-sombre
80 80
30 � • Ven-jaune
Vert-Rouge
30
70 70 • Ven-foncé
Vert-foncé

60 Vert- 60 • Ven Rouge

anthocyane Ven Clair

50 • Vert vtolacé 50
• Vert
40 • Ven foncé
40
• Rouge vert
• Vert Clair
30 30
• Verte • Rouge foncé

20 20 • Marron violet
• Marron Clair

10 • Marron
10 • Jaune
violacée
0 0 • Blanchâtre
GROUPE A GROUPE B GROUPE A GROUPE B

Figure n° 1 2 : Proportion du nombre d'accessions des groupes A et B en fonction du critère « port

de la plante »

1 00
90 +----
80
70
60
50
• Ouvert
40
30
20
10
0

68
3.1 .4.4. Relations des deux groupes avec les caractères morphologiques (figures 1 0, 1 1 , 1 2)
Les données morphologiques du Cameroun sont absentes dans ces résultats, et rendent incomplets
nos résultats. Toutefois, avec les quatre autre pays, l 'organisation des deux groupes s ' explique par
certains caractères morphologiques. A partir des tableaux de contingences réalisés sur les
caractéristiques majeures de la morphologie des individus nous observons 50 variétés amères dans
le groupe B contre 23 dans le Groupe A. Par contre, le groupe A compte 28 maniocs doux et 8
seulement pour le groupe B . Au niveau du critère « couleur du tubercule », la couleur blanche
prédomine, avec 53 individus dans le groupe B et 32 dans le groupe A. Les maniocs de type doux
sont à cycle plus court que le type amer, selon les préférences des paysans un type sera favorisé
dans la culture selon les sites de production dans un groupe comme dans l ' autre.

Nous avons regardé aussi les critères « couleur de la feuille» et « couleur du pétiole », les couleurs
« vert Clair »(40), « Marron violacée »(29) et vert foncé(20) sont plus fréquentes au niveau de la
feuille, tandis que les couleurs « Rouge »(49), vert clair et vert prédominent au niveau du pétiole.
Le groupe B a plus d' individus à feuilles « marron violacée » et de pétiole « rouges » par rapport au
groupe A qui a plus de feuilles « Vert clair ».

Le port érigé apparait être le plus rencontré au sein des deux groupes, majoritairement dans le
groupe B . Le test de F isher réalisé sur ces caractères morphologiques avec l ' hypothèse Ho : il ya
autant d'accessions pour un caractère dans le groupe A que dans le groupe B avec une pvalue<5%.
A 95% d ' IC Les caractères « Gout du tubercule »(pval= 0.208), « couleur du pétiole » (pval=
0,063 7) ne sont pas significativement différents entre les deux groupes.

Par contre, les caractères « Goût du tubercule », « port de la plante » et la couleur des feuilles ont
une pvalue <5%, (7. 1 7 1 0-5, 0.038 et 0 .048) Il ya bien une différence du nombre d'accessions entre
les deux groupes pour ces caractères morphologiques.

69
70
 3.2. Discussion

Analyse de la diversité et de la structure génétiques

Le principal objectif de cette étude était de déterminer la diversité génétique des variétés du manioc
cultivé dans cinq pays de la zone CEMAC. Sur 3 3 8 accessions analysées 253 sont des génotypes
bien distincts. Une diversité génétique est observée sur notre échantillon étudié. Le nombre moyen
d'allèles par locus est de 4.74 est comparable à celui trouvé par Kisito (2005) dans son étude
multidisciplinaire de la diversité génétique du manioc en Ouganda sur 288 accessions génotypées
par 1 1 microsatellites. Si nous nous référons au nombre moyen d'al lèles trouvés de 7 dans l 'étude
de Kawuki(20 1 3 ). Il apparaît que la base génétique du manioc cultivé en Afrique Centrale soit
assez étroite malgré une diversité de génotypes.
Le taux d'al lèles rares de 29% des individus provenant de tous les pays, indique q u ' ils contribuent
à la diversité génétique globale. Leur répartition expliquerait le manque de structuration
géographique. (l'allèle 23 1 du locus SSRY 1 0 1 (0.0 1 5) est présent au Congo ( 1 , site Hinda), au
Gabon (3 , au site Tchad) et en RCA (2, site Alindao); l'allèle 1 24 du locus SSRY3 8 est présent au
Gabon et au Cameroun et le 1 34 du même locus a été trouvé dans des accessions du Cameroun, du
Gabon et de la RCA. Les allèles rares ont été retrouvés le plus souvent au Cameroun, au Congo et
en RCA. La tai lle des échantil lons de ces pays justifierait ce résultat, mais on peut aussi faire
l 'hypothèse d'une diversité introduite récemment qui pourrait provenir de variétés sélectionnées ou
améliorées et distribuées dans des programmes de développement sous-régionaux.

Nos données ne montrent aucune différenciation entre les accessions de manioc des cinq pays
d'étude. Il n' est pas possible de les séparer ni géographiquement, ni par zone agroclimatique.
Cependant, une étude réalisée par Kawuki et al (20 1 3 ) a montré une structuration géographique
entre 1 40 1 accessions génotypées avec 26 microsatellites. Les zones d'étude étaient l'Afrique de
l 'Est, de l ' Ouest, du Centre et Madagascar (7 pays). Il semble qu'il ya eu des échanges
considérables entre les pays d'Afrique Centrale. Traditionnellement, les agriculteurs échangent du
matériel génétique avec des amis et des parents dans d'autres régions de proche en proche. Ce
mécanisme de circulation de variétés peut expliquer cette absence de structuration. On peut aussi
faire l 'hypothèse que cela provient également de l ' h istoire connue du manioc en Afrique Centrale
qui est une zone d'introduction récente du manioc avec probablement un petit nombre d'accessions
et une diffusion active avec des échanges le long des fleuves.

Avec les pandémies des maladies du manioc telle que la mosaïque africaine et celle actuelle de la
striure brune l 'liTA a mis en place des programmes d'amélioration variétale dans le but de les

71
72
éradiquer. Une diffusion de ces variétés a pu contribuer à la modification de la base génétique du
manioc cultivé dans les pays ayant participé à ces programmes. Il est remarqué qu'au sein des
groupes formés par le logiciel Structure les individus dénommés « 6 mois » ou avec des codes
rappelant une variété amé l iorée (TME225, 94/D66, ICRA) semblent se regrouper. La recherche
d'allèles rares spécifiques à ces accessions serait intéressante afin de pouvoir soutenir l ' hypothèse
d'une introduction récente de ces accessions par des programmes de diffusion de variété améliorée
par l ' liTA. Auquel cas l ' hypothèse de mutations clonales tiendrait pour ces accessions.

Il existe éventuellement des regroupements entre certaines accessions par pays ou par sites, avec de
forts pourcentages de bootstraps sur le dendrogramme. Nous avons essentiellement 6 accessions du
site Odziba, 7 à Ekona et aussi des sites géographiquement proches en RCA qui se regroupent.
(Sibut, Yaloké et Bossangoa). On pourrait dans ce cas émettre l 'hypothèse d ' une diversification
locale.
La division en deux groupes proposée par l ' analyse de Structure qui fonctionne avec un minimum
de 2 populations est peu soutenue par les paramètres génétiques calculés (Fst très faible de 0,08) et
le pourcentage faible des bootstraps (< 5 0%) observé sur le dendrogramme.
Cependant, nous avons observé la présence de quelques allèles spécifiques dans le groupe A ( 1 2)
que dans le B (3), et les deux groupes peuvent être différenciés significativement par certains
caractères morphologiques (goût du tubercule, et port du plant).
On peut aussi observer une certaine cohérence des deux groupes au niveau des accessions du
Gabon et du Tchad qui se regroupent très majoritairement dans le groupe A pour les accessions du
Gabon et dans le groupe B pour celles du Tchad. Cette différence observée pourrait se justifier par
l ' éloignement géographique, ou par les zones agroclimatiques différentes (Forêt tropicale h umide
et la zone de Savane soudanienne) mais aussi par une introduction relativement récente de variétés
améliorées pour le Tchad qui repose sur le fait que les accessions du Tchad sont spécifiquement
nommées par des noms qui rappellent une variété améliorée .

