Cours de BMC 456 Dr Lienou LL Cytologie et histologie moléculaires

CHAPITRE I : CYTOLOGIE ET HISTOLOGIE : GENERALITES

STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES

La cytologie est la branche de la biologie qui s’intéresse à l’étude de la structure et du fonctionnement

des cellules. La cellule elle-même constitue l’unité anatomique et physiologique de tout être-vivant, et est par
ailleurs la plus petite structure physique vivante rencontrée, assurant elle-même ses fonctions vivantes, qu’elle
soit isolée ou qu’elle appartienne à un organisme. On les retrouve dans les règnes animal, végétal, fongique et
même microbien. De ces organismes, nous distinguons les unicellulaires qui sont constitués d’une seule cellule
possédant et assumant toutes ses fonctions vitales, et les pluricellulaires qui sont constitués de plusieurs
cellules. Chez les êtres-vivants pluricellulaires, on note généralement une spécialisation : la cellule n’assure
plus toutes les fonctions de l’organisme et celles-ci se différencient pour apporter une fonction particulière à
l’organisme, d’où la notion d’organisation qui naît. Les cellules chez le pluricellulaire s’organiseront en tissus,
les tissus s’assembleront en organes, les organes en appareils et l’ensemble des appareils constitue
l’organisme. Cette hiérarchisation fonctionnelle, ayant à sa base la cellule, permet de comprendre que la
structure et le fonctionnement de tout un organisme reposent sur ceux de la cellule ; toute perturbation du
fonctionnement cellulaire résulterait donc en une perturbation de celui de l’organisme tout entier.
On distingue deux grands types de cellules qui diffèrent par leur taille, leur forme et leur organisation
structurale :
- La cellule procaryote : c’est une cellule de très petite taille (taille moyenne comprise entre 1 et
10 µm). Elles possèdent une organisation rudimentaire et sont généralement unicellulaires. Elles sont
entourées d’une paroi rigide et peuvent se présenter sous des formes diverses (bâtonnet, sphère, spirille,…)
- La cellule eucaryote : c’est une cellule de grande taille (taille moyenne comprise entre 10 et 100
µm) pouvant aller jusqu'à quelques centimètres chez les cellule-œufs des oiseaux. Elles sont souvent entourées
d’une paroi (cellules végétale et fongique) et peuvent être unicellulaires (protistes) ou pluricellulaires. Les
eucaryotes sont subdivisés en quatre sous-groupes : les protistes, les fonges (champignons filamenteux), les
animaux et les végétaux.
Tout comme les organismes, les cellules possèdent une organisation interne et même externe très
précise définissant leur fonctionnement ; de même, le flux de substances de part et d’autre de la membrane
définira son fonctionnement et même sa survie. C’est ainsi que les points suivants décriront la structure fine
des cellules et les mécanismes qui lui confèrent ses propriétés fonctionnelles.
La théorie cellulaire
• La cellule est une unité vivante, c'est l'unité de base du vivant.
• Individualité cellulaire grâce à une membrane plasmique qui règle les échanges entre la cellule et
l’environnement.
• Tous les êtres vivants sont faits de cellules (au moins une cellule).
• Toute cellule provient d'une autre cellule.
• La cellule renferme l'information (ADN) nécessaire à son fonctionnement et sa reproduction. L'ADN
est libre ou stocké dans un noyau.
• Cellules avec noyau = Eucaryotes (1,5 milliards d'années).
 Cellules sans noyau = Procaryotes (3,5 milliards d'années).

I- ORGANISATION STRUCTURALE DE LA CELLULE

1) Structure de la cellule procaryote

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Les procaryotes, dont le principal

représentant est la bactérie, sont des
êtres-vivants d’organisation interne
très rudimentaire : ils ont un noyau
embryonnaire et sont dépourvus
d’organites cellulaires. Ils possèdent
des cils et/ou un flagelle, leur
permettant de se déplacer. Certains
possèdent en plus de leur paroi, une
capsule rigide qui leur confère une
grande résistance aux antibiotiques et
une grande adaptabilité à des milieux
de vie variés. On retrouve les
bactéries dans tous les écosystèmes.
Elles sont dites Ubiquitaires.
Le cytoplasme de la cellule bactérienne ne contient pas d’organites. Son noyau, quasi-inexistant est
constitué d’un chromosome circulaire confiné dans un espace cytoplasmique appelé le nucléoide. Dans son
cytoplasme baignent des granulations appelées ribosomes, assurant la synthèse protéique ainsi que quelques
petites molécules d’ADN circulaire appelées plasmides portant des gènes de résistance. Leur membrane
cytoplasmique est recouverte extérieurement par une paroi peptido-glucidique d’épaisseur variable et dont la
coloration au réactif de Gram permet la distinction. En effet, les bactéries à Gram positif (Gram +) présentent
une forte coloration au réactif de Gram en raison de leur paroi épaisse tandis que les bactéries à Gram négatif
(Gram -) de paroi plus fine, ne retiennent pas le colorant et ne présentent pas de coloration. En plus de leur
paroi, certaines bactéries possèdent des excroissances cytoplasmiques telles que les cils vibratiles et flagelles
permettant le déplacement, les pili qui assurent la conjugaison, ou encore une capsule apportant une couche
protectrice supplémentaire et permettant l’adhésion de la bactérie à des surfaces.

2) Structure de la cellule eucaryote

Contrairement à la cellule procaryote, la cellule eucaryote possède une organisation cellulaire bien
définie et son protoplasme (ensemble des constituants solides de la cellule) est organisé en de nombreux
organites possédant des fonctions variées. Les organites sont des structures cellulaires caractéristiques des
cellules eucaryotes, situées dans le cytoplasme et délimitées par une membrane, dont il existe plusieurs types,
chacun impliqué dans la réalisation d’une ou plusieurs fonctions cellulaires spécifiques :
- Le noyau, entouré de deux membranes lipidiques séparées par un espace intermembranaire et perforées
de pores, contient l’information génétique de la cellule. C’est là que se trouvent les chromosomes et qu’a lieu
la transcription des gènes en ARN messager. Le noyau contrôle toutes les activités cellulaires et assure le
maintien de l’information génétique d’une génération cellulaire à l’autre. Au repos, on observe la chromatine
qui est la forme de l’ADN associée aux protéines histones et compactée en nucléosomes. On distingue:
l’euchromatine peu condensée et accessible aux ARN polymérases (Transcription: ARNm et ARNt) et
l’hétérochromatine très condensée et inaccessible aux ARN polymérases (« inactive »).
- Les organites non-énergétiques : ils participent aux activités de synthèse des cellules, c’est-à-dire à la
production de nouvelles molécules fonctionnelles. On en distingue deux : le réticulum endoplasmique et
l’appareil de Golgi. Le réticulum endoplasmique est associé aux structures cellulaires responsables de la
synthèse des protéines et des lipides : les ribosomes dans le premier cas, des enzymes dans le second. Ces
molécules nouvellement synthétisées sont prises en charge par le réticulum endoplasmique, qui assure leur

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transport jusqu’à l’appareil de Golgi. Celui-ci est responsable de la maturation finale des protéines et des
lipides qu’il reçoit, ainsi que de leur tri et de leur dispersion vers les différents compartiments cellulaires où
ces molécules sont nécessaires.
- Les organites énergétiques : Les réactions de synthèse réalisées dans les cellules nécessitent des
molécules de base et de l’énergie, sous forme d’ATP. Il existe deux types d’organites énergétiques.
Présentes chez tous les êtres vivants eucaryotes, les mitochondries réalisent la respiration cellulaire, qui
fournit de l’ATP en grande quantité. Présents uniquement dans les cellules végétales, les chloroplastes, qui
réalisent la photosynthèse, produisent de l’énergie chimique sous forme de molécules organiques (glucides
simples) — chez les animaux et les champignons, les hétérotrophes, les molécules organiques sont fournies
par l’alimentation (ingestion ou absorption) — et de l’ATP.
- Pour s’entretenir, une cellule a non seulement besoin de synthétiser des molécules, mais aussi de
détruire pour les renouveler, certaines molécules, et de détruire les molécules déchets du métabolisme.
Les organites de la digestion sont des vésicules remplies d’enzymes qui ont pour fonction la dégradation des
molécules de la cellule dans le processus de renouvellement des constituants cellulaires :
— les peroxysomes assurent des fonctions de type oxydation des acides gras et dégradation des
prostaglandines.
— les lysosomes sont impliqués dans la dégradation des macromolécules : acides nucléiques, glucides,
lipides, protéines.

ULTRASTRUCTURE D’UNE CELLULE EUCARYOTE ANIMALE

3) Les organites cellulaires

3.1 Le noyau
En biologie cellulaire, le noyau est une structure cellulaire présente dans la majorité des cellules
eucaryotes, et contenant l'essentiel du matériel génétique de la cellule (ADN). Il a deux fonctions principales :
contrôler les réactions chimiques du cytoplasme et stocker les informations nécessaires à la division cellulaire.
Il a un diamètre variant de 5 à 7 micromètres, ce qui fait de lui l'une des plus importante structure cellulaire,
en comparaison à certains organites.
Le noyau est entouré par une double membrane appelée l'enveloppe nucléaire. Les membranes internes
et externes de cette enveloppe fusionnent à intervalles réguliers, formant les pores nucléaires. Ces derniers
permettent les échanges nucléo-cytoplasmiques dans les deux sens, comme la sortie des ARNm (ARN
messagers) vers le cytoplasme et l'entrée de nucléotides dans le noyau nécessaire à la synthèse des ARN. Ainsi,

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l'enveloppe nucléaire régule et facilite le transport entre le noyau et le cytoplasme, tout en séparant les
réactions chimiques se déroulant dans le cytoplasme de celles se déroulant à l'intérieur du noyau.
La membrane externe est en continuité avec le réticulum endoplasmique granuleux ou rugueux (REG)
et peut être, comme ce dernier, parsemée de ribosomes sur sa face cytoplasmique. L'espace entre les deux
membranes (appelé l'espace périnucléaire) est en continuité avec la lumière (espace interne) du REG. Quant à
la membrane interne, elle est recouverte par la lamina sur sa face nucléoplasmique. La lamina est un réseau
de protéines (environ 2000 types de protéines) qui joue un rôle de soutien et participerait selon des recherches
récentes à l'organisation des mouvements de la chromatine pendant les différentes phases du cycle cellulaire.
À l'intérieur du noyau se trouve un ou plusieurs nucléoles entourés par une matrice fibreuse appelée le
nucléoplasme. Le nucléoplasme est un liquide ayant une consistance gélatineuse (similaire, à ce niveau, au
cytoplasme), dans lequel de nombreuses substances sont dissoutes. Ces substances comprennent des
nucléosides triphosphates, des enzymes, des protéines et des facteurs de transcription. Le matériel génétique
(ADN) est lui aussi présent dans le noyau, sous la forme d'un complexe ADN-protéines appelé chromatine et
composé de plusieurs unités discontinues appelées chromosomes.
Il y a deux types de chromatine : l'euchromatine et l'hétérochromatine.
 L'euchromatine est la forme la moins compacte d'ADN, et les régions d'ADN qui la constituent
contiennent des gènes qui sont fréquemment exprimés par la cellule. Elle se trouve principalement au centre
du noyau. L'euchromatine est active d'un point de vue transcriptionnel et apparait claire au microscope
électronique.
 Au contraire, dans l'hétérochromatine, située principalement en périphérie du noyau, l'ADN est
assez compact. À l'inverse de l'hétérochromatine, apparait sombre au microscope électronique et n'est pas
active d'un point de vue transcriptionnel. Les régions qui la constituent soit contiennent des gènes qui ne sont
pas exprimés par la cellule (ce type d'hétérochromatine est connue en tant que hétérochromatine facultative)
ou bien constituent les télomères et centromères des chromosomes (ce type d'hétérochromatine est connue
en tant que hétérochromatine constitutive). Dans les organismes multicellulaires, les cellules sont hautement
spécialisées dans l'exécution de fonctions particulières, en conséquence différents ensembles de gènes sont
requis et exprimés. Ainsi, les régions d'ADN qui constituent l'hétérochromatine varient suivant les types de
cellules.

