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Biologie médicale
[90-05-0220]

Mycobacterium tuberculosis

C hantal Truffot-Pernot : Praticien hospitalier

laboratoire de bactériologie-hygiène, centre national de référence de la résistance aux antituberculeux
(Paris), groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, 47, boulevard de l'Hôpital, 75651 Paris cedex 13 France
Emmanuelle C ambau : Praticien hospitalier
laboratoire de bactériologie-virologie-hygiène, C HU Henri Mondor, avenue du Maréchal de Lattre de
Tassigny, 94010 C réteil cedex France
David Trystram : Praticien hospitalier
laboratoire de bactériologie-hygiène, centre national de référence de la résistance aux antituberculeux
(Paris), groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, 47, boulevard de l'Hôpital, 75651 Paris cedex 13 France
Vincent Jarlier : Praticien hospitalier
laboratoire de bactériologie-hygiène, centre national de référence de la résistance aux antituberculeux
(Paris), groupe hospitalier Pitié-Salpêtrière, 47, boulevard de l'Hôpital, 75651 Paris cedex 13 France

Résumé
L'examen microscopique, effectué par la recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants (baar)
après coloration spécifique, est la méthode la plus rapide pour diagnostiquer la maladie
tuberculeuse.

La croissance de Mycobacterium tuberculosis est détectée en 3 à 4 semaines sur milieu de

Löwenstein-Jensen, et en 2 semaines en milieux liquides spéciaux. Les bacilles obtenus en
culture sont identifiés par tests biochimiques ou par hybridation avec une sonde génomique
spécifique du complexe M. tuberculosis.

La sensibilité aux antibiotiques est mesurée par la méthode des proportions. Les mutations du
gène rpoB, responsables de la résistance à la rifampicine, peuvent être détectées par tests
génétiques.

L'amplification génique, utilisable pour identifier des baar vus en microscopie, n'est pas encore
fiable pour rechercher M. tuberculosis dans les échantillons peu riches en baar (examen
microscopique négatif).

© 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

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INTRODUCTION

La tuberculose est habituellement suspectée sur des signes cliniques. Les examens
complémentaires (radiographie de thorax et autres examens d'imagerie, intradermoréaction à la
tuberculine...) peuvent renforcer l'impression clinique, mais le diagnostic de certitude est
bactériologique.

Le diagnostic bactériologique de la tuberculose s'effectue selon la séquence suivante : recueil

des prélèvements, recherche de bacilles acido-alcoolo-résistants (baar) par examen

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microscopique et culture in vitro qui permet l'identification des bactéries et la mesure de la
sensibilité aux antibiotiques.

Lorsque l'examen microscopique est négatif, la culture est la seule possibilité d'affirmer le
diagnostic. La croissance des bacilles de la tuberculose étant lente, la confirmation
bactériologique est alors tardive. Pour tenter de raccourcir les délais du diagnostic, des
systèmes de culture à détection rapide et des méthodes dérivées de la génétique moléculaire
ont été mis au point.

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AGENT PATHOGÈNE

Caractères généraux des mycobactéries, le complexe M. tuberculosis

Les bactéries responsables de la tuberculose sont M. tuberculosis, M. bovis et M. africanum qui,
pour des raisons de similarités génétiques, sont réunies dans un même ensemble appelé
complexe M. tuberculosis. Le bacille de Calmette et Guérin ou BCG, mutant non virulent de M.
bovis et M. microti, responsable de la tuberculose du campagnol, font aussi partie de ce
complexe.

Ces bactéries appartiennent au genre Mycobacterium : ce sont des bacilles dont la paroi,
épaisse et riche en lipides, leur confère des propriétés tinctoriales particulières et une
résistance relative à de nombreux antiseptiques (soude, acide, détergents). Ils se colorent
difficilement par les méthodes habituelles (Gram, bleu de méthylène) mais une fois colorés par
un colorant fort auquel est associé un mordanceur (phénol) ils ne se décolorent pas sous
l'action combinée d'un acide dilué et de l'alcool. Pour cette raison, ils sont dits « acido-alcoolo-
résistants ». Ils sont aérobies stricts et ont un temps de doublement particulièrement long.

Les bacilles de la tuberculose et les bacilles responsables de la lèpre [13] constituent les
espèces du genre Mycobacterium parasites strictes de l'homme ou des animaux. D'autres
espèces, plus nombreuses, qui sont appelées mycobactéries « atypiques » ou « non
tuberculeuses » (mycobacteria other than tuberculosis ou MOTT, des Anglo-Saxons) sont
présentes dans l'environnement et habituellement non pathogènes pour l'homme.

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RAPPEL PHYSIOPATHOLOGIQUE ET ÉPIDÉMIOLOGIQUE

L'infection tuberculeuse se fait habituellement par inhalation de quelques bacilles émis à

l'occasion de la toux par les malades atteints de tuberculose pulmonaire bacillifère (forme
cavitaire).

Dans la majorité des cas (90 %), la multiplication des bacilles est stoppée par le développement
des réactions immunes. L'infection tuberculeuse reste alors latente (ni signes cliniques, ni
signes radiologiques) et se manifeste seulement par la positivation des tests cutanés à la
tuberculine (primo-infection). Dans les autres cas, l'infection évolue en maladie, soit juste après
la primo-infection (80 % des cas dans les 2 ans qui suivent l'infection), soit plus tardivement (20
% le reste de la vie). Chez les jeunes enfants et les sujets immunodéprimés, en particulier ceux
séropositifs pour le VIH, l'infection tuberculeuse évolue beaucoup plus fréquemment vers la
maladie que chez les sujets immunocompétents.

La maladie tuberculeuse est la conséquence de la multiplication des bacilles dans les tissus qui
entraîne leur caséification par conflit immunologique. Si les foyers caséeux se liquéfient et
s'évacuent dans l'arbre bronchique, la tuberculose devient cavitaire.