73
74
Clonalité et reproduction sexuée

L ' indice de clonalité calculé est de 0.75, ce résultat est comparable à celui obtenu sur le manioc au
Vanuatu par Sardos et al (2008) qui avait trouvé un indice de clonalité de O. 74. Cet indice est
remarquablement é levé sachant que l ' on est dans des zones d' introduction relativement récentes
avec des plantes dont le mode de multiplication végétatif est prédominant. Ce résultat peut être

nuancé car les divergences entre les génotypes peuvent provenir de données manquantes sur
certains individus ou éventuel lement de problèmes de lecture (cas des 5 groupes d' homonymes
différenciés par un seul allèle). L' indice de clonalité de la RCA est le plus faible (0.6), ce qui
indique un fort taux de clones dans ce pays.

Une valeur de Ho (0.627) de même qu'un Fis <0 viennent bien rendre compte du mode de
reproduction asexué du manioc cultivé. L ' histoire de l ' introduction récente du manioc cultivé en
Afrique nous indique qu'elle a d' abord eu lieu en Afrique Centrale à l 'embouchure du fleuve
Congo entre 1 6 1 1 et 1 640 (Carter, 1 992). Le manioc cultivé d'Afrique a été isolé de la grande
diversité disponible en Amérique et de la majorité des espèces sauvages apparentées en l 'exception
de l' espèce M glaviozii qui est utilisé dans les programmes de création variétale comme source de
résistance au virus de la mosaïque Africaine (Lokko et Al., 2005). L ' étude qui a été menée par
Kawuki (20 1 3 ) a montré aussi une diversité génétique relativement faible, bien que le nombre
moyen d'allèles par locus soit relativement élevé (7). L' hétérozygotie moyenne He = 0.57 obtenue
est comparable à celle de l ' étude de Fregene et al (2003) sur la diversité génétique de 283
accessions d'Afrique (Nigéria et Tanzanie) et celles de 7 pays d' Amérique, dont le Brésil
génotypées avec 67 loci. Par contre, l ' étude sur 76 accessions collectées dans un village amérindien
au Guyana et 38 du ClAT a montré que la diversité génétique dans ce village était presqu' identique
à la diversité des accessions de la collection du CIAT évaluée dans la même étude El ias (2000), ce
qui laisse suggérer une forte diversité génétique dans ce village.

La situation de synonymie semble nous révéler le phénomène de plasticité des cultures à

multiplication végétative : des accessions de même génotype présentent des morphologies
identiques ou différentes. Les agriculteurs changeraient le nom d ' une variété à différents endroits
lors des échanges entre paysans (El ias et al, 200 1 ; Mekbib, 2007) en constatant une différence
morphologique ou une morphologie apparentée à une de ses anciennes variétés.
La comparaison des données morphologiques entre les clones nous montrent deux phénomènes :
certains individus de villages différents, de même génotype présentent aussi des morphologies
identiques (Mauritania= Madama ; Moudouma= Kignoumba= Moudoma(Congo) ; Muzumba=
Munzomba(Gabon) ; B ambari = Bambariiii (RCA). Par contre, les clones du Tchad (Lisette= Ngali
moré ; TinodjiDNK= Ndabra n 'ont aucun caractère morphologique reporté en commun. Certains

75
76
c lones cultivés dans différents pays ne diffèrent que par un seul caractère par exemple Ditadi du
Gabon, et Moudelepako en RCA différent par la couleur de la tige (Gris C lair et blanchâtre
respectivement Ditadi et Moudelepako). Cette différence pourrait s'expliquer par une variation du
milieu car i ls sont dans une même zone agroécologique. Pour d'autres accessions la variabilité
morphologique intravariétale affecte plusieurs caractères dans des environnements soit identiques
ou différents; c ' est le cas respectivement de Cimetière et Adou qui sont du même village Gbou

(Si but en RCA) et qui différent sur tous les caractères sauf par le caractère « goût du tubercule » et
de Rendre et Toubdiara collectés dans des villages différents (Békamone et NC) en RCA. Ces
résultats suggèrent une influence de la morphologie du génotype sur son identité. Une accession va
voir son nom changer à cause de sa morphologie qui rappel lerait celle d ' une accession connue ou
alors on lui donne un nouveau nom. Les clones qui ont pu garder le même nom ayant aussi la
même morphologie sur des sites différents pourraient être d ' introduction récente ou alors le paysan
est capable de différencier et garder l ' identité d ' une variété ancienne (Kisito., 2005). Nous avons
le cas de deux accessions « Munzomba » dans deux v illages du même site au Gabon et en RCA de
l ' accession « Bambari » .

Il est montré que le manioc a gardé ses facultés de reproduction sexuée (El ias et al., 200 1 ; Fregene
et al., 2003) et est une plante allogame, des hybridations naturelles dans les d ifférents pays peuvent
recréer une diversité génétique. Nous avons observé que deux marqueurs avaient des fis >0, signe
d ' un excès d 'homozygotes potentiellement lié à la reproduction sexuée dans la culture du manioc
tel que l ' a signalé Delêtre en 20 1 0 au Gabon. Les paysans ont tendance à cultiver les mêmes
génotypes de manière groupée dans leurs champs, ce qui augmenterait le taux de consanguinité
entre eux lors de la pol l inisation croisée (Kawuki et al., 20 1 3), et donc la probabil ité d 'obtention
d' homozygotes.
La situation d ' homonymie enregistrée pourrait appuyer l ' hypothèse de l 'existence de reproduction
sexuée et de l ' introduction dans les cultures des plants issus de la reproduction sexuée au cours des
générations. Ce phénomène s'observe avec les accessions de certains pays. Les accessions qui ont
un nombre d'al lèles différents pour le même nombre de loci viendraient appuyer cette hypothèse. Il

s'agit pour exemple des accessions « Tchikoukounafemel le et Tchikoukounamâle » et « Ngantsa »

au Congo ; les accessions « Claire » et Zaoroumbissé en RCA et Feufeukassala au Cameroun. En
effet, régulièrement le paysan en Afrique reçoit de ses proches les semences d' une variété qu' il
trouve intéressante et qu'il cultive avec ses semences. Si la nouvel le variété donne des résultats
satisfaisants, i l augmente sa surface de production les campagnes suivantes. Le manioc est une
espèce monoïque allogame et contrairement à d 'autres cultures à multipl ication végétative, il a
gardé ses facultés de reproduction sexuée. Du fait de la proximité des variétés dans le champ, il
peut donc y avoir des échanges de pollen entre variétés cultivées.

77
78
Si des variétés introduites (amél iorées ou non) et des variétés locales sont cultivées simultanément
ces échanges peuvent produire des résultats bénéfiques pour l ' agriculteur.

Les ressemblances morphologiques de ces nouvelles variétés avec des variétés anciennes
induiraient des les regrouper sous un même nom (Elias, 200 1 ). Cette situation semble se confirmer
au Congo avec quatre accessions dénommées « Moudelépakou » qui sont de villages et de sites
différents ayant 25 allèles de différence sur 1 8 locus.