3.2 Le réticulum endoplasmique

En biologie cellulaire, le réticulum endoplasmique (RE) est un organite présent dans les cellules
eucaryotes et lié à la membrane nucléaire. Le RE modifie les protéines, produit des macromolécules et
transfère des substances vers l'appareil de Golgi via des vésicules.
Dans les neurones, le réticulum endoplasmique se nomme « corps de Nissl », et dans les hépatocytes,
« corps de Berg ». Le terme « réticulum endoplasmique » est formé à partir du latin reticulum : « réseau » ; et
du mot endoplasmique : « à l'intérieur du cytoplasme ».
Le réticulum endoplasmique est une structure qu'on ne rencontre que chez les cellules eucaryotes; il est
toujours absent chez les cellules procaryotes (archéobactéries et eubactéries).
Le RE est une sous-compartimentation de la cellule. Il est composé d'une membrane (de composition
identique à la membrane plasmique) et d'une lumière. Ses fonctions s'expliquent par sa capacité à délimiter
un volume du reste du cytoplasme.
Il constitue un élément essentiel du réseau membranaire interne des cellules eucaryotes, en continuité
avec l'enveloppe nucléaire et en relation avec les autres compartiments, notamment les vésicules de l'appareil
de Golgi.
Le RE est constitué d'un réseau membraneux étendu. La membrane sépare la lumière du réticulum du
cytosol. Des parties de la membrane du réticulum sont en continuité avec la membrane externe du noyau, et
la lumière du RE est en continuité avec l'espace intermembranaire du noyau.
Une partie du RE est couverte de ribosomes qui assemblent les acides aminés en chaînes protéiques
suivant l'information venue du noyau. L'apparence rugueuse de ces parties au microscope électronique leur
vaut la qualification de RE granuleux (REG ou RER). Les parties sans ribosomes sont appelées RE lisse (REL). Les
ribosomes sur le REG insèrent la protéine synthétisée directement dans la lumière du RE, où elles acquièrent
leur configuration avant de gagner l'appareil de Golgi.
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La quantité de REL et de REG varie selon les cellules. De même la proportion de REG par rapport à celle
de REL varie aussi selon l'état d'activité de la cellule, selon les besoins en protéosynthèse de la cellule.
Les ribosomes peuvent être séparés les uns des autres, ou être assemblés en amas et reliés par un
filament d'ARN. Dans ce dernier cas ils forment les polysomes ou polyribosomes.
Les REG et REL ont des fonctions différentes mais ces deux éléments constituent des compartiments en
constante évolution dynamique et de ce fait l'on peut passer de l'un à l'autre dans une même cellule.
Le réticulum endoplasmique rugueux (RER), ou granuleux (REG), assemble et transporte les protéines
destinées aux membranes et à la sécrétion. Quelques minutes après la synthèse des protéines, la plupart
gagnent l'appareil de Golgi dans des vésicules golgiennes. Au sein du REG les protéines peuvent être modifiées,
repliées et leur qualité «contrôlée».
Le REG est le site de la traduction et du repliement lors de la synthèse des protéines.
En microscopie électronique, on remarque que le REG porte à sa surface une multitude de petits
granules. Ce sont des ribosomes en pleine synthèse protéique fixés à la surface externe du réticulum. Les
protéines qu'ils synthétisent sont injectées dans la lumière du réticulum via un pore aqueux, nommé Sec61.
Une fois dans la lumière, les protéines subissent une maturation, puis elles sont envoyées vers l'appareil de
Golgi. Si des protéines sont mal repliées, elles sont éliminées par le protéasome.
Une fois dans le Golgi, elles peuvent subir une modification post-traductionnelle (clivage de précurseur,
glycosylation, sulfatation ou encore phosphorylation), puis sont ensuite envoyées par des vésicules vers les
lysosomes, la membrane plasmique ou le milieu extracellulaire (sécrétion). Elles peuvent aussi rester dans le
Golgi, ou retourner dans le REG.
Le réticulum endoplasmique lisse (REL) intervient dans plusieurs processus métaboliques. Il participe à
la synthèse de lipides (phospholipides membranaires, cholestérol, stéroïdes...) et joue un rôle pour le début
de la glycosylation, la détoxification des cellules et le stockage du calcium. Dans certains types cellulaires le
REL spécialisé pour le stockage du calcium est appelé calciosome ou, dans les cellules musculaires, réticulum
sarcoplasmique.
Ses fonctions sont très diversifiées. Il peut s'agir tout d'abord d'une zone de réticulum granuleux mais
où ne s'exerce encore aucune synthèse. C'est aussi une zone de transit entre les régions de synthèse protéique
et celles où elles sont excrétées. Mais d'autres endroits assurent la synthèse des lipides membranaires. Ces
lipides seront intégrés à des vésicules d'exocytose qui fourniront leurs lipides à la membrane en fusionnant
avec elle.
Une autre fonction très importante du réticulum endoplasmique lisse est de réguler le calcium
intracellulaire. Le calcium est en effet un poison pour la plupart des processus métaboliques, la cellule en
contient donc le minimum. Or ce calcium est utilisé comme signal par certains des récepteurs membranaires.
Comme il y en a très peu dans la cellule, il suffit de peu d'ions pour augmenter la concentration dans des
proportions élevées. Il permet entre autres de déclencher la contraction musculaire, le potentiel d'action ou
l'exocytose et même la fusion des pronuclei lors de la fécondation. La cellule doit donc maintenir une
concentration intracellulaire de calcium très basse, tout en s'assurant qu'il y en a assez pour le signal calcique,
et ensuite évacuer le calcium du signal le plus vite possible pour permettre l'arrivée d'un nouveau signal, tout
en évitant que la concentration augmente trop et atteigne le seuil létal. Certaines zones du réticulum lisse
participent à cette régulation en constituant une réserve de calcium pour le signal et en récupérant le calcium
cytoplasmique, puis en évacuant l'excès de calcium vers le milieu extérieur.
Le RE assure de multiples fonctions :
 Stockage et concentration de molécules. Il le fait par endocytose, par pinocytose, ou à partir de
substances élaborées par la cellule. On note par exemple l'accumulation dans les vacuoles du RE des
plasmocytes, d'immunoglobulines.
 Rôle de détoxification, avec la transformation de molécules toxiques en molécules atoxiques, en
partie grâce au cytochrome P450. Cela a surtout lieu dans le rein et le foie.
 Rôle dans le métabolisme du calcium. Le calcium est stocké dans le RE. La régulation du calcium
avec l'Inositol-tris-phosphate (IP3) notamment, joue un rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire, dans
l'apoptose, et le métabolisme cellulaire.
 Sécrétion d'H+ et Cl- par les cellules bordantes de l'estomac et de ses boyaux.

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 Production de biomembrane : le REG produit des vésicules (dites de 'transition'), qui regagnent
l'appareil de Golgi, ce dernier produira des vésicules de sécrétion, à l'origine de l'exocytose. La membrane de
ces vésicules sera en fin de compte incorporée à la membrane plasmique, ainsi régénérée en permanence.
Les ribosomes sont des complexes ribonucléoprotéiques (c'est-à-dire composés de protéines et d'ARN)
présents dans les cellules eucaryotes et procaryotes. Leur fonction est de synthétiser les protéines en décodant
l'information contenue dans l'ARN messager. Ils sont constitués d'ARN ribosomiques, qui portent l'activité
catalytique, et de protéines ribosomiques. Les ribosomes sont constitués de deux sous-unités, une plus petite
qui « lit » l'ARN messager et une plus grosse qui se charge de l'agrégation des acides aminés pour former la
protéine correspondante.
Ils se trouvent dans le cytoplasme, libres, ou associés, soit aux membranes du réticulum endoplasmique,
soit à l'enveloppe nucléaire, soit même chez certaines bactéries à leur membrane interne (par exemple chez
Escherichia coli). Lorsque la traduction est très active, plusieurs ribosomes peuvent être associés
simultanément à un même ARN messager, ce chapelet de ribosomes consécutifs sur l'ARN étant appelé
polysome ou polyribosome. On trouve aussi des ribosomes dans les mitochondries et certains plastes, et leur
structure est proche de celle des ribosomes procaryotes. Ceci s'explique par la théorie de l'endosymbiose. Leur
fonction est de traduire les ARN messagers issus de l'ADN mitochondrial ou de l'ADN chloroplastique.
Comportant des ARN dits ARN ribosomiques (ou ARNr) et des protéines ribosomiques, ils sont composés
de deux sous-unités : une grande (L pour large) et une petite (S pour small) sous-unité. Ces sous-unités sont
construites0 autour d'un cœur d'ARN ribosomique possédant une structure très compacte, autour duquel sont
accrochées les protéines. Le site actif du ribosome qui catalyse la liaison peptidique est constitué d'ARN. Chez
les eucaryotes, la biogenèse des ribosomes a lieu dans le nucléole, une structure du noyau.

3.3 L’appareil de Golgi

L'appareil de Golgi est un organite des cellules biologiques. Il joue un rôle majeur dans le processus
d'exocytose, puisqu'il fait l'intermédiaire entre le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Il est
unique dans une cellule et régule le transport vésiculaire et se charge de modifier les protéines par
glycosylation, sulfatation…
Il est composé de deux faces : le site cis, face d'entrée des protéines sécrétées par le réticulum et le site
trans, face de sortie des vésicules
L'appareil de Golgi est un organite cellulaire polymorphe constitué d'un ou plusieurs dictyosomes (en
général : un seul dictyosome dans les cellules animales, et plusieurs dizaines dans les cellules végétales),
empilement de saccules membranaires de forme discoïdale et d'un réseau de canalicules appelé réseau trans-
golgien (Trans Golgi Network ou TGN). L'appareil de Golgi est formé d'un empilement de vésicules aplaties.
Chaque dictyosome peut être divisé en trois régions fonctionnelles différentes :
 les saccules de la face cis ou face d'entrée du matériel du réticulum endoplasmique ;
 les saccules de la région médiane ;
 les saccules de la face trans ou face de sortie.
L'appareil de Golgi est le lieu où certaines protéines sont modifiées, notamment par glycosylation, après
leur synthèse dans le réticulum au cours de la traduction des molécules d'ARNm- et de l'assemblage des
protéoglycanes.
L'évolution des composés contenus dans le dictyosome s'effectue de la face cis (cis-golgi, contenant
70 % de protéines et 30 % de lipides) à la face trans (trans-golgi, contenant 60 % de protéines et 40 % de lipides)
de celui-ci. Les protéines qui composent chacune des régions sont différentes et subissent des transformations
différentes dans chaque compartiment. Il existe deux postulats quant au transport des protéines dans
l'appareil de Golgi :
 Le modèle du transport vésiculaire : l'appareil de Golgi serait statique et le transport des
protéines dans celui-ci se ferait par des vésicules. Les enzymes spécifiques de chaque compartiment seraient
donc maintenues sur place alors que les protéines voyageraient via les vésicules qui bourgeonneraient d'un
compartiment pour aller fusionner avec le suivant. Il existerait tout de même un flux rétrograde de vésicules
qui s'assurerait de ramener toutes les protéines qui ont été capturées malencontreusement dans les vésicules
COP I se dirigeant vers la face cis.

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 Le modèle de la maturation des citernes : le Golgi serait une structure dynamique où les
différents compartiments se transformeraient au fur et à mesure et migreraient progressivement vers la face
trans. Ainsi, les vésicules du RER fusionneraient pour donner le premier compartiment (face cis) qui se
transformerait à son tour au fur et à mesure qu'il avance pour devenir un compartiment médian et ainsi de
suite jusqu'à se dissocier en diverses vésicules. Là aussi, un flux rétrograde de vésicules assurerait la spécificité
de chaque compartiment en ramenant les enzymes spécifiques du compartiment qui vient de migrer.
Les vésicules produites par l'appareil de Golgi permettent l'assemblage des chaînes lourdes (H) et des
chaînes légères (L) (dans le cas des anticorps) ainsi que l' "emballage" des immunoglobulines. De plus, ces
vésicules de sécrétion permettent les transports des protéines vers la membrane cytoplasmique.
L'un des rôles majeurs de l'appareil de Golgi est lié à des phénomènes d'exocytose. Il est le point de
passage obligé et régulateur du trafic vésiculaire. Il régule le nombre de vésicules allant à la membrane et
participe au renouvellement membranaire. Il entraîne des modifications post-traductionnelles des protéines

3.4 La mitochondrie
Une mitochondrie (du grec mitos, fil et chondros, grain) est un organite à l'intérieur d'une cellule
eucaryote, dont la taille est de l'ordre du micromètre. Son rôle physiologique est primordial, puisque c'est dans
les mitochondries que l'énergie fournie par les molécules organiques est récupérée sous forme d'ATP (énergie
contenue dans la liaison phosphoanhydride), la source principale d'énergie pour la cellule eucaryote, par le
processus d'oxydation phosphorylante. L'ensemble des mitochondries d'une cellule constitue ce que l'on
appelle son chondriome.
Elle est considérée comme la « centrale énergétique » de la cellule, car c'est là que se déroulent les
dernières étapes du cycle respiratoire qui convertit l'énergie des molécules organiques issues de la digestion
(glucose) en énergie directement utilisable par la cellule (l'ATP). En cas d'absence d'oxygène la cellule utilise la
fermentation dans le cytoplasme pour produire l'énergie nécessaire à son fonctionnement, mais c'est un
système bien moins efficace, qui dégrade le substrat de façon incomplète. L'augmentation de la concentration
en ions H+ dans les cellules musculaires est une des raisons de la fatigue après une activité intense. En effet,
ces ions H+ changent le pH intracellulaire et modifient de fait les conditions de fonctionnement enzymatiques
de la cellule qui ne peut plus travailler correctement.
C'est dans la mitochondrie que se déroulent les deux dernières phases de la respiration cellulaire : le
cycle de Krebs (dans la matrice) et la chaîne de transport d'électrons (au niveau de la membrane interne). En
effet, la production d'ATP comporte 3 principales étapes :
1. La glycolyse est la première étape. Elle se déroule dans le cytoplasme cellulaire.
2. La deuxième étape est la production d'Acétyl-CoA dans la mitochondrie.
3. La troisième et dernière étape est la phosphorylation oxydative.
Au cours de ces 3 étapes, via le cycle de Krebs (donc en condition d'aérobiose), la mitochondrie permet,
à partir d'une molécule de glucose, la production théorique de 36 ou 38 molécules d'ATP(cela dépend de la
navette utilisée pour transporter le NAD de la glycolyse) — en pratique, le rendement est un peu moins élevé,
voisin d'une trentaine de molécules d'ATP par molécule de glucose oxydée, certaines études donnant la valeur
de 29,85 ATP/glucose.
Les mitochondries participent à l'apoptose (mort cellulaire) avec le cytochrome C. De plus, elles ont aussi
une fonction de concentration et de stockage des ions calcium, sodium et potassium où ils sont stockés sous
forme de granules opaques. On trouve également de l'or, du fer et de l'osmium.

