Travaux pratiques de Bactériologie

2ème
année Médecine

2025-2026
OBJECTIFS PEDAGOGIQUES

• L’étudiant devra pouvoir : Manipuler le microscopique optique.

• Interpréter et réaliser une coloration de Gram à partir d’un échantillon

biologique.

• Interpréter une coloration de Ziehl Neelson pour la mise en évidence du

bacille de Koch (BK), agent de la tuberculose.

• Réaliser l’ensemencement d’un échantillon biologique sur milieu gélosé.

• Réaliser les différentes étapes de l’identification bactérienne :

- Interpréter les caractères macroscopiques des colonies isolées

- Réaliser une coloration de Gram à partir des colonies bactériennes

- Interpréter les Caractères microscopiques des colonies bactériennes

- Réaliser les épreuves enzymatiques simples qui vont conditionner le choix des

galeries biochimiques d’identification (test à la catalase, test à l’oxydase)

INTRODUCTION
Ce document est destiné aux travaux pratiques de bactériologie des étudiants de

deuxième année de Médecine. Il vient compléter l'enseignement théorique dispensé

aux cours magistraux de Bactériologie.

Cet enseignement pratique a pour objectif de donner un aperçu sur les modalités

du diagnostic bactériologique conventionnel afin de favoriser le dialogue entre des

futurs cliniciens praticiens et les laboratoires de diagnostic.

Toutes les manipulations effectuées par les étudiants font préalablement l'objet

d'une démonstration.

Les séances de travaux pratiques durent 2 heures. Elles auront lieu dans la salle

de travaux pratiques du Laboratoire de Microbiologie.

MESURES DE SECURITE
Revêtir une blouse propre fermée sur le devant.

Ouvrir avec précaution les récipients contenant les échantillons cliniques et les

cultures microbiennes, afin d'éviter toute projection.

Une désinfection immédiate doit être effectuée en cas de projection de matière

virulente ou lors de la casse accidentelle d'un récipient contenant un produit

pathologique ou une culture bactérienne.

Il est interdit de manger, de boire dans la salle de travaux pratiques et pendant

les TP.

En cours de travail, les mains peuvent être souillées. Aussi, il faut éviter de porter

les mains au visage, de toucher des objets personnels (mouchoirs, sac, ...), etc.
DEROULEMENT DES SEANCES
Séance 1 :
Manipulation du Microscope.

Réaliser sur un échantillon biologique un examen direct après coloration (coloration

de Gram).

Lire et interpréter un examen direct après coloration : forme des bactéries et mode

de regroupement.

Interpréter un examen direct coloré au Ziehl Neelsen

Mise en culture sur une gélose nutritive.

Établir un compte rendu de la séance.

Séance 2 :
Étude d’une culture positive sur milieu gélosé.

Description des colonies bactériennes.

Identification bactérienne :

• Faire une Coloration de Gram sur les colonies bactériennes

• Réaliser les Épreuves enzymatiques d’orientation (Test à la catalase, Test à

l’oxydase).

Établir un compte rendu de la séance.

 Séance 1
Examen direct et Mise en culture
Etape 1 : Manipulation du Microscope

1- Description :

Le microscope est un instrument d'optique muni d'un objectif et d'un oculaire qui

permet de grossir l'image d'un objet de petite dimension et de séparer les détails

de cette image (résolution) afin qu'il soit observable par l'œil humain.

(Vis macrométrique
Vis micrométrique)

Schéma des différents composants d’un microscope optique

Microscope optique
2- Utilisation du microscope :

Préparation du microscope : Travailler assis, le microscope devant soi. Vérifier

l’ouverture du diaphragme, objectif en place et le mouvement libre de la vis

micrométrique. Allumer la lampe.

Observation au grossissement 400 :

- Placer la préparation (lame et lamelle) sur la platine, la fixer avec les

valets

- Placer l’objectif 10 en tournant le barillet dans le sens des aiguilles d’une

montre (vérifier le clic)

- En regardant dans l’oculaire : Descendre le tube à l’aide de la vis

macrométrique au plus près de la préparation

- Remonter lentement la préparation, jusqu'à la mise au point

- Régler la lumière à l’aide du diaphragme

- Passer au grossissement supérieur

- La mise au point se fait avec la vis micrométrique si le microscope est

bien réglé. Régler la lumière à l’aide du diaphragme.