Selon les estimations de l'Organisation mondiale de la Santé [5], il y a, chaque année, 9 millions
de nouveaux cas de tuberculose, responsables de 3 millions de décès. La tuberculose sévit
essentiellement dans les pays en voie de développement (tableau I). En France, l'incidence est
d'environ 11 cas pour 100 000 habitants [4]. Elle est plus de deux fois plus élevée en Île-de-
France que dans les autres régions de la métropole. Les personnes âgées nées en France (≫
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60 ans) et les adultes jeunes de sexe masculin nés à l'étranger sont les plus touchés par la
maladie.

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RAPPEL CLINIQUE

La tuberculose est essentiellement (90 %) une maladie respiratoire (pulmonaire et/ou pleurale).
L'ensemble des localisations extrarespiratoires (ganglionnaire, urogénitale, ostéoarticulaire,
méningée...) totalisent les 10 % restants.

La période d'état de la tuberculose pulmonaire est souvent, mais pas toujours,

plurisymptomatique avec des signes généraux non spécifiques (fièvre, asthénie) et spécifiques
(toux prolongée, hémoptysies, douleurs thoraciques si atteinte pleurale). La radiographie révèle
des opacités, excavées ou non, d'un ou des deux champs pulmonaires.

Les formes excavées à expectoration contenant des bacilles visibles à l'examen microscopique
(M+) sont très contagieuses et, en raison du très grand nombre de bacilles (de l'ordre de 108 )
dans les lésions, exposent au risque de sélection de mutants résistants aux antibiotiques sous
traitement.

Les caractéristiques cliniques sont indépendantes du bacille en cause, M. tuberculosis, M. bovis

ou M. africanum.

Chez les malades séropositifs pour le VIH, les images radiologiques sont moins caractéristiques
(images cavitaires moins fréquentes et souvent atypiques) et surtout les localisations
extrarespiratoires sont beaucoup plus fréquentes (ganglionnaire, méningée et même
disséminée avec hémocultures positives) que dans la tuberculose des malades
immunocompétents.

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RECUEIL, TRANSPORT ET CONSERVATION DES PRÉLÈVEMENTS

Les prélèvements pour recherche de bacilles de la tuberculose sont recueillis dans des flacons
fermés hermétiquement afin d'éviter tout risque de contamination lors du transport. Si l'analyse
doit être différée, les prélèvements sont conservés à + 4 °C pour préserver la viabilité des
bacilles et limiter la multiplication des micro-organismes contaminants (bactéries oropharyngées
pour les prélèvements respiratoires).

En cas de suspicion de tuberculose pulmonaire, on recueille les sécrétions respiratoires dans

des flacons propres. La présence des bacilles dans les sécrétions étant irrégulière, les
prélèvements sont habituellement répétés plusieurs jours de suite, le plus souvent trois. S'il
n'est pas possible d'obtenir, en quantité suffisante, des crachats de qualité (c'est-à-dire non
salivaires), il faut avoir recours au tubage gastrique, voire à des examens plus invasifs comme la
fibroscopie bronchique ou le lavage bronchoalvéolaire. Le recueil des prélèvements respiratoires
constitue une source d'aérosols de bacilles tuberculeux, ce qui fait courir des risques de
contamination au personnel et aux malades proches. Il doit donc être organisé avec soin.

En cas de suspicion de tuberculose extrapulmonaire, les prélèvements issus de ponctions de

séreuse ou d'abcès, ou de biopsies, qui ne sont pas contaminés par une flore commensale
(liquide céphalorachidien,...), sont recueillis aseptiquement dans des flacons stériles. Les
prélèvements contaminés (urines, pus d'abcès ouverts...) sont recueillis dans les mêmes
conditions que les crachats.

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DIAGNOSTIC AU LABORATOIRE

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Examen microscopique
Pour mettre en évidence les mycobactéries à l'examen microscopique, on utilise leur propriété
d'acido-alcoolo-résistance après les avoir colorées à la fuchsine phéniquée ou avec un
fluorochrome. Après coloration à la fuchsine, par la méthode de Ziehl-Neelsen (tableau II)
l'observation est faite au microscope optique avec un objectif à fort grossissement (x 100,
immersion dans l'huile) et les bacille s acido-alcoolo-résistants (baar) apparaissent comme des
bâtonnets rouges sur fond bleu (fig 1). Après coloration fluorescente à l'auramine 0 par la
méthode de Degommier (tableau II), l'observation est faite au microscope à fluorescence et les
baar apparaissent comme des bâtonnets jaune-vert et brillants sur fond sombre (fig 2). Dans
ce cas les bacilles peuvent être repérés avec un objectif de faible grossissement (x 25) et
l'examen microscopique est alors beaucoup plus rapide [7, 10].

Le résultat de l'examen microscopique est exprimé quantitativement (tableau III). Lorsque,

après coloration à l'auramine, le nombre total de bacilles observés sur le frottis est inférieur à
10, il est recommandé, en raison du risque de confusion entre baar et débris cellulaires,
d'effectuer un contrôle sur un autre prélèvement.

L'examen microscopique met en évidence des baar, c'est-à-dire des mycobactéries, mais ne
permet pas de faire la distinction entre complexe M. tuberculosis et mycobactéries atypiques.

L'examen microscopique n'est pas très sensible car il faut que le produit pathologique contienne
au moins 10 000 bacilles par ml pour que l'on puisse voir au moins un baar sur le frottis avec
une probabilité supérieure à 95 %.

Malgré ses limites, l'examen microscopique est une étape essentielle du diagnostic de la
tuberculose car il permet de détecter rapidement (en pratique en moins de 1 heure), les
malades les plus bacillifères, donc les plus contagieux pour leur entourage. C'est sur cet
examen que repose la stratégie de diagnostic et de traitement recommandée par l'OMS. En
France, en moyenne, la moitié des cas de tuberculose pulmonaire bactériologiquement
documentés sont à examen microscopique positif.