3.5 Le centrosome
Dans les cellules animales, le centrosome est le centre cellulaire organisateur des microtubules. Un
centrosome est un organite non membrané qui se compose d'une paire de centrioles, entourée par un nuage
de matériel amorphe appelé matériel péricentriolaire. Il s'agit d'un édifice composé de deux fois neuf triplets
de microtubules (avec trois protofilaments entre chaque microtubule), formant la paroi d'un cylindre. Cet
ensemble constitue donc un centre organisateur des microtubules, à partir duquel s'effectue la nucléation des
microtubules grâce à la présence, à sa surface, d'anneaux de tubuline γ, homologue de la protéine ARP pour
l'actine. Les microtubules polymérisent à partir de ce centre organisateur qui représente le point de ralliement

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des microtubules, lui forgeant alors un rôle primordial dans le trafic intracellulaire. Le centrosome a un rôle
dans l'orientation des cellules et est à l'origine des cils et des flagelles.
Durant l'interphase, le centrosome est responsable de la nucléation microtubulaire.
Le centrosome se duplique au cours de la phase de synthèse (pendant l'interphase) et, pendant la mitose, se
sépare pour former les deux pôles du fuseau mitotique (appareil mitotique). Il y a donc 2 paires de centrioles
appelées chacune « diplosome », c'est de ces deux pôles que seront nucléés les microtubules du fuseau
mitotique.

3.6 Les peroxysomes

Un peroxysome est un organite cellulaire entouré par une membrane simple et ne contenant pas de
matériel génétique. Contrairement à la mitochondrie ou au chloroplaste, toutes les protéines qui le constituent
sont codées par des gènes nucléaires et proviennent du cytosol. Le peroxysome a été découvert en 1965 par
Christian de Duve grâce à l'utilisation du microscope électronique.
Les peroxysomes permettent la détoxification de la cellule (par dégradation du peroxyde d'hydrogène
très toxique produit par les peroxysomes grâce à l'importation de dioxygène provenant des mitochondries, par
dégradation des acides gras à très longue chaîne et par synthèse d’acides gras polyinsaturés).
Les peroxysomes font partie d'une classe d'organite appelés « microbodies ».
 Ce sont des organites sphériques de 0,1 à 2 µm (on parle de microperoxysomes ou microbodies) jusqu'à
1 µm de diamètre chez les animaux, mais ils peuvent atteindre 1,7 µm chez les plantes.
 Ils sont présents dans toutes les cellules eucaryotes (sauf dans les réticulocytes et les hématies), avec une
taille maximale chez les animaux dans les cellules du foie (hépatocytes) et des reins.
 Ils possèdent un nucléoïde cristallin protéique (urate-oxydase), à l'exception des primates.
 Ils contiennent des enzymes oxydantes : D-amino-acide-oxydase, urate-oxydase, et catalase… (pour les
réactions de finalisation de la consommation d'O2)
Comme la mitochondrie, les peroxysomes sont des sites essentiels pour l'utilisation du dioxygène. Ils
utilisent de l'O2 et du H2O2 lors de réactions enzymatiques d'oxydations.

3.7 La membrane plasmique

MODELE DE MOSAIQUE FLUIDE MEMBRANAIRE (Singer et Nicholson, 1970)

La membrane cytoplasmique est une bicouche constituée principalement de lipides et de protéines et

de glucides entourant la cellule.
La membrane plasmique est composée d’une double couche de lipides particuliers (phospholipides en
majorité, mais aussi glycolipides et cholestérol) associés à des protéines et à des molécules de glucides. Les
phospholipides qui forment la structure de base de la membrane plasmique sont composés de deux parties
distinctes : une partie hydrophile (« qui aime l’eau ») et une partie hydrophobe (« qui repousse l’eau ») — les
phospholipides sont des molécules dites amphiphiles. Les phospholipides s’assemblent spontanément entre

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eux par leur partie hydrophile pour former une double couche, laissant les parties hydrophobes tournées vers
l’extérieur.
Les protéines insérées dans la bicouche lipidique sont responsables des fonctions de la membrane.
Certaines la traversent de part en part on parle de protéines transmembranaires. D’autres, plus rares, ne sont
associées qu’à l’une des deux couches lipidiques, interne ou externe. Les protéines qui affleurent du côté
externe sont appelées protéines de surface. Dans les cellules eucaryotes, les protéines membranaires sont
souvent liées, du côté externe, à des molécules de glucides (oligosaccharides ou polysaccharides). Ces glucides
de surface joueraient un rôle dans la reconnaissance entre cellules.
La membrane plasmique n’est pas une structure figée, mais fluide : les lipides et les protéines qui
composent la bicouche diffusent en permanence de façon latérale. Plus rarement, les phospholipides peuvent
également passer d’une couche à l’autre.
La membrane plasmique est la membrane qui entoure toutes les cellules, procaryotes (bactéries) ou
eucaryotes. Elle est constituée d'une double couche de phospholipides où sont insérées des molécules de
cholestérol, et à la surface de laquelle affleurent des protéines. Les protéines qui traversent la membrane de
part en part sont dites transmembranaires.
Les molécules de phospholipides sont constituées d'une tête hydrophile (qui aime l'eau) d'une queue
hydrophobe (qui repousse l'eau). Les deux couches de phospholipides se font face dans la membrane, les têtes
dirigées vers l'extérieur et les queues vers l'intérieur. Les têtes hydrophiles sont en contact avec le cytoplasme
et le liquide extracellulaire, tandis que les queues hydrophobes empêchent les molécules solubles dans l'eau
de traverser la membrane, tout en permettant le passage des molécules liposolubles. La membrane joue donc
un rôle essentiel dans la régulation de la composition du cytoplasme et du liquide extracellulaire.
Les protéines membranaires assurent une multitude de fonctions. Les protéines de transport, canaux ou
pompes, assurent le passage d'un côté ou de l'autre de la membrane de grosses molécules hydrosolubles comme
les sucres et certains acides aminés. Les glycoprotéines, protéines associées à des résidus glucidiques, jouent un
rôle dans l'identification de la cellule par le système immunitaire.
Sous la membrane, le cytosquelette, réseau de protéines filamenteuses dont certaines sont contractiles,
assurent le maintien de la forme de la cellule et ses mouvements éventuels (certains globules blancs,
notamment, sont capables de se déplacer par mouvements amiboïdes).
La membrane plasmique est une structure dynamique : les molécules de phospholipides sont en continuel
déplacement. Les molécules de cholestérol de la membrane plasmique agissent comme des stabilisateurs qui
limitent les mouvements de glissement entre les deux couches de phospholipides ; plus les molécules de
cholestérol sont nombreuses, moins la membrane est fluide.

3.8 La paroi cellulosique

Une paroi cellulaire est une paroi assez rigide entourant certaines cellules, situé à l'extérieur de la
membrane cellulaire, qui apporte à la cellule un soutien structurel, une protection, et agit comme un
mécanisme de filtrage. La paroi cellulaire fait aussi obstacle à l'expansion lorsque l'eau pénètre dans la cellule.
Les plantes, les bactéries, champignons, les algues, et certaines archées possèdent des parois cellulaires. Les
animaux et les protozoaires n'en ont pas.

Les matériaux constitutifs de la paroi cellulaire varient d'une espèce à l'autre. Chez les plantes, la plus
forte composante de la paroi cellulaire complexe est un glucide de grande taille appelé cellulose. Chez les
bactéries à Gram positif, les formes de peptidoglycane sont dominantes, tandis que la paroi est
majoritairement protéique chez les bactéries à Gram négatif. Chez les archéens, les parois des cellules ont des
compositions différentes, elles peuvent être formées de glycoprotéines couches S, de pseudopeptidoglycanes,
ou de polysaccharides. Les champignons possèdent des parois cellulaires composées de chitine, alors que les
murs des algues sont généralement constitués de glycoprotéines et de polysaccharides. Toutefois, certaines
espèces d'algues peuvent avoir une paroi cellulaire formée d'acide silicique. Souvent, les molécules d'autres
structures se trouvent ancrées à la paroi cellulaire.
La paroi pectocellulosique est un élément de structure cellulaire qui protège chaque cellule végétale.
Les végétaux ne sont pas les seuls à entourer leurs cellules de protections. En effet les champignons

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(eumycètes), les archées, les eubactéries et une partie des protistes possèdent une paroi. Mais la paroi
pectocellulosique est spécifique des cellules végétales (sauf quelques cellules comme les gamètes mâles n'en
possèdent pas). Elle n'a pas un caractère obligatoire car les chercheurs peuvent maintenir en culture des
protoplastes dans un milieu osmorégulé.

3.9 Le cytosquelette

Le cytosquelette d'une cellule est l'ensemble organisé des polymères biologiques qui lui confèrent
l'essentiel de ses propriétés mécaniques. La référence terminologique au « squelette » des vertébrés est
cependant trompeuse puisque :

 toutes les composantes du cytosquelette sont renouvelées par polymérisation en permanence

 le cytosquelette est à l'origine de la plupart des forces exercées par la cellule pour se déplacer et
se nourrir, ce en quoi il s'apparente plutôt à un ensemble de "muscles".
 enfin, les propriétés mécaniques du cytosquelette sont très variables suivant les composantes et
les situations considérées.

Le cytosquelette est composé de filaments d’actine (une protéine contractile), de microtubules et de

filaments intermédiaires. Dans les cellules eucaryotes, le cytosquelette forme également un support pour le
déplacement des organites et des vésicules d’endocytose ou d’exocytose. Il dirige également un grand nombre
des réactions chimiques de la cellule le long de voies bien définies. Les cytosquelettes de tous les eucaryotes
sont assez similaires (bien que des différences importantes existent entre les cellules animales et végétales),
tandis que ceux récemment découverts chez les procaryotes semblent organisés de façon tout à fait différente.

Le cytosquelette contribue à de nombreuses fonctions au sein de la cellule :

 La régulation de la forme de la cellule.

 L'ancrage aux membranes des cellules voisines.
 La formation de protrusions ou d'involutions membranaires (importantes pour la phagocytose et pour
la migration cellulaire : pseudopodes)
 Le maintien de la structure interne, et en particulier des compartiments cellulaires.
 Le transport de protéines ou d'ARNm.
 La séparation des chromosomes lors de la mitose
 La formation et la contraction de l'anneau mitotique permettant la séparation physique de deux cellules
filles (cytodiérèse).
 La contraction des cellules musculaires.

3.10 Le chloroplaste
C’est un organite typique de la cellule végétale, contenant le pigment vert appelé chlorophylle qui lui
confère des propriétés de photosynthèse. Ce pigment colore les feuilles et les tiges des plantes qui en
contiennent en vert.

3.11 La vacuole
Ce sont des grands sacs membraneux qui accumulent l’eau en excès, les pigments et les solutés. Elle est
très volumineuse chez les cellules végétales mais de petite taille chez les cellules animales.

Le tableau suivant résume les principales caractéristiques qui différencient les cellules procaryotes des
cellules eucaryotes :

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II- FONCTIONNEMENT CELLULAIRE

1) Flux de substances cellulaires

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La vie cellulaire est définie par la capacité de celle-ci à échanger des substances nutritionnelles ou de
déchets à travers sa membrane. Cet échange peut se faire de deux manières en fonction du type de substance
transportée:
- Par diffusion pour les substances dissoutes,
- Par endocytose/exocytose pour les substances non dissoutes.

1.1. La diffusion
La diffusion des substances à travers la membrane plasmique se fait sur la base de la fluidité
différentielle des composants membranaires : on dit que la membrane plasmique est hémiperméable. En effet,
les substances diffusibles, en fonction de leur taille traverseront la membrane plasmique cellulaire au niveau
de ses pores, des phospholipides, ou des protéines. Il existera donc plusieurs mécanismes de diffusion :

1.1.1 Le transport passif

C’est un mode de diffusion de substances dissoutes qui se fait sans consommation d’énergie chimique
par la cellule. Le flux de substances se fait dans le sens du gradient décroissant de concentration. On dispose
de :
- La libre diffusion : elle s’applique aux substances de très petite taille capable de diffuser à travers
les pores membranaires, ou de se dissoudre dans la bicouche phospholipidique. C’est le cas de l’eau, des acides
gras et des solutés neutres de petite taille ;
- La diffusion facilitée : ce mode de transport s’applique aux substances non diffusibles qui
traversent la membrane plasmique au niveau de protéines spécifiques assurant leur transport. On dit que
celles-ci facilitent le transport de ces substances. Ce mode de transport s’applique aux substances ionisées

1.1.2 Le transport actif

C’est un mode de transport qui s’applique aux substances dissoutes qui se déplacent dans le sens
contraire du gradient décroissant de concentration. Ce transport s’effectue grâce à des protéines de transport
et nécessite la consommation d’énergie sous forme d’ATP.

