UNIVERSITE DE DOUALA

ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE L’ENSEIGNEMENT TECHNIQUE

DEPARTEMENT DE CHIMIE INDUSTRIELLE

COURS TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES

Année académique 2024-2025 1

 Chap. I : LABORATOIRES DE MICROBIOLOGIE

A- REGLES DE SECURITES

A savoir avant de commencer à travailler

 Chaque collaborateur doit être capable de répondre aux questions suivantes :
- Où se trouve la sortie de secours du laboratoire ?
- Où se trouvent les différents chemins de fuite et les escaliers d’évacuation ?
- Comment appeler du secours et qui appeler ?
- Comment déclencher une alarme incendie ?
- Où se trouvent les boutons d’arrêt d’urgence du gaz naturel et de l’électricité ?
- Où se trouvent les moyens d'extinction (extincteurs, couvertures anti-feu, seaux de sable) ?
- Que faire si un liquide se répand sur le sol ou dans les canalisations ?
- Où se trouvent la douchette oculaire et la douche de secours ?
- Où se trouve la pharmacie la plus proche ?
- Quels sont les laboratoires équipés de détecteurs spéciaux et comment est-on alerté ?
- Où sont affichés les N° de téléphone d’urgence?
- Quelles sont les chapelles équipées de détection incendie ?
- Où peut-on trouver un bunker pour les réactions sous haute pression ?
- Que faire si on prévoit une réaction sans surveillance ?
- Comment trouver les données de sécurité sur un produit chimique ?

 Chaque étudiant doit scrupuleusement respecter les règles de sécurités suivantes

-Porter une blouse blanche en coton. La blouse doit être boutonnée.

- Nouer les cheveux longs. S’asseoir pour manipuler et pour observer au microscope.
- Se laver les mains avant et après chaque manipulation.
- Eviter de manger, boire, bavarder ni se promener dans le Laboratoire
- Ne rien poser sur la paillasse
- Connaître les différents pictogrammes

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A faire pendant et après le travail
- Désinfecter la paillasse.
- Éviter les courants d'air ; limiter les déplacements ; éviter de parler.
- Aucun pipetage à la bouche.
- Ne pas porter ses doigts ou tout objet à sa bouche. Ne pas manger, boire, fumer.
- Eviter de mettre tout objet personnel en contact avec les bactéries.
- Marquer soigneusement les lames, tubes, boîtes, etc... Avec un feutre indélébile.
- Les manipulations seront faites dans un rayon de 10 cm autour de la flamme du bec Bunsen.
- Ne pas éteindre la flamme sans couper l'arrivée du gaz.
- Ne pas laisser à proximité de la flamme des objets ou liquides inflammables (papiers, alcool,
etc...).
- Désinfection.
· Paillasse : alcool 70° (ou eau de Javel à 3° chlorométriques) à l'aide d'un papier jetable.
· Peau contaminée : laver au savon et à alcool 70°.
· Instruments (pipette Pasteur, anse, etc…) : flambage.
-Aucun instrument (pipette, anse) ni objet contaminé ne doit être posé directement sur
la paillasse.
- Flambage des instruments et de l’orifice des tubes : sert à stériliser localement tout objet
métallique ou en verre.

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Ouvrir la virole du bec Bunsen. Le flambage se fait dans le cône bleu de la flamme.
- Orifice des tubes : flamber 1 à 2 secondes. A faire après chaque ouverture et avant chaque
fermeture de tube.
1. Anse de platine : tenir l’anse verticalement ; placer la boucle métallique dans la
flamme ; attendre qu’elle devienne rouge. La maintenir 5 secondes. A faire avant et
après chaque utilisation.
2. Pipette Pasteur : La pipette est utilisée soit boutonnée (fermée) pour prendre une
colonie, soit ouverte pour prélever un liquide. Il faut l’ouvrir avant le flambage. Tenir
la pipette horizontalement et passer lentement la partie effilée de la pipette 5 à 6 fois
dans la flamme.
Laisser refroidir anses et pipettes environ 10 secondes avant tout contact avec un
liquide, une colonie bactérienne…
Ne jamais passer du plastique ou la pince en bois dans la flamme.