79
80
Conclusion et Perspectives

L'analyse des 23 SSR sur 3 3 8 accessions présentées dans cette étude, ne constitue qu'une première
approche dans la compréhension de la diversité génétique du manioc cultivé des cinq pays de la
CEMAC. Il apparait que dans cette zone d' Afrique la diversité génétique qui existe n'est pas
structurée géographiquement. Malgré le nombre moyen d'allèles assez faible et son mode de
multiplication végétatif, le manioc cultivé en Afrique Centrale semble s' être diversifié localement,
probablement par le biais de la reproduction sexuée et l ' introduction des plants spontanés dans les
nouvelles plantations (Delêtre., 20 1 0). Malgré que ce processus de gestion ne soit pas bien adopté
en Afrique comme il est pratiqué par les paysans en Amazonie (Elias., 200 1 ). De plus, la
propagation clonale ne génère pas de variation car chaque plante de la nouvelle génération est une
copie identique génétiquement de la précédente, sauf lors des mutations clonales, et conduit à une
perte de la diversité génétique (McKey., 20 1 2).
Il est montré aussi que ce mode de culture a pour inconvénients d'accumuler les bioagresseurs

réduisant ainsi les rendements (McKey et al., 20 1 2). Ce qui pourrait ainsi favoriser l ' érosion
génétique qui est déjà évoqué par plusieurs auteurs du fait de l'adoption de variétés plus
performantes et l'abandon des anciens cultivars (Kombo (20 1 2), Manu-Aduaning (2005)).
En perspectives, les résultats de cette étude devraient être renforcés par la collecte dans tous les
sites choisis pour ce projet, chaque pays devrait prendre le relais de ce projet PRASAC pour en
faire un programme national étendu à toutes les régions du pays. Des études plus approfondies
doivent être réalisées sur la diversité morphologique et génétique, la distribution et la gestion des
variétés locales de manioc pour le développement d'une base de données et de l ' élaboration de
catalogues pour des besoins de recherche et de développement.
Une conservation de cette diversité tel que prévu dans le projet trouve ici toute sa j ustification,
sachant que l ' homogénéisation des variétés cultivées est toujours un risque important face aux
contraintes biotiques et abiotiques. De plus, il est nécessaire que ces programmes se fassent comme
dans le cadre du projet PRASAC avec une approche participative qui implique fortement les
utilisateurs du manioc afin de les sensibiliser sur tous les aspects qui impactent sur la valorisation
du manioc, mais surtout de prendre en compte les souhaits et les besoins de ces derniers.
Les travaux à venir devraient prévoir, d'étudier l ' influence des pratiques traditionnelles de culture
et leur interaction avec les pressions du milieu sur la diversité variétale et génétique. Une ouverture
vers la zone d' origine du manioc cultivé a certainement un avenir entre les deux continents pour

mieux appréhender les questions liées à la gestion dynamique de la diversité génétique sur le
continent africain. Pourrait-on penser à une autre introduction du manioc en Afrique afin
d'améliorer la base génétique existante actuellement?

81
82
Activités réalisées pendant le stage

Ce rapport se place dans le cadre de l' obtention du diplôme de master 2 en SEPMET à SupAgro­
Montpell ier. Il a été réalisé de mars à septembre 20 1 3 au CIRAD, sous la direction de Marie France
DUVAL pour l'étude de la diversité génétique du manioc cultivé en Afrique Centrale. Pour cela
j ' ai réalisé plusieurs activités qui se résument à l'extraction de l'ADN génomique des accessions
reçues pour chaque pays, le choix des microsatel lites, l ' ampl ification par PCR de amorces
microsatellites, l ' électrophorèse cap i llaire pour le génotypage des accessions, l ' utilisation des
logiciel et les analyses statistiques et interprétations de l ' ensemble de données, suivi de la rédaction

du rapport. De première impression la recherche est un réel travail de fourmi et très prenant.
Les activités réalisées ont été les suivantes encadrée par l ' équipe des techniciens:

1 - Relancer les partenaires pour 1 ' envoi des accessions dans les délais

2- Réception et inventaire des accessions reçues par pays

3- Choix des microsatellites pour notre étude, et inventaire de ceux présents au C IRAD,
commande de ceux épuisés au CIRAD.
4- Utilisation de bases de données pour le choix des microsatel lites et leurs caractéristiques
5- Extraction de 1 ' ADN génomique des accessions
6- Quantification et qualité des ADN extraits
7- Préparation des ADN pour l ' ampl ification PCR
8- Programmation des séries d' analyse : Préparation des solutions et des ADN, réservation
des appareils d'analyse (PCR, Séquenceur capillaire)
9- Réalisation des PCR
1 0- Préparation des ADN pour le séquenceur ABI
1 1 - Mise en forme des données moléculaires
1 2- Uti lisation de plusieurs logiciels pour les analyses statistiques des données 1
a. GeneMapper
b. Create
c. Genetix
d. Fstat
e. DARwin
1 3- Interprétation des résultats et rédaction du mémoire

83
84
Références bibliographiques

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http://dombes.eirad .fr/cgi-bin/web grouper/grouper.pl (3 Mai 20 1 3 )

http://pdf.usaid.gov/pdf docs/PNACQ291 .pdf ( 20 Mars 20 13)

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http://www .d irectmatin.fr/envi ron nement/20 13-05-07/le-manioc-menace-en-afrigue-par-un­

virus-459587 (Juillet 2013)

http://marne. u 707.jussieu.fr/biostatgv/? m od ule=tests/fisher (28/08/13)

99
100
Annexes
Liste des Annexes

Annexe n° 1 : Situation géographique de 1 'Afrique Centrale.

Annexe n° 2 : Carte des zones agro-éco logiques des pays de la CEMAC.

Annexe n°3 : Carte des sites de collecte des accessions par pays.

Annexe n°4 : protocole de collecte des accessions dans chaque pays.

Annexe n°5 : Accessions uti lisées pour l ' étude de la diversité génétique des cinq pays

Annexe n° 6 : Protocole d'extraction et du dosage de l 'ADN (adapté).

Annexe n° 7 : Protocole pour l 'estimation de la quantité et de la qualité de l 'ADN sur gel d'agarose
à 1 %.

Annexe n°8 : Protocole de dosage de la quantité d'ADN par Fluoskan.

Annexe n° 9 : Protocole pour l ' amplification par PCR.

Annexe n° 1 0 : Protocole pour l'électrophorèse capillaire.

Annexe n° 1 1 : Principe de fonctionnement du séquenceur capillaire ABI

Annexe n° 12 : Protocole d'analyse sur GeneMapper

Annexe n° 1 3 : Exemple de profils GeneMapper (bon profil du marqueur EME20, mauvais profils
du marqueur SSRY55).

Annexe n° 1 4 : Fréquences alléliques de 23 marqueurs microsatel l ites étudiés sur 3 3 8 accessions.

101
102
An nexe n°l : Situation géographique de l'Afrique Centrale.

103
104
Annexe n° 2 : Carte des zones agro-écologiq ues des pays de la CEMAC.

� l o n t age� tropiralr�
Jlauts plateaux
Zone sa harienne
Zone sahélienne
Sa\'lmes souda nienne
Savanes arbnsti\·es humide
f"orêt tropicale h u mide dédd u e
Forêt tropicale hn mide semi­
déC'îdue et s.empen·irc.>ntc.>
0 5 0 0 km
1 1

105
106
Annexe n°3 : Carte des sites de collecte des accessions par pays.

107
108
 Annexe n°4 : protocole de collecte des accessions dans chaque pays.

Collecte de matériel végétal

Lors de cette phase de la mission, l ' enquêteur-prospecteur accompagne le producteur sur son
terrain pour prélever le matériel végétal . C ' est donc l ' occasion d'approfondir les enquêtes et
de poser des questions annexes si nécessaire.

Les variétés col lectées font l 'objet d' une description agromorphologique succincte qui
servira de première description et de référence pour vérification de la conformité lors de la
mise en collection.

Les documents suivants seront nécessaires :

fiche de collecte (annexe 6)

document descripteurs et modal ités à utiliser pour la caractérisation (annexe 7)

protocoles de prélèvement de bouture et de feuil les (annexe 8)

109
1 10
ANNEXE 4: Fiche de collecte

FICHE DE COLLECTE

Photos : champ, appareil végétatif (plant), racines

Date : Nom du cultivateur

Localisation : - District : GPS

Nom vernaculaire : Langue : Signification

Synonymes Origine de la variété

1- Description d u lieu de collecte : Observations

Végétation : Savane- Savane boisée- Forêt-

Topographie : Pente- Bas-fond- Plateau- Plaine- Val lée.