Culture
[7, 10]
La culture est beaucoup plus sensible que l'examen microscopique et permet
l'identification de la mycobactérie isolée ainsi que la mesure de sa sensibilité aux antibiotiques.
En moyenne, la moitié des cas de tuberculose pulmonaire bactériologiquement documentés ne
sont diagnostiqués que par culture (formes M-C +).

En raison des exigences nutritives et de la croissance lente des bacilles de la tuberculose, il est
nécessaire d'employer des milieux de cultures enrichis et d'éliminer les micro-organismes
commensaux des prélèvements (décontamination) avant de les ensemencer [7, 10].

Homogénéisation-décontamination
La décontamination des prélèvements repose sur la propriété qu'ont les mycobactéries de
mieux résister à certains antiseptiques que les autres bactéries. Les agents décontaminants
utilisés sont la soude ou un acide dilués. On y adjoint souvent un agent fluidifiant (par exemple,
le laurylsulfate de sodium ou la N-acétyl-L-cystéine) dont le rôle est d'homogénéiser les
prélèvements, notamment les crachats [7, 10]. Certains de ces agents sont des inhibiteurs de
la culture et de l'amplification génique (tableau IV) et ne peuvent donc être utilisés que dans
certaines conditions.

Bien que plus résistantes aux antiseptiques que les autres bactéries, les mycobactéries n'y sont
pas insensibles. C'est pourquoi :

les prélèvements issus de lésions fermées, qui ne sont pas contaminés par des
bactéries commensales et qui sont habituellement paucibacillaires, doivent être
manipulés dans des conditions de stérilité rigoureuse et ne pas être décontaminés;
le protocole de décontamination doit être soigneusement adapté pour réduire les
risques de contamination de la culture sans tuer trop de mycobactéries (dans ces
conditions 50 à 90 % des mycobactéries le sont pourtant). Un juste équilibre est
atteint lorsque le taux des cultures perdues par contamination est compris entre 2 et
5 % [7, 10].

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Milieux de culture
Les milieux pour la culture des bacilles de la tuberculose sont des milieux enrichis sur lesquels
peuvent se développer de nombreuses espèces de bactéries, mycobactériennes et autres.

Le milieu solide à l'œ uf de Löwenstein-Jensen est le milieu le plus couramment employé en

France.

Il est recommandé d'ensemencer plusieurs tubes de milieu de culture avec 0,2 à 0,5 ml de
prélèvement, de les incuber à 35-37 °C, de ne les fermer qu'après évaporation complète de la
semence et de les examiner chaque semaine pendant au moins 2 (si possible 3) mois, avant de
déclarer la culture négative [7].

Lors de la primoculture, les colonies de M. tuberculosis s'y développent en moyenne en 21 à 28

jours et prennent, lorsque l'aération du tube est satisfaisante, l'aspect typique en « chou-fleur
» (fig 3). Celles de M. bovis (fig 4) et de M. africanum (fig 5) s'y développent en plus de 1 mois
et restent petites (dysgonie).

Le milieu de Coletsos, milieu de Löwenstein-Jensen enrichi de pyruvate de sodium, favorise la

croissance de M. bovis et de M. africanum (fig 6).

Plusieurs milieux de culture liquide, dérivés du milieu de Middelbrook, peuvent être utilisés. Le
plus ancien, le milieu 7H12, qui est utilisé dans le système de respirométrie radiométrique
BACTEC 460 TB, a été supplanté, à cause des difficultés liées à l'élimination des déchets
radioactifs, par des méthodes utilisant des milieux non radioactifs. Ces milieux sont utilisés
®
manuellement (Mycobacterial Growth Indicator Tube ou MGIT , Becton Dickinson, et tube MB
®
Redox , Biotest) ou sont intégrés dans des systèmes automatiques de détection des cultures
® ® ®
positives (systèmes 9000 MB et Bactec 960 , Becton Dickinson et système BacT/Alert 3D ,
BioMérieux) (tableau V).

L'ensemencement des milieux liquides est habituellement précédé de l'addition d'un complexe
vitaminique (OADC) et de l'addition d'un cocktail d'antibiotiques pour les prélèvements non
stériles (sécrétions respiratoires...) (tableau V).

Dans les milieux liquides, la présence de bacilles de la tuberculose est détectée en moyenne en
8 jours (prélèvements M +) à 14 jours (prélèvements M-) et avec une sensibilité au moins égale
à celle du milieu de Löwenstein-Jensen. Toutefois, l'absence de colonies, la difficulté pour
détecter des cultures mixtes de mycobactéries et la fréquence des contaminations limitent leur
intérêt.

L'utilisation conjointe du milieu de Löwenstein-Jensen et d'un milieu liquide est recommandée à

chaque fois que cela est possible.

Certains milieux liquides ont été adaptés pour la recherche des mycobactéries dans le sang
et/ou pour l'antibiogramme (tableau V).

Identification
La première étape de l'identification des cultures est la vérification du caractère acido-alcoolo-
résistant des bactéries qui se sont développées (coloration de Ziehl-Neelsen). L'étape suivante
est la distinction entre bacilles de la tuberculose et mycobactéries atypiques et la dernière est
l'identification précise des bacilles de la tuberculose au sein du complexe M. tuberculosis. Trois
épreuves biochimiques simples permettent de faire la distinction entre bacilles du complexe
tuberculosis et mycobactéries atypiques : la recherche de l'activité catalasique après chauffage
pendant 20 minutes à 68 °C, le niacine-test et l'étude de la sensibilité à l'acide para-
aminosalicylique ou PAS (tableau VI).

