Master Sciences Analytiques, Qualité

et Environnement

Validation des Méthodes Analytiques

(Cours et travaux dirigés)
• Pr. A. SIFOU
• Laboratoire Matériaux, Nanotechnologies et
Année Universitaire 2024/2025
Environnement
1
2
3
1. Introduction

Une méthode analytique regroupe un ensemble de techniques et

de protocoles permettant de détecter, identifier, quantifier ou
caractériser une substance donnée. Elle est utilisée dans divers
domaines tels que la chimie, la pharmacie, l’environnement et
l’agroalimentaire.

Les méthodes analytiques jouent un rôle clé dans:

• Le contrôle qualité des produits pharmaceutiques et
industriels
• La détection de contaminants dans les matrices alimentaires
et environnementales.
• L'analyse des ingrédients dans les produits cosmétiques.
4
2. Classification générale des méthodes analytiques
Les méthodes analytiques sont classées selon plusieurs critères.
2.1. Selon la nature de la méthode:
🔹 Méthodes classiques (ou chimiques).
🔹 Méthodes instrumentales
2.2. Selon l’objectif de la méthode:
🔹 Méthodes qualitatives
🔹 Méthodes quantitatives
2.3. Selon le statut réglementaire de la méthode :
🔹 Méthodes normalisées
🔹 Méthodes non normalisées

5
2. Classification générale des méthodes analytiques
2.1. Selon la nature de la méthode

🔹 Méthodes classiques (ou chimiques) sont les méthodes les plus anciennes,
ne nécessitant pas ou peu d’instruments sophistiqués.
On distingue :
 Méthodes gravimétriques sont basées sur la mesure de masse d’un précipité
ou résidu (ex. : la synthèse de l’aspérine).
 Méthodes volumétriques (ou titrimétriques) sont basées sur la mesure de
volume de solution titrante réagissant avec la solution titrée (ex. : titrage
acide-base, et titrage redox).
📌 Avantage : simples et peu coûteuses.
📌 Limite : moins sensibles, nécessitent une bonne technique manuelle.

6
2. Classification générale des méthodes analytiques
2.1. Selon la nature de la méthode
🔹 Méthodes Instrumentales

TECHNIQUE PRINCIPE EXEMPLE D’APPLICATION

Mesure l’absorbance d’un

Spectrophotométrie UV- Dosage des principes actifs
analyte à une longueur d’onde
Visible pharmaceutiques.
donnée.
Séparation des composants
Chromatographie liquide Analyse des impuretés dans
d’un mélange sur une colonne
haute performance (HPLC) les médicaments.
chromatographique.
Chromatographie en phase Séparation et identification des Détection de pesticides dans
gazeuse (GC-MS) molécules volatiles. les aliments.
Étude des réactions en Analyse d’un polymère pour
Méthodes thermiques (ATG,
fonction de la T(perte d’eau, connaître sa stabilité
et DSC)
décomposition, combustion). thermique .
📌 Avantage : haute sensibilité, rapidité, automatisation possible.
📌 Limite : coût et besoin de validation rigoureuse. 7
2. Classification générale des méthodes analytiques
2.2. Selon l’objectif de la méthode
🔹 Méthodes qualitatives permettent d’identifier la nature chimique d’un ou
plusieurs composants d’un échantillon, sans en déterminer la quantité.
Objectif :
- Vérifier la présence ou l'absence d'un composé ou d'une famille chimique.
- Rechercher des impuretés et des contaminants.
Applications courantes :
- Contrôle de qualité (ex. : vérification de conformité);
- Analyses toxicologiques ou environnementales;
- Identification de substances dans un mélange inconnu.
📌 Avantages : Elles permettent de comprendre en profondeur les
comportements et les contextes, en produisant des données riches et
nuancées.
📌 Limites :
- Résultats non quantitatifs.
- Nécessite parfois une confirmation par méthode quantitative.
8
2. Classification générale des méthodes analytiques
2.2. Selon l’objectif de la méthode

🔹 Méthodes quantitatives permettent de mesurer la quantité exacte

d’un analyte présent dans un échantillon.
Objectif :
- Déterminer une concentration (mg/L, ppm, %, etc.).
- Effectuer un dosage précis pour le contrôle qualité, la recherche ou
la réglementation.
Exemples d'applications :
- Teneur en principe actif dans un médicament;
- Analyse de polluants dans l’eau ou l’air;
- Quantification d’éléments traces dans les aliments.
📌 Avantages : Résultats chiffrés, exploitables et comparables.
📌 Limites : Sensibles aux variations expérimentales (température,
réactifs, opérateur).
9
2. Classification générale des méthodes analytiques

2.3. Selon le statut réglementaire de la méthode

🔹Méthodes normalisées sont des procédures officielles, établies par des organismes de
normalisation internationales (ISO, IMANOR, ICH, FDA, etc.) pour garantir des résultats
fiables, reproductibles et comparables.
Objectif :
- Assurer la conformité aux normes en vigueur
- Permettre la comparaison internationale des résultats
- Servir de référence dans les laboratoires accrédités (ex : ISO/CEI 17025)
Exemples d'applications :
- Dosage du plomb dans l’eau selon la norme (ISO 8288)
- Détermination de la teneur en matières grasses dans les aliments (NF V03-713)
- Analyse de l’eau potable selon la norme (NM ISO 15923 1).
📌Avantages: Méthodes validées, reconnues a l’échelle international et reproductibles.
📌Limites : Peuvent être longues, coûteuses, et parfois inadaptées à certaines matrices
nouvelles.

10
2. Classification générale des méthodes analytiques
2.3. Selon le statut réglementaire de la méthode
🔹Méthodes non normalisées sont des procédures développées en interne par un
laboratoire ou un chercheur, non publiées dans une norme officielle.
Objectif :
- Répondre à un besoin spécifique non couvert par une méthode officielle
- Adapter une méthode à une nouvelle matrice ou une nouvelle technologie
- Proposer une alternative plus rapide, plus sensible ou plus économique
Exemples d'applications :
- Développement d’une méthode HPLC pour un nouveau médicament
- Dosage de composés bioactifs dans des extraits végétaux
📌 Avantages : Souples à adapter aux besoins du laboratoire, rapide et moins
couteuses par rapport aux méthodes officielles.
📌Limites :
- Non acceptées dans les démarches réglementaires sans validation conforme ce
qui nécessite une validation rigoureuse avant toute utilisation officielle
- Résultats non comparables directement avec d’autres laboratoires sans
validation croisée 11
3. Critères de choix d’une méthode analytique

Le choix d’une méthode dépend de plusieurs facteurs, qui assurent la pertinence

et l’efficacité de l’analyse.

1. Nature de l’analyte: Organique, inorganique, volatil…

→ Chaque analyte nécessite une méthode adaptée.
2. Matrice de l’échantillon: Eau, sol, sang, aliment…
→ Influence la préparation de l’échantillon et la méthode à utiliser.
3. Sensibilité requise: Détection de traces, ou bien des quantités importantes?
→ On choisira une méthode plus ou moins sensible selon le besoin.
4. Temps d’analyse: Analyses urgentes vs. approfondies
→ choix d'une méthode rapide ou détaillée.
5. Disponibilité des instruments: Méthode adaptée aux équipements présents
dans le laboratoire.
6. Coût global: Inclut le matériel, les réactifs, le personnel, et l’entretien des
appareils.