B- NIVEAUX DE CONFINEMENT

Niveau de confinement 1

Ce niveau de confinement s’applique au laboratoire de base pour la manipulation des agents

du groupe de risque 1. Le niveau de confinement 1 n’exige aucune caractéristique de
conception particulière autre que celles propres aux laboratoires fonctionnels et bien conçus.
Il n’est pas nécessaire de prévoir des enceintes de sécurité biologique. Les manipulations
peuvent se faire sur des paillasses à découvert. Les pratiques normales des laboratoires de
microbiologie de base assurent le confinement nécessaire.

Agents du groupe de risque 1 :

Agents biologiques peu susceptibles d’infecter une personne saine ou un animal sain. Le
risque pour l’utilisatrice, l’utilisateur et la collectivité est faible.

Niveau de confinement 2
Ce niveau de confinement convient à la manipulation des agents du groupe de risque 2. Les
principaux risques d’exposition associés à des organismes devant être manipulés en niveau de
confinement sont l’ingestion, l’inoculation et l’exposition de membranes muqueuses. Les
agents pathogènes manipulés dans un niveau de confinement 2 ne sont généralement pas
transmissibles par voie aérienne, mais il est important d’éviter la production d’éclaboussures
et d’aérosols qui peuvent se répandre sur les paillasses et se révéler dangereux pour la santé
s’ils sont ingérés après contamination des mains. Les principaux dispositifs de confinement
sont les enceintes de sécurité biologique et les centrifugeuses à rotors scellés ou munis de
godets de sécurité. Le personnel doit porter des équipements de protection personnels

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appropriés (gants, sarraus, lunettes,etc.). Des éviers seront prévus pour se laver les mains. Des
installations de
Décontamination (autoclaves) limiteront le risque de contamination environnementale.

Agents du groupe de risque 2 : Agents pathogènes susceptibles de provoquer une maladie

humaine ou animale, mais qui constitue rarement, à priori, un danger grave pour le personnel
de laboratoire, pour la collectivité, pour le bétail ou pour l’environnement. L’exposition en
laboratoire provoque rarement une infection grave. Toutefois, il existe en pareil cas des
mesures préventives et thérapeutiques efficaces, et le risque de propagation est limité. Les
risques sont considérés comme modérés pour les utilisatrices, utilisateurs mais faible pour la
collectivité.

Niveau de confinement 3

Ce niveau de confinement convient à la manipulation des agents du groupe de risque 3. Les

agents pathogènes manipulés en niveau de confinement 3 sont transmissibles par voie
aérienne et ont souvent une dose infectieuse faible, mais suffisante pour provoquer une
maladie grave, voire mortelle. Des barrières primaires et secondaires additionnelles limiteront
la libération d’organismes infectieux en laboratoire et dans l’environnement. Les autres
exigences liées à la prévention de la transmission de tels organismes sont une protection
respiratoire appropriée, des filtres HEPA pour traiter l’air évacué du laboratoire et un accès
strictement contrôlé au laboratoire.

Agents du groupe de risque 3 : Agents pathogènes provoquant généralement une maladie

humaine grave ou ayant de lourdes conséquences économiques, mais qui se transmet rarement
par simple contact de personne à personne et qui cause rarement des maladies ne pouvant pas
être traitées par des agents anti-microbiens ou antiparasitaires. Les risques sont élevés pour les
utilisatrices, les utilisateurs mais faibles pour la collectivité.

Niveau de confinement 4

Ce niveau de confinement extrême autorise la manipulation d’agents transmissibles par

aérosol, comportant souvent une faible dose infectieuse et entraînant des maladies graves,
souvent mortelles, pour lesquelles en général aucun traitement ou vaccin n’est disponible. Il
représente une unité de fonctionnement isolée et, si nécessaire, structurellement indépendante
des autres unités. Le périmètre du laboratoire sera scellé afin d’isoler complètement l’agent
infectieux, et la pression à l’intérieur de l’installation sera négative. L’utilisatrice, l’utilisateur
portera une combinaison de surpression pour être également isolé de l’agent pathogène, ou
bien l’agent sera maintenu dans une enceinte de sécurité biologique de niveau 3. L’air et les
autres effluents produits en laboratoire seront décontaminés.

Agents du groupe de risque 4 : Agents pathogènes entraînant généralement une maladie

humaine très grave, souvent impossible à traiter, facilement transmissible par simple contact,
directement ou indirectement, de personne à personne ou d’un animal à une personne et vice-
versa. Les risques sont élevés pour les utilisatrices, les utilisateurs et pour la collectivité.