Actuellement, on tend à remplacer les épreuves biochimiques par l'hybridation avec une sonde
génique complémentaire d'une séquence d'acide nucléique spécifique du complexe M.
® ®
tuberculosis (Accuprobe , GenProbe ou Inno-Lipa Mycobacteria, Innogenetics ou encore
® ®
Genotype Assay , Hain Science). L'hybridation avec la sonde Accuprobe permet d'identifier en
moins de 2 heures les bacilles du complexe M. tuberculosis obtenus en culture pure sur milieu
solide ou en milieu liquide. Sa sensibilité et sa spécificité proches de 100 %, en font un outil
fiable d'identification.

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La différenciation des quatre espèces d'intérêt clinique du complexe tuberculosis : M.
tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG et M. africanum est actuellement effectuée par étude des
caractères culturaux (temps de croissance, morphologie des colonies), biochimiques et de
sensibilité à certains antibiotiques (tableau VII) ou par génétique (trousse MTBC, Biocentric,
Hain Lifesciences).

Typage moléculaire
La technique de référence pour le typage moléculaire (empreinte digitale génomique) est la
technique RFLP (pour «restriction fragment length polymorphism»). Par cette technique, on
détermine le nombre et la taille des fragments d'ADN (obtenus après digestion de l'ADN
chromosomique par l'enzyme Pvu V), qui hybrident avec une sonde spécifique de la séquence
d'insertion IS6110 [15]. Le nombre de copies de l'IS6110 (1 à 20 copies par génome) et leur
position sur le chromosome sont stables pour une souche donnée mais différents d'une souche
à une autre, ce qui permet de « prendre les empreintes digitales génomiques » d'une souche et
de les comparer à celles d'autres souches.

La technique RFLP est très efficace mais elle est longue et complexe à mettre en œ uvre. Elle
est, pour l'instant, réservée à des cas particuliers et à des laboratoires spécialisés. D'autres
méthodes (ex. : spoligotyping) sont plus simples et plus rapides que la RFLP mais ont un
pouvoir discriminant plus faible, ce qui limite leur intérêt.

Amplification génique
Malgré l'utilisation de systèmes de culture en milieu liquide et de l'hybridation par sonde, la
culture n'est pas un moyen de détection rapide des bacilles de la tuberculose. C'est pourquoi
l'amplification de séquences nucléotidiques spécifiques de M. tuberculosis (amplification
génique), qui peut se faire en quelques heures, suscite tant d'intérêt.

La technique d'amplification initialement employée, une réaction artisanale de polymérisation en

chaîne (PCR), était relativement laborieuse et a été remplacée par des méthodes mieux
standardisées utilisant des réactifs prêts à l'emploi. Plusieurs « trousses » sont actuellement
® ®
disponibles en France : Amplicor Mycobacterium tuberculosis test (Roche), LCX-MTB (Abbott),
® ®
Amplified M. tuberculosis direct test ou AMTDT (GenProbe) et BD Probe-Tec (Becton Dickinson)
(tableau VIII).

Avec ces trousses, les résultats sont obtenus en moins de 24 heures mais, pour diverses
raisons (présence d'inhibiteurs dans le prélèvement, contamination par amplicons, difficulté de
lyser la paroi des mycobactéries...), ils sont moins performants que la culture en termes de
sensibilité et de spécificité, spécialement lorsque les échantillons sont peu riches en baar (à
examen microscopique négatif ou M-) : en effet, le taux de faux négatifs est très faible (< 1 %)
pour les prélèvements riches en bacilles (M +) mais élevé (30 -40 %) pour les prélèvements à
culture positive mais pauvres en bacilles (M-). Le taux de faux positifs est de 1 à 5 %. En
conséquence, lorsque la prévalence des cultures positives dans les prélèvements est de 2 à 3
%, ce qui est le cas pour les échantillons « tout-venant » dans la plupart des pays
industrialisés, la valeur prédictive d'un résultat positif est mauvaise (environ 50 %), et expose à
un risque élevé de diagnostics faussement positifs.

L'amplification génique ne peut donc être appliquée de manière satisfaisante à la détection de

M. tuberculosis dans les produits pathologiques peu riches en baar (M-). En revanche, pour les
prélèvements à examen microscopique positif, elle peut être appliquée, avec une bonne fiabilité,
à l'identification des baar vus à l'examen microscopique [2].

Diagnostic indirect
De nombreux essais ont été effectués, depuis des dizaines d'années, pour mettre au point une
sérologie spécifique de la tuberculose. Jusqu'ici aucun n'a donné de résultats satisfaisants.
Même en utilisant des épitopes dits spécifiques de M. tuberculosis, la spécificité du
sérodiagnostic est médiocre et la sensibilité ne dépasse guère 70 % [9].

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SENSIBILITÉ AUX ANTIBIOTIQUES

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Antibiotiques actifs

Résistance naturelle
Les bacilles de la tuberculose sont naturellement résistants à la plupart des antibiotiques actifs
sur les bactéries courantes de la pathologie humaine (β-lactamines, macrolides, cyclines,
phénicols, sulfamides...), à l'exception des aminosides, des rifamycines et de certaines
fluoroquinolones. Ils sont naturellement sensibles à des antibiotiques spécifiques : isoniazide,
pyrazinamide, éthambutol, thioamides (tableau IX).

Les antibiotiques de première ligne pour le traitement standard des nouveaux cas de la
tuberculose sont : isoniazide et rifampicine (les deux antibiotiques majeurs), pyrazinamide et
éthambutol (recommandations OMS). Tous les autres antibiotiques sont considérés comme des
antibiotiques de seconde ligne et ne sont prescrits qu'en cas de résistance aux antituberculeux
de première ligne.

M. bovis est naturellement résistant au pyrazinamide et certaines souches de M. africanum sont

naturellement résistantes à la thiacétazone.