12
4. Limites et enjeux des méthodes analytiques
Même bien choisie, une méthode présente des contraintes et risques à considérer.

🔹 Manque de sensibilité ou de sélectivité: Certaines méthodes ne détectent pas

les très petites quantités (traces) ou peuvent confondre des substances proches.
Cela peut provoquer des erreurs ou des résultats faussés.

🔹 Dépendance aux conditions opératoires: Les résultats peuvent changer si les

conditions ne sont pas bien contrôlées. Par exemple: un mauvais étalonnage, une
température ou un pH instable, ou aussi un protocole mal suivi
→ peuvent rendre l’analyse incorrecte.

🔹 Risque de non-conformité réglementaire: Une méthode non validée peut être

refusée par les autorités. C’est pourquoi il est important de la valider avant toute
utilisation officielle.

13
 Exercice1: Classification des méthodes analytiques
Classer différentes méthodes selon leur type (classique, instrumentale, qualitative, quantitative,
normalisée, non normalisée). Complétez le tableau suivant en cochant les bonnes cases.
Méthode (exemple concret) Classique Instrumentale Qualitative Quantitative Normalisée Non normalisée
Titrage de HCl par NaOH) selon
(NF T90-016)
Détermination de teneur en
caféine dans un soda en
utilisant UV-Visible selon ISO
20481
Analyse de sucre dans le miel
par HPLC avec une méthode
interne de laboratoire
Dosage du Ca dans le lait
(Titrage de complexation par
EDTA) selon (ISO 8070)
Analyse des métaux lourds par
Spectrométrie de masse avec
plasma a couplage inductif ICP-
MS
Mesure du pH dans une eau
minérale en utilisant pH-mètre
14
selon ISO 10523
 Correction Exercice1:
Non
Méthode (exemple concret) Classique Instrumentale Qualitative Quantitative Normalisée
normalisée
Titrage de HCl par NaOH) selon
✔️ ✔️ ✔️(NF T90-016)
(NF T90-016)
Détermination de teneur en
caféine dans un soda en
✔️ ✔️ ✔️ ✔️ ISO 20481)
utilisant UV-Visible selon ISO
20481
Analyse de sucre dans le miel
par HPLC avec une méthode ✔️ ✔️ ✔️
interne de laboratoire
Dosage du Ca dans le lait
(Titrage de complexation par ✔️ ✔️ ✔️(ISO 8070)
EDTA) selon (ISO 8070)
Analyse des métaux lourds par
Spectrométrie de masse avec
✔️ ✔️
plasma a couplage inductif ICP-
MS
Mesure du pH dans une eau
minérale en utilisant pH-mètre ✔️ ✔️ ✔️ ✔️ (ISO 10523)
15
selon ISO 10523
Exercice2: Limites et enjeux

À partir des exemples proposés ci-dessous, indique la limite ou l'enjeu susceptible

d'altérer la fiabilité des résultats analytiques:
1. Une analyse spectrophotométrique donne des résultats très différents selon la
température ambiante.
2. Une méthode donne des résultats, mais ne peut pas distinguer deux
substances très proches chimiquement.
3. Un laboratoire utilise une méthode sans l’avoir validée, dans un cadre
réglementaire.
4. Un technicien ne suit pas le protocole de préparation de l’échantillon.
16
Exercice2: Correction

1. Température ambiante qui influence les résultats spectrophotométriques

→ Dépendance aux conditions opératoires

2. Méthode qui ne distingue pas deux substances proches

→ Manque de sélectivité

3. Méthode non validée utilisée dans un cadre réglementaire

→ Risque de non-conformité réglementaire

4. Protocole mal suivi par le technicien lors de la préparation de

l’échantillion
→ Dépendance aux conditions opératoires

17
Exercice3: Choix d’une méthode adaptée

Pour chaque situation suivante, propose une méthode appropriée et justifie

ton choix en citant au moins 2 critères de sélection.
1. Analyse d’un pesticide en très faible concentration dans de l’eau potable.
2. Contrôle de la teneur en fer dans des compléments alimentaires.
3. Détection rapide de la présence d’une substance colorée dans un extrait
végétal.
4. Dosage du calcium dans un échantillon de lait en laboratoire
universitaire à petit budget.
18
 Exercice3: Correction
1. La méthode adéquate pour l’analyse d’un pesticide en très faible concentration
dans de l’eau potable est la chromatographie couplée à la spectrométrie de masse
(soit GC-MS ou LC-MS selon la nature de la substance à analyser)
✔️ Haute sensibilité requise
✔️ Nature de l’analyte (trace organique dans une matrice aqueuse).

2. La méthode adéquate pour faire le contrôle de la teneur en fer dans des

compléments alimentaires est la spectrométrie d’absorption atomique (AAS)
✔️ Haute sensibilité requise
✔️ Nature de l’analyte (Métal dans une matrice solide)
19
Exercice3: Suite de la correction

3. La spectrophotométrie UV-Visible est la méthode la plus adaptée pour la

détection rapide d’une substance colorée dans un extrait végétal
✔️ Cout global (méthode peu coûteuse)
✔️ Temps d’analyse (méthode rapide)

4. Le titrage complexe-métrique (EDTA) est la méthode classique adaptée au

dosage du calcium dans un échantillon de lait en laboratoire universitaire à
petit budget
✔️ Coût global faible
✔️ Temps d’analyse faible 20
21
 1. Introduction

La validation analytique est le processus qui permet de démontrer qu'une

méthode analytique est adaptée à son usage prévu. Elle prouve que la méthode
est capable de fournir des résultats fiables, reproductibles, et interprétables
dans des conditions déterminées tout en respectant les normes et exigences
légales ou réglementaires.

Il existe plusieurs degrés de validation selon la nature de la méthode analytique,

son objectif et le contexte réglementaire dans lequel elle est utilisée.
• Une méthode destinée à un contrôle de qualité en routine, appliquée sur
plusieurs sites ou dans un contexte réglementaire exigeant, nécessite une
validation approfondie.
• En revanche, une méthode utilisée de façon ponctuelle, dans un seul
laboratoire, sans exigence réglementaire stricte peut faire l’objet d’une
validation allégée (Vérification).
22
 2. Degrés de validation:

Processus Validation Vérification

Processus qui confirme qu’une méthode
Processus documenté qui démontre
validée fonctionne correctement dans un
Définition qu’une méthode est adaptée à son usage
contexte donné (laboratoire, matrice,
prévu.
équipement).
S’assurer qu’une nouvelle méthode est Confirmer l’adéquation d’une méthode
Objectif fiable, reproductible et adaptée à l’usage existante déjà validée dans un contexte
prévu. spécifique.

Paramètres Tous les paramètres de performance : Quelques paramètres critiques seulement

évalués spécificité, justesse, fidélité, etc. (précision, exactitude, linéarité si besoin).

Temps et Processus long, coûteux, nécessitant des Moins long, plus ciblé, moins de ressources
ressources essais approfondis. nécessaires.

Développement d’une nouvelle méthode Vérification d’une méthode USP dans un

Exemple typique
HPLC pour dosage d’un médicament. nouveau laboratoire. 23
 3. Objectifs de la validation:

•Assurer la fiabilité des résultats : La validation garantit que les

méthodes donnent des résultats corrects et constants dans des
conditions contrôlées.
•Conformité aux exigences : La validation permet de s'assurer que la
méthode respecte les spécifications des autorités réglementaires.
•Fiabilité et précision : L'objectif principal est d'éviter les erreurs de
mesure et de s'assurer que les résultats sont reproductibles.