1 2-Type de Sol :

Type de culture : association- monoculture

Pratiques culturales spécifiques de la variété :

Description de la plante

Cycle végétatif

Critères de reconnaissance du pa ysan

Age de la plantation

Port de la plante érigé - ouvert -étalé

Ramification : Nulle - basse -haute

Couleur de la tige : orange - vert - gris clair - marron

Couleur du pétiole : jaune - vert - rouge - marron-vio let

Couleur des Jeunes feuil les : vert clair - vert foncé - marron
violacé

111
Pubescence des jeunes feuilles : oui - non

Présence de fleurs :

Présence des fruits :

Couleur de la chair du tubercu le : jauneatre - rosé - blanc

Nombre de tubercules : �2 _ �5 plus

Saveur du tubercule : douce, amère, fade

homogénéité

II- Etat phytosanitaire

3 1 - Maladies bactériennes, fongiques et virales :

32- Ravageurs : Cochenille farineuse, Cochen i l le racmatre,

Criquet puant, Pseudothérapus devastans

Remarques : souligner le terme uti le

Prélévements de feuilles

Prélévement de 3 feuil les par accession (ni trop jeunes, ni trop vieilles) sur un même p lant ou sur
des plants d'apparence identique (déjà utilisés pour les boutures). Placer ces feuilles dans des
enveloppes papier identifiées (une feu i l le par enveloppe) avec le nom de la variété, le lieu de
collecte, les coordonnées GPS et le nom du producteur. Faire sécher les enveloppes à l 'air l ibre.
Envoi par DHL à Montpel l ier.

Matériel nécessaire : Enveloppes papier et Marqueurs

112
ANNEXE 4 : Descripteurs

Port de la p l a nte

é rigé cyl i n d rique éta lé

R a m ificat i o n :

nulle b a sse h a ute

1 13
 Co u l e u r de la tige : Co u l e u r du p ét i o l e :

jaune jaune ro u ge
o ra n ge - vert - m a rron - gris cl a i r jaune
m a rron-vio l et
vert

Cou l e u r d e s J e u nes fe u i l les

m a rro n vi o l a cé
vert c l a i r vert fo ncé

ANNEXE 7 (suite): Descripteurs

1 14
 P u besce nce des je unes fe u i lles

p résente a bs e nte

Cou l e u r de l a c h a i r du t u b e rc u l e

Blanc crème jauneâtre rosé

ANNEXE 7 (fin): Descripteurs

Matériel nécessaire Instrument coupant (machette, sécateur . . . )

Sachets plastique polyéthylène
Scotch
Marqueurs indélébiles
Etiquettes
Appareil photo
GPS
Désinfectant (alcool)

115
116
 Annexe n°5 : Accessions des cinq pays utilisées pour l'étude de la
diversité génétiq ue.

Tableau : le nombre d ' accessions par sites et par pays.

Pays Nom d u site nom d u village Total par village Total par site Total pa r pays
EFOKBILON 7
YAMBASSA 8

NC 6
3 30
B IYEYEM 6

NGOUFANESI 2

M E LONG 1

A M E LONG 1 1

B KNOUMBAGAI 3 3

BERTOUA NC 12 12

c 4 4
CAMEROUN D SANTCHOU 2 2 1 04

E EDEAV ILLAGE SOUGLONGUE 4 4

EKONA 20 20

SANTCHOU 2 2
F
KWOUMBAGAI 1 1
G EDEA V I L LAGE SOUGLONGUE 3 3

GAROUA NC 5 5

H EDEA V I L LAGE SOUGLONGUE 3 3

1 EDEAVILLAGE SOUGLONGUE 1 1
NGAOUNDERE NC 12 12

SNC SANTCHOU 1 1

KAN GA 5

CAYO 1

DJENO 4
H fNDA 19
MPONDILA 2

TCH!ZALAMOU 2

LES SARAS 5

OSS!BA 4

K I HOUNGOU 5

MPILA Il
LOUDIMA MBOUGOU 3 43

SOULOU 13
CONGO KfNGOUALAKOLA 3 90

MOUfNDl 4

ESSOUA 2

IMBAMA 3

MVOULOU MAMBA SUD 3

LOU MOU 7
YALA VOUNGA 3
ODZ!BA 28
NTOULA 3

ETSOUALI 2

Y lE 2

ODZIBA 1

OWANDO 2

117
 Pays Nom du site nom du village Total pa r village Total par site Total par pays
M E KAMBO (Oyem) PLANTATION PILOTE 15 15

MOUGALA 8

MAN GA 7
GABON MBENGA 7 49
TCHAD(Libreville) 34
MANDJOYI 3

MAREE 5

DERRIERE LA CARR!ERE 4

ALINDAO NC 5 5

BAMBARI NC 2 2

BAORO NC 3 3

BOS SAN GOA NC 2 2

BOU AR NC 8 8

KELENGO 2

BOYALE 3
PISSA 9
SABE 3

SNC 1

AMOU 3

BOM!Ml 4

KONGATO 7
RCA 101
BOUBOU 7
SlBUT 40
BOBADERE 3

KPABE 4

MANDJA-OTO 5

GBOU 7
ZAWA 8

BEKAMONE 9

NGAWI 1
YALOKE BOKEDE 6 32

BONDBAL06BOUKANGA 3

LADOUM! 4

BOYA 1

BEKAO B EBEDJ!A 2

BEROUKOU 4

MOISSALA DARADJA NADJI KELO 6 21

KAMKOUTOU 7
TCHAD MBOU RA 2

TOTAL 365

118
 Annexe n° 6: Protocole d'extraction et du dosage de l'ADN (adapté).
1- Extraction
- Dans des tubes de 1 3 ml annotés au numéro de l ' accession, placer 5 à 7 billes
- Peser environ 2 g de feuil les sèches pour chaque accession, puis les introduire dans les tubes
indiqués
- broyer dans un broyeur à billes RESCH MM30 1 .
- ajouter 5 m l de tampon d 'extraction MATAB dans chaque tube, les mélanger au vortex puis les
placer dans un bain marie à 74 oc
- incuber 30 mn, agiter légèrement de temps à temps toutes les dix minutes
- laisser refroidir pendant 1 5 minutes à température ambiante sous la hotte
- ajouter 5 ml de CIAA (Chloroforme Isoamyl alcool), agiter par retournement 1 00 fois.
- centrifuger à 6000 RPM pendant 3 0 mn
- transférer le surnageant dans de nouveaux tubes annotés de 1 3 ml contenant 4 ml d' isopropanol
- mélanger par retournement
- laisser précipiter au moins 1 H au réfrigérateur
- pécher l 'ADN à l' aide de pipettes pasteurs
- diluer l 'ADN dans des tubes annotés eppendorf de 2 ml contenant 400fll d'eau millipore
- laisser reprendre l'ADN pendant 24 heures par retournement sur un agitateur
- les garder au congélateur à -20°C pour la suite des manipulations (Gel d'agarose, PCR)
Tableau de composition du tampon d'extraction MAT AB( Mixed Alkyl Trimethyl Amon ium
Brom ide)

1 ,4M SM 1 40ml 280ml

20mM 50 0mM 20ml 40ml

2% x l Og 20g

1% x Sg l Og
0,5% x 2,5g 5g

EDTA= Ethylène diamine tétraacétate

PEG = Polyéthylène glycol

119
120
 Annexe n° 7 : Protocole pour l'estimation de la quantité et de la qualité
de l'ADN sur gel d'aga rose à 1 °/o.