Résistance acquise
Chez les bacilles de la tuberculose, la résistance acquise aux antibiotiques résulte de la
sélection de mutants résistants, initialement présents au sein de lésions très riches en bacilles,
lorsque le traitement ne comprend pas plusieurs antibiotiques actifs (polychimiothérapie). À ce
jour il n'a pas été mis en évidence de plasmides de résistance chez les bacilles de la
tuberculose.

Les gènes et les mutations impliqués dans la résistance acquise sont en cours d'identification
depuis une dizaine d'années (tableau X). La résistance à certains antibiotiques n'est pas
encore complètement élucidée (souches résistantes sans mutation connue) [12].

La résistance acquise sous traitement est appelée résistance secondaire; elle signe l'échec
thérapeutique. La résistance primaire, observée chez les malades avant tout traitement
antituberculeux, résulte de la contamination par une souche de M. tuberculosis déjà résistante
aux antibiotiques.

La résistance aux antituberculeux est un problème mondial. Les taux de résistance globale
(c'est-à-dire à au moins un antituberculeux) primaire et secondaire varient selon les pays [11].
Les antibiotiques concernés sont essentiellement l'isoniazide et la streptomycine
(antituberculeux les plus anciens), et à un moindre degré, la rifampicine. La fréquence de la
multirésistance, définie par la résistance aux deux antituberculeux majeurs, isoniazide et
rifampicine, progresse dans certains pays, ce qui constitue une menace redoutable.

Comme dans la plupart des pays industrialisés, la fréquence globale de la résistance primaire
est, en France, inférieure à 10 % et celle de la résistance secondaire de l'ordre de 20 %. La
multirésistance (0,3 % chez les malades sans antécédents de traitement antituberculeux et 3 %
chez ceux qui ont déjà été traités) n'est pas un problème majeur (tableau XI).

Antibiogramme

Indications de l'antibiogramme et antibiotiques à éprouver

L'antibiogramme est indispensable pour mener à bien le traitement lorsque les malades
rechutent ou lorsque les cultures sont encore positives après 4 mois de traitement. On pourrait
penser que l'antibiogramme n'est pas indispensable, en France, pour les nouveaux cas de
tuberculose puisque la quadrithérapie standardisée est conçue pour couvrir les risques de
résistance primaire. Cependant, les flux migratoires en provenance de pays où la résistance est
fréquente et l'émergence de souches multirésistantes, en particulier chez les malades fortement
immunodéprimés, justifient actuellement la réalisation d'un antibiogramme dans tous les cas de

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tuberculose, surtout si le malade est bacillifère [6].

En cas de première atteinte de tuberculose, les antibiotiques à éprouver d'emblée sont :

isoniazide, rifampicine, éthambutol et streptomycine. Bien que le pyrazinamide soit administré
en première intention, il n'est pas recommandé de le tester systématiquement, la résistance
primaire à cet antibiotique étant une rareté et l'interprétation des résultats étant délicate et
sujette à erreurs. En cas de rechute, et spécialement chez les malades ayant fait plusieurs
rechutes, il est nécessaire, étant donné le risque de multirésistance, d'éprouver aussi la
sensibilité aux antituberculeux de seconde ligne : aminosides (amikacine, capréomycine),
thioamides, fluoroquinolones, cyclosérine et PAS. Il est alors indispensable de transmettre la
souche dans un laboratoire hautement spécialisé, qui a l'expérience pour préparer les milieux
de cultures nécessaires (non disponibles dans le commerce), et pour interpréter les résultats.

Différentes méthodes

Méthode des proportions

La méthode des proportions est la méthode de référence. Elle consiste à vérifier si la proportion
de mutants résistants aux antibiotiques est celle que l'on observe pour les souches sauvages
normalement sensibles ou si elle est anormalement élevée. En France, la méthode des
proportions est habituellement effectuée sur milieu de Löwenstein-Jensen [1].

Pour déterminer la proportion de mutants résistants avec une bonne précision, il est
indispensable :

de préparer une suspension homogène des bacilles à étudier (pour cela on broie à sec
les colonies dans un ballon contenant des billes de verre avant d'ajouter l'eau pour
diluer);
d'ensemencer plusieurs dilutions de la suspension obtenue sur des milieux de culture
avec et sans antibiotique (milieux témoins).

La souche de M. tuberculosis est déclarée résistante lorsque la proportion des bacilles résistants
est égale ou supérieure à la proportion critique (tableau XII).

La méthode donne de bons résultats avec la majorité des antibiotiques à l'exception du

pyrazinamide. En effet, cet antibiotique n'étant actif qu'à pH 5,5 et la croissance de M.
tuberculosis à ce pH étant difficile et irrégulière, l'interprétation des résultats est délicate.

Les résultats de l'antibiogramme sont obtenus après 4 à 6 semaines d'incubation, délai

nécessaire au développement des colonies. Lorsque l'antibiogramme est effectué à partir d'une
primoculture (antibiogramme « indirect »), il sont donc généralement obtenus 2 mois après la
mise en culture du prélèvement. Lorsque l'examen microscopique du prélèvement révèle une
quantité suffisante de bacilles (plus de 1, et au mieux plus de 5 par champ), on peut faire un
antibiogramme « direct ». Pour cela, le prélèvement est homogénéisé, décontaminé et
ensemencé (pur et dilué) directement sur des tubes de milieu de culture avec et sans
antibiotiques. Les résultats de l'antibiogramme sont alors disponibles en même temps que ceux
de la primoculture.