24
4. Quand faut-il valider une méthode ?

•Nouvelle méthode ou instrument : Validation nécessaire lorsqu'une

nouvelle méthode analytique est introduite ou un nouvel instrument est
utilisé .
•Modification de la méthode : Lorsque des changements sont
apportés à une méthode (par exemple, modification de la méthode de
préparation de l’échantillon, ou de l'équipement).
•Changement dans le processus : Lors de l'introduction de nouveaux
réactifs, ou d'un changement dans les conditions opératoires.

25
6. Qui valide?

Acteurs impliqués dans la validation:

•Analystes : Effectuent les tests pratiques de validation sur les
méthodes.
•Responsables qualité : Supervisent la validation pour s'assurer
qu'elle respecte les normes.
•Responsables de la gestion des risques : Identifient et gèrent les
risques potentiels associés aux méthodes non validées.
•Techniciens et ingénieurs : Assurent la bonne mise en place des
méthodes analytiques et la gestion des équipements.
26
7. Cadre Réglementaire
7.1. Référentiels
De nombreux référentiels abordent la validation des méthodes analytiques
entre autres:
•ICH Q2(R2) : Ligne directrice internationale sur la validation des
procédures analytiques, publiée par l'International Council for
Harmonisation.
•USP <1225> : Normes pour les méthodes chromatographiques.

•ISO 17025 : Norme internationale qui définit les exigences pour la

compétence des laboratoires d'essais et d'étalonnages.
27
 7.2. Comparaison entre les différentes normes
Critère USP <1225> ICH Q2(R2) ISO 17025
Établir les bonnes Validation des méthodes Vérifier la compétence
pratiques de validation des analytiques dans le cadre technique des laboratoires en
Objectif principal
méthodes analytiques selon pharmaceutique au niveau garantissant la traçables et
la pharmacopée américaine international la reproductibles.
Tous les laboratoires
Laboratoires de l’industrie Laboratoires de l’industrie
Domaine d’analyse, d'essai et
pharmaceutique aux États- pharmaceutique
d’application d’étalonnage au niveau
Unis internationale
international
Méthodes analytiques
Toutes les méthodes
Type de méthodes Méthodes analytiques pour médicaments :
d’analyse ou d’essai utilisées
couvertes qualitatives et quantitatives identification, dosage,
dans les laboratoires
impuretés

Exigences similaires, avec

Paramètres de Spécificité, linéarité, Identiques à USP
accent sur la traçabilité et
validation précision, exactitude, etc. (alignement des exigences)
l’incertitude 28
8. Contexte d’application
La validation analytique est indispensable dans plusieurs secteurs :
 Industrie pharmaceutique (analyse des médicaments) ;
 Industrie agroalimentaire (détection de contaminants) ;
 Chimie analytique (recherche et développement) ;
 Environnement (analyse de polluants) ;
 Santé publique (analyses cliniques ou biologiques).

29
9. Risques d’une méthode non validée

L’absence de validation peut entraîner :

 Des résultats erronés ou non fiables ;
 Des problèmes réglementaires (audits, sanctions) ;
 Une perte de confiance dans les analyses du laboratoire.
Cas réel d’erreur analytique
En 2008, un laboratoire pharmaceutique a subi un rappel de lot massif après
découverte que la méthode de dosage du principe actif n’était pas validée, ce qui
a entrainé la perte de plus de 10 millions d’euros et suspension temporaire de
l’agrément.
30
31
1. Introduction
La validation d’une méthode analytique repose sur l’évaluation de critères
appelés « paramètres de performance » ou « critères de validation ». Ces
critères permettent de déterminer si une méthode est fiable, exacte, précise,
spécifique, etc., en fonction de l’objectif analytique visé, qu'il s'agisse de
l’identification d’une substance, de son dosage ou de la détection d’impuretés.
Par exemple, une méthode utilisée pour le dosage de médicaments doit
offrir une grande précision et exactitude, tandis qu'une méthode de détection
d’impuretés dans un produit chimique doit se concentrer davantage sur la
sensibilité et la spécificité.
32
2. Paramètres principaux de validation

Les paramètres principaux à évaluer sont les suivants :

[Link]écificité / Sélectivité
[Link]/ Exactitude)
3. Fidélité/ Précision (répétabilité et reproductibilité)
4. Linéarité
[Link] de travail (ou intervalle de linéarité)
[Link] de détection (LOD) et de quantification (LOQ)
[Link]
[Link]é
33
Thesis defense at Solistice Lab
2.1. Spécificité / Sélectivité
a. Définition: La spécificité (ou sélectivité) c’est la capacité d’une méthode analytique à détecter ou
mesurer uniquement la substance recherchée, même en présence d’autres composés dans
l’échantillon ((impuretés, contaminants, etc.).
b. Méthodes d’évaluation:
La spécificité se vérifie,
 Comparaison d’échantillons :
1. Analyse d’un standard (matériau de référence)
2. Analyse d’un échantillon vierge (blanc de matrice)
3. Analyse d’un échantillon fortifié ( Standard + matrice)
 Étude d'interférences : Ajouter des substances connues pour vérifier qu’elles n’altèrent pas le
signal de l’analyte.
 Test de pureté du pic (en chromatographie) : Analyse spectrale du pic pour confirmer qu’il ne
contient qu’un seul composé. 34
c. Exemple concret:
Chromatographie (HPLC, GC) : Une méthode chromatographique est spécifique si le
temps de rétention de l’analyte est bien séparé de ceux des autres composés. Le pic doit
être isolé, sans chevauchement.

 Un pic apparait à 28.47 mn qui

correspond au temps de rétention de l’OTA,
et qui est séparé de ceux du solvant
d’extraction et de la matrice.

 La méthode est dite donc spécifique pour

le dosage de l’OTA dans les échantillons
puisque le pic est identifiable. (A) une solution standard d’OTA (3 ng/ml),
(B) un échantillon de l’alimentation de volailles fortifié
35
2.2. Justesse (ou Exactitude)
a. Définition
La justesse exprime la proximité entre la valeur mesurée et la valeur vraie (de référence).
Elle s’exprime souvent en taux de recouvrement ou biais relatif.

b. Evaluation de la justesse
 Biais relatif : Le biais est la différence systématique entre la valeur moyenne obtenue
par la méthode analytique et la valeur vraie de référence. Il est généralement exprimé
en pourcentage et reflète l’exactitude de la méthode.
: moyenne des mesures
CRef : Concentration de référence

 Taux de recouvrement (ou récupération) : Mesure la capacité de la méthode à

récupérer une quantité connue de l'analyte ajouté à l'échantillon, il est exprimé en
pourcentage. C : concentration mesurée après ajout
mesurée
Cajoutée : concentration de référence ajoutée
36
c. Plages acceptables de taux de recouvrement et de biais relatif
 Biais relatif
La plage acceptable pour le biais relatif dépend de la nature de la matrice et des exigences de la
méthode, mais voici des repères généraux :

 ≤ ±2 % pour les méthodes de mesure très précises.

Exemple : le dosage de l’insuline dans le plasma par chromatographie (LC-MS/MS), exige une très
grande précision, avec un biais relatif souvent inférieur à ±2 %.

 ±5 % à ±10 % pour les méthodes analytiques standards ou moins sensibles.

Exemple : le dosage des nitrates dans l’eau potable par spectrophotométrie UV, méthode simple et
courante en environnement, peut tolérer un biais relatif dans cette plage.