- Peser 3,5 g d'agarose

- Verser l 'agarose dans un erlenmeyer de 500 ml contenant 350 m l de TAE( Tris Acetate EDTA
Buffer) l X (9 1 d'eau miliQ et 1 1 de TAE 1 0X)

- Bien mélanger et chauffer au micro-onde pendant 4 minutes

- Laisser refroidir sur une plaque d'agitation

- Préparer la plaque d'électrophorèse en scotchant les bords

- Puis, placer les peignes appropriés sans toucher le fond de la plaque

- Verser le gel refroidit dans la plaque et laisser gélifier pendant environ 30 minutes

- Retirer les peignes du gel d' agarose refroidit

- Numéroter un puits de 96 et y aj outer :

* 7 f.l l de mi liQ

* 1 f.l l de B leu de charge

* 2 f.ll d'ADN de chaque échantillon

- B ien mélanger et prélever 1 0 f.ll de chaque mélange et les déposer dans les puits du gel d'agarose

- Les 5 premiers puits sont réservés aux gammes étalon d'ADN (50, 1 00, 1 50, 200, 3 00 ng/ f.ll)

- Retirer le scotch des bords de la plaque

- Remplir la cuve de migration de TAE l X jusqu'au trait maxi

- Brancher les électrodes et régler le voltage supérieur à 1 OOV pour une migration d ' une heure

- pendant l H laisser migrer les ADN (vérifier que les bulles apparaissent pour s' assurer que

l ' électricité passe)

- Retirer le gel de la cuve et le placer dans une solution de BET (Bromure d 'Ethidium) pendant 20
minutes

- Rincer le gel dans de l ' eau miliQ pendant 1 5 minutes

121
- placer le gel sur une plaque UV pour visualiser les acides nucléiques (ADN, ARN) en
fluorescence sous lumière ultra violette

- Réaliser des photographies numériques des acides nucléiques

- envoyer la photo sous format é lectronique par email ()

- Imprimer la photo pour estimer la quantité et la qualité des ADN des échantil lons en comparant
leurs bandes à celles des ADN de référence (Exemple du gel du Tchad)

122
 Annexe n°8 : Protocole de dosage de la quantité d 'ADN par
FLUOROSKAN.

1 - Bien vortexer l'AD- mère

2- Dans des p laques 96 noires entourées de papier alu, déposer 2 !J. I de 1 'ADN-mère
3- Préparer le mix à l' obscurité: dans un tube mettre 27 ml d' eau miliQ, 3!J.I de TNE et 6fll de
Hoescht
4- B ien mélanger

5- Déposer dans la première colonne de la plaque 96 un volume indique de la gamme étalon

choisi en fonction des estimations effectuées sur gel d'agarose.
6- Le dernier puits contient 2 !J.l d ' un ADN de contrôle de Coco.
7- Dans chaque puis, à l' aide d ' une pipette multicanaux, déposer 2ÜÜ!J.I du m1x, bien
mélanger après dépôt avec les mêmes cônes
8- Retirer le papier alu et placer la p laque sur l'appareil de mesure
9- A l 'ordinateur, à l 'aide du logiciel « gffdg » effectuer la mesure des ADN selon la
procédure indiquée.
1 0- Enregistrer les données sur une clé USB, et les transposer dans un tableau en reportant les
noms des ADN étudiés
I l - Dans un tableau excel, le calcul des volumes à prélever d'ADN et d'eau miliQ sont

calculées pour avoir une concentration finale de 5ng/!J.I.

123
124
 Annexe n° 9 : Protocole pour l'am plification par PCR.

1- Dilution des ADN des accessions pour la PCR

Comparer chaque bande d'ADN des accessions obtenue avec celles des gammes étalons
(50 l OO 1 50 200 et 3 00 ng/fll)
Faire un tableau excel pour reporter ces valeurs
Appliquer la règle de trois sachant la concentration finale de 5ng/fll d'ADN et le volume
final de 200 fll par tube pour connaître les volumes d'ADN et d'eau miliQ à prélever
Organiser la répartition des échantillons sur la plaque violette de 96 pour la PCR ( 1 2
colonnesX8 lignes)
Prélever la quantité d ' eau nécessaire pour chaque échantillon à mettre dans chaque tube de
2 ml préalablement annoté
Ajouter le volume d'ADN à compléter pour obtenir les 200fll de volume final
Mélanger, fermer(bien tenir compte de l ' orientation de la plaque et du couvercle) et les
placer au Congélateur à -20°C.

2- Préparation des solutions-mères et filles des amorces microsatellites pour la PCR

Selon le fournisseur :

Les solutions-mères doivent avoir une concentration de lOO�J.M.

Agiter au vortex les tubes contenant les amorces F et R

ajouter la quantité de TE (Tris EDTA) équivalente à chaque amorce F ou R du
microsatel l ite (ex : pour 43,5mM, on ajoute 435fl l de TE)

Mélanger au vortex

Les solutions filles doivent avoir une concentration de l01J.M

Pour chaque amorce, apprêter des tubes eppendof avec vis en les nommant des mêmes
noms qui sont sur les flacons d ' origine avec des sticks
Placer dans chaque tube 90 fll d 'eau miliQ
Ajouter 1 Ofll d' amorce, bien refermer
Agiter au vortex
Placer les solutions mères et fil les au congélateur

125
3-La p réparation des plaques 384 ABI pou r la PCR
Prendre un nombre de plaque 384 pour PCR correspondant au nombre de marqueurs
microsatel lites à étudier suivant le plan de plaque annexe n°

Dans chaque puits de plaque à l ' aide du robot, distribuer 5 !11 de l 'ADN à étudier. Sur
l 'ordinateur l ié au robot :

1 - A ller dans U sers , users nam es, et écrire « users », puis ok

2- Project�open projet � genotiping

3- Onglet « open methods » � View� list

4- DNA-transfer Juliette-sans-lavage
5- Instruments setup�ok (visualisation du plan de disposition des plaques et des racks sur le

P lace d e s E a u p u re Eau m i l iQ
Racks des

Rack d e cônes Rack de cô nes Rack de cônes Rack de cônes

ADN l ADN2 ADN3 ADN4

Rack PCR Rack PCR Rack PCR

Rack PCR
ADNl ADN2 ADN3
ADN4

P l a q u e 384 P l a q ue 384 P l a q ue 384 P l a q ue 384

ADNl ADN2 ADN3 ADN4

6- Remplir le bac d' eau avec de l'eau pure

7- Placer les 4 racks à cônes et à ADN sur le robot
8- Vérifier dans les bidons d'eau s'il y a suffisamment d'eau miliQ
9- C liquer sur l ' icône triangle vert
1 0- Noter le nombre de racks, 4 et 4, le nombre de plaques 3 84 : 4, au dernier passage on
mettra 3
I l - Le volume d'ADN à prélever est de 5 !11, eau=O
1 2- Puis Ok
1 3 - On lave les cônes au dernier passage et on utilise le programme « DNA-transfer-juliette
avec lavage »

1 4- Mettre les dernières plaques 3 84

1 5- Lancer le programme

126
 1 6- Centrifuger les plaques pour vérifier que chaque puits contient de 1 'ADN, s mon on
complète les puits à la main
1 7- Ranger les Racks de cônes dans le tiroir indiqué
1 8- Conserver les plaques au frigidaire le temps de préparer le mix
4- Préparation du mix PCR

Une fois les ADN distribués dans les plaques 3 84, on prépare les mix PCR, tel qu' indiqué ci­
dessous :

Protocole tailing avec M 1 3-amorce + M13 marqué à I'IR-700 ou 800, Cirad-

Biotrop
Rq : ces concentrations sont spécifiques au laboratoire DAP

(le tampon 1 Ox contient par exemple déjà du MgCI2à 1 . 5 m M final)

Marqueur :

Qté Vol. d'ADN par

[Initiale} Unité Unité
finale réaction
ADN 5 ng/J.l l ADN 25 ng ADN 5 .00 J.!l

{Initiale} Unité [Finale} Unité Vol. réacti{J ds mix

Tp 10 x Tp 1 .0 x Tp 460.00 Il l
d NTP 2000 J.!M dNTP 200 J.!M dNTP 460 . 00 Il l
MgCI2 50 mM MgCI2 0.50 mM MgCI2 46.00 J.!l

Aml-M13 10 J.! M A m l -M l 3 0.08 J.! M Aml-M13 36.80 Il l

Am2 10 J.! M Am2 0. 1 0 J.!M Am2 46.00 Il l
M13
10 J.! M M 1 3 m a rq u é 0. 1 0 J.!M M l 3 m a rq ué 46.00 J.!l
m a rq u é