Observation au très fort grossissement (lames colorées) :

Observation au grossissement 1000 :

- Placer la préparation (lame colorée) sur la platine, la fixer avec les

valets

- Relever le tube optique

- Déposer une goutte d’huile à immersion sur la lame

- Remonter le condensateur et ouvrir le diaphragme

- En regardant dans l’oculaire : Descendre le tube à l’aide de la vis

macrométrique jusqu’à ce qu’il plonge dans l’huile à immersion

- Remonter lentement la préparation, jusqu'à la mise au point

- Régler la vis micrométrique jusqu'à ce que l'image soit nette

Rangement du microscope :

- Débrancher la prise

- Remonter le tube optique

- Enlever la lame et nettoyer la platine si nécessaire

- Nettoyer l’objectif (X 100) pour enlever l’huile à immersion

- Remettre le faible grossissement

Etape 2 : Examen microscopique d’un échantillon
biologique coloré au Gram

A- Principe générale d’une coloration

Toutes les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut se définir

en 3 (éventuellement 4) étapes qui sont :

• Etape de COLORATION (c’est le colorant qui donnera un résultat positif à

la fin)

• Etape de fixation ou d’intensification de la coloration

• Etape de DECOLORATION ou épreuve (c’est le caractère que l’on cherche à

mettre en évidence)

• Etape de CONTRE COLORATION qui permet d’observer les germes décolorés

précédemment (donc c’est le colorant donnant un résultat négatif).

C- Réalisation d’un frottis pour coloration de Gram

Un frottis correspond à un étalement sur lame d’un échantillon biologique (pus,

liquide céphalo rachidien, urines...) si possible en monocouche (couche fine).

Technique de réalisation du frottis :

- Déposer sur une lame propre une goutte de l’échantillon biologique avec une

pipette pasteur.

- Réaliser le frottis en partant du centre de la lame, en décrivant avec l’anse des

mouvements circulaires de façon à obtenir un étalement mince et homogène sur

au moins 2/3 de la lame

- Mettre l’anse utilisée dans le bocal d’eau de javel

- Sécher et fixer sur une plaque chauffante.

- Le frottis étant fixé, la lame ne présente plus de danger de contamination.

B- Coloration de Gram

Principe

La coloration de Gram est la coloration de base en Bactériologie et constitue une

première étape dans l’identification bactérienne permettant le choix des examens

complémentaires à effectuer et des milieux de culture à ensemencer.

C’est une coloration qui teste l’alcoolo résistance d’une souche bactérienne. En

effet, les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de

constitution de la paroi bactérienne.

 1. Technique de coloration :
Matériel nécessaire : Echantillon biologique, Lame, Pipette pasteur, Kit de

coloration de Gram

Mode opératoire

Effectuer les étapes suivantes sur un frottis fixé.

Etape 1 : Coloration
• Flacon n° 1 : violet de gentiane phéniqué ou cristal violet
• Couvrir la lame par le cristal violet pendant une minute
• Rincer à l’eau du robinet
Etape 2 : Fixation
• Flacon n°2 : Fixateur : Lugol (réactif iodo-ioduré qui accentue la
coloration).
• Recouvrir la lame de réactif de Lugol pendant 1 minute
• Rincer à l’eau de robinet
Etape 3 : Décoloration (alcoolo résistance)
• Flacon n° 3 : Alcool
• Plonger 3 ou 4 fois une demi-seconde dans un pot d’alcool
• Rincer à l’eau du robinet immédiatement
Etape 4 : Contre coloration
• Flacon n°4 : Fuschine diluée au 1/20 ème
ou de safranine
• Couvrir la lame par la Fuschine pendant une minute
• Rincer à l’eau du robinet
• Sécher sur plaque chauffante

Lire le frottis coloré au Microscope optique au fort grossissement (objectif 100

à immersion).

2. Interprétation :
• Au cours de la première étape, toutes les bactéries prennent le colorant et

sont donc colorées en violet

• Le Lugol vient fixer cette première coloration.