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C- MATERIEL ET CONSOMMABLES DES LABORATOIRES DE
MICROBIOLOGIE

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 Etuve

Boîtes de pétri Séquenceur

Râteau

Ecouvillon

Autoclave
Thermocycleur

Bec bunsen Flacon de culture Microscope

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Cas Pratique : Utilisation d’un Microscope

1- Travailler assis, placer le microscope, la crosse devant soi

2- Vérifier l’ouverture du diaphragme, objectif faible grossissement en place et
mouvement libre de la vis micrométrique
3- Allumer la lampe
4- Placer la préparation (lame lamelle) sur la platine, la fixer ou non avec les valets
5- Observer au faible grossissement et régler l’ouverture du diaphragme afin d’obtenir
l’éclairement optimal.
6- Mette au point au faible grossissement en regardant dans l’oculaire :
- Descendre le tube à l’aide de la vis macrométrique au plus près de la préparation
- Remonterlentement la préparation, jusqu’à la mise au point
7- Déplacer délicatement la préparation en la faisant glisser sur la platine pour une
exploration complète
8- Régler la lumière à l’aide du diaphragme

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 9- Passer à un grossissement supérieur ; placer l’objectif plus puissant au dessus de la
lame en tournant le barillet dans le sens des aiguilles d’une montre (vérifier le clic)
10- La mise au point doit pouvoir se faire avec la vis micrométrique si le microscope est
bien réglé. Régler la lumière à l’aide du diaphragme.

Chapitre 2 : TECHNIQUES DE STERILLISATIONS ET DIVERSITE DU MONDE

MICROBIEN

I- TECHNIQUES DE STERILLISATIONS

A/ Stérilisation par la chaleur :

I / Chaleur sèche (oxydation des protéines):

o chauffage direct :

- Effectuer trois ou quatre passages lents des objets à stériliser dans la flamme bleue du bec
Bunsen afin de détruire à sa surface toute matière organique
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- A utiliser pour les objets en verre (pipettes, baguettes de verre...), pour certains objets en
métal (anse, pince), ne convient pas pour le plastique, les objets tranchants, les instruments de
chirurgie délicats ...

o stérilisateurs à air chaud (fours Pasteur, Poupinel, de type Jouan ) :

- Emballer le matériel dans du papier aluminium, les récipients et tubes à col doivent être
bouchés avec du coton cardé

- Les spores et germes sont détruits en chaleur sèche, par un chauffage de : 4 heures à 140
°C ; 2 heures 30 à 160°C ; 30 min à 180°C

- A utiliser pour la verrerie, porcelaine et instruments métalliques (indispensable pour les

parties des objets qui ne peuvent pas être atteintes par la flamme)

- Ne convient pas pour les objets en matière plastique ou caoutchouc ou objets délicats.

II / Chaleur humide (dénaturation des protéines) :

o autoclavage (méthode de stérilisation la plus efficace )

- Dans une atmosphère de vapeur d'eau exempte d'air, toutes les bactéries y compris les spores
sont tuées en 20 min à 121°C. Pour un volume donné, la température est fonction de la
pression ; on obtient la température requise de 120°C, très supérieure à la température
normale d'ébullition de l'eau, en chauffant en surpression, c'est à dire en vase clos. L'appareil
utilisé est l'autoclave.

- La préparation du matériel se fait selon l'indication du fournisseur de l'autoclave, à savoir de

façon générale que la verrerie sera bouchée au coton et recouvert de papier aluminium, les
récipients contenant un milieu de culture seront remplis aux 3/4, les instruments métalliques
sont déposés sur un plateau de boites spéciales contenant une solution de carbonate de soude à
2% contre la rouille ...

- Ne convient pas pour les produits liquides délicats (milieux albumineux, lait, gélatine ...)

- A utiliser pour les milieux de culture, matériel en caoutchouc, la verrerie, les instruments de
prélèvement et la stérilisation du matériel après son utilisation.

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 o ébullition

- Un chauffage de 30 minutes à 100°C par ébullition ou un maintien dans la vapeur d'eau

bouillante suffit à détruire toutes les formes végétatives. Dans ces conditions les spores ne
sont pas détruites : on peut améliorer à ce moment là l'efficacité de l'ébullition en ajoutant à
l'eau des solutions salines concentrées (augmentation du point d’ébullition) ou en prolongeant
le chauffage.

- A utiliser pour la stérilisation des produits liquides délicats : milieux albumineux, lait,
gélatine, solutions concentrées de glucides, ...