Taq 2 U/111 Taq 0. 1 0 UIJ.l l Taq 2 3 0 .00 Il l

H20 975 .20 J.! l

Nombre de
460
réactions :
Volume de
10 J.! l Vo l u m e M ix 2 3 00 . 00 J.!l
réaction :
M arge pour le mix Vol. à
0 % 5 .00 J.! l
distribuer

Pour le mix PCR, procéder comme ci-dessous :

a. Dans des tubes approprié et entouré de papier alu(les marqueurs de tail l e sont
photosensibles) mettre 975 .20 f..LI d 'eau miliQ, puis 460 J.!l équivalente de Tampon
1 OX et de dNTP, et 46 fll de MgC12.
b. Dans chaque tube on met une amorce microsatel lite (F et R respectivement 36.8 111

et 46 J..l l)

127
 c. Pour chaque amorce de microsatellite une couleur a été attribuée suivant les
groupes définis au départ (tableau annexe n°). Les couleurs des dye sont les
suivantes : Fam, Ned, Vic et Pet, 46 f.d sont distribué dans chaque tube. La Taq
polymérase est introduite en dernier pour un volume de 230!11.
d. Bien mélanger le mix au vortex

5- Distribution du Mix dans les plaques 3 84 et lancement des PCR

a. Verser le tout dans un bac blanc (rincer à l ' eau entre mix)
b. Distribuer à la pipette multi-canaux multidistributions 5 !li dans chaque puits
contenant 1 ' ADN à étudier.
c. Centrifuger et vérifier que chaque puits contient le même volume d'ADN
d. Mettre chaque plaque dans les appareils PCR suivant le programme défini pour
chaque microsatel l ite et la température d'ampl ification :

Températures

59°C 55°C 50°C

EME 222 SSRY6 1 SSRY3 8 SSRY55

EME 1 77 SSRY 1 70 SSRY64 SSRY 1 69

SSRY 1 9 SSRY63 SSRY30

SSRY9 1 SSRY l O l SSRY I OO

Marqueurs SSRY9 SSRY78 EME260

SSRY8 1 SSRY 1 2 EME4 1 2

SSRY82 EME3 53 EME3 3 1

SSRY45 EME20 EME3 73

EME303

EME63 7

. .
Tableau : RépartitiOn des microsatellttes en fonction de la température d'amplificatiOn

128
La PCR dure environ 3 H . Après le cycle PCR, centrifuger les plaques (si la migration sur capillaire
ne se fait le jour même, placer les p laques emballées dans du papier alu au frigo ou au congélateur
jusqu'à util isation)

129
130
Annexe n° 1 0 : Protocole pour l'électrophorèse capillaire.

1- Préparation de la plaque de Pool par le robot

A l 'aide du robot on prépare une plaque de pool :

a. Pour chaque plaque contenant du produit PCR, on prélève 3 1..tl pour les plaques en

FAM, NED et VIC et 3 , 3 fl l pour les plaques en PET qu'on introduit dans une
plaque 3 84 de manière à ce que chaque puis contienne pour un individu tous les
produits PCR des microsatel lites étudiés.
b. Enlever les plastiques sur les plaques 3 84 et les placer comme suit :

P lace des Racks Eau pure Eau m iliQ

des cônes

Plaque de
Rack d e cônes
Rack d e cônes
Pool ADN
ADNl
ADN2

Plaque 384 Plaque 384 P l a q ue 384 P l a q ue 384

A D N l-FAM ADN2- A D N 3-VIC AD N4-PET

P l a q u e 384 P l a q u e 384
Plaque 384 P l a q ue 384

A D N 3-VIC AD N4-PET
A D N l-FAM ADN2-

2- Al ler sur Users, usemames : « users »

3- Project 7 capillaires7open methods7ok

4- View 7 ABI pool PCR-3 84 7 ok
5- Lancer : icône triangle vert
6- Nombre de multiplexage : 8
7- Volume d'eau : 3 , S fl l
8- FAM: 2fll, NED : 2,2fll, V IC : 2fll et PET : 3 , 3 fl l
9- Le reste on laisse par défaut
1 0- L'eau est prise en premier par le robot (il faut changer l 'eau avant toute manip ! EAU
PURE)
1 1 - Lancer : ok, ok
1 2- Pause, puis ok

131
 1 3 - Remplacer les Racks de cônes par les deux autres.
1 4- Centrifuger la plaque de pool et les racks de cônes (ils vont être encore uti lisés)

Préparation de la plaque de migration ABI

A l ' aide du robot on prépare la plaque de migration pour le séquenceur cap illaire ABI
a. A partir de la plaque de pool on prélève 2 111 dans chaque puits qu'on introduit

dans une autre p laque 3 84

Placer les racks de cônes, la plaque de pool et celle pour ABI suivant le schéma :

Place Rack

d e cône

Rack de Rack d e Rack d e Rack de

cône ADNl c ô n e ADN2 c ô n e ADN3 cône ADN4

Plaque de Plaque ABI

pool

1- Run(triangle vert)
2- Par défaut accepter 2111 Ok ok ok
3- Centrifuger la plaque ABI en posant juste le plastique dessus
4- Laver les racks de cônes : déplacer les racks 3 et 4 et les placer devant les deux autres, puis
continuer le programme de lavage

Rack d e Rack de

c ô n e ADN l cône ADN2

Rack d e Rack de

c ô n e ADN3 cône ADN4

5- Remettre les racks à leur place dans le tiroir et centrifuger la plaque ABI
6- Préparation du mélange
1 - Dans un tube de 5 m l mettre 4ml d 'eau pure( pipette indiquée sous la hotte)
2- Centrifuger le marqueur de taille GeneScan600-LIZ Size-Standard V2.0 (2 tubes,
dont 1 est marqué par une croix : à utiliser en premier, bien centrifugé avant
prélèvement),
3- Mettre 48 111 de marqueur de taille dans le tube( bien mélanger le mix au vortex).

132
4- Distribuer en ligne 1 0 11 1 par puits dans la plaque ABI et la pipette indiquée est sur la
paillasse extérieure de la sal le du robot (utiliser u niquement les cônes 300Jd, jamais
les jaunes et n ' uti liser que cette pipette pour éviter les contaminations), régler pour 24
distributions de 1 0 111 avant la distribution
5- Remettre la pipette à la charge
6- Fermer la plaque ABI avec le plastique vert

7- Centrifuger et mettre dans le frigidaire à côté du séquenceur, dans la boîte « plaque à

déposer »
8- Préparer la feuille de route qui contient la disposition des ADN sur les plaques 3 84,
l 'envoyer par mai l au responsable de la plateforme génotypage

133
1 34
 An nexe n° 1 1 : Principe de fonctionnement du séquenceur capillaire
A BI.

L a méthode d e séquençage uti lisée est ici celle d e Sanger, q u i met à profit l'interruption aléatoire

du processus d'élongation de l'ADN au moyen des quatre dNTP marqués par un

fluorochrome. Après dénaturation de la plaque ABI 3 84 à l ' aide d ' un thermocycleur (94°C
pendant 5 minutes), on dépose la plaque dans le séquenceur ABI. On fourni une feu i l le de route
précisant l ' identité des échantillons dans les puits de la plaque ABI3 84. L'appareil est composé de
1 6 capillaires, d'un système d'électrophorèse, d'un laser et d'une caméra CCD. Les capillaires, d'un
diamètre d'environ 250 J..L m , sont rempli s avec un polymère liquide qui sert de tamis moléculaire.
Ce polymère (pop6-ABI) contient un polymère de séparation, les sels nécessaires à la migration et
l 'urée (conditions dénaturantes). Le capillaire réalise 1 6 injections de 24 échantillons en environs
30 min soit une durée de 9h pour une plaque 3 84. Le séquenceur est piloté par une plate-forme PC
qui commande pour chaque run : le remplissage des capil laires, l ' injection des échantil lons, la
détection et l ' analyse. Les molécules d'ADN sont introduites à une extrémité des capillaires par
é lectro-injection et migrent ensuite tout au long de ceux-ci sous l'effet d'un très haut voltage de
façon à les séparer en fonction de leur longueur. Près de l'anode, un rayon laser traverse chaque
capil laire afin d'exciter les molécules fluorescentes qui ont été incorporées à l'ADN durant la
réaction de pcr. Une caméra CCD recueille les informations émise par les molécules fl uorescentes
au fur et à mesure que celles-ci passent devant le rayon laser. Chacune des quatre bases nucléiques
(A, C, G et T) est associée à un fluorochrome particulier, le système peut les distinguer l'une de
l'autre selon la longueur d'onde émise. L'appareil est connecté à un ordinateur qui enregistre les
signaux en continu des échantil lons, des fichiers de données sont créés sous formes d' images.