1.2. L’endocytose/exocytose
Les macromolécules (protéines, glucides, lipides) sont trop grosses pour être prises en charge par les
transporteurs de la membrane. Leur transport se fait par l’intermédiaire de vésicules membranaires : c’est le
phénomène d’exocytose (qui assure la sortie des macromolécules de la cellule) et d’endocytose (entrée des
molécules).

1.2.1 L’endocytose
À la surface de la cellule, des portions de la membrane plasmique s'invaginent continuellement vers
l’intérieur, formant dans le cytoplasme des vésicules d’endocytose. Ce mécanisme permet à la cellule de
capturer diverses substances et molécules du milieu extérieur. La phagocytose, réalisée par des cellules
spécialisées, est une forme d’endocytose. Elle permet à la cellule d’ingérer des particules de grande taille, voire
des cellules entières. La pinocytose, quant à elle, permet l’intégration de petites gouttelettes de liquide du
milieu extérieur.

1.2.2 L’exocytose
Un échange continuel de matériaux se produit entre le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi.
Là, les molécules sont triées et envoyées vers leur destination finale par des vésicules membranaires. Certaines
sont des molécules de sécrétion : elles fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu dans
le milieu extérieur, c’est l’exocytose.

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1.3. La plasmolyse/ turgescence

Le comportement cytoplasmique d’une cellule dépend de la concentration du milieu dans lequel celle-
ci se trouve. Suivant la loi de l’osmose, le solvant diffuse à travers la membrane du milieu le plus dilué vers le
milieu le plus concentré. En effet, une cellule placée dans un milieu hypotonique (de faible concentration en
solutés) conduit à une entrée d’eau dans la cellule entrainant une augmentation du volume de celle-ci. Par
contre, si la cellule est placée dans un milieu hypertonique, l’eau sort de la cellule pour diluer le milieu
extracellulaire, entrainant une réduction de son volume. L’état d’équilibre est marqué par une isotonie de part
et d’autre de la membrane plasmique.
Cette modification est liée à une modification du volume cellulaire uniquement avec les cellules
animales car dépourvues de paroi. Les cellules végétales par contre, entourées d’une paroi rigide, ne changent
pas de forme. On note par contre un décollement par endroit de la membrane plasmique vis-à-vis de la paroi
en cas de plasmolyse végétale.
1.4. Les communications cellulaires
Les organismes pluricellulaires disposent de nombreux atouts permettant la communication entre leurs
cellules : elles peuvent communiquer par contact direct au niveau de certaines jonctions de leurs membranes
(jonctions serrées, jonctions ouvertes, plasmodesmes ou desmosomes) qui permettent la communication
entre les cytoplasmes. Les messages électriques (influx nerveux) qui se propagent le long des cellules
excitables, de même que certaines informations chimiques, nécessitent des récepteurs membranaires
sensibles à la stimulation par des molécules messagères. C’est le cas des récepteurs de neurotransmetteurs
situés sur les neurones, assurant le passage des messages nerveux entre cellules excitables. Les récepteurs
situés à la surface de certaines cellules peuvent aussi être stimulés par fixation d’hormones spécifiques.

1.5. La division cellulaire

La division des cellules eucaryotes se déroule de deux manières en fonction du type de cellule. Les cellules
somatiques se divisent exclusivement par mitose, qui est une division conforme, c’est-à-dire que les cellule-
filles obtenues sont en tous points identiques à la cellule mère. Les cellules sexuelles par contre possèdent un
mode particulier de reproduction qui est la méiose. Cette dernière division n’est pas conforme car les gamètes
qui en sont issus ont une garniture chromosomique réduire de moitié et une forme différente de celle de la
cellule-mère.
Elle désigne aussi une étape bien particulière du cycle de vie des cellules eucaryotes, dit « cycle cellulaire »,
qui est l'étape de séparation de chaque chromosome de la cellule mère et de leur répartition égale dans
chacune des deux cellules filles. Ainsi, chaque « noyau fils » reçoit une copie complète du génome de
l'organisme « mère ». L’ADN est répliqué grâce à l'ADN polymérase lorsqu’il se trouve sous forme de
chromatine (équivalent à un chromosome déroulé), lors de l’interphase du cycle cellulaire.
Le cycle cellulaire est divisé en plusieurs phases :

 la phase G1, première phase de croissance (la plus longue),

 la phase S durant laquelle le matériel génétique est répliqué,
 la phase G2, qui est la seconde phase de croissance cellulaire et,
 la phase M, celle de la mitose proprement dite,
 il existe une phase dite de quiescence qui correspond à la sortie du cycle, phase G0, celle-ci survient
généralement en G1.

Les phases G1, S et G2 constituent l'interphase.

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La mitose est un phénomène continu, mais pour faciliter la compréhension de son déroulement, les
biologistes ont décrit quatre étapes caractéristiques de la mitose qui sont la prophase, la métaphase,
l'anaphase et la télophase. La mitose dure entre 1 et 4 heures. L’interphase est la période du cycle cellulaire
précédant la mitose qui est caractérisée par un accroissement du volume cellulaire, la cellule transcrit ses
gènes et les chromosomes sont répliqués. Elle ne fait donc pas à proprement parler partie de la mitose. Les
chromosomes sont sous forme de filaments compacts : la chromatine. C'est pendant cette phase que la
réplication de l'ADN s'effectue (chaque chromosome se double, il a deux chromatides). Elle peut être
subdivisée en plusieurs phases.

 La phase G1 (de l’anglais Gap 1 ; gap = espace, pour l'espace entre la mitose et la phase S) au cours de
laquelle la cellule croît et effectue les fonctions pour lesquelles elle est programmée génétiquement :
synthèse protéique, etc. Cette phase détermine la taille finale des cellules filles issues de la mitose.
 La phase S (pour Synthèse de nouvelle molécule d’ADN) au cours de laquelle le matériel chromosomique
(pour l'instant sous forme de chromatine) est doublé par duplication. Chaque filament de chromatine s'est
dédoublé en deux filaments qui restent collés en une sorte de croix (cette croix constituera, par
compactage/enroulement/condensation ce qu'on appelle habituellement le chromosome, c'est-à-dire
deux chromatides collées par leurs centromères).
 La phase G2 (Gap 2) où la cellule se comporte comme lors de la phase G1.

2. LA MITOSE

La mitose, division caractéristique des cellules somatiques, est un phénomène commun aux organismes
eucaryote. Cette division permet d'obtenir deux cellules filles à partir d'une seule cellule initiale et aboutit à la
distribution de deux lots de chromosomes identiques entre les deux cellules filles.

Rôles de la mitose

Les mitoses assurent plusieurs fonctions, elles permettent :

- Le développement embryonnaire qui permet le passage de l'état unicellulaire (œuf fécondé = zygote) à état
pluricellulaire (organisme).
- La croissance générale depuis la naissance jusqu'à la taille adulte
- La croissance continue de certains organismes (racine et tige des plantes supérieures) et organes (cheveux,
ongles)
- Le remplacement des cellules mortes et la cicatrisation des tissus lésés.
- Cas particulier
Si les mitoses intéressent presque toutes les cellules somatiques de l'organisme; certaines cellules ne sont pas
aptes à se diviser ainsi :
- Les cellules nerveuses (neurones) ne se divisent jamais au sein du système nerveux de l'adulte ce qui signifie
que toute perte de neurones est irréversible.
- Les hématies (globules rouges) du sang, cellules sans noyaux ne se divisent pas, mais elles proviennent de
cellules nucléées.
- Les cellules musculaires qui possèdent plusieurs centaines de noyaux ne subissent jamais de mitoses.

Mécanisme déterminant la division cellulaire

Divers hypothèses font l'objet d'études et de controverses :

- Facteurs héréditaires de taille : chaque type de cellule aurait une taille héréditaire, qui une fois atteinte et
dépassée, provoquerait la division.

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- Rapport nucléocytoplasmique (R.N.P.) : le noyau dont la croissance et plus lente que celle du cytoplasme,
devient incapable de contrôler efficacement un volume cytoplasmique important; la réduction de moitié du
volume cytoplasmique par la mitose rétablirait un contrôle efficace.

- Rapport membrano-cytoplasmique: la surface de la membrane cytoplasmique ne pourrait assurer des

échanges efficaces que pour une quantité limitée de cytoplasme.

- Existences de signaux cytoplasmiques: le cytoplasme contiendrait une substance (ou des substances)
chimique constituant un signal du déclanchement de la mitose. Ainsi on a montré qu'un noyau normalement
appelé à se diviser, transplanté dans un autre cytoplasme ne se divisait plus.

Fréquence des mitoses

Le rythme des mitoses varie d'une cellule à l'autre:

- Pour la peau humaine chaque cellule de l'épiderme est éliminée 20 à 30 jours après sa formation et le rythme
des mitoses dans les couches profondes de l'épiderme est tel que la genèse de nouvelles cellules par mitose,
compense exactement la perte des cellules mortes éliminées en surface, l'épaisseur de l'épiderme reste donc
constante.

- Une hématie vit 120 jours, la perte de 200 milliards d'hématies par jour est compensée par la fabrication de
200 milliards de jeunes hématies dans la moelle osseuse.

- Les cellules hépatiques (du foie) présentent généralement peu de mitoses, ces dernières augmentent
considérablement en cas d'ablation d'une partie du foie.

- Une cellule intestinale vit de 3 à 5 jours avec 1 million de cellules remplacées chaque jour

Remarque: l'altération du rythme des mitoses engendre des cellules cancéreuses qui subissent des divisions
anormales à un rythme aberrant conduisant à la formation de tumeurs malignes qui s'infiltrent dans les tissus
sains et les lèse, on parle alors de cancer.

Déroulement des mitoses

La division cellulaire est un phénomène continu, les cytologistes ont, néanmoins, fixé 4 phases aux limites un
peu arbitraires, il s'agit de la prophase, la métaphase, l'anaphase et la télophase. Entre deux divisions, c'est-à-
dire entre la fin de la télophase et le début de la prophase suivante, la cellule est dite en interphase.

On appelle cycle cellulaire l'ensemble interphase + mitose.

L'interphase est la phase la plus longue du cycle cellulaire et la prophase est la phase la plus longue de la
mitose. La durée d'une mitose varie de quelques minutes à quelques heures en fonction des cellules.

3. MEIOSE
La méiose est la division caractéristique des cellules germinales, elle se déroule durant la gamétogenèse
(spermatogenèse ou ovogenèse), c'est-à-dire durant l'élaboration des gamètes et a pour but de donner des
cellules haploïdes (à n chromosome) à partir de cellules diploïdes (à 2n chromosomes) au cours de deux
divisions successives :
- la méiose I ou division réductionnelle.
- la méiose II ou division équationnelle.
Chaque division est formée de quatre phases : prophase, métaphase, anaphase et télophase.

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Déroulement de la méiose
Méiose I (division réductionnelle)
a) Prophase I
Le début de la prophase de méiose I rappelle le début de la mitose. On assiste à un épaississement et un
raccourcissement progressif des chromosomes qui deviennent de plus en plus visibles.
Cependant la prophase de méiose I est beaucoup plus longue et plus complexe que la prophase mitotique.
Cette complexité a conduit les cytologistes à subdiviser la prophase I de méiose en 5 stades qui se succèdent
de manière continue:

Stade leptotène
Les filaments chromosomiques commencent à devenir visibles au microscope optique.
A la différence de la mitose les chromosomes n'apparaissent pas clivés longitudinalement en chromatides. Le
long des chromosomes on peut distinguer des régions plus ou moins épaisses, irrégulièrement espacés : les
chromomères dont la séquence est caractéristique de chaque chromosome.

Stade zygotène :
On assiste à un appariement des chromosomes homologues, l'appariement débute en certains points puis se
propage sur toute la longueur du chromosome. Les paires de chromosomes accolés constituent des bivalents.
Pendant ce stade le processus d'épaississement des chromosomes se poursuit ceux-ci paraissent de mieux en
mieux individualisés

Stade pachytène :
À ce stade l'épaississement est tel qu'il devient possible de reconnaître et d'individualiser chaque bivalent
d'après la disposition des chromoméres et du centromère qui devient visible.

Stade diplotène:
A se stade chacun des deux chromosomes homologues apparaît nettement clivé longitudinalement en
chromatides (excepté au niveau des centromères). Chaque bivalent est donc constitué de deux chromosomes
clivés soit 4 chromatides constituant ainsi des tétrades
L'attraction mutuelle entre les chromosomes homologues se relâche de telle sorte que ceux-ci ne sont plus en
contact étroit qu'au niveau de certains points de contact appelés chiasmas.
Ces chiasmas indiquent les endroits où se sont produits des échanges de segments de chromosomes entre 2
chromatides non sœurs (homologues). Ces échanges correspondent au phénomène d'enjambement ou
crossing-over.