Antibiogramme en milieu liquide

Il est possible d'apprécier, au sein d'une souche de M. tuberculosis, la proportion de mutants

®
résistants en utilisant le système Bactec 460 . On mesure alors la quantité de 14 CO 2 produite
dans des flacons additionnés d'antibiotique et dans des flacons sans antibiotique (témoins), les
flacons-témoins ayant été ensemencés avec 100 fois moins de bacilles que les flacons
contenant l'antibiotique. Si la production de CO2 marquée dans les flacons avec antibiotique est
au moins égale à celle de CO2 marquée dans les flacons-témoins, c'est qu'au moins 1 % des
bacilles sont résistants à l'antibiotique considéré.

La méthode permet de déterminer avec fiabilité la sensibilité à l'isoniazide, à la rifampicine, à la

streptomycine et à l'éthambutol, en 5 à 10 jours après la primoculture. On peut également
procéder à un antibiogramme direct si le produit pathologique est suffisamment riche en bacilles
mais les risques de contamination sont élevés. La méthode en milieu liquide n'est pas
standardisée pour les autres antibiotiques antituberculeux [8].
® ®
Le milieu MGIT et les systèmes Bactec 960 et BacTAlert 3D offrent la possibilité d'effectuer

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l'antibiogramme de M. tuberculosis et remplacent le système radioactif [8].

Antibiogramme par les méthodes de biologie moléculaire

Les mutations bien connues pour être responsables de la résistance aux antibiotiques et
localisées sur des séquences nucléotidiques bien identifiées peuvent être détectées après
amplification génique de ces séquences.

L'identification de la mutation peut être faite par séquençage du fragment génique amplifié, ce
®
qui est réservé à de rares laboratoires. Une technique plus simple et plus rapide, la LIPA ou «
Line probe assay », peut être utilisée dans certaines conditions. Elle consiste à hybrider la
séquence, préalablement amplifiée par PCR classique, avec des sondes fixées sur une
bandelette. La révélation des hybrides est enzymatique et se traduit par une réaction colorée.
®
Actuellement, la LIPA est commercialisée, sous la forme de réactifs prêts à l'emploi (InnoLipa-
®
RifTB , InnoGenetics), pour la détection de la résistance à la rifampicine (détection de mutations
du gène rpoB). Les résultats sont obtenus en 24 heures. Les premières évaluations montrent
qu'ils sont fiables [3] et qu'il semble possible d'appliquer la technique directement aux
®
prélèvements très riches en bacilles. Onéreuse et délicate, la technique LIPA doit être réservée
aux malades suspects de tuberculose à bacilles résistants (antécédents de traitement...) et
effectuée par des laboratoires entraînés.
®
La LIPA ne permet pas de faire l'analyse de grandes régions d'ADN et ne peut donc être
appliquée à la détection de résistances résultant de mutations dispersées et/ou concernant
plusieurs gènes comme c'est le cas pour la résistance à l'isoniazide.

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SÉCURITÉ AU LABORATOIRE

Le personnel, dans les laboratoires de mycobactériologie, est exposé à des aérosols de bacilles
de la tuberculose essentiellement générés par les manipulations des primocultures, lors des
identifications et des antibiogrammes.

Les manipulations doivent donc être effectuées dans des pièces qui leur sont réservées, dont
l'accès est contrôlé et qui, idéalement, doivent être placées en pression négative.

Pour obtenir la meilleure sécurité, les pièces doivent être équipées de poste de sécurité
microbiologique de classe I (à pression négative) qui doivent être contrôlés régulièrement.

Les centrifugations doivent être effectuées dans des nacelles fermant hermétiquement.
L'agitation des prélèvements, lors de leur décontamination, doit être effectuée dans un endroit
en dépression (sous un PSM de classe 1 ou dans une pièce séparée).

Les techniciens doivent porter des blouses de protection dont ils doivent se débarrasser avant
de quitter le laboratoire.

Enfin, tous les déchets (prélèvements, cultures positives...) doivent être autoclavés dans le
laboratoire avant d'être éliminés.

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STRATÉGIE DIAGNOSTIQUE « IDÉALE »

La stratégie diagnostique « idéale », combinant toutes les techniques disponibles pour le

diagnostic de la tuberculose et les tests de sensibilité est résumée dans la figure 7. Les tests
moléculaires et les tests de sensibilité aux antibiotiques de seconde ligne ne peuvent être mis
en œ uvre que dans les laboratoires très spécialisés.

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Références
[1] C anetti G, Rist N, Grosset J Mesure de la sensibilité du bacille tuberculeux aux drogues
antibacillaires par la méthode des proportions. Rev Tuberc Pneumol 1963 ; 27 : 217-272
[2] C antazaro A, Davidson BL Rapid diagnosis test for tuberculosis. What is the appropriate use?
. Am J Respir Crit Care Med 1997 ; 155 : 1804-1814
[3] C ooksey RC , Morlock GP, Glickman S, C rawford J Evaluation of a line probe assay kit for
characterization of rpoB mutations in rifampicin resistant Mycobacterium tuberculosisfrom New-
York C ity. J Clin Microbiol 1997 ; 35 : 1281-1283
[4] Decludt B, C ampese C Les cas de tuberculose déclarés en France en 2000. Bull Epidémiol
Hebd 2002 (n°16-17) :
[5] Dye C , Scheele S, Dolin P, Raviglione MC for the WHO global surveillance and monitoring
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country. JAMA 1999 ; 282 : 677-686 [crossref]
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strategy? Int J Tuberc Lung Dis 1999 ; 3 : 549-550
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1017.
[8] Heifets LB, C angelosi GA Drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis: a neglected
problem at the turn of the century. Int J Tuberc Lung Dis 1999 ; 3 : 564-581
[9] Mathur ML, Lobue PA, C atanzaro A Evaluation of a serologic test for the diagnosis of
tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 1999 ; 3 : 732-735
[10] Nolte FS, Metchock B Mycobacterium. In: Washington: American Society for
microbiology (Ed.) : 1995; 400-437.
[11] Pablo-Mendez A, Raviglione MC , Laszlo A, And AL Global surveillance for antituberculous drug
resistance 1994-1997. N Engl J Med 1998 ; 338 : 1641-1648
[12] Ramaswany S, Musser JM Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in
Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. Tuberc Lung Dis 1998 ; 79 : 3-29
[13] Shinnick TM, Good RC Mycobacterial taxonomy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994 ; 13 : 884-
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American Society for microbiology (Ed.) : 1995; 75-85.

