« Génomique & protéomique » M I biotech Micro
La PCR
L’invention de la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) par K. Mullis et ses
collaborateurs en 1985 été le début d’une révolution dans la biologie moléculaire et la médecine
moléculaire. La réaction de polymérisation en chaîne est une technique in vitro utilisée pour
amplifier l’ADN à l’aide d’enzymes une région déterminée de l’ADN qui se trouve entre deux
régions de séquence ADN connue.
Alors qu’autrefois seules de très petites quantités d’un gène spécifique pouvaient être
obtenues, la PCR permet maintenant d’amplifier même une seule copie de gène à un million
d’exemplaires en quelques heures. 10
Si une paire d’amorces d’oligonucléotides peut être conçue pour être complémentaire à une
molécule d’ADN cible, de sorte que chacune subit une élongation en direction de l’autre par une
ADN polymérase, la région de la matrice liée aux amorces peut largement être amplifiée en
effectuant des cycles de dénaturation, d’appariement des amorces et de polymérisation.
Éléments nécessaires
Fragments d’ADN à amplifier (ADN matrice)
Deux amorces d’ADN en excès (Primers) ; ce sont deux fragments d’ADN simple brin de
courte taille (~ 20 nucléotides) complémentaires à chacune des extrémités de l’ADN.
Une ADN polymérase résistant à une température élevée. La première polymérase utilisée
était la Taq polymérase provenant d’une bactérie (Thermophlylus Aquaticus) qui vit dans
des sources chaudes. Aujourd’hui, on utilise d’autres polymérases plus fiables.
Des dNTP = dATP ; dCTP ; dGTP ; dTTP.
Thermocycler.
Cycle de la PCR :
Au début du cycle l’ADN cible est séparé en deux brins en élevant la température jusqu’à 95°C.
La température ensuite réduite à 55°C pour permettre aux amorces de s’apparier. La température
est adaptée en fonction de la longueur de la séquence de l’amorce. Après l’appariement, la
température s’élève jusqu’à 72°C (pendant 60 à 90 second) pour une polymérisation optimale qui
consomme les dNTP du milieu réactionnel et nécessite du Mg+2. Au cours de la première étape de
polymérisation, chaque cible est copiée à partir du site d’amorçage sur une distance variable
jusqu’au début du deuxième cycle.
Au cours de la deuxième étape d’appariement, la seconde amorce peut au brin nouvellement
synthétisé et au cours de la polymérisation, elle copie le brin jusqu’à atteindre l’extrémité de la
première amorce.
Les étapes sont présentées ci-dessous :
1. Dénaturation :
Au cours de la dénaturation, le double brin s’ouvre pour donner de l’ADN monocaténaire, et
toutes les réactions enzymatiques s’arrêtent (c’est-à-dire l’extension d’un cycle précédent). Les
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deux chaînes complémentaires sont séparées par une augmentation de température. C’est ce
qu’on appelle la dénaturation. Pour obtenir la dénaturation de l’ADN, on augmente généralement
la température à environ 93 – 96 °C. De cette façon, les fortes liaisons H sont rompues et le
nombre de bases non appariées augmente. La réaction est complète lorsque tout l’ADN
bicaténaire est devenu un ADN monocaténaire.
2. Hybridation (alignement) des amorces :
L’hybridation, ou réhybridation, des brins d’ADN a lieu à une température plus basse
(généralement 55–65 °C). Une fois que la température est abaissée, les deux chaînes
complémentaires d’ADN monocaténaire se reformeront en une molécule d’ADN bicaténaire. Au 11
cours de cette phase, les amorces se déplacent librement et des liaisons ioniques sont
constamment formées et rompues entre l’amorce monocaténaire et la matrice monocaténaire.
Les liaisons plus stables durent un peu plus longtemps (amorces qui correspondent exactement à
l’ADN matrice) et sur ce petit morceau d’ADN bicaténaire (matrice et amorce), la polymérase peut
se fixer et commencer à copier la matrice. Une fois que quelques bases sont incorporées, la liaison
ionique est si forte entre la matrice et l’amorce qu’elle ne se rompra pas.
3. Extension des amorces
Au cours de cette étape, les amorces sont étendues sur la séquence cible en utilisant une ADN
polymérase thermostable (souvent l’ADN polymérase Taq) en présence de dNTP, ce qui aboutit à
une duplication du matériel cible de départ. La température de travail idéale pour l’ADN
polymérase Taq est 72 °C. Lorsque les amorces ont été étendues de quelques bases, elles
possèdent une plus forte attraction ionique pour la matrice, ce qui réduit la probabilité de
survenue du processus inverse. Les amorces qui ne correspondent pas exactement se détachent
de nouveau (en raison de la température plus élevée) et n’entraînent pas une extension du
fragment. Les bases (complémentaires de la matrice) sont couplées à l’amorce du côté 3’ (la
polymérase ajoute des dNTP de 5’ vers 3’ en lisant la matrice de 3’ vers 5’). La durée des étapes
d’extension des amorces peut être augmentée si la région de l’ADN à amplifier est longue ;
cependant, pour la majorité des réactions PCR, une durée d’extension de 1 minute est suffisante
pour obtenir une extension complète.
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« Si la PCR était efficace à 100 %, une molécule cible serait présente à une quantité
de 2n après n cycles. En pratique, 20 à 40 cycles sont fréquemment utilisés »
L’ADN :
Toute source d’ADN qui fournit au moins une molécule cible peut ainsi en principe être utilisée
comme matrice pour la PCR. Cela inclut l’ADN préparé à partir de sang, de sperme ou de tout
autre tissu, d’anciens spécimens médicaux légaux, de vieux échantillons biologiques ou, en
laboratoire, à partir de colonies bactériennes ou de plages de phages, et d’ADN purifié. Quelle que
soit la source de l’ADN matrice, la PCR peut uniquement être appliquée si certaines informations
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concernant la séquence sont connues, afin de concevoir les amorces.
Si la PCR est bien optimisée, elle peut amplifier des séquences allant de 500pb à 10 kb.
Amorces :
Les amorces utilisés pour la PCR doivent avoir une longueur de 18-30 nt et un contenu similaire en
G+C afin qu’elles puissent s’apparier à leur séquence complémentaire à des températures
identiques
Les réactions de PCR ne sont pas efficaces à 100%, même si l’on utilise de l’ADN cloné et des amorces
bien définies. Alors il faut bien adapter les conditions des réactions pour améliorer l’efficacité
« L’optimisation est demandée »
Cycles de PCR