 ±15 % à ±20 % pour les méthodes moins critiques, où une certaine tolérance peut être acceptée
sans compromettre la validité des résultats.

Exemple : la détermination des métaux lourds dans les sols par spectrométrie d’absorption atomique
avec flamme (FAAS). En raison de la complexité de la matrice (matière organique, humidité,
interférences minérales), un biais relatif pouvant aller jusqu’à ±20 % est souvent accepté dans les
études environnementales. 37
  Taux de recouvrement
Au niveau international, la plage acceptable du taux de recouvrement dépend de plusieurs
facteurs, notamment : la concentration de l’analyte, la complexité de la matrice analysée (ex. : lait,
sol, plasma), et les recommandations de l’organisme de référence. Les plages admises selon la
concentration (d’après les recommandations de l’AOAC et de la FDA) :

Concentration de l’analyte Taux de recouvrement acceptable

< 1 µg/L 70 % – 120 %

1- 10 µg/L 80 % – 120 %
10- 100 µg/L 85% – 115 %
100- 1000 µg/L 90 % – 108 %
> 1000 µg/L 95 % – 105 %
Remarques :
•ICH Q2(R1) ne fixe pas une plage précise.
•ISO 17025 laisse également une certaine liberté, à condition que les critères soient reproductibles.38
d. Exemple concret (calcul de taux de recouvrement)
Enoncé: Deux concentrations connues (3 µg/L et 5 µg/L) de l’aflatoxine M1 ont été
ajoutées à un échantillon du lait. Les concentrations mesurées après analyse par HPLC
étaient de 2,98 µg/L et 4,79 µg/L. Calculer le taux de recouvrement pour chaque
concentration.
 Pour la concentration 3 µg/L:

 Pour la concentration 5µg/L:

Conclusion : Les taux de recouvrement de 99,33 % et 95,80 % indiquent que la méthode

est capable de récupérer la quasi-totalité de l’analyte, ce qui témoigne d’une bonne
justesse de la méthode aux deux niveaux de concentration.
39
2.3. Fidélité (répétabilité et reproductibilité)

a. Définition :
La fidélité, aussi appelée précision, exprime la proximité entre les résultats obtenus lors d’analyses
répétées d’un échantillon homogène dans des conditions déterminées.
b. Types de fidélité:
 Répétabilité (intra-laboratoire) : Correspond à la capacité d’une méthode analytique à donner des
résultats proches lorsqu'une même personne effectue plusieurs mesures en utilisant le même
équipement dans le même laboratoire, sur des échantillons identiques analysés le même jour.
Elle permet de vérifier si la méthode est stable à court terme.
 Fidélité intermédiaire: Correspond à la capacité d’une méthode analytique à donner des résultats
proches lorsque des mesures sont réalisées par des personnes différentes, à des moments
différents, ou avec des équipements différents, mais toujours dans le même laboratoire. Elle est
utile pour vérifier la fiabilité d’une méthode dans des conditions réalistes d’utilisation. 40
b. Types de fidélité:
 Reproductibilité (inter-laboratoire) : Correspond à la capacité d’une méthode
analytique à fournir des résultats proches lorsque des mesures sont réalisées dans
des laboratoires différents, par des personnes différentes, en utilisant des
équipements différents et à des moments différents, sur des échantillons
identiques. Elle montre si la méthode reste fiable malgré des variations
importantes.
La répétabilité et la reproductibilité sont exprimées le coefficient de variation (CV)
calculé sur plusieurs répétitions.
Exemple : deux laboratoires différents analysent le même échantillon avec la même
méthode.
41
c. Evaluation de la répétabilité et la reproductibilité:
La répétabilité et la reproductibilité sont exprimées en coefficient de variation (CV) calculé sur
plusieurs répétitions.
• xi représente chaque valeur individuelle,
• μ est la moyenne des valeurs obtenues,
• n est le nombre total de valeurs,
Avec
• SD: l’écart type des réponses des blancs ou
des échantillons de faible C.

La valeur acceptable du coefficient de variation dépend du type d’analyse et du domaine

d'application. En général :
 Pour les analyses chimiques : un CV ≤ 5 % est souvent considéré comme très bon.
 Jusqu'à 10 % : acceptable pour de nombreuses méthodes, surtout en biologie.
 Entre 10 % et 20 % : peut être toléré pour des matrices complexes ou des concentrations très
faibles.
 Supérieur à 20 % : généralement considéré comme trop élevé.
42
 d. Exemple de calcul de répétabilité (CV%)
Enoncé: Pour déterminer la répétabilité d'une méthode, nous avons réalisé trois répétitions (N=3) à
deux concentrations différentes de l’aflatoxine M1 (référence) en HPLC. Après avoir obtenu les aires
de pic, nous avons calculé le coefficient de variation.

Solution pure 3µg/kg 5 µg/kg

Répétition N=3 N=3

Moyenne (Aires de pics) 49288 73349

Ecart type 1523 910

CV % 3,09% 1,24 %

• Les Coefficients de variation sont inferieurs a 5% (Acceptable puisque nous avons analysé une
solution chimique pure) ce qui signifie que la réponse à une concentration donnée est identique
durant le même jour, ca confirme aussi que le processus d’extraction est hautement répétable.
43
2.4. Linéarité
a. Définition
La linéarité est la capacité d’une méthode (quantitative) à obtenir des résultats
directement proportionnels à la concentration de l’analyte dans un échantillon, sur
une plage donnée. Cette proportionnalité est évaluée par le coefficient de
détermination qui doit être proche de 1.
b. Evaluation de linéarité
[Link]éparer au moins 4 niveaux de concentration couvrant toute la plage attendue.
[Link] chaque niveau au moins en double.
[Link] la courbe réponse en fonction de la concentration
[Link] une régression linéaire (y = a·x + b).
[Link] le coefficient de détermination (R²).
44
b. Exemple concret (analyse d’une mycotoxine)
Enoncé: Afin d’évaluer la linéarité d’une méthode, quatre concentrations différentes de l’aflatoxine
M1 (référence) ont été injectées dans le système HPLC. Les aires des pics correspondants ont été
mesurées, puis une courbe d’étalonnage a été tracée afin de déterminer le coefficient de détermination
R2
Concentration en µg/L 1 3 5 l0
Conclusions:
Aire de pic 11220 47397 71707 160011
 La relation entre la quantité injectée
et la réponse du détecteur est 180000
160000
proportionnelle. 140000
y = 16379x - 5217
R² = 0,9968
120000

Air de pic
 Le coefficient de détermination 100000
80000 Air de pic
obtenu pour M1 est R² = 0,9968. 60000 Linear (Air de pic)
40000

 Ce résultat confirme la linéarité de 20000

0
la méthode dans la plage de 0 2 4 6 8 10 12

concentrations étudiée. Concentration en µg/L

Courbe de linéarité d’une mycotoxine 45

2.5. Plage de travail (ou intervalle de linéarité)

a. Définition :
La plage de travail est l’intervalle de concentrations pour lequel une méthode analytique est
considérée comme valide, c’est-à-dire :
• Linéaire : la réponse du système (signal analytique) est proportionnelle à la concentration de
l’analyte.
• Précise : les résultats sont reproductibles à l’intérieur de cet intervalle.
• Exacte : les valeurs mesurées sont proches des valeurs vraies.
Exemple : si une méthode est linéaire, précise et exacte entre 1 µg/mL et 100 µg/mL, cette plage est
considérée comme sa plage de travail.