 • Au cours de l’étape de décoloration, Les bactéries Gram négatif ont une paroi

plus fine que celles à Gram positif. De plus, cette paroi est très riche en

lipides (membrane externe de la paroi) dans laquelle l’éthanol est fortement

soluble, les lipides de la paroi des bactéries Gram négatif sont dissous et

l’alcool peut donc pénétrer dans le corps bactérien et expulser le violet de

gentiane. Les bactéries Gram négatif sont alcoolo-sensibles et sont donc

décolorées. La paroi des bactéries Gram positif contient une couche épaisse

de peptidoglycanne et ne laisse pas passer l’alcool et sont dites alcoolo-

résistantes et restent colorées en violet.

• Au terme du processus de coloration, les bactéries dites « Gram Négatives »

apparaissent roses tandis que les bactéries dites « Gram Positives » sont
colorés en bleu foncé/violet.

La figure suivante illustre les 4 étapes de la coloration de Gram

• A : Les bactéries colorées en violet foncé, qui ont gardé le violet, ‘le

gram’ elles sont dites « Gram positif »

• B : Les bactéries colorées en rose ou rouge pâle, qui ont perdu le violet,

‘le Gram’ elles sont dites « gram négatif »

 A B
Cocci à Gram positif en amas Bacilles à Gram positif

et en grappe de raisin

Bacilles à Gram négatif Cocci à Gram positif

en diplocoque et petites chainette
Etape 3 : Interprétation d’un frottis d’expectoration coloré au

Ziehl Neelson

1. Principe

Les mycobactéries avec leur chef de fil, le bacille tuberculeux ou bacille de Koch

(BK), ne se colorent pas au Gram et nécessitent pour leur mise en évidence des

colorations spéciales. La coloration de Ziehl Neelson est la coloration de référence

utilisée pour objectiver présence de ces BAAR au niveau des échantillons cliniques.

Lire le frottis coloré au Microscope optique au fort grossissement

(objectif 100 à immersion).
Interprétation :

Les mycobactéries ont la capacité de conserver, après coloration à chaud la fuschine

malgré l’action d’un acide fort concentré et d’éthanol à 95°. Cette propriété est

en relation avec une constitution particulière de la paroi : elles ont une paroi grasse

et cireuse, très riche en lipides (acide mycoliques, acides gras à longues chaînes et

cires) qui ne sont retrouvés que chez ces bactéries dites « alcoolo-acido-

résistantes » ou BAAR.

Frottis coloré au Ziehl Neelsen montrant les BK colorés en rose sur un fond bleu

Les mycobactéries (BAAR) apparaissent roses, le reste des structures apparaissent

bleus.
Etape 4 : Ensemencement d’un échantillon biologique

La mise en culture d’un échantillon biologique permet un diagnostic de certitude.

L’isolement d’une bactérie va permettre son identification et l’étude de sa

sensibilité aux antibiotiques.

La première étape consiste à ensemencer le prélèvement reçu au laboratoire sur

les milieux de culture appropriés en assurant la température de croissance optimale

et l’atmosphère d’incubation adéquat. Le principe de la mise en culture consiste à

prélever une goutte de l’échantillon biologique puis l’étaler sur une gélose nutritive

à l’aide d’un instrument d’isolement (anse de platine, anse d’inoculation stérile à

usage unique, pipette pasteur stérile etc).

Ensemencement sur gélose nutritive en boite de pétri et Méthode des 4 quadrants :

Matériel : Anse stérile, Gélose nutritive en boite de pétri, échantillon biologique

Mode opératoire

1. Déposer en utilisant une anse stérile une goutte du prélèvement près d’un bord

de la boite de Pétri

2. Avec la main gauche maintenir entrouverte la boite et étaler le prélèvement par

stries très serrées dans un quart de la boite de Pétri qui constituera le premier

quadrant.

3. Etaler à nouveau le prélèvement par stries moins serrées dans la moitié

correspondante au quadrant 2

4. Répéter une dernière fois l'étalement en stries plus larges dans la moitié

correspondante aux quadrants 3

5. Incubation au niveau de l’étuve à 37 °C en choisissant l’atmosphère d’incubation

adapté (aérobiose ou anaérobiose)

Les boites doivent être placées couvercle en bas : Pour éviter que l’eau de

condensation dans les boîtes de Pétri ne perturbe la surface du milieu gélosé, on

place les boîtes en position retournée dans l’étuve à 37°C.