135
136
 Tableau : Plan des plaques 96 pour les 365 accessions.

Plaaue
. ·- - � l. C
�-·
···
·
·-· - -··

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12
A Ea u CAMI CAM2 CAM3 CAM4 CAM5 eau CAM6 CAM7 CAM8 CAM9 CAM J O
8 CAM I I CAM I 2 CAM I 3 CAM I 4 CAM I 5 CAM I 6 CAM I 7 CAM I 8 CAM I 9 CAM20 CAM2 1 CAM22
c CAM23 CAM24 CAM25 CAM26 CAM27 CAM28 CAM29 CAM30 CAM3 1 CAM32 CAM33 REF2
D CAM34 CAM35 CAM36 CAM37 CAM38 CAM39 CAM4 1 CAM43 CAM44 CAM45 CAM46 CAM47
E CAM48 CAM49 CAM 50 CAM5 1 CAM 52 CAM 53 CAM 5 5 CAM5 8 CAM 59 CAM60 CAM61 CAM62
F CAM63 CAM64 CAM65 CAM66 CAM67 CAM68 CAM69 CAM70 CAM7 1 CAM72 CAM73 CAM74
G CAM75 CAM76 CAM77 CAM78 CAM79 CAM80 CAM8 1 CAM82 CAM83 CAM84 CAM85 CAM86
H CAM87 CAM88 CAM89 CAM90 CAM91 CAM92 CAM93 CAM94 REFI CAM95 CAM96 CAM97
Plaque2 RCA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 JO I l 12
A REF2 RCAI RCA2 eau RCA3 RCA4 RCA5 RCA6 RCA7 RCA8 RCA9 RCA I O
8 RCA I I RCA I 2 RCA I 3 RCA I 4 RCA I 5 RCA I 6 RCA I 7 RCA I 8 RCA I 9 RCA20 RCA2 1 RCA22
c RCA23 RCA24 RCA25 RCA26 RCA27 RCA28 RCA29 RCA30 RCAJ I RCA32 RCA33 RCA34
D RCA35 RCA36 RCA37 RCA38 RCA39 RCA40 RCA4 1 RCA42 RCA43 RCA44 RCA45 RCA46
E RCA47 RCA48 RCA49 RCA50 RCA5 1 RCA52 RCA53 RCA54 RCA55 RCA56 RCA57 RCA58
F RCA59 RCA60 RCA6 1 RCA62 RCA63 RCA64 RCA65 RCA66 RCA67 RCA68 RCA69 RCA70
G RCA7 1 RCA72 RCA73 REFI RCA74 RCA75 RCA76 RCA77 RCA78 RCA79 RCA80 RCA81
H RCA82 RCA EK 1 4 5 8 RCA E K 1 46C RCA EK 1 4 7A RCA EK 1 48A RCA EK 1 5 5A RCA EK 1 56C RCA EK 1 70A �K_36 EAU RCA EK I 72A
_ _
RCA EK 1 0 7
Plaque) Congo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I l 12
A EAU COl C02 C03 C04 EAU cos C06 C07 cos C09 CO I O
8 COl l CO I 2 CO I 3 C0 1 4 CO I S CO I 6 CO I 7 CO I S CO I 9 C020 C02 1 C022
c C023 C024 C025 C026 C027 C028 C029 C030 C03 1 C032 C033 C034
D C035 C036 C037 C038 C039 C040 C04 1 C042 C043 C044 C045 C046
E C047 C048 C049 C050 C05 1 C052 C053 C054 C0 55 C056 C057 C058
F C0 59 C060 C061 C062 C063 C064 C065 C066 C067 C068 C069 C070
G EAU C07 1 con C073 C074 C075 C076 C077 C078 C079 C080 C081
H C082 C083 REFI C084 C085 C086 REF2 C087 C089 C090 v C088
Plaque4 Gabon, RCA Tchad et Cameroun
,
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 I l 12
A REF2 GAB I GA82 GA83 GAB4 GAB5 GAB6 GAB7 GAB8 GAB9 GAB I O GAB I I
B GAB I 2 GAB I 3 GAB I 4 GAB I 5 GAB I 6 GAB I 7 GAB I 8 GAB I 9 GAB20 EAU GA82 1 GA822
c GAB23 GAB24 GAB25 GAB26 GAB27 GAB28 GAB29 GAB30 GAB3 1 GAB33 GAB34 GAB35
D GAB36 GA837 GAB38 GA839 GA840 GAB4 1 GAB42 GAB43 GAB44 GA845 GAB46 GAB47
E GA848 GAB49 TCH I TCH2 TCH3 TCH4 TCH5 TCH6 TCH7 TCH8 TCH9 TCH I O
F TCH I I TCH I 2 TCH I 3 TCH I 4 TCH I 5 TCH I 6 TCH I 7 TCH I 8 TCH I 9 TCH20 TCH21 RCA E K 1 08
G RCA EK 1 09 RCA EK I l l RCA EK 1 1 2 RCA EK 1 1 3 RCA EK 1 2 2 RCA EK 1 2 3 RCA E K 1 2 7 RCA E K 1 3 0 RCA EK 1 4 78 CAM98 RE F I CAM99
H i CAM I OO CAM l O I Ea u CAM I 02 CAM I 03 CAMI04 CAM I OS CAM I 06 CAM I 07 CAM I 08 CAM I 09 v

137
138
 An nexe n 1 2 : PROTOCOLE ANALYSE GENEMAPPER.

1- Récupérer les images dans D-7 dossier Manioc 7 « ManiocAFC-Gl-date ou « ordi

ABI »-7 Feui l le de route ; copier sur la clé USB

2- Ouvrir Gennemapper avec le sigle sur le bureau de l'ordinateur

3- Créer un projet :
a. File7 new project 7 type de marqueur : Microsatellite
b. Nommer le projet et l 'enregistrer : file-7save p roject(la nomenclature doit être
homogène : Manioc_AFC_2905 1 3_ADN_M 1 )
c. lmporter les données : file-7add samples to p roject, chercher le dossier à
importer puis -7add to list-7add

4- Analyse des échantil lons

a. Paramétrage des échantil lons pour analyse : « samples »7analysis method7

microsatel l ite banane-7edit-7 fill down ou CtrlD, puis sur la colonne « size
standard » choisir7 GS600Liz run court(-20, -40), cliquer dessus, puis Edit7fil l
down ou CtriD enfin « panel » : Tools7 panel management7Bin7New kit, le
nommer, et y ajouter les marqueurs « news markers » ou faire glisser si ils existent
déjà dans des groupes crées

b. Slectionner le projet 7analysis7 Analysis selected sample7 ok o u cliquer sur un

triangle vert

c. C lasser les individus par groupe de marq ueur : edit-7select on-7 edit sort-7 sort
by U D 1 (Used Defined column 1 )

d. Si le marqueur de tai l le a bien fonctionné, la colonne SQ est en vert pour tous, mais
ceux en orange ou rouge posent problèmes : pour corriger cliquer sur l ' individu à
relire et c liquer sur l ' icône « size match editor » et en cliquant sur chaque pic du
Marqueur de tai l le on peut « supprimer, ajouter ou modifier », on valide en cliquant
sur « override SQ », puis « size match editor », « apply » et « ok », cliquer dans
l ' onglet « samples » 1 sur la flèche verte pour réanalyser