46
2.5. Plage de travail (ou intervalle de linéarité)
b. Evaluation de la plage de travail
 Préparation d’étalons : préparer au moins 5 à 7 solutions standards couvrant
l’éventail de concentrations visé.
 Analyse : mesurer les réponses analytiques (ex. : absorbance, intensité de signal…).
 Évaluation de la linéarité :
1. Tracer la courbe concentration vs. réponse.
2. Calculer la droite de régression (équation et R²).
3. Critère courant : coefficient de corrélation R² ≥ 0,99.
 Conditions pour valider la plage de travail :
• Linéarité confirmée sur l’intervalle.
• Précision intra- et inter-journalière acceptable.
• Justesse correcte (récupérations entre 98 % et 102 %, selon les guides).
47
2.6. Limite de détection (LOD) et de quantification (LOQ)
a. La limite de détection LOD
La LOD est la plus faible quantité de substance à analyser que la méthode peut détecter, elle est
généralement exprimée comme une valeur de concentration et calculée en utilisant des méthodes
statistiques,
 LOD avec courbe d’étalonnage:  LOD sans courbe d’étalonnage:

 LOD: Limite Of Détection

 a: pente de la courbe d’étalonnage
 SD: Ecart type des réponces de blancs ou des
échantillons de faible C
Conclusion:
La pente a ajuste la sensibilité de la méthode. Une pente plus faible signifie que pour une même
concentration d'analyte, la réponse mesurée sera plus faible, et donc la LOD et la LOQ seront plus
élevées. Inversement, une pente plus élevée indique une meilleure sensibilité.
48
b. La limite de quantification (LOQ)
La LOQ ou limite de dosage est la plus faible quantité de substance à analyser que la méthode
peut quantifier avec une incertitude connue, dans les conditions expérimentales de la méthode
considérée.
 LOQ avec courbe d’étalonnage:  LOQ sans courbe d’étalonnage:

 LOD: Limite Of Détection

 a: pente de la courbe d’étalonnage
 SD: Ecart type des raiponces de blancs
ou des échantillons de faible C

Conclusion:
La pente a ajuste la sensibilité de la méthode. Une pente plus faible signifie que pour une même
concentration d'analyte, la réponse mesurée sera plus faible, et donc la LOD et la LOQ seront plus
élevées. Inversement, une pente plus élevée indique une meilleure sensibilité.
49
c. Exemple de calcul de (LOD) et (LOQ)
Enoncé: Dans une analyse chromatographique pour détecter l'aflatoxine M1 dans un
échantillon du lait, l'écart-type du bruit de fond (SD) est mesuré à 0,05 et la pente de la
courbe de calibration (a) est de 0,01.
• Calculer la (LOD) et la (LOQ) de l'aflatoxine M1.
Solution:
En utilisant la formule de la LOD, nous avons :
Donc, la LOD est 15 ng/mL.

Pour calculer la LOQ, nous avons :

Donc, la LOQ est 50 ng/mL.

Conclusion: Cela signifie que l'aflatoxine M1 peut être détectée à partir de 15 ng/mL et
quantifiée de manière fiable à partir de 50 ng/mL.
50
2.7. Robustesse
a. Définition
La robustesse est la capacité d’une méthode analytique à rester fiable et précise,
même si on change légèrement certaines conditions de l’analyse (température, pH,
composition du solvant, Instrument, Débit de la phase mobile, etc…)
b. Evaluation de la robustesse

La robustesse d’une méthode s’évalue en modifiant légèrement un paramètre

critique et en comparant les résultats obtenus. Si la variation reste inférieure à 2 %, la
méthode est jugée robuste. Cette variation est calculée à l’aide de la formule :

 Cmodifiée : Concentration mesurée après une

légère variation des conditions expérimentales
 Cinitiale: Concentration mesurée dans les
conditions normales (référence)
51
c. Exemple concret

Énoncé : Vous analysez la concentration la l’aflatoxine M1par chromatographie liquide à haute

performance (HPLC) sous des conditions normales à 30 °C. Après avoir modifié la température à 25
°C, vous obtenez la concentration suivante :
 Concentration normale à 30 °C : 0,80 ng/mL
 Concentration après modification à 25 °C : 0,79 ng/mL
Évaluez la robustesse de la méthode en calculant la variation relative de la concentration.

Solution: En utilisant la formule de la robustesse , nous avons :

La variation de 1,25 % est inférieure à 2 %, ce qui signifie que la méthode est robuste pour une
variation de température dans cette plage.
52
2.8. Stabilité

a. Définition
La stabilité d'une méthode analytique est la capacité de cette méthode à produire des résultats
fiables et cohérents lorsque les échantillons, les réactifs ou les solutions étalons sont soumis à
différentes conditions de conservation.
b. Evaluation de la stabilité: Approche basée sur la concentration
La stabilité d’une méthode est évaluée en soumettant les échantillons, réactifs ou standards à
des conditions variables telles que le temps, la température, la lumière ou l’humidité.
Ensuite, les échantillons sont analysés à nouveau, et les concentrations obtenues sont
comparées à celles mesurées initialement. La méthode est considérée stable si ces facteurs
n'entraînent pas de variations significatives des concentrations au fil du temps, généralement
inférieure à 5 %.
53
 Exemple concret:

Enoncé: Un laboratoire souhaite évaluer la stabilité du standard de la mycotoxine B1 utilisé

pour l’analyse des échantillons du mais. La solution standard, préparée à une concentration
de 0,50 µg/L, est conservée à 4 °C à l’abri de la lumière. Après 20 jours de stockage, une
nouvelle analyse par chromatographie révèle une concentration de 0,46 µg/L.
Calculez le pourcentage de variation par rapport à la concentration initiale, et concluez sur la
stabilité du standard.
Solution:

En utilisant la formule ci-dessus, nous avons:

La variation est de 8 %, ce qui est supérieur à 5 %. La méthode n’est donc pas stable
après 20 jours de stockage à 4 °C. Les échantillons doivent être analysés plus tôt ou
conservés dans de meilleures conditions. 54
d. Approche basée sur la réponse instrumentale

L'objectif principal de cette approche est de suivre l’évolution de la réponse brute de l’instrument
pour une même solution sur une période donnée. Cela se fait sans recalculer la concentration de
l’échantillon à chaque mesure, mais en observant simplement les variations de la réponse mesurée
au fil du temps. En général, une méthode est considérée stable si la réponse mesurée se situe entre
95 % et 105 % de sa valeur initiale.
Techniques concernées :
UV-Visible : Absorbance
HPLC : Aire du pic chromatographique
SAA / ICP : Intensité du signal atomique
Pour évaluer la stabilité dans ce cas, on utilise la formule suivante:

Exemple concret: (Voir TD)

55
Exercice 1 : Étude de spécificité/ Sélectivité

La vitamine B9, aussi appelée acide folique, est une vitamine essentielle au bon
fonctionnement de notre organisme. Elle joue un rôle important dans la synthèse de
l’ADN et la formation des cellules. On la trouve naturellement dans de nombreux
aliments comme les légumes verts, les céréales, ou encore les légumineuses. On
souhaite doser cette vitamine dans un aliment à l’aide d’une méthode HPLC-DAD.
Cependant, d’autres composés présents, comme les sucres ou d’autres vitamines,
semblent apparaître dans la même zone de rétention que la vitamine B9, ce qui
complique l’analyse.