Stade diacinèse :
Pendant ce stade les chromosomes continuent à s'épaissir (on ne distingue plus de chromomère) les chiasmas
se terminalisent: ils glissent vers l'extrémité des bras et leur nombre diminue, chaque tétrade forme alors des
figures caractéristiques, en croix, en 8, ou en anneau.
A la fin de la diacinése, l'enveloppe nucléaire et les nucléoles disparaissent, et un fuseau de division analogue
au fuseau mitotique est mis en place.

b) Métaphase I :
Pour chaque bivalent, les centromères homologues se disposent, à égale distance, de part et d'autre de la
plaque équatoriale (et non dans le plan équatorial comme pour la mitose)

c) Anaphase I :
La terminalisation prend fin. Les derniers chiasmas se séparent. Les deux homologuent de chaque bivalent
migrent chacun vers un pôle de la cellule (chaque chromosome étant clivé en deux chromatides).

d) Télophase I :

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On obtient finalement à chaque pôle n chromosomes déjà clivés. Selon les cas il y a reconstitution d'un noyau
interphasique selon un processus analogue à la télophase de mitose, ou bien amorce immédiate de la seconde
division de la méiose.

Méiose II ou division équationnelle

Elle est comparable à une mitose normale. Les deux noyaux issus de la première division subissent chacun une
seconde division parallèlement, de manière synchrone.
- La prophase de cette deuxième division est souvent escamotée puisque les chromosomes sont déjà
constitués.
- La métaphase est normale
- A l'anaphase les centromères se divisent, et chaque chromosome fils gagne un pôle de la cellule.
A la télophase la cytodiérèse divise chaque cellule haploïde en deux cellules haploïdes
En définitif, la cellule originelle diploïde a donc donné 4 cellules haploïdes, à la suite de ces deux divisions
consécutives (méiose I et méiose II).
Chez les animaux supérieurs ces 4 cellules haploïdes se différencieront en spermatozoïdes chez le mâle
alors que chez la femelle une seule sera fonctionnelle, les trois autres appelées globules polaire, étant
éliminées.

1.6 Métabolisme cellulaire

Le métabolisme cellulaire est l’ensemble des réactions de synthèse et de dégradation se déroulant dans
une cellule vivante. Les cellules prennent de manière sélective dans leur environnement les divers produits
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(nutriments, oxygène...) nécessaire à leur fonctionnement, et y excrètent les déchets qui résultent de celui-ci.
L'intérieur de la cellule est le siège de transformations chimiques incessantes réalisées (catalysées) par des
enzymes. Ces réactions biochimiques constituent le métabolisme cellulaire et permettent à la cellule de
fabriquer et de renouveler ses constituants. Les cellules communiquent entre elles par contacts
membranaires, échanges de molécules et d'ions, et par l'intermédiaire du système nerveux et/ou d'hormones.
Les potentialités de la cellule sont déterminées par les gènes qu'elle contient et qui s'y expriment et par
l'interaction de ceux-ci avec leur environnement. Les cellules différenciées, en plus de leur métabolisme de
base, assurent chacune des fonctions particulières : (ex: traitement et transmission de l'information pour les
neurones, absorption des nutriments pour les entérocytes etc.)

1.6.1 Anabolisme
L’anabolisme est l’ensemble des réactions cellulaires de synthèse. Les cellules sont le siège de synthèses
multiples en fonction du type cellulaire et des fonctions desdites cellules. En effet, les cellules glandulaires
assurent la synthèse de substances qui seront émises par le tissu en question. Les réactions d’anabolisme
nécessitent au niveau cellulaire d’une grande quantité d’énergie qui est généralement fournie par le
catabolisme. Dans la cellule, de nombreuses molécules sont quotidiennement synthétisées pour son
fonctionnement. La cellule renouvelle continuellement son matériel génétique (ADN) par réplication ainsi que
son ARN (transcription) et ses protéines (traduction) pour son fonctionnement. La réplication et la
transcription du matériel génétique se déroulent dans le noyau cellulaire tandis que la traduction se déroule
dans le cytosol. Chez les procaryotes par contre, les trois mécanismes anaboliques se déroulent dans le cytosol
en raison de l’absence de membrane nucléaire.

1.6.2 Le catabolisme
C’est l’ensemble des réactions de dégradation de la cellule. Le catabolisme principal chez les eucaryotes
se construit autour de substances provenant de l’alimentation. Les enzymes digestives chez les organismes
animaux sont responsables de la dégradation des macromolécules alimentaires. Les nutriments absorbés dans
le milieu intérieur arrivent au niveau des cellules et y sont absorbées. Ils sont dès lors dégradés par des
enzymes cellulaires avec libération d’énergie. Le principal substrat utilisé par les cellules pour le catabolisme
est d’origine glucidique : c’est le glucose. Les réactions cellulaires qui se succèdent au cours du catabolisme
cellulaire du glucose sont :
- La glycolyse : c’est un ensemble de dix réactions enzymatiques qui transforment le glucose en
deux molécules d’acide pyruvique ; elles se déroulent dans le cytosol.
- La décarboxylation oxydative du pyruvate : les molécules de pyruvate issues de la glycolyse
diffusent dans la mitochondrie et y sont transformées en Acétyl coenzyme A ;
- Le cycle de krebs : c’est un cycle métabolique mitochondrial dans lequel les acetyl coenzyme A
sont totalement oxydés pour produire du CO2 et de l’eau.
Cette dégradation complète du glucose nécessite un apport en oxygène, qui intervient au niveau
mitochondrial. Les mitochondries étant absente chez la plupart des cellules procaryotes, leur dégradation du
glucose se fait par fermentation dans le cytosol, laquelle débute par la glycolyse. Il existe différents types de
fermentations en fonction du substrat utilisé par la cellule procaroyte. C’est ainsi qu’on distinguera :
- La fermentation ethanolique : ce mode de fermentation permet la dégradation du glucose en
alcool ethylique.
- La fermentation lactique : elle s’effectue à partir du glucose ou du lactose et libère de l’acide
lactique
- La fermentation butyrique : elle s’effectue à partir de l’amidon et libère de l’acide butyrique
- La fermentation acétique : elle s’effectue en milieu aérobie et transforme le glucose en acide
acétique.

III. HISTOLOGIE

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L’histologie est la science qui étudie la structure et le fonctionnement des tissus.

Un tissu est un ensemble de cellules semblables par: leur forme (arrondies, rectangulaires, ...), leur
structure (mêmes organites), leur physiologie (origine, développement, durée de vie, fonction).
Un tissu est un ensemble de cellules, un organe est un ensemble de tissus et un système est un ensemble
d'organes:
Exemple: l'ensemble des cellules cardiaques forment le cœur (un organe), le cœur, les artères, les veines, les
capillaires constituent ensemble le système cardio-vasculaire. Il ne faut pas confondre tissu et organe:
un organe est constitué de plusieurs tissus différents (l'estomac est composé de tissu épithélial, de tissu
musculaire, de tissu nerveux et conjonctif). Un même tissu peut se retrouver dans plusieurs organes différents
(Le tissu épithéliale (de revêtement) se retrouve partout oû il y a un contact avec l'extérieur ou en contact avec
une cavité, comme à la surface de la peau, à l'intérieur de l'estomac, autour du cœur, ...).

Formation d'un tissu: Tout organisme vivant provient, à l'origine, d'une cellule unique: l'œuf fécondé. Celui-ci
va se diviser pour former un ensemble de cellules identiques et indifférenciées (elles peuvent encore devenir
(«se différencier») n'importe quel type de cellule (adipocyte, neurone, ...). Ce sont les fameuses cellules
souches! Plus tard, lorsque l'organisme est totalement formé, il y a toujours des cellules souches à différents
endroits du corps et qui vont permettre de refabriquer les tissus endommagés. Les cellules souches
(indifférenciées) se divisent par mitose: une des cellules filles reste indifférenciée pour qu'il y ait toujours un
certain nombre de cellules souches disponibles. L'autre cellule fille va se diviser encore pour faire de nouvelles
cellules qui vont se différencier pour former les différents tissus:

Une fois différenciée, il est rare (mais ça existe tout de même) qu'une cellule puisse se dédifférencier ou se
transdifférencier (devenir un autre type de cellule). Les cellules souches ne sont pas regroupées de la même
façon entre les végétaux et les animaux:

A) Chez les végétaux:

Les cellules indifférenciées sont regroupées dans des zones de la plante adulte, appelées méristèmes. Un
méristème est donc un tissu formé de cellules indifférenciées qui vont permettre de former les parties de la
plante lors de sa croissance. Il y a 2 sortes de méristèmes:

- Apicaux (en rouge): pour la croissance en longueur, ils sont situés au niveau des bourgeons et des racines.
- Latéraux (en bleu): pour la croissance du diamètre des racines et des pousses chez les plantes ligneuses
(arbres et arbustes).

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B) Chez les animaux:

Après fécondation, l'oeuf va se diviser: il y a plusieurs groupes de cellules qui vont se former:
Ces cellules vont commencer à se différencier en 3 types, qui forment 3 feuillets:
- l'ectoderme: les cellules qui seront situées vers l'extérieur (exemple: peau, intérieur de l'estomac, ..)
- l'endoderme: les cellules qui seront situées à l'intérieur (exemple: le foie, le tube digestif, ...)
- le mésoderme: les cellules situées entre deux (exemple, les muscles, le tissu conjonctif, os, sang, ...)
Ce sont des cellules embryonnaires,, c'est-à-dire que l'on ne trouve que chez l'embryon, mais qui vont donner
toutes les cellules du corps. Chez l'adulte, ces feuillets n'existent plus, mais il persiste des cellules souches pour
le renouvellement des tissus.
Les différents types de tissus: On distingue les différents types de tissus d'après leur origine embryonnaire
(ectoderme, mésoderme, endoderme), leur structure et leur fonction.

A) Chez les végétaux supérieurs:

1. Les tissus épithéliaux protecteurs: épiderme, cuticule et liège: pour le recouvrement externe et la
protection des végétaux.
2. Les tissus de soutien: collenchyme (paroi en cellulose très épaisse) et sclérenchyme (paroi de lignine très
épaisse). Ce sont des tissus de remplissage.
3. Les tissus conducteurs de sève:
- le bois (xylème) pour la sève brute (sève qui monte depuis les racines, elle est composée d'eau et de sels
minéraux puisés dans le sol),
- le liber (phloème) pour la sève élaborée (sève contenant les produits de la photosynthèse),
4. Les tissus parenchymateux: différentes fonctions: pour la mise en réserves de substances nutritives pour la
plante (lipides, sucres, protéines) chlorophyllien pour la photosynthèse.
5. Les méristèmes: les cellules indifférenciées donnant naissance à toutes les autres.

ORGANISATION HISTOLOGIQUE VEGETALE

B) Chez les animaux:

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1. Les tissus épithéliaux:

Ce sont toujours les tissus qui recouvrent toutes les surfaces en contact avec l'extérieur du corps
ou qui bordent une cavité:

Exemples: peau, intérieur de l'estomac, l'extérieur de l'estomac,... Rôle: protéger l'organe et permettre des
échanges.

Remarque: Il n'y a pas de vaisseaux sanguins dans les tissus épithéliaux: l'oxygène doit diffuser depuis des
vaisseaux situés à proximité!

Les tissus épithéliaux sont formés d’une ou plusieurs couches de cellules:

- plus la zone est agressée, plus il y a de couches de cellules pour augmenter la protection (exemple: la peau
des pieds comporte de nombreuses couches de cellules)

- plus il y a d'échanges nécessaires, moins il y aura de couches pour faciliter la diffusion des éléments
(exemple: l'épithélium des poumons n'est composé que d'une seule couche de cellules pour permettre à
l'oxygène et au gaz carbonique de passer à travers pour entrer ou sortir du sang).

2. Les tissus conjonctifs:

Les tissus conjonctifs sont les tissus de remplissage, ainsi que de soutien (apport de nutriments,...). Ils sont
formés de 2 parties:

- des cellules (moins nombreuses que dans les épithéliums)

- de la substance fondamentale: un liquide avec des sels minéraux et d'autres éléments.

Il y a plusieurs types de tissus conjonctifs:

- le sang (cellules = globules blanc, globules rouges et plaquettes). C'est un tissu conjonctif un peu particulier.
- l'os (cellules = ostéocytes)

- le cartilage (cellules = chondrocytes)

- le tissu adipeux (cellules = adipocytes)

- le tissu conjonctif à proprement parler (cellules = fibroblastes)

3. Tissus mixtes : muqueuses et séreuses

Il s’agit de tissus périphériques formés par association d’une couche de cellules épithéliales tapissée
intérieurement par une lame de tissus conjonctif plus ou moins épaisse qui tapisse l’intérieur des organes creux
(muqueuse) ou recouvre extérieurement la couche musculeuse des organes mobiles facilitant leur mouvement
(séreuse).

4. Les tissus musculaires:

Ce tissu représente les 2/3 de la masse d'un humain. Les cellules musculaires sont appelées par abus de langage
les fibres musculaires. Ces cellules sont allongées, excitables et contractiles. Elles sont regroupées en faisceaux
musculaires.

Chaque fibre musculaire possède dans son cytoplasme des microfilaments placés en parallèle (l'actine et la

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myosine) qui permettent la contraction de la fibre musculaire. Ce sont 2 protéines qui glissent l'une par rapport
à l'autre pour que la cellule se contracte ou se détende.

Il y a plusieurs types de tissus musculaires:

A) Tissus musculaires striés squelettiques:

Ils sont responsables des mouvements volontaires et réflexes. Leur nombre est fixe dans un organisme. Le
sport augmente leur volume, et non pas leur nombre.