[15] Van Embden JD, C ave MD, C rawford JT, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B , et al. Strain
identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommandations for a
standardized methodology. J Clin Microbiol 1993 ; 31 : 406-409

© 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Fig. 1 :

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Fig. 1 :

Bacilles acido-alcoolo-résistants dans expectoration après coloration par la méthode de Ziehl-Neelsen.

Fig. 2 :

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Fig. 2 :

Bacilles acido-alcoolo-résistants dans expectoration après coloration de Degommier.

Fig. 3 :

Fig. 3 :

C olonies de M. tuberculosis sur milieu de Löwenstein-Jensen.

Fig. 4 :

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Fig. 4 :

C olonies de M. bovis sur milieu de Löwenstein-Jensen.

Fig. 5 :

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Fig. 5 :

C olonies de M. africanum sur milieu de Löwenstein-Jensen.

Fig. 6 :

Fig. 6 :

C olonies de M. bovis var BC G sur milieu de Löwenstein-Jensen.

Fig. 7 :

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Fig. 7 :

Arbre décisionnel idéal pour le diagnostic de la tuberculose.

Tableaux
Tableau I
Tableau I - Estimation des cas totaux de tuberculose dans le monde et des cas dans les 10 pays les plus touchés
par la maladie (OMS, 2000).

C as totaux C as M+*

Nombre x 1000 Incidence** Nombre x 1000 Incidence**

Inde 1856 184 831 82

C hine 1365 107 588 46

Indonésie 595 280 267 126

Nigeria 347 305 150 132

Bangladesh 332 242 149 109

Ethiopie 249 397 105 166

Philippines 249 330 112 148

Pakistan 247 175 111 78

Afrique du Sud 228 526 93 214

Fédération Russie 193 132 87 59

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Total mondial 8735 144 3836 /

* M+, présence de bacilles acido-alcoolo-résistants à l'examen direct

**Incidence = nombre/100 000 habitants

Tableau II
Tableau II - Les différentes étapes des méthodes de coloration de Ziehl-Neelsen et de Degommier

Méthode de Ziehl-Neelsen Méthode de Degommier

colorant fuchsine phéniquée à chaud (10 min) auramine phéniquée à froid (15 min)

décolorant mélange acide-alcool (5 min)

acide sulfurique au 1/4 (3 min)
alcool à 90° (5 min)

contre-colorant bleu méthylène (30 s) rouge thiazine phéniquée (1 min 30)

coloration finale des bacilles

rouge jaune-vert fluorescent
(sur fond bleu) (sur fond rouge sombre)

Tableau III
Tableau III - Expression des résultats de l'examen microscopique.

Nombre de baar observés

Résultat après coloration à la fuchsine après coloration avec fluorochrome

(x 1000) (x 250)

absence 0 0

douteux* 1-2/200 champs 1-9 frottis

1+ 1-9/100 champs 1-9/10 champs

2+ 1-9/10 champs 1-9/champ

3+ 1-9/champ 10-99/champ

4+ > 10/champ > 100/champ

*à contrôler sur d'autres prélèvements.

Tableau IV
Tableau IV - Les principales méthodes de décontamination et leurs principales caractéristiques.

Méthode Agent C ompatible avec Inhibition

culture amplification

décontaminant fluidifiant sur en milieu

LJ liquide

Petroff soude 4 % / oui non non

Löwenstein acide sulfurique 4 % / oui oui non

à lÂÂ}acide acide oxalique 5 % / oui oui non

oxalique

soude 2 % lauryl sulfate oui non oui

Tacquet et
Tison

Kubica soude 2 % acétyl cystéine oui oui non

au Zéphiran chlorure de benzalkonium trisodium oui non oui

0,3 % phosphate

C PC 1 % chlorure sodium oui non oui

au chlorure

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de cétyl
pyridium (C PC )

Tableau V
Tableau V - Les différents tubes ou flacons pour la culture des bacilles de la tuberculose en milieu liquide et leurs
principales caractéristiques.

Tube ou Signal de Milieu prêt à Automatisation(c ) Flacons spéciaux pour

flacon croissance lÂÂ}emploi(b)
Hémoculture antibiogramme
(dénomination)

Bactec 460 radiométrie non oui(d) oui

oui
(13A)

MB Redox grains colorés oui non non non

MGIT fluorescence non non non oui

Bactec fluorescence non oui non oui

960(a)

BD fluorescence non oui Non

9000MB (a) oui
(mycoF/lytic)

BacT/Alert colorimétrie non oui oui

3D oui
(MB Bact Tsang)

(a) milieu identique

(b) contenant déjà le cocktail d'antibiotiques et le complexe vitaminique
(c ) de la détection des cultures positives
(d) semi-automatisation seulement

Tableau VI
Tableau VI - Principaux caractères différentiels des bacilles de la tuberculose et des mycobactéries atypiques.

Mycobactéries C atalase PAS Niacine Hybridation avec sonde spécifique du complexe

test tuberculosis
22 ÂÂ 68 ÂÂ
°C °C

bacilles de la + 0 S +* +
tuberculose

mycobactéries ++ + R 0 0
atypiques

*pour M. tuberculosis et certaines souches de M. africanum (négatif pour M. bovis)

PAS = acide para-aminosalicylique ; S = sensible ; R = résistant

Tableau VII
Tableau VII - C aractères d'identification des principales mycobactéries du complexe M. tuberculosis.