1. Proposez une stratégie expérimentale pour tester la spécificité.

2. Pourquoi est-il important de tester la spécificité d’une méthode analytique

56
Corrigé de l’exercice 1: Étude de spécificité/ Sélectivité

1. Proposez une stratégie expérimentale pour tester la spécificité.

Pour vérifier que la méthode mesure uniquement la vitamine B9 sans interférence :
 Injecter un standard pur de vitamine B9 → pour connaître son temps de rétention.
 Injecter la matrice enrichie en B9 (échantillon + B9 ajouté) → le pic de B9 doit augmenter sans
changer de forme ou de position.
 Injecter la matrice seule (sans ajout de B9) → pour voir si d'autres substances donnent un pic au
même temps de rétention.

2. Pourquoi est-il important de tester la spécificité d’une méthode analytique ?

Parce que la spécificité permet de s’assurer que la méthode mesure uniquement la vitamine B9,
même en présence d'autres substances comme le sucre ou d'autres vitamines. Sans spécificité, on
risque de mesurer autres choses que la vitamine B9, ce qui rend les résultats faux ou peu fiables.
57
Exercice 2 : Évaluation de la justesse ou l’exactitude

Le bisphénol A (BPA) est un composé chimique controversé, souvent utilisé dans les plastiques, et
potentiellement dangereux pour la santé. Un laboratoire souhaite mettre au point une méthode fiable
pour mesurer la quantité de BPA dans des bouteilles d’eau en plastique. Pour valider la justesse de la
méthode, trois niveaux de fortification (ajouts connus de BPA) sont réalisés sur des échantillons d’eau
dépourvus initialement de BPA. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous :

Échantillon Quantité de BPA ajoutée (mg/L) Quantité de BPA mesurée (mg/L)

A 0,50 0,43
B 5,00 4,52
C 15,00 13,50
1. Calculez le taux de recouvrement (%) pour chaque échantillon.
2. Évaluez la conformité de chaque taux de recouvrement par rapport aux plages recommandées par
(AOAC/FDA).
3. Donnez une conclusion globale sur la justesse de la méthode aux trois niveaux de concentration. 58
Corrigé de l’exercice 2: Évaluation de la justesse ou l’exactitude
1. La formule utilisée pour calculer le taux de recouvrement:

 Pour l’échantillon A nous avons:

Cajoutée = 0,50 mg/L et Cmesuré = 0,43 mg/L, donc

 Pour l’échantillon B nous avons:

Cajoutée = 5 mg/L et Cmesuré = 4,52 mg/L, donc

 Pour l’échantillon B nous avons:

Cajoutée = 15 mg/L et Cmesuré = 13,5 mg/L, donc

2. Les taux de recouvrement mesurés pour les échantillons A, B et C sont de 86,0 %, 90,4 % et 90,0 %
respectivement, valeurs qui s’inscrivent dans les intervalles d’acceptabilité définis par l’AOAC et la
FDA, soit 70-120 % pour les concentrations < 1 mg/L, 80-120 % pour 1-10 mg/L et 85-115% pour 10-
100 mg/L respectivement.

3. On conclue que les trois taux de recouvrement sont conformes aux plages recommandées par les
référentiels AOAC/FDA. La méthode peut être considérée comme juste pour l’analyse du bisphénol A dans
l’eau minérale aux concentrations testées.
59
Exercice 3: Evaluation de la fidélité

Afin d’évaluer la reproductibilité d’une méthode de dosage par HPLC, un test collaboratif est réalisé
entre deux laboratoires indépendants : Laboratoire A et B. Un même échantillon contenant un principe
actif avec une concentration initial de 100mg/L est transmis à chacun des laboratoires. Dans chaque
site, l’échantillon est analysé trois fois par le même opérateur, le même jour, en utilisant le même lot de
réactifs et des conditions opératoires identiques. Les résultats obtenus, exprimés en mg/L, sont présentés
dans le tableau ci-dessous:
Laboratoire Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
A 98.4 98.7 98.6
B 99.1 99.3 99.2
1. Calculez la moyenne (µ) et l’écart-type (SD) pour chaque laboratoire.
2. Calculez le coefficient de variation (CV) pour chaque laboratoire.
3. Interprétez la répétabilité (fidélité intra-laboratoire) à partir des CV.
4. Calculez la moyenne globale des 6 mesures et l’écart-type global.
5. Calculez le coefficient de variation global (CV inter-laboratoire).
6. Discutez la reproductibilité inter-laboratoire de la méthode. 60
 Corrigé de l’exercice 3: Evaluation de la fidélité

1. Calcul de la moyennes (µ) et de l’écart-type (SD) pour chaque laboratoire en utilisant les formules
suivantes:

Et
 Laboratoire A :

- Moyenne = 98.57 mg/L

- Écart-type : = 0.153 mg/L

 Laboratoire B :
- Moyenne = 99.20 mg/L
- Écart-type = 0.100 mg/L

2. Calcul le coefficient de variation (CV) pour chaque laboratoire en utilisant la formule ci-dessous

 Laboratoire A :

 Laboratoire B :
61
Suite du corrigé de l’exercice 3: Evaluation de la fidélité

3. Interprétation de la répétabilité (fidélité intra-laboratoire): Le CV% du labo B (0,10%) est inférieur à

celui du labo A (0,15%), ce qui signifie que le laboratoire B est plus répétable, c’est-à-dire que ses
résultats sont plus cohérents entre eux.

4. Moyenne et écart-type globaux (inter-laboratoires)

 Moyenne globale (μglobale) :
 Ecart type globale:
xᵢ xᵢ − μ (xᵢ − μ)²
98.4 98.4 − 98.88 = -0.48 (-0.48)² = 0.2304
98.6 -0.28 0.0784
98.7 -0.18 0.0324
99.1 +0.22 0.0484
99.3 +0.42 0.1764
99.2 +0.32 0.1024
62
Suite du corrigé de l’exercice 3 : Evaluation de la fidélité

D’après le tableau précédent nous avons :

Alors, la formule de l’écart-type globale (n = 6) s’écrit:

5. Coefficient de variation global (inter-laboratoire) :

6. Le coefficient de variation global, très faible (0,374 %), témoigne d’une excellente reproductibilité
de la méthode HPLC. Cela confirme que la méthode est fiable et performante, même lorsqu’elle est
appliquée dans des environnements de travail différents.
63
Exercice 4 : Etude de la linéarité

Dans le cadre d’un contrôle qualité, un laboratoire cherche à valider une méthode de dosage
du Carbaryl, un pesticide fréquemment utilisé pour protéger les fraises contre les insectes. La GC-
FID a été utilisée pour de doser ce composé dans des extraits de fraises.