Les cellules sont très longues, avec plusieurs noyaux situés sur le bord de la cellule. Elles sont appelées striées,
car si on les observe au microscope on peut voire des stries dues à la présence de l'actine et de la myosine.

B) Tissu musculaire cardiaque:

Il est responsable des mouvements involontaires pour les contractions du cœur. Les cellules sont plus petites,
avec un seul noyau, mais au centre de la cellule. Elles sont également striées.

C) Tissu musculaire lisse:

Il est responsable des mouvements involontaires des organes internes. Les cellules sont petites, avec un seul
noyau central. Elles ne sont pas striées, mais possèdent tout de même l'actine et la myosine, cependant elles
ne sont pas visibles.

5. Les tissus nerveux:

Ils sont composés principalement de neurones (cellules nerveuses) et des cellules gliales (de soutien).
Le neurone doit produire et transmettre un influx nerveux. Il est composé de plusieurs parties:
- le corps cellulaire (pour fabriquer l'influx nerveux)

- les dendrites pour recevoir les influx depuis les autres neurones

- l'axone (pouvant atteindre plus d'1 m) pour transmettre l'influx vers les autres neurones

Les cellules gliales sont 10 à 50 fois plus nombreuses, elles soutiennent les neurones (aide, nutrition, ...)

Le renouvellement des tissus:

Les cellules qui composent un tissu ont une vie limitée, il faut les renouveler pour que le tissu puisse
continuer à fonctionner. Cela est possible grâce la multiplication par mitose de cellules indifférenciées.

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1. Pour les végétaux:

Les lieux de renouvellement sont bien définis et permettent selon leur développement la croissance en
longueur ou la croissance du diamètre, ce sont les méristèmes.

2. Pour les animaux:

Des cellules indifférenciées sont disséminées de façon discontinue dans le corps de l'adulte. Elles permettent
notamment les réparations de lésions, c'est la cicatrisation.

Exemple:
Les épithéliums composés de plusieurs couches de cellules se reforment de façon continue à partir de cellules
de la couche basale.

CHAPITRE II : TECHNIQUES CYTOMETRIQUES ET IMMUNOLOGIQUES DE

DETECTION DES BIOMOLECULES
Quelques méthodes de coloration cellulaires/tissulaires
1. Hématoxyline-éosine (H&E)
But :
 Hématoxyline : Colore les noyaux cellulaires en bleu ou violet.
 Éosine : Colore le cytoplasme et les structures extracellulaires en rose.
Rôle :
 Utilisée pour l'examen général des structures tissulaires.
 Aide à identifier les morphologies cellulaires et les anomalies tissulaires.
 La coloration de routine la plus utilisée en histologie.
Temps moyen d'application :
 Hématoxyline : 5-10 minutes.
 Éosine : 1-2 minutes.
2. Coloration de Gram
But :
 Crystal Violet : Colore toutes les cellules bactériennes en violet.
 Iode de Lugol : Fait précipiter le cristal violet dans les bactéries à Gram positif.
 Décoloration à l'alcool/éthanol : Élimine la couleur des bactéries à Gram négatif.
 Safranine ou Fuchsine : Contre-colore les bactéries à Gram négatif en rose.
Rôle :
 Différencier les bactéries à Gram positif (violet) et Gram négatif (rose).
 Important pour le diagnostic microbiologique et la classification des bactéries.
Temps moyen d'application :
 Crystal Violet : 1 minute.
 Iode de Lugol : 1 minute.
 Décoloration à l'alcool/éthanol : 10-30 secondes.
 Safranine ou Fuchsine : 30 secondes à 1 minute.
3. Coloration de May-Grünwald-Giemsa

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But :
 May-Grünwald : Colore les cellules sanguines et les noyaux en différentes teintes.
 Giemsa : Apporte des détails supplémentaires aux structures cellulaires.
Rôle :
 Utilisée pour la coloration des frottis sanguins.
 Identification des différentes cellules sanguines et des parasites du sang (par exemple,
Plasmodium spp. causant le paludisme).
Temps moyen d'application :
 May-Grünwald : 5-10 minutes.
 Giemsa : 20-30 minutes.
4. Coloration de Ziehl-Neelsen (Acido-Alcoolo-Resistant, AAR)
But :
 Carbol-fuchsine : Colore les bactéries acido-alcoolo-résistantes en rouge.
 Décoloration à l'alcool acide : Élimine la couleur des autres bactéries et cellules.
 Bleu de méthylène : Contre-colore les autres éléments en bleu.
Rôle :
 Détection des bactéries acido-alcoolo-résistantes, comme Mycobacterium tuberculosis.
 Important pour le diagnostic de la tuberculose.
Temps moyen d'application :
 Carbol-fuchsine : 5 minutes.
 Décoloration à l'alcool acide : 1-3 minutes.
 Bleu de méthylène : 1 minute.
5. Trichrome de Masson
But :
 Hématoxyline : Colore les noyaux en bleu foncé.
 Fuchsine acide : Colore les fibres musculaires, les fibres de collagène et les cytoplasmes en
rouge.
 Vert lumière/bleu aniline : Colore les fibres de collagène et d'autres structures en vert ou en
bleu.
Rôle :
 Différencier les fibres de collagène des fibres musculaires.
 Utilisée pour l'étude des tissus conjonctifs et les pathologies fibrosantes.
Temps moyen d'application :
 Hématoxyline : 5-10 minutes.
 Fuchsine acide : 5-10 minutes.
 Vert lumière/bleu aniline : 5-10 minutes.
6. Coloration PAS (Acide Périodique de Schiff)
But :
 Acide périodique : Oxydation des groupements glycogène en aldéhydes.
 Réactif de Schiff : Colore les groupes aldéhydes en magenta.
Rôle :
 Détection des polysaccharides comme le glycogène.
 Utilisée pour diagnostiquer les maladies liées aux glucides et pour examiner les structures
basales des membranes.
Temps moyen d'application :
 Acide périodique : 5-10 minutes.
 Réactif de Schiff : 10-15 minutes.
7. Coloration de Fontana-Masson
But :
 Colore la mélanine et les argentaffines en noir.

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Rôle :
 Utilisée pour identifier les mélanines dans les échantillons de peau.
 Aide au diagnostic des mélanomes et autres pathologies liées à la pigmentation.
Temps moyen d'application :
 Solution argentique : 10-20 minutes.
 Fixateur réducteur : 1-2 minutes.
8. Coloration de Perls (Bleu de Prusse)
But :
 Acide chlorhydrique : Libère le fer des complexes protéiques.
 Ferrocynanure de potassium : Réagit avec le fer pour former un précipité bleu de Prusse.
Rôle :
 Détection des dépôts de fer dans les tissus.
 Important pour diagnostiquer l'hémosidérose et d'autres troubles du métabolisme du fer.
Temps moyen d'application :
 Acide chlorhydrique : 20-30 minutes.
 Ferrocynanure de potassium : 20-30 minutes.

Introduction à la cytométrie en flux

Définition : La cytométrie en flux est une technique permettant d'analyser les caractéristiques physiques
et chimiques de cellules ou de particules en suspension dans un liquide. Cette méthode utilise des lasers
pour illuminer les particules, qui sont ensuite analysées en fonction de la lumière qu'elles émettent ou
diffusent.

Historique : Développée dans les années 1960 par Leonard Herzenberg et son équipe à l'université de
Stanford, la cytométrie en flux a révolutionné la biologie cellulaire et médicale, en permettant des analyses
rapides et précises de grands volumes de cellules.

Principe de la méthode

Technologie : La cytométrie en flux repose sur trois systèmes principaux :

1. Le système fluidique :
o But : Transporter les cellules en suspension dans un flux liquide aligné pour qu'elles passent
une par une devant un faisceau laser.
o Méthode : Utilisation de systèmes de confinement hydrodynamique pour garantir un flux
laminaire. Le fluide dans lequel les cellules sont suspendues est injecté au centre d'un flux
de gaine (un flux de liquide non mélangé) pour aligner les cellules en une seule file.
2. Le système optique :
o But : Illuminer les cellules et détecter la lumière diffusée et fluorescente.
o Composants :
 Lasers : Différentes longueurs d'onde (par exemple, 488 nm, 633 nm) pour exciter
les fluorochromes.
 Détecteurs :
 FSC (Forward Scatter) : Mesure la lumière diffusée vers l'avant, fournissant
des informations sur la taille des cellules.
 SSC (Side Scatter) : Mesure la lumière diffusée à 90 degrés, fournissant des
informations sur la granularité et la complexité interne des cellules.
 Détecteurs de fluorescence : Captent la lumière émise par les
fluorochromes spécifiques liés aux anticorps ou aux marqueurs cellulaires.
3. Le système électronique :
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o But : Convertir les signaux optiques en données numériques pour analyse.

o Méthode : Les signaux lumineux captés par les détecteurs sont convertis en signaux
électriques, amplifiés et transformés en données numériques par des convertisseurs
analogique-numérique (ADC).

Processus détaillé :

1. Préparation de l'échantillon :
o Récolte des cellules : Les cellules sont collectées à partir de cultures, de tissus, ou de fluides
corporels.
o Dissociation des tissus : Les tissus solides sont dissociés en cellules individuelles à l'aide
d'enzymes comme la trypsine ou la collagénase.
o Suspension des cellules : Les cellules sont mises en suspension dans un tampon
physiologique approprié.
o Coloration : Les cellules sont marquées avec des anticorps fluorescents spécifiques à des
antigènes d'intérêt. Ces anticorps sont conjugués à des fluorochromes comme FITC
(fluoresceine isothiocyanate) ou PE (phycoérythrine).
o Filtration : Les échantillons sont filtrés à travers des tamis pour éliminer les agrégats et les
débris.
2. Injection et alignement :
o Méthode : Les échantillons sont introduits dans le cytomètre en flux. Le flux
hydrodynamique aligne les cellules pour qu'elles passent une à une devant le faisceau laser.
3. Excitation par laser et détection :
o Lasers : Les cellules passent devant les faisceaux laser, qui excitent les fluorochromes.
o Détection : La lumière diffusée et la fluorescence émise par chaque cellule sont captées
par les détecteurs.
 FSC : La lumière diffusée vers l'avant est proportionnelle à la taille de la cellule.
 SSC : La lumière diffusée latéralement est proportionnelle à la granularité et à la
complexité interne de la cellule.
 Fluorescence : La lumière émise par les fluorochromes fournit des informations sur
les antigènes ou marqueurs spécifiques.
4. Analyse des données :
o Conversion des signaux : Les signaux optiques sont
convertis en données numériques.
o Présentation des données : Les données sont analysées et
présentées sous forme de graphiques de dispersion (dot
plots) et d'histogrammes.
 Dot plots : Représentent deux paramètres à la fois, par
exemple FSC vs SSC, ou deux couleurs fluorescentes.
 Histogrammes : Représentent un paramètre, montrant la
distribution de fluorescence pour un marqueur spécifique.

Grace au cytomètre en flux, il est possible d’analyser des solutions

cellulaires à un rythme extrêmement soutenu (jusqu’à des dizaines de milliers
de cellules par seconde) tout en permettant jusqu’à 500 molécules par cellule
d’être enregistrées. La rapidité et sensibilité de la cytométrie en flux en fait
donc une méthode d’analyse de choix pour des populations cellulaires
secondaires.

Le cytomètre en flux – Composants de base

 La Chambre de flux (en anglais: flow chamber; voir diagramme à droite)
est au coeur du système instrumental et a pour objectif de délivrer un flux à cellule unique à l’endroit de mesure.
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Pour rendre ceci réalisable, il est nécessaire de concentrer les

cellules analysées au centre d’un flux étroit, appelé fluide vecteur, de
telle sorte qu’une seule cellule soit autorisée à passer au travers du
rayon lumineux dans la chambre de flux.
Cette technique, qui permet d’obtenir un flux à cellule unique grâce
à un rétrécissement du courant, est utilisée dans la plupart des
cytomètres en flux; cependant une nouvelle technique utilisant la
focalisation acoustique est en cours de développement.
Le débit du fluide vecteur détermine la vitesse à laquelle le courant
de matière traverse la chambre de flux, et donc atteint le laser du
cytomètre. Dans l’idéal, les cellules passent au travers du rayon une
par une, ce qui permet de collecter des données pour chaque cellule (ou
événement). Ceci permet l’obtention de résultats aussi précis que
possible, c’est pourquoi il est primordial de connaître les limites du
cytomètre que vous utilisez.
Certains cytomètres sont limités à un maximum de 900 événements
par seconde. Dans l’éventualité où le débit du fluide délivre les cellules
à un taux plus élevé que celui recommandé pour l’instrument en question, cela peut amener 2 cellules (ou plus)
a passer au travers du rayon laser simultanément (événements coïncidents’). Dans ce cas, une seule des cellules
sera analysée, ce qui conduira à une perte de données. Bien que la plupart des cytomètres affichent un message
tel que “Alerte: débit binaire”, les utilisateurs doivent garder à l’esprit les conséquences qu’un débit de fluide
vecteur trop élevé peut entraîner.

 La source lumineuse peut être un laser, une lampe à arc ou une diode électroluminescente (LED). Les
lampes à arc (ex: mercure, xénon-mercure) sont des sources lumineuses brillantes et puissantes qui émettent à
des longueurs d’ondes multiples. Elles sont typiquement utilisées dans les microscopes optiques.