III / Pasteurisation et tyndallisation :

o pasteurisation

- Conservation des produits naturels pendant un temps limité, ne détruit que les formes
végétatives mais pas les spores.

- Le liquide est porté rapidement à 90°C pendant 30s, par exemple,puis on le refroidit
brusquement à 10°C.

- Conservation des produits alimentaires

o tyndallisation

- Chauffage à 70°-100°C à plusieurs reprises ( 1 heure tous les jours pendant 3 jours ) dans un
bain marie thermostaté.

- Utilisation très limitée aux substances thermolabiles non filtrables (émulsion de jaune d'œuf,
vaccins), préparation de milieux à base de sérum ou de jaune d'œuf.

B/ Stérilisation par filtration:

Plusieurs types de filtration existe :

- les bougies de type Chamberland : tubes à fond arrondi dont les parois sont poreuses, en
porcelaine. la dimension de ces pores varie de quelques µm au 1/10 ème de µm.

- disques : disques en verre fritté de porosité de 150 à 1 µm.

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- membranes : membranes plastiques minces comportant des millions de pores par cm2 dont
la taille, très uniforme, varie de 8 à 0.01 µm et occupant environ 80% du volume du filtre. En
bactériologie, on utilise surtout les filtres de 47 mm de diamètre dont les pores 0.45 µm de
diamètre retiennent à peu près tous les microorganismes en dehors des virus.

Stériliser des liquides altérables par la chaleur : sérums, solutions hydrolysables, solutions
glucidiques, vitamines ...

C/ Action des agents chimiques :

L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes déterminées au sein

d'une flore poly-microbienne.

I / Antiseptiques

- Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantanée. Ils
agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface

Exemple : teinture d'iode, mercryllaurylé, permanganate de potassium, eau oxygénée ...

- Utilisation locale chez les êtres vivants, au niveau des plaies et des muqueuses

II / Désinfectants

- Empêche les contaminations humaines et animales

Exemple :

* vapeurs (formol, gaz sulfureux, oxyde d’éthylène)

* liquides (phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permanganate de

potassium)

- solide (chaux vive)

- Utiliser pour tous les milieux extérieurs à l'Homme : eau, air, sol (objets inanimés,
désinfection du matériel plastique utilisé en microbiologie)

III / Antibiotiques
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Substances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique.

On distingue :

- les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans les
détruire

- les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries

Utilisation in vivo.

D/ Action des radiations :

- C'est la lumière U.V qui est le plus souvent utilisée (lampes germicides ou stérilampes ) :
stérilisation des surfaces et de l'air ambiant, dans des locaux ou des hottes, servant aux
manipulations en atmosphère stérile ( hottes à flux laminaire ).

- Utilisation en virologie, cultures cellulaires, préparation et conditionnement des produits

pharmaceutiques, ensemencements bactériens, préparation de milieux. L'irradiation précède et
suit la manipulation.

- Les rayons X ou y sont utilisés pour la conservation de certains produits alimentaires.

II- DIVERSITE DU MONDE VIVANT

II-1. Détection des microbes

II-1-1. Détection des bactéries et des champignons

a- Dans l’air que nous respirons

Pendant le Travail pratique,

- Vous prendrez une boîte de pétri dans laquelle vous coulerez un milieu PCA,
- Après solidification, vous la laisserez ouverte sur la paillasse pendant 3 heures,
- Vous la refermerez et l’incuberez à l’étuve pendant 24h à 37°C,
- Observation des résultats et conclusion

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 b- Sur la paillasse que vous allez utiliser

Pendant le Travail pratique,

- Vous prendrez une boîte de pétri dans laquelle vous coulerez un milieu PCA,
- Vous écouvillonnerez la paillasse,
- Après solidification, vous ensemencerez stérilement par étalement dans la boîte de
pétri,
- Vous la refermerez et l’incuberez à l’étuve pendant 24h à 37°C,
- Observation des résultats et conclusion

c- Sur vos mains

Pendant le Travail pratique,

- Vous prendrez une boîte de pétri dans laquelle vous coulerez un milieu PCA,
- Vous allez prélever l’eau de rinçage de vos mains,
- Après solidification, vous ensemencerez stérilement par la méthode des stries, la boîte
de pétri,
- Vous la refermerez et l’incuberez à l’étuve pendant 24h à 37°C,
- Observation des résultats et conclusion

d- Sur vos cheveux

Pendant le Travail pratique,

- Vous prendrez une boîte de pétri dans laquelle vous coulerez un milieu PCA,
- Vous allez prélever un de vos cheveux,
- Après solidification, vous le déposerez stérilement dans la boîte de pétri,
- Vous la refermerez et l’incuberez à l’étuve pendant 24h à 37°C,
- Observation des résultats et conclusion

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Chapitre 4 : LES MILIEUX DE CULTURES

Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactéries, de levures,
de moisissures afin de permettre leur étude. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu
les composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement, mais
aussi parfois des éléments qui permettront de privilégier un genre bactérien ou une famille.