Avant de pouvoir utiliser cette méthode de manière fiable, il est nécessaire d’en vérifier la
linéarité. Pour ce faire, les analystes préparent plusieurs solutions étalons à différentes
concentrations à partir d’une solution mère de Carbaryl. Chaque étalon est ensuite injecté dans le
chromatographe, et l’aire du pic correspondant est enregistrée. Le tableau ci-dessous présente les
concentrations des étalons ainsi que les aires des pics obtenus.
Concentration (µg/Kg) Aire du pic (UA)
10 145
20 305
40 612
60 920
80 1225 64
Exercice 4 : Etude de la linéarité
1. Tracer la courbe d’étalonnage (Aire du pic en fonction de la concentration).
2. Déterminer l’équation de la droite de régression linéaire et déterminer le coefficient de détermination
R².
3. La méthode est-elle bien linéaire ? Justifier votre réponse ?
4. Calculer la réponse relative (aire/concentration) pour chaque point. Que peut-on dire de cette
réponse et qui ce que ca représente?
5. Donner deux raisons qui peuvent faire que la méthode ne soit pas linéaire.
6. Si un extrait de fraises traité donne une aire de pic égale à 980 UA, quelle est la concentration en
Carbaryl dans cet échantillon ? 1600

1400
y = 15.153x + 2.1014
Corrigé de l’exercice 4 : 1200 R² = 0.9997

Aire du pic (UA)

1000
1. La courbe d’étalonnage
800

2. L’équation de la courbe y= ax+ b = 15,153x + 2,1014 600

Le coefficient de détermination R² = 0,9997

400

200

0
0 20 40 60 80 100 120
Concentration en µg/Kg

Courbe de linéarité du Carbaryl

65
Suite du corrigé de l’exercice 4

3. Oui la méthode est bien linéaire parce que la courbe obtenue entre la concentration en
Carbaryl et l’aire du pic est une droite. De plus, et le coefficient de détermination R² = 0,9997
est très proche de 1.
4. Calcul de la réponse relative:
C (µg/Kg) Aire Aire/C
10 145 14,5
20 305 15,25
40 612 15,3
60 920 15,33
80 1225 15,31
100 1503 15,03
• Selon les résultats du tableau ci-dessus, la réponse relative est assez constante ce qui
confirme la linéarité de cette méthode. Elle représente la pente de la courbe.
66
Suite du corrigé de l’exercice 4

5. La non-linéarité peut être causée par plusieurs facteurs. Par exemple:

 Lorsque les concentrations sont trop élevées, le détecteur peut être saturé et ne plus
répondre correctement, ce qui fausse les résultats.
 Une autre cause fréquente est simplement une erreur lors de la préparation des solutions
étalons : un petit oubli ou une mauvaise dilution peut suffire à perturber toute la courbe.
6. Nous avons y= 980 UA
On remplace y par sa valeur dans l’équation de la droite et on résout:

67
Exercice 5: Évaluation de la stabilité

Dans un laboratoire d’analyse pharmaceutique, un technicien souhaite s’assurer que la solution de

paracétamol qu’il utilise en routine reste stable dans le temps. Pour cela, il prépare une solution de
paracétamol à 10µg/mL, dissoute dans de l’eau distillée. La solution est conservée à température
ambiante, à l’abri de la lumière, pour éviter toute dégradation due à la chaleur ou à la photolyse. Afin de
suivre la stabilité de cette solution, l’analyste mesure l’absorbance à 243 nm, qui correspond au maximum
d’absorption (λ max) du paracétamol. Les mesures sont effectuées à plusieurs moments pendant une
période de 24 heures. Le tableau ci-dessous regroupe les résultats obtenus :

Temps (heures) Absorbance mesurée

1. Calculer le pourcentage % de réponse restante à chaque
0h 0,820
temps par rapport à t = 0 h. 2h 0,818
2. Interpréter la stabilité de la méthode durant les 24 h. 4h 0,814
3. Quelle serait la conséquence si la réponse tombait à 85 % ? 6h 0,811
24 h 0,780
68
Corrigé de l’exercice 5:

1. Calculer le % de réponse restante à chaque temps par rapport à t = 0 h.

Nous utilisons la formule suivante pour calculer la réponse restante à chaque temps:

À t = 0 h (référence) :

Àt=2h:

Àt=4h:

Àt=6h:

À t = 24 h :
69
Suite du corrigé de l’exercice 5:

2. D’après les résultats de la question 1, on constate que la variation de l'absorbance reste faible pendant
24 heures. À la fin de cette période, la réponse reste à 95,1 % de sa valeur initiale (à t = 0 h), ce qui
montre que la méthode semble stable, car la diminution de l'absorbance est faible (moins de 5 %). Cette
stabilité est acceptable, surtout si l’objectif est de suivre la méthode sur une période de 24 h. Le
paracétamol ne subit pas de dégradation significative sous les conditions expérimentales données.

3. Si l’absorbance tombait à 85 % de sa valeur initiale, cela indiquerait une instabilité significative de la

solution. Cette diminution pourrait être due à :
 Une dégradation chimique du paracétamol dans la solution (par exemple : oxydation, hydrolyse, etc.) ;
 Des conditions de stockage inappropriées telles qu’une température trop élevée ou une exposition à la
lumière (photolyse).

70
71
1. Étapes générales d’une validation

 Détermination du but de la méthode

 Choix du protocole expérimental
 Rédaction du protocole de validation
 Réalisation des essais expérimentaux
 Évaluation des performances de la validation
 Traitement des résultats obtenus
 Documentation et conclusion: Rapport
 Suivi post-validation (monitoring)

72
1.1. Détermination du but de la méthode
Avant toute expérimentation, il est crucial de définir clairement l’objectif de la méthode
à valider:
 Identifier la substance cible (dosage d’un principe actif, impureté, contaminant,
etc.);
 Spécifier le type de la méthode à appliquer (qualitative ou quantitative);
 Caractériser la matrice à examiner (solide, liquide, biologique, alimentaire, etc.);
 Déterminer la plage de concentration visée.
 Quelles sont les normes applicables ? (ex. : ISO17025, ICH Q2)
But : s'assurer que la méthode est adaptée à l'usage prévu.

Exemple : doser 5 mg/L d’un pesticide dans une eau potable avec une méthode
HPLC.
73
1.2. Choix du protocole expérimental
Cette étape consiste à élaborer un plan de validation rigoureux :
a. Sélection du matériel et des réactifs
Il est essentiel d’identifier précisément les équipements et substances utilisés lors de la validation :
 Appareils : chromatographe HPLC, GC-MS, balance analytique, etc.
 Matériel spécifique : type et marque de colonne, détecteur, système d’injection.
 Réactifs et solvants : leur nature, leur qualité, et leur lot doivent être documentés.
Exemple : lors de la validation d’une méthode HPLC, il convient de spécifier la colonne utilisée, la
composition de la phase mobile, le débit, la température, et le détecteur employé.
b. Détermination du nombre d’échantillons et de niveaux de concentration
Le protocole doit aussi indiquer :
 Le nombre de répétitions nécessaires pour évaluer la répétabilité et la reproductibilité,
 Les différentes concentrations testées pour couvrir l’ensemble du domaine analytique (faible, moyen, élevé).
Exemple : pour valider la linéarité d’une méthode, on prépare en général entre 5 et 7 étalons couvrant une
gamme de concentrations croissantes.
74
1.2. Choix du protocole expérimental
c. Répartition des essais dans le temps
Afin d’évaluer la reproductibilité de la méthode, il est essentiel de planifier la réalisation des essais dans le
temps. Il convient de déterminer si :
 Les essais seront effectués le même jour ou sur plusieurs jours,
 Ils seront réalisés par un seul opérateur ou par plusieurs analystes,
 Des périodes différentes permettront d’observer la stabilité des performances analytiques.

d. Identification des sources de variabilité à étudier

Dans le cadre de la validation, il est important de vérifier la robustesse de la méthode en testant les
principaux facteurs de variation :
 Le changement d’opérateur,
 L’utilisation de différents équipements,
 Les conditions environnementales (température, humidité…).
75
1.3. Rédaction du protocole de validation:
 Les objectifs de la validation: Expliquer clairement pourquoi la validation est entreprise (ex. : mise en
conformité réglementaire, développement d’une nouvelle méthode, amélioration d’une méthode existante).
 Les paramètres à valider: Préciser les performances attendues et les critères à évaluer
(Exactitude, fidélité, spécificité, linéarité, LOD, LOQ, robustesse, etc…).
 Les conditions expérimentales: Détailler les conditions opératoires comme types des équipements utilisés
(HPLC, spectrophotomètre, etc.), type de colonne, nature des solvants, température, durée, mode d’injection, etc.
 Le nombre d’essais à réaliser: Indiquer le plan d’expérimentation tel que le nombre de séries, nombre de
répétitions par niveau de concentration, étalonnages, etc.
 La méthode de traitement statistique des résultats: Calcul de moyennes, écart-type, courbes de calibration,
régression linéaire, calculs d’incertitude, etc.
 La répartition responsabilités (qui réalise quoi): Désigner clairement les opérateurs, les responsables de la
validation, les superviseurs et les personnes en charge de l’approbation finale.