Malgré les avantages qu’un large spectre d’excitation peut

parfois apporter ; dans certains cas, cela peut être un vrai
désavantage. Pour cette raison, la plupart des cytomètres en flux
ont un laser pour source lumineuse. Un laser permet une source
brillante et cohérente, avec une longueur d’onde étroite, bien
définie et spécifique. De nombreux lasers de différents types sont
actuellement disponibles, et ce nombre ne cesse d’augmenter.
Certains lasers couramment utilisés comprennent les lasers à argon
(351, 454, 488, 514 nm), au krypton (488, 532, 630 nm), hélium-
néon (632 nm), hélium cadmium (325, 441 nm) et les lasers Yag
(532 nm).

 Le système optique
La lumière émise par les cellules après qu’elles aient été irradiées dans la chambre de flux est dirigée vers un
ensemble de détecteurs par un système complexe de miroirs et filtres qui constituent le système optique. Une
configuration typique pour un instrument à laser simple est illustrée ci-contre.
Dans cet exemple, la source lumineuse est un laser de couleur bleue qui est concentré grâce à une lentille de
focalisation avant de pénétrer dans la chambre de flux. Comme précédemment expliqué, les caractéristiques
physiques et fluorescentes des cellules peuvent être directement déterminées à partir des caractéristiques des
signaux lumineux émis par ces cellules.
Une barre située à l’extrémité opposée de la chambre de flux permet de bloquer le rayon laser. Un détecteur
de dispersion lumineuse frontale (DLF) se trouve derrière cette barre de blocage et détecte toute dispersion

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lumineuse qui est dirigée vers l’avant. Cette dispersion lumineuse frontale est une indication de la taille des
cellules.

Une seconde lentille de focalisation permet de diriger les rayons lumineux vers un ensemble de filtres qui
permettent de séparer les différentes longueurs d’onde présentes. Les filtres passe-haut ne laissent passer que la
lumière au-dessus d’une certaine fréquence d’onde et les filtres passe-bas ne laissent passer que la lumière en-
dessous d’une certaine fréquence. Ensembles, ces deux filtres forment un filtre passe-bande. Dans le diagramme
ci-dessus, le filtre 1 sélectionne la lumière à une longueur d’onde inférieure à 500 nm (bleue) qui nous permet
d’obtenir des données sur la dispersion latérale (granularité cellulaire) tandis que le filtre 2 filtre la lumière à une
longueur d’onde supérieure à 540 nm (vert).

La lumière (photons) qui traverse un système optique doit être

convertie en un signal électronique afin de permettre l’acquisition et
l’analyse de données. Ceci est réalisé grâce à des photodiodes
(dispersion frontale) et des tubes photomultiplicateurs (TPM) pour les
rayons fluorescents et les signaux associés à la lumière à dispersion
latérale; ces composants sont souvent décrits en tant que détecteurs
lumineux. Certains cytomètres en flux modernes peuvent avoir jusqu’à
12 TPM, un nombre que ne fait qu’augmenter avec le développement
de nouvelles technologies.

 Analyse des données

Les signaux électroniques générés par les photodiodes et les TPM
sont collectés et traités par des logiciels informatiques. Certains de ces
logiciels peuvent être dédiés à l’acquisition et l’analyse de données venant d’un type spécifique d’instrument,
tandis que d’autres, plus autonomes, peuvent être adaptes à n’importe quel instrument à condition que les
données aient été collectées dans le format .fcs (flow cytometry standard).

Les caractéristiques de la dispersion lumineuse frontale et latérale peuvent être utilisées pour identifier des
cellules de type diffèrent grâce à leur taille et granularité. Dans l’exemple ci-contre, neutrophiles, monocytes et
populations lymphocytes sont différenciées sur base des caractéristiques de leur dispersion lumineuse.
La viabilité cellulaire et la présence de composants cellulaires et de certaines protéines sont quelques-uns
des paramètres qui peuvent être déterminés grâce au marquage des cellules avec des molécules ou anticorps
fluorescents adaptés. Il est aussi possible de déterminer l’interaction de ces cellules avec différentes molécules
en les incubant avec des protéines et molécules fluorescentes. La lumière fluorescente émise par ces colorants
quand ils traversent le laser d’excitation est dirigée au travers du système optique puis analysée.

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Les signaux sont collectés par l’ensemble des détecteurs et étudiés pour fournir des informations sur les
caractéristiques fluorescentes de la population cellulaire en cours d’analyse. En plus de permettre de déterminer
si une certaine population cellulaire réagit avec une probe fluorescente, la cytométrie en flux peut fournir de
précieuses données sur l’intensité du signal, et donc une indication de la quantité de probes conjuguées à vos
cellules. Il est donc important de considérer le pourcentage de cellules qui expriment l’émission fluorescente en
question et l’intensité de cette fluorescence.

Applications détaillées

Recherche scientifique :

 Études de la biologie des cellules : Identification des sous-populations cellulaires, étude des cycles
cellulaires, et analyse de l'expression des protéines.
 Génétique : Analyse des anomalies chromosomiques, trisomies, et autres désordres génétiques.
 Interactions moléculaires : Étude des interactions entre molécules sur la surface cellulaire et
intracellulaire.

Médecine :

 Diagnostic des maladies hématologiques : Identification et quantification des différents types de

cellules sanguines, diagnostic des leucémies et lymphomes.
 Surveillance des maladies : Suivi de la progression des maladies, évaluation de l'efficacité des
traitements.
 Transplantations : Typage des lymphocytes pour la compatibilité des greffes.

Industrie biopharmaceutique :

 Contrôle qualité : Vérification de la pureté et de la viabilité des cultures cellulaires.

 Développement de médicaments : Criblage de nouvelles molécules et évaluation de leur effet sur
les cellules.

Exercices pratiques détaillés

Exercice pratique 1 : Préparation d'un échantillon de sang

1. Récolte des échantillons :

o Prélever du sang périphérique par ponction veineuse.
2. Isolation des leucocytes :
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o Utiliser un gradient de densité pour séparer les cellules mononucléaires (par exemple,
Ficoll-Paque).
3. Coloration des échantillons :
o Ajouter des anticorps fluorescents spécifiques à CD3 (lymphocytes T), CD19 (lymphocytes
B), et CD56 (cellules NK).
o Incuber les échantillons pour permettre la liaison des anticorps aux antigènes spécifiques.
4. Filtration :
o Passer les échantillons à travers des filtres à mailles fines pour éliminer les débris.
5. Analyse :
o Passer les échantillons au cytomètre en flux et collecter les données.

Exercice pratique 2 : Analyse des résultats

1. Visualisation des données :

o Créer des graphiques de dispersion pour visualiser les sous-populations cellulaires.
o Utiliser des histogrammes pour analyser l'expression des marqueurs.
2. Interprétation des résultats :
o Identifier les populations cellulaires en fonction des marqueurs fluorescents.
o Comparer les résultats avec des contrôles pour vérifier la précision des analyses.

Lightning-Link ® - Kits de marquage d’anticorps simples d’utilisation

La simplification du procédé de marquage d’anticorps (plus particulièrement l’élimination des
étapes de séparation) supprime de nombreux problèmes souvent associés aux procédures
traditionnelles; par exemple la perte de matériel, la dilution des échantillons lors de la chromatographie
sur colonne, les variations entre lots et les difficultés liées à l’augmentation de l’échelle.

Le procédé Lightning-Link® est illustré dans la figure ci-dessous.

Les anticorps purifiés sont transférés dans un tube contenant une mixture lyophilisée qui comprend
le fluorochrome d’intérêt. La dissolution de cette mixture rend actives les substances qui catalysent la
réaction du marquage des anticorps. Etant donné qu’il n’y a pas d’étape de purification ou de séparation
(les produits dérivés de la réaction sont entièrement bénins), le recouvrement des anticorps approche les
100%. La simplicité de la démarche signifie que la procédure peut être accomplie en moins de trente
secondes.
Le procédé chimique derrière le marquage utilise les groupes amines libres qui se trouvent sur les
acides aminés « lysines » ; dès lors, n’importe quel anticorps ou protéine peut être marqué,
indépendamment de son isotope ou espèce.
Ces kits de marquage d’anticorps simples d’utilisation sont particulièrement intéressants pour les
utilisateurs de cytomètres en flux, étant donné que plus de 50 différents marqueurs sont disponibles, y
compris des protéines fluorescentes, des fluorochromes et des tandems, qui, ensembles, couvrent la
totalité du spectre lumineux, de l’UV à l’infrarouge. Par conséquent, il est maintenant possible pour
l’utilisateur du cytomètre en flux de concevoir et élaborer un ensemble unique d’anticorps marqués prêts
à l’emploi à partir d’anticorps de provenance commerciale.

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Par ailleurs, il existe de nombreux avantages liés au marquage direct des anticorps primaires :

 Supprime la nécessité d’utiliser des anticorps secondaires, réduisant ainsi le nombre

d’incubations et d’étapes de lavage - soit un gain de temps et d’argent.
 Pour les expérimentations qui utilisent plusieurs anticorps simultanément, la réactivité inter-
espèces ne pose pas de problème puisque les anticorps primaires peuvent être marqués avec des
fluorochromes différents. En effet, pour la détection indirecte, la réactivité inter-espèces des anticorps
secondaires est souvent un problème.
 Les fournisseurs d’anticorps commerciaux ne procurent pas toujours les anticorps combinés au
marqueur désiré. En marquant vos anticorps vous-même, cet obstacle est facilement surmontable.

Introduction aux méthodes immunologiques

Définition : L'immunohistochimie (IHC) et l'immunocytochimie (ICC) sont des techniques utilisées pour
détecter des antigènes spécifiques dans des échantillons de tissus (IHC) ou de cellules (ICC) à l'aide
d'anticorps spécifiques. Ces méthodes permettent de visualiser la localisation des protéines d'intérêt dans
les cellules et les tissus.

Historique : Développées dans les années 1940 et 1950, ces techniques ont révolutionné la recherche
biologique et médicale. L'introduction des anticorps monoclonaux dans les années 1970 a permis
d'améliorer considérablement la spécificité et la précision des analyses.

Principe de l'immunohistochimie

L’immunohistochimie est une technique très répandue, car peu coûteuse et facilement réalisable.
Elle permet de démontrer la présence ou l’absence d’une protéine dans les cellules d’une coupe de tissu
inclus en paraffine (FFPE) ainsi que sa localisation.
Principe : identifier une protéine d’intérêt grâce à un anticorps primaire spécifique, qui est lui-même
reconnu par un anticorps secondaire directement couplé à une enzyme ou lié à un polymère couplé à une
enzyme. Cette enzyme peut être la peroxydase de raifort aussi appelée HRP (Horse Radish Peroxidase) ou
la phosphatase alcaline, aussi connue sous le nom de AP (Alkaline Phosphatase). Le complexe antigène-
anticorps-enzyme est révélé grâce à un substrat spécifique de l’enzyme HRP ou AP. Il existe plusieurs
chromogènes de l’HRP (DAB, Emerald, AEC, Permanent HRP green …) et de l’AP (BCIP/NBT, Permanent
Red, Fast Red …); Les anticorps peuvent aussi être marqués par un fluorochrome (ex. : FITC, Rhodamine,
Texas Red ou Alexa Fluor). Une contre-coloration peut être réalisée en fin de marquage pour permettre
une meilleure visualisation des tissus/cellules.

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L'immunohistochimie est largement utilisée pour le diagnostic et/ou le suivi de cancers par détection
de cellules anormales telles que celles trouvées dans les tumeurs cancéreuses. Des marqueurs spécifiques
sont ainsi aujourd'hui connus pour divers cancers :
• antigène carcino-embryonnaire (CEA) : utilisé en cas de cancer du côlon ;
• CD15 et CD30 : utilisés pour la maladie de Hodgkin ;
• alpha-fœtoprotéine : en cas de carcinome hépatocellulaire ;
• CD117 : en cas de tumeur stromale gastro-intestinale ;
• Ki-67 : un des indices de prolifération tumorale.
Ces marqueurs moléculaires sont caractéristiques de certains événements cellulaires tels que la
prolifération ou la mort cellulaire (apoptose).

L'IHC est aussi largement utilisée en recherche fondamentale pour comprendre la distribution et la
localisation de biomarqueurs et de protéines différentiellement exprimés dans les différentes parties d'un
tissu biologique.

Méthode
Le tissu est placé sur un support solide. L'anticorps est ajouté à la préparation de tissu, fixant
spécifiquement la protéine à détecter sur ce tissu. L'ajout d'un anticorps primaire lié à un système de
détection (enzyme liée à l'anticorps, dont la mise en présence du substrat provoque une réaction colorée
(peroxydase) ou fluorescente (Rhodamine), provoquant un signal visible à l'œil nu, ou par des techniques
de microscopie et de spectrophotométrie.
Il existe principalement deux méthodes concernant l'immunohistochimie et la détection
d'antigènes au sein des tissus biologiques :
• la méthode directe ;
• la méthode indirecte.
La « méthode directe » est une méthode de coloration en une seule étape. Elle utilise un anticorps
marqué (c.-à-d. antisérum conjugué par FITC) qui réagit directement avec les antigènes présents dans les
sections tissulaires. Un seul anticorps étant utilisé, la procédure est courte et rapide. Elle manque
cependant de sensibilité en raison d'une faible amplification du signal, et est rarement utilisée depuis
l'introduction de la méthode indirecte.