139
C liquer sur l ' individu à l ire, puis « display plots », les couleurs bleue et verte sont par défaut, il
faut cliquer sur les couleurs rouge et jaune, puis sur l ' onglet qui a les 4 couleurs

e. La loupe permet de mieux vi sualiser les pics : se placer à gauche puis tirer vers le
haut ; puis se placer en haut et tirer vers la droite
f. Création des bins
1. F i le� selected all � bins�add reference data� add�aller chercher le
groupe de marqueurs� cliquer sur chaque marqueurs en ayant au
préalable mis sur l ' onglet bin set » banane »� avec le curseur on cl ique
sur chaque individu et ajouter les bins à chaque fois qu'on rencontre un pic
sur un individu
11. A la fin d e la création des bins, cliquer sur « apply » et ok

111. Après création des bins : selected all�analysis� analysis marqueur

g. vérifications des profils et des bins crées : al ler dans Genotype � ctr!A�choix du
marqueur à visualiser� display plot�panes(choix du nombre d ' individus à
visualiser sur écran)� Acceptation des pics ou pas : peak selection mode� delete
alleles ou rename alleles ou add alleles cali
h. validation des pics : les allèles sont relus plusieurs fois pour voir la cohérence des
pics (tail le, nombre de bases entre les pics)
1. Exportation des données : dans l ' onglet « genotype »�File� export
table�enregistrer le fichier

140
 An nexe n° 1 3 : Exemple de profils GeneMapper ( bon p rofil marqueur
EME20, de mauvais profils du marqueur SSRY55).

'�L�----m�: ____________ ·�
----------�
���
�--� �
�mt]
� ��
��
�.=-
� -------------------'-
"----------�----�

�·�------�
.f\�
,�-;=:: .73 ----:jl
�
i,: m
1

�� "------
� ____ ___._·�--'
------ ------�
Manloc_AFC_groo. CAM101 groupe M1bis EME20

1 � j___
� l�
�--� I::-------�·�_______J
IDam

��� �·�-----��---�·�� jji,5

1 3304

• • •
'" "' "' ... "' '"'

'" • • • •
"'

.... •y _,JI t , ..� ,

'" .... 110

:::
1�

( ,

141
142
 Annexe n°1 4 : Fréquences alléliqu es d e 2 3 marqueurs microsatellites
étudiés sur 338 accessions.

Allèles FA Allèles FA A l lèles FA

SSRY 1 70 p SSRY63 p EM E637 p

298 0.2545 301 0.6 1 95 206 0. 1 68 1
300 0. 1 1 53 303 0.0059 212 0.3348
302 0. 1 8 1 1 305 0.06 1 9 218 0.4 1 3
307 0.00 1 5 311 0.3 1 27 223 0.084 1
309 0. 1 527 SSRY61 p E M E353 p
313 0.0808 239 0. 1 89 1 58 0.2426
3 15 0.2 1 26 24 1 0. 1 369 161 0.73 8 1
317 0.00 1 5 25 1 0.6696 1 96 0.0 1 64
SSRY169 p 253 0.0045 213 0.003
1 05 0.097 SSRY45 p E M E331 p
1 07 0. 1 836 207 0.2 1 83 1 65 0.747
1 15 0.0209 209 0.2994 1 77 0.253
1 17 0.697 219 0.0 1 47 E ME303 p
1 19 0.00 1 5 223 0. 1 445 161 0.33 1 8
SSRY 1 0 1 p 237 0. 1 047 1 63 0.4786
228 0.0488 245 0.2 1 83 1 67 0 . 1 896
23 1 0.0 1 48 SSRY38 EM E260 p
234 0.3654 1 22 0.9853 1 72 0.368
237 0.0784 1 24 0.0059 1 84 0.3 1 2 1
240 0.3757 1 34 0.0088 1 88 0.0295
255 0. 1 1 69 SSRY30 p 1 89 0.0047
SSRY91 p 226 0.5682 1 90 0.2842
307 0.2455 237 0.00 1 5 204 0.00 1 6
315 0.5 240 0.4303 E ME222 p
317 0.2545 SSRY 1 9 p 1 90 0.0045
SSRY82 p 217 0. 1 348 1 93 0.0446
1 99 0. 1 882 219 0. 1 227 1 99 0.8036
207 0.025 229 0.0742 205 0 . 1 473
209 0.3206 233 0.353 E M E 1 77 p
21 1 0.0426 235 0.2409 1 87 0.2 1 36
217 0.0 1 76 237 0.0 1 97 1 90 0.7864
225 0.40 1 5 239 0.053 E M E20 p
227 0.0044 24 1 0.00 1 5 237 0.00 1 5
SSRY78 p SSRY 1 2 p 24 1 0.00 1 5
259 0.2 1 03 263 0.0355 247 0 . 1 97
267 0.3559 275 0. 1 893 250 0. 1 045
269 0. 1 029 28 1 0. 1 938 253 0.6791
271 0.3235 283 0.0725 256 0.0 1 64
279 0.0074 285 0.5089
FA = Fréquences alléligues Les chiffres en rouge indiquent les fréquences des allèles rares (<0.05).

143
 Allèles FA Allèles FA Allèles FA

SSRY64 p SSRY9 p
207 0.074 265 0.003
Allèles FA Allèles FA Allèles FA

208 0.284 275 0. 1 479

209 0. 2 1 3 277 0.0695
213 0. 1 1 98 279 0.07 1
215 0. 1 45 28 1 0.4038
217 0. 1 642 29 1 0.3047

FA = F réquences alléligues Les chiffres en rouge indiquent les fréquences des allèles rares (<0.05).

144
Resume

Le manioc, Manihot escu/enta Crantz est un aliment · oase dans les regions tropicales. 11 est

diploi"de, fertile, mais sa culture se fait largement par multiplication vegetative. 11 a ete introduit en

Afrique depuis le XVIeme siecle par les portugais. Bien que I' Afrique Centrale soit le premier

centre d'introduction, la diversite genetique du manioc dans cette region est mal connue. Suite a

une collecte de manioc cultive menee dans cinq pays de la CEMAC dans le cadre du projet

PRASAC pour une production durable du manioc, nous avons genotype 365 accessions en utilisant

28 marqueurs microsatellites. L'etude a revele 109 alleles avec un nombre moyen d'alleles par

locus de 4.74, pour un taux de 28% d'alleles rares. Les 338 accessions etudiees representent 253

genotypes multilocus. L'analyse de la diversite genetique ne revele aucune structuration

geographique ni agro-ecologique. Cela indique probablement une diversification locale d 1 111anioc

dans la region liee aux forts echanges entre les pays, mais aussi que la sexualite a part ci01. Ces

res·, bts serviront a guider les programmes de conservation regionale, et d'amelioration du tantoc

dans la region.

Mots cles : Manioc, Manihot Esculenta Crantz, microsatellites, diversite genetique, Afrique Centrale.

Abstract

Cassava, Manihot esculenta Crantz is a staple food in the tropics. Although diploid and fertile,

cassava is vegetatively propagated by farmers. Whereas it was frrst introduced in Central Africa

inthe XVIth century by Portuguese, little is known about its genetic diversity in this region. Within

the frame of a PRASAC project for sustainable production of cassava, 338 landraces and varieties

grown by farmers were collected in five countries of the CEMAC. These accessions were

genotyped using 28 microsatellite markers. The study revealed 109 alleles with an average number

of 4.74 per locus, for a rate of28% of rare alleles. 253 distinct multilocus genotypes were identified

among the 338 accessions studied. The analysis of genetic diversity revealed no geographical

structure nor agro-ecological. This may be due to exchanges and trade in the regio d indicates

that sexual reproduction was probably involved in the local diversification of cassava. These results

will be useful for conservation and breeding programs in Central Africa.

Keywords: cassava, Manihot esculenta Crantz, microsatellites, genetic diversity, Central Africa.