N.B: Le protocole doit obligatoirement être approuvé par le service assurance qualité du laboratoire avant de
commencer les essais, afin d’assurer la conformité avec les normes (ex. : ISO 17025).
76
1.4. Réalisation des essais expérimentaux
Elle vise à tester concrètement la méthode sur des échantillons représentatifs, dans des conditions
contrôlées. Ces types d’échantillons à analyser incluent généralement :
 Les standards (solutions étalons) : Solutions préparées à partir de matériau de référence
certifiés, à des concentrations connues. Ils permettent d'établir la courbe d'étalonnage et
d’évaluer la justesse et la fidélité de la méthode.
 Les blancs (solvant sans matériau de référence) : Permettent de détecter toute contamination
croisée ou tout signal parasite provenant des réactifs, du solvant ou du matériel.
 Les échantillons fortifiés : Echantillons auxquels une quantité connue de matériau de
référence est ajoutée. Ils permettent de vérifier la récupération, l’exactitude et la linéarité dans
une matrice réelle.
 Les échantillons réels non fortifiés : Permettent d'évaluer la performance de la méthode sur
des matrices complexes, dans des conditions similaires à celles de l’analyse en routine.
NB : Tous les résultats obtenus doivent être consignés dans des cahiers de laboratoire officiels,
avec les conditions expérimentales, les observations, les calculs et les résultats finaux. 77
1.5. Évaluation des performances analytiques
Une fois les essais expérimentaux réalisés, il est essentiel de procéder à l’évaluation rigoureuse des
performances de la méthode analytique et les comparées aux critères fixés dans le protocole. Si un ou plusieurs
paramètres ne respectent pas les seuils fixés :
a. Si un paramètre échoue
 Identifier la cause possible :
 Erreur de préparation des échantillons ?
 Dysfonctionnement ou mauvais réglage de l’appareil ?
 Méthode inadéquate pour le type de matrice ?
 Corriger et ajuster :
 Revoir les étapes critiques (préparation, calibration, temps d’analyse, etc.
 Réaliser à nouveau les essais après correction.
b. Cas d’échec multiple
Si plusieurs paramètres échouent malgré les ajustements, la méthode est considérée non validée.
Dans ce cas, il peut être nécessaire de revoir le protocole, ou de changer la méthode ou les conditions
expérimentales. 78
1.6. Traitement des résultats obtenus

Une fois les essais réalisés, les données brutes sont analysées statistiquement pour :
a. Calculs statistiques de base
 Calculer les moyennes,
 Déterminer l’écart-type (SD),
 Calculer le coefficient de variation (CV).
b. Évaluer les erreurs
 Erreurs systématiques : déviation constante dus à un appareil mal calibré ou à une
méthode inadaptée (étalon mal préparé). Elles affectent l’exactitude,
 Erreurs aléatoires : fluctuations imprévisibles liées à des incertitudes expérimentales
(ex. : petites variations d’injection). Elles affectent la fidélité.
c. Tracer des courbes d’étalonnage
 Courbe d’étalonnage : indispensable pour les méthodes quantitatives.
d. Outils statistiques utilisés
 Régression linéaire : pour modéliser les relations linéaires
 ANOVA (Analyse de la variance) : Pour vérifier si les variations entre jours sont
significatives.
 Test de Student, test de Fisher : pour évaluer la significativité des écarts entre groupes.

N.B: L’objectif est de produire des résultats interprétables, représentatifs et comparables.

79
1.7. Documentation et conclusion: Rapport

La dernière étape consiste à rédiger un rapport de validation complet qui regroupe toutes les
données, observations et interprétations.
a. Contenu obligatoire du rapport
 Contexte de la méthode: Objectifs, domaine d’application, type d’analyse, matrice étudiée.
 Description du protocole expérimental: Méthodologie, paramètres validés, conditions
opératoires, matériel utilisé.
 Résultats expérimentaux: Données brutes et résultats traités (moyennes, écarts-types, CV…).
 Interprétation statistique: Outils utilisés (régression, ANOVA, etc.), comparaison aux critères
d’acceptation.
 Conclusion finale: Méthode validée ou non, limites identifiées, recommandations éventuelles.

80
b. Vérification qualité et archivage
Le rapport doit être :
 Relu, validé et signé par un responsable qualité,
 Archivé de façon sécurisée,
 Disponible en cas d’audit (interne ou externe).
c. Rôle réglementaire du rapport
Le rapport constitue une preuve documentaire officielle :
 De la validité de la méthode,
 Du respect des normes en vigueur (ex. ISO 17025),
 De la traçabilité et reproductibilité des résultats.
NB. Le rapport de validation constitue une preuve réglementaire officielle de la performance et de
la fiabilité de la méthode. Il garantit la traçabilité, la conformité aux exigences normatives (ex.
ISO/IEC 17025) et la crédibilité scientifique des résultats produits.

81
d. Exigences qualité et administratives du rapport
Le rapport doit être vérifié et approuvé par l’AQ et au minimum inclure les éléments suivants :
 Une numérotation unique du document (identifie clairement le rapport dans le système
documentaire)
 Le nom et l’affiliation de l’auteur; du/des vérificateur(s), des approbateurs (au minimum un
responsable CQ et un responsable AQ).
 La référence au protocole de validation (Indiquer où les données originales sont archivées et
accessibles.)
 Nom de la méthode, son principe et l’utilisation qui en sera faite.
 La description détaillée de la méthode ou une référence à un document (Ex. Norme, article
scientifique…)
 Le matériel et les équipements utilisés durant la validation avec références pour la traçabilité
 La référence aux données brutes (Indiquer où les données originales sont archivées et accessibles)

82
1.8. Suivi post-validation (monitoring)

Même après validation, une méthode doit être surveillée régulièrement pour garantir la
stabilité de ses performances dans le temps.
a. Vérification périodique des performances
 Contrôles réguliers (ex. : fidélité, justesse),
 Revalidation partielle en cas d’écart ou de changement critique,
b. Surveillance continue
 Utilisation de cartes de contrôle et d’échantillons de référence,
 Détection rapide des dérives analytiques (modification des performances d’une
méthode, qui peut fausser les résultats sans que cela soit immédiatement visible)
c. Adaptation du protocole
 Si changement de matériel, réactif ou matrice,
 Mise à jour nécessaire avec réévaluation de certains paramètres,
83