Ainsi par cette méthode, le dernier quadrant va contenir des colonies isolées dont

la morphologie permet déjà une orientation vers un genre bactérien voire une famille

de bactéries.

Q II
QI

Q III
Q IV

Schéma illustrant la méthode d’ensemencement selon les 4 quadrants

Colonies isolées et bien séparées au niveau du quadrant 4
 Séance 2
Identification bactérienne
Cette séance de TP a pour but de familiariser l’étudiant avec les premières étapes

de l'identification des bactéries par leur culture, leur étude macroscopique et leur

étude microscopique.

A partir des cultures obtenues de différents groupes bactériens (staphylocoques,

Streptocoques, entérobactéries, Pseudomonas), l’étudiant doit reconnaître l'aspect

des colonies et décrire les caractères morphologiques : forme, groupement, taille,

caractères tinctoriaux, mobilité, capsules. Chaque étudiant doit réaliser par la suite

les premières Tests d’orientation de l'identification bactérienne.

Etape 1 : Identification bactérienne

A- Aspect macroscopique des colonies

L'examen macroscopique des cultures est le premier examen effectué sur une

culture positive. L'aspect des colonies isolées dépend du milieu utilisé, de la durée

et de la température de l'incubation. Un bon ensemencement de l’échantillon

biologique permet d’obtenir des colonies bien isolées.

Principe : Sur une culture positive, décrire l’aspect des colonies isolées.

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Mode opératoire : Noter l’aspect des colonies isolées sur la surface de la gélose

1. Taille :

Petite, moyenne ou grande

2. Forme :

- Contour : lisse, irrégulier (Forme diffuse et floue)

- Relief : surface bombée, demi bombée, plate

- Centre : surélève, ombiliquée (en creux)

3. Surface : lisse, rugueuse

4. Opacité :

- Opaques (ne laissent pas passer la lumière)

- Translucides (laissent passer la lumière)

- Transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers)

5. Consistance : muqueuse, crémeuses, sèches

6. Couleur et/ou pigment :

- Pas de couleur bien définie (blanc, gris)

- Pigment insoluble qui donne un aspect bien caractéristique à la colonie (rose,

jaune, rouge)

- Pigment soluble qui diffuse et colore le milieu.

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 Colonies jaunes fermentant le Mannitol sur gélose Chapman

Colonies bêta hémolytiques sur gélose au sang frais

Colonies roses fermentant le lactose Colonies blanches muqueuses sur gélose

B- Aspect microscopique des colonies

L’observation microscopique des colonies obtenues comprend un examen après

coloration de Gram qui permet de distinguer entre les bactéries à Gram positif et

les bactéries à Gram négatif : cette distinction est fondamentale pour leur

identification.

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Principe : Décrire les caractères morphologiques : forme, groupement, taille,

caractères tinctoriaux, capsule.

Matériel : Lame, Sérum physiologique, Anse d’inoculation stérile, Kit de coloration

de Gram.

Mode opératoire : Réalisation d’un frottis à partir d’une colonie

1. Déposer une goutte d'eau sur une lame. Prélever un fragment de colonie à l'aide

d'une anse stérile

2. Dissocier soigneusement l'inoculum dans la goutte d'eau

3. Réaliser un étalement en couche mince et régulière

4. Fixer à la chaleur sur une plaque chauffante

5. Réaliser une coloration de Gram comme indiquée ci-dessus (Page 10).

Lecture du frottis

- Observer au Microscope à l’objectif x 100 à l’huile à immersion

- Noter la forme, le mode de groupement et la propriété tinctoriale des bactéries

- Les bactéries colorées en violet foncé sont dites ‘Gram positif’

- Les bactéries colorées en rose ou rouge pâle sont dites ‘gram négatif’

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 C- Tests d’identification bactérienne : Epreuves enzymatiques
simples

A partir d’une culture positive et après avoir réalisé un examen direct coloré au

Gram sur les colonies isolées, des tests d’orientation s’imposent pour le choix adapté

des galeries d’identification et de la liste d’antibiotiques à tester.