La « méthode indirecte » emploie un anticorps principal non-marqué (première couche) qui réagit
avec les antigènes au sein du tissu, un anticorps secondaire marqué (seconde couche) qui réagit avec
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Cours de BMC 456 Dr Lienou LL Cytologie et histologie moléculaires

l'anticorps principal. L'anticorps secondaire doit être dirigé contre l'immunoglobuline G de l'anticorps
principal. Cette méthode présente une meilleure sensibilité grâce à l'amplification du signal permise par
plusieurs réactions de l'anticorps secondaire à différents sites antigéniques de l'anticorps principal. La
seconde couche d'anticorps peut être marquée avec un colorant fluorescent tel que le FITC, la rhodamine
ou le Texas Red, ce qui s'appelle la méthode par immunofluorescence indirecte. La seconde couche
d'anticorps peut aussi être marquée par une enzyme telle que la peroxidase, la phosphatase alcaline ou
la glucose oxydase. Cette dernière variante est appelée la méthode par immunoenzyme indirecte. Offrir
un substrat à ces enzymes permet d'établir la présence de l'enzyme (et donc de l'anticorps) d'une manière
quantifiable.

Préparation des échantillons de tissus :

1. Fixation :
o But : Préserver les structures cellulaires et les antigènes. La fixation empêche également la
dégradation des tissus.
o Méthode : Utilisation de fixateurs tels que le formaldéhyde ou le paraformaldéhyde. Les
tissus sont immergés dans le fixateur pendant un certain temps, généralement entre 4 et
24 heures.
2. Inclusion en paraffine :
o But : Faciliter la coupe des tissus en sections très fines.
o Méthode : Les tissus fixés sont déshydratés à l'aide de bains d'alcool de concentrations
croissantes, puis infiltrés avec de la paraffine liquide. Après refroidissement, la paraffine se
solidifie, permettant de couper des sections de 4 à 5 micromètres avec un microtome.
3. Montage sur lames :
o But : Préparer les tissus pour les étapes ultérieures.
o Méthode : Les sections de tissus sont montées sur des lames de microscope enduites de
substances adhésives pour éviter que les sections ne se détachent pendant les
manipulations.

Blocage des sites non spécifiques :

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Cours de BMC 456 Dr Lienou LL Cytologie et histologie moléculaires

1. But : Éviter les liaisons non spécifiques des anticorps qui pourraient produire un signal de fond.
2. Méthode : Incuber les lames avec une solution bloquante, souvent un sérum animal ou une solution
de protéines telles que l'albumine sérique bovine (BSA).

Application de l'anticorps primaire :

1. But : Lier spécifiquement l'antigène cible.

2. Méthode : Appliquer l'anticorps primaire sur les sections de tissus et incuber pendant un temps
déterminé, généralement entre 1 heure et une nuit, à une température contrôlée.

Application de l'anticorps secondaire :

1. But : Détecter l'anticorps primaire lié à l'antigène.

2. Méthode : Utiliser un anticorps secondaire conjugué à une enzyme (comme la peroxydase) ou à un
fluorochrome. Incuber les lames avec l'anticorps secondaire pour permettre la liaison.

Détection et visualisation :

1. Techniques enzymatiques :
o But : Visualiser l'antigène par une réaction colorée.
o Méthode : Ajouter un substrat chromogénique (par exemple, le DAB) qui réagit avec
l'enzyme conjuguée pour produire une coloration visible.
2. Techniques fluorescentes :
o But : Visualiser l'antigène par fluorescence.
o Méthode : Utiliser un microscope à fluorescence pour observer directement la
fluorescence émise par le fluorochrome conjugué à l'anticorps secondaire.

Contre-coloration :

1. But : Faciliter l'observation des structures tissulaires non marquées.

2. Méthode : Utiliser des colorants tels que l'hématoxyline pour teindre les noyaux ou d'autres
structures cellulaires.

Principe de l'immunocytochimie

Préparation des échantillons de cellules :

1. Fixation :
o But : Préserver les structures cellulaires et les antigènes.
o Méthode : Utiliser des fixateurs tels que le paraformaldéhyde. Les cellules sont fixées soit
directement sur les lames de microscope, soit en suspension avant d'être déposées sur les
lames.
2. Montage sur lames :
o But : Préparer les cellules pour les étapes ultérieures.
o Méthode : Les cellules fixées en suspension peuvent être centrifugées sur les lames ou
directement cultivées sur des lames de microscope.

Blocage des sites non spécifiques :

1. But : Éviter les liaisons non spécifiques des anticorps.

2. Méthode : Incuber les lames avec une solution bloquante, similaire à celle utilisée en IHC.

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Application de l'anticorps primaire :

1. But : Lier spécifiquement l'antigène cible.

2. Méthode : Appliquer l'anticorps primaire sur les cellules et incuber pendant un temps déterminé.

Application de l'anticorps secondaire :

1. But : Détecter l'anticorps primaire lié à l'antigène.

2. Méthode : Utiliser un anticorps secondaire conjugué à une enzyme ou à un fluorochrome.

Détection et visualisation :

1. Techniques enzymatiques :
o But : Visualiser l'antigène par une réaction colorée.
o Méthode : Ajouter un substrat chromogénique pour produire une coloration visible.
2. Techniques fluorescentes :
o But : Visualiser l'antigène par fluorescence.
o Méthode : Utiliser un microscope à fluorescence pour observer la fluorescence émise par
le fluorochrome.

Contre-coloration :

1. But : Faciliter l'observation des structures cellulaires non marquées.

2. Méthode : Utiliser des colorants pour contre-colorer les noyaux ou d'autres structures cellulaires.

Applications détaillées

Immunohistochimie :

 Diagnostic des cancers : Détection de marqueurs tumoraux spécifiques dans les biopsies pour
diagnostiquer et classer les cancers.
 Recherche en pathologie : Étudier l'expression des protéines dans les tissus pour comprendre les
mécanismes des maladies.
 Neurosciences : Identifier des protéines dans les tissus cérébraux pour étudier les maladies
neurodégénératives.

Immunocytochimie :

 Recherche en biologie cellulaire : Étudier la localisation des protéines dans des cellules en culture.
 Virologie : Détecter les protéines virales dans des cellules infectées.
 Immunologie : Analyser l'expression des marqueurs de surface et intracellulaires dans des cellules
immunitaires.

Exercices pratiques détaillés

Exercice pratique 1 : Immunohistochimie

1. Préparation des tissus : Fixer, inclure en paraffine, et couper des sections de 4-5 micromètres.
2. Blocage des sites non spécifiques : Incuber avec un sérum bloquant.
3. Application de l'anticorps primaire : Incuber avec l'anticorps primaire spécifique.
4. Application de l'anticorps secondaire : Incuber avec l'anticorps secondaire conjugué à une enzyme.
5. Détection du signal : Ajouter le substrat pour révéler la couleur.
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6. Contre-coloration et montage : Contre-colorer avec de l'hématoxyline, déshydrater et monter les

lames.

Exercice pratique 2 : Immunocytochimie

1. Préparation des cellules : Fixer les cellules sur des lames de microscope.
2. Blocage des sites non spécifiques : Incuber avec un sérum bloquant.
3. Application de l'anticorps primaire : Incuber avec l'anticorps primaire spécifique.
4. Application de l'anticorps secondaire : Incuber avec l'anticorps secondaire conjugué à un
fluorochrome.
5. Observation au microscope à fluorescence : Visualiser les cellules marquées sous un microscope à
fluorescence.

Exemple de Protocole : Mise au point de l’anticorps PEA3

L’anticorps PEA3 est utilisé pour rechercher la protéine ETV4 qui est exprimé en grand nombre
dans le sarcome à cellules rondes d’Ewing.
Le sarcome à cellules rondes d’Ewing est un cancer très agressif qui s’attaque principalement aux os
et aux tissus mous chez des personnes assez jeunes. Il est lié à une translocation au niveau des gènes CIC
– DUX4, ce qui va produire une surexpression de la protéine ETV4. PEA3 est un anticorps de souris
monoclonal c’est-à-dire que l’on a injecté à la souris, l’antigène humain que l’on recherche (ETV4) dans le
sarcome à cellules rondes d’Ewing, pour créer une réaction immunitaire chez la souris et pour qu’elle
puisse produire les anticorps qui vont nous servir pour l’immunohistochimie.
Lecture de la fiche technique
 Espèce chez laquelle est fabriqué l’anticorps (Source/Purification)
 Stockage (Frigo/Congélateur)
 Lot (aliquote* ou pas)
 Volume d’anticorps disponible
 Dilution (Soit proposé dans la fiche technique, soit se rapporter à un article publié)
Réhydratation
Tout d’abord, pour réaliser une réaction antigène/anticorps, il faut réhydrater les tissus paraffinés
sur la lame. Donc faire les étapes inverse où l’on met le tissu dans de la paraffine.

1. 4 min dans chaque bain

o Xylène* (3 bains)
o Alcool absolu (2 bains)
o Alcool 90 °C (1 bain)
o Alcool 70 °C (1 bain)
2. Plonger la lame immédiatement dans un récipient d’eau (pour que les tissus réhydratés ne
sèchent pas), et faire rincer pendant 3 min en faisant couler l’eau du robinet dans le récipient.
3. Plonger la lame dans un récipient d’eau distillée

Prétraitement
1. Diluer le pH9 au 1/10 (50 ml de tampon + 500 ml d’eau distillée) dans une éprouvette de 500 ml.
Mettre la lame dans le pH9 dilué.
2. Faire chauffer au micro-onde « programmé sur vapeur », la lame dans le pH9 dilué, pendant 30
min en ne fermant pas totalement le bocal (pour que la vapeur puisse s’échapper).
3. Attendre que la solution pH9 dans le bocal refroidisse pendant 20 min.

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4. Rincer la lame dans un récipient d’eau pendant 3 min.

5. Faire une délimitation des tissus, à l’aide d’un marqueur hydrophobe.
6. Déposer de H2O2 (permet de neutraliser les peroxydases endogènes (dans le tissu) en vue de la
coloration au DAB [peroxydases oxydent DAB produit coloré]) jusqu’à remplir le cadrant de délimitation
et laisser reposer 10 min dans une chambre humide (car anticorps PEA3 agit de nuit).
7. Pendant ce temps faire une dilution adaptée de l’anticorps PEA3.
8. Rincer la lame dans un récipient d’eau.
9. Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.
10. Faire tremper la lame dans un récipient contenant un tampon de réaction (tampon de lavage qui
permet à l’anticorps de mieux se répartir sur la lame car il a un effet «mouillant») pendant 5 min.
11. Déposer l’anticorps (permet la fixation spécifique de l’anticorps (de souris) sur la protéine ETV4
[marquage nucléaire]) dans le cadrant de délimitation à l’aide d’une pipette et faire reposer la nuit au
frigo.
Révélation
1. Rincer la lame avec du tampon de réaction.
2. Laisser la lame 3 min dans un récipient contenant du tampon de réaction.
3. Mettre l’anticorps de chèvre Rabbit/Mouse (cette chaîne de dextranes sur laquelle est couplée à
l’anticorps de chèvre anti lapin/souris et est fixée un grand nombre de peroxydase, permet la fixation
d'anticorps de chèvre sur les anticorps de souris [amplifie le signal donne une meilleure vue à
l’observation microscopique]) pendant 30 min.
4. Rincer avec du tampon de réaction.
5. Laisser la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction.
6. Préparer la dilution de la DAB (1 ml de tampon DAB + 1 goutte de DAB) à l’aide d’une pipette
compte-goutte.
7. Mettre la révélation à la DAB (révélation de l’anticorps secondaire, par l’action enzymatique des
peroxydases + DAB [produit coloré], donc localisé là où la protéine ETV4 est fixée sur l’anticorps primaire)
sur le cadrant de délimitation et laisser reposer 8 min dans une boite hydratée cachée de la lumière.
8. Rincer la lame dans un récipient d’eau.
9. Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.

Contre-coloration
1. Plonger la lame pendant 5 à 10 secondes (si le tissu est grand) ou moins dans de l’hématoxyline
(permet de colorer les noyaux/cytoplasme/membranes qui ne sont pas relevés par l’anticorps).
2. Rincer à l’eau jusqu’à ce que le colorant parte.
3. Mettre la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction (virage bleu des
noyaux/cytoplasme/membranes) pendant 2 min.
4. Déshydrater (alcool 70 °C, alcool 90 °C, alcool absolu [x2], Xylène [x3]) et monter sous lamelle

Autres méthodes immunologiques

1. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) :

o Principe : Utilisation d'anticorps pour détecter et quantifier des antigènes spécifiques dans des
échantillons. Les anticorps sont liés à une enzyme qui produit un signal coloré lorsqu'un substrat
est ajouté.
o Rôle : Diagnostic et recherche pour mesurer les concentrations de protéines, d'hormones, et
d'autres molécules dans les échantillons biologiques.
2. Western Blot :
o Principe : Séparation des protéines par électrophorèse sur gel, transfert sur une membrane, et
détection des protéines spécifiques à l'aide d'anticorps et de substrats
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