Mycobactéries Taille et aspect des C roissance favorisée par Nitrate Niacine

colonies* pyruvate TC H CS réductase test
2 30
mg/l mg/l

M. tuberculosis grosse a rugueux - R S + +

M. africanum petite b rugueux + V S V V

M. bovis petite c lisse + S S - -

M. bovis, var. grosse d rugueux - S R - -

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BC G

TC H = hydrazide de l'acide tiophène carboxylique (résultat valable uniquement pour les souches sensibles à
l'isoniazide).
C S = cyclosérine ; V = variable ; R = résistant ; S = sensible
*sur milieu de Löwenstein-Jensen.
a = fig 3 ; b = fig 5 ; c = fig 4 ; d = fig 6

Tableau VIII
Tableau VIII - Les différentes trousses d'amplification génique pour M. tuberculosis et leurs principales
caractéristiques.

Trousse Fabricant Méthode Test Automatisationa C ontrôle b Détection

dÂÂ}amplification manuel inhibition ampliconsc

Amplified GenProbe Transcription oui nond non non

Mycobacterium BioMérieux mediated
tuberculosis direct test amplification (TMA)
(AMTDT)Â Â �

Amplicor Mycobacterium Roche Polymerase chain oui oui oui oui

tuberculosis test  � reaction (PC R)

LC X MTB Â Â � Abbott Ligase chain non oui non oui

reaction (LC R)

BD Probe Tec  � Becton- Strand displacement non oui oui oui

Dickinson amplification (SDA)

a : pour les étapes suivantes = détection du produit amplifié ÂÂ� amplification.

b : recherche intégrée des inhibiteurs de l'amplification.
c : recherche intégrée des amplicons contaminants.
d : en cours de développement.

Tableau IX
Tableau IX - Activité des différents antibiotiques antituberculeux

Antibiotiques C MI (mg/l) Posologie mg/kg C . max. mg/l Type activité

1re ligne

Isoniazide 0,05 4-5 2,5 bactéricide

Rifampicine 0,20 10 10 bactéricide

Éthambutol 1 20 2,5 bactériostatique

Pyrazinamide 5 (à pH 5,5) 25 40-50 bactéricide (à pH acide)

2e ligne

Streptomycine 0,5 15 30 bactéricide

Kanamycine 0,5 15 30 bactéricide

C apréomycine 1 15 bactéricide

Thioamides 0,5 10-20 3,5 bactéricide

Ofloxacine 0,5 bactéricide faible

C yclosérine 10 10-20 40 bactériostatique

PAS 0,1 150-200 >100 bactériostatique

Thiacétazone 0,5 2-3 6 bactériostatique

C MI = concentration minimale inhibitrice moyenne pour les souches sauvages de M. tuberculosis mesurée en
milieu de Middlebrook.
C . max. = concentration sérique maximale.

Tableau X

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Tableau X - Les gènes impliqués dans la résistance de M. tuberculosis aux antibiotiques.

Antibiotiques Gène Protéine (ou ARN) cible Phénotype Fréquence

Rifampicine rpoB sous-unité B ARN toutes rifamycines haut 95 %

polymérase niveau

Streptomycine(SM) rpsL S12 SM haut niveau 50 %

rrS ARN16S SM 15 %

Isoniazide(INH) katG catalase peroxydase INH haut niveau 50 %

inhA énoyl AC P réductase (FAS INH bas niveau et 20 %

2) thioamides

ahpC hydroperoxyde réductase ? 15 %

kasA keto AC P réductase ? ?

Pyrazinamide(PZA) pncA pyrazinamidase PZA haut niveau 80 %

Éthambutol (EMB) embB arabinosyl transférase EMB haut niveau 70 %

Fluoroquinolones gyrA ADN gyrase sous-unité A toutes FQ 95 %

(FQ)
ifrA pompe efflux FQ hydrophiles 5%
hydrophiles

Tableau XI
Tableau XI - Prévalence de la résistance primaire (nouveaux cas) et secondaire (cas déjà traités) de M.
tuberculosis aux antituberculeux majeurs en France en 1999 (enquête Groupe Azay-Mycobactéries).

Résultat des tests de sensibilité Nouveaux cas C as déjà traités Antécédents inconnus

No (%) No (%) No (%)

Sensible 826 (90,8) 89 (84) 72 (83,7)

Résistant à : un antibiotique au moins 84 (9,2) 17 (16) 14 (16,3)

dont :

SM seule 45 (5,5) 3 (2,8) 6 (6,9)

INH seul 15 (1,6) 4 (3,8) 4 (4,6)

RMP seule 0 (0,2) 1 (0,9) 0

EMB seul 0 (0,1) 0 0

INH + SM 10 (1,1) 0 4 (4,6)

INH + RMP 6 (0,6) 9 (8,5) 0

Total 910 (100) 106 (100) 86 (100)

Tableau XII
Tableau XII - Proportions maximales de mutants résistants aux antibiotiques pour les souches sauvages de M.
tuberculosis et proportions critiques utilisées pour l'interprétation des tests de sensibilité par la méthode des
proportions.

Antibiotiques (conc. LJ) Proportion maximale mutants résistants Proportion critique

Isoniazide (0,2) 10- 6 1%

Rifampicine (40) 10- 7 1%

Éthambutol (2) 10- 6 1%

Pyrazinamide (200) / 10 %

Streptomycine (4) 10- 5 1%

Kanamycine (20) 10- 5 10 %

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C apréomycine (/) / 10 %

Thioamides (20) 10- 3 10 %

Ofloxacine (/) / 10 %

C yclosérine (30) 10- 2 10 %

PAS (0,5) 10- 5 10 %

(conc. LJ) : concentration antibiotique (mg/l) incorporée dans le milieu de L. Jensen pour le calcul des proportions.

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