Matériel : Lames, anses stériles, Eau oxygénée, disques d’oxydase, gélose ADN

Recherche de l’oxydase

Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram négatif.

Les bactéries possédant une chaîne respiratoire complète sont dotées d’un

cytochrome oxydase. La mise en évidence de cette oxydase est effectuée à l’aide

d’un disque imprégnée d’une solution aqueuse à 1% de chlorhydrate de diméthyl

paraphénylène diamine qui forme un complexe violet au contact de cette enzyme.

Pour les bactéries à Gram négatif, la recherche de cette enzyme permet de

différencier entre les Entérobactéries (Oxydase négative) et bacilles à Gram

négatif non fermentaires (Oxydase positive).

Principe : le test de l'oxydase met en évidence la présence d'une cytochrome-

oxydase qui oxyde le cytochrome c réduit. Ce test met en évidence la présence de

cytochrome c dans les chaînes respiratoires grâce à des réactifs ayant le même

potentiel d'oxydo-réduction que le cytochrome c.

Technique : Plusieurs réactifs sont commercialisés et plusieurs méthodes peuvent

être utilisées. Au cours des travaux pratiques, la recherche de l'oxydase sera

effectuée à l'aide de disques en papier dont la zone réactionnelle est composée d'un

papier filtre imprégné par le réactif.

1. Prélever à l'aide d'une anse stérile un fragment de colonie

2. Dissocier le fragment de colonie sur le disque en papier.

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Lecture : la présence d'une cytochrome-oxydase se traduit, en 20 à 60 secondes,

par l'apparition d'une coloration rouge virant rapidement au violet très foncé.

Test à l’oxydase positif avec apparition d’une coloration violette

Recherche de la Catalase

Certaines bactéries ont la faculté de dégrader le peroxyde d’hydrogène (H2O2). En

présence d’une bactérie productrice de catalase, on observe, à partir de H2O2 une

libération d’oxygène gazeux selon la réaction : H2O2 donne H2O + ½ O2. Ceci se

traduit par le dégagement de bulles d’air visibles à l’œil nu. Pour les bactéries à

gram positif, la recherche de cette enzyme permet de différencier entre les

Staphylococcus (catalase positive) et les Streptocoques (catalase -).

Principe : En présence d'oxygène moléculaire, certaines réactions métaboliques

conduisent à la formation d'eau oxygénée. La catalase est une enzyme qui dégrade

l'eau oxygénée en eau et oxygène.

Technique :

1. Déposer sur une lame une ou deux gouttes d'eau oxygénée.

2. Prélever à l'aide d'une anse un fragment de colonie et le dissocier dans l'eau

oxygénée.

Lecture : la présence d'une catalase se traduit, en quelques secondes, par la

formation de bulles d'oxygène.

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Test à la catalase : réaction positive avec dégagement de bulles d’air à

droite et réaction négative à gauche

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En fin de chaque séance :

• Oter les lames dès l’observation terminée et les mettre dans un bocal

contenant de l’eau de javel.

• Ranger la paillasse en fin de séance : éteindre et nettoyer avec soin le

microscope.

• Évacuer les déchets dans les poubelles adéquates.

• Ordonner et désinfecter la paillasse.

En fin des deux séances de travaux pratiques :

Remettre un compte rendu.

L’étudiant doit indiquer sur le compte rendu de la séance 1 :

• Le résultat de l’examen coloré au Gram

• Décrire comment il a réalisé la mise en culture de l’échantillon biologique.

• L’interprétation de l’examen microscopique coloré au Ziehl Neelson.

L’étudiant doit indiquer sur le compte rendu de la séance 2

• Les critères morphologiques des colonies bactériennes

• Le résultat de l’examen direct coloré au Gram

• Le résultat des épreuves enzymatiques simples permettant d’orienter

l’identification vers une de ces trois familles : Entérobactéries, Pseudomonas,

Staphylocoques et Streptocoques.

Il doit proposer sous forme de schéma, une démarche analytique hiérarchisant

ces critères.

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Évaluation

L’évaluation finale des travaux pratiques est notée sur 20.

Elle comprend :

• Épreuve théorique.

• Respect des bonnes pratiques de laboratoire et d’hygiène.

• Présence aux travaux pratiques.

• Compte rendu remis à la fin de chaque séance.

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