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Ainsi, selon le but de la culture, il est possible de placer les micro-organismes dans des
conditions optimales, ou tout à fait défavorables.

Il se compose d'une base (agar-agar, eau, minéraux...) ainsi que d'un indicateur coloré de pH
ou de réaction d'oxydo-réduction pour permettre de formuler des hypothèses sur le genre.

Il existe aussi des bouillons de culture qui possèdent la même fonction, mais ces milieux ne
contiennent pas d'agar-agar, ils sont donc totalement liquides.

Types de milieu de culture

On distingue deux sortes de milieux de culture :
 Synthétiques : milieux dont on peut donner la composition chimique complète. Les milieux
synthétiques sont utilisés en recherche fondamentale.

 Empiriques : milieux dont on ne connaît que partiellement la composition.

Exemple : dans le milieu type cœur-cervelle, il y a de l'eau, de l'agar-agar, de l'hydrolysat de

cœur et de cervelle sans que l'on en connaisse les aspects qualitatifs et quantitatifs. Il sera
donc utilisé uniquement pour la croissance des bactéries. Il n'a pas d'effet sélectif.

Parmi ces 2 types de milieux, il existe des milieux sélectifs (qui vont permettre de
sélectionner le type de micro-organismes qui pourront s'y multiplier). On peut ainsi choisir de
ne laisser se développer qu'un genre de bactérie donné (ex: milieu mFC pour les coliformes
fécaux ou gélose au sang pour certains pathogènes) ou au contraire de favoriser le
développement des levures moisissures en ajoutant un antibiotique au milieu. La température
à laquelle on incubera les milieux inoculés constitue également un facteur de sélection comme
mentionné plus haut.

Les milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellules de levure déshydratées
et lysées) qui fournissent une source d'acides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de
malt apportant une source de carbone, des peptones (protéines animales, de poisson, de
caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.
Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour solidifier le milieu on utilise fréquemment la
gélose ou agar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de
former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à 60°C.

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Autres caractéristiques des milieux

Milieu minimum

Un milieu minimum ou milieu défini est un milieu comportant les éléments chimiques
strictement nécessaires à la croissancebactérienne, sous une forme utilisable par des bactéries
n'ayant pas d'exigence particulière.

 Composition d'un milieu minimum:

o Une source de carbone et d'énergie, généralement le glucose.
o Une source de potassium et de phosphore: K2HPO4
o Une source d'azote et de soufre: (NH4)2SO4
o Une source de magnésium: MgCl2
o Une source de calcium: CaCl2
o Une source de fer: on emploie le citrate de fer (le citrate a pour rôle de
maintenir le fer en solution)
o Une source d'oligo-éléments: sels de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti
o Une source d'eau, indispensable à toute forme de vie: on utilise l'eau distillée
(stérile)
o Un tampon pH: il permet de maintenir un pH correct voire optimum: KH2PO4
par exemple

 En l'absence de l'un de ces composants, les bactéries ne se développent pas, car elles
ne peuvent synthétiser ces produits.

 C'est l'adjonction de facteur(s) de croissance approprié(s) qui permet à des

bactéries exigeantes de se développer.

Milieu de culture sélectif

Les milieux de culture dit sélectifs permettent uniquement la culture de certains genres de
micro-organismes. Pour cela on ajoute des éléments qui inhibent la croissance des micro-
organismes indésirables comme le chlorure de sodium à forte concentration, le thiosulfate de
sodium, le cristalviolet ou certain antibiotiques etc.

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Les éléments ajoutés sont sélectionnés selon les caractéristiques du micro-organisme
recherché. Ces milieux sont utilisés pour l'analyse d'un prélèvement polybactérien. Ce milieu
permet de sélectionner uniquement en cas de crible positif : Résistance à un antibiotique, la
prototrophie etc.

Exemples de milieux sélectifs :

 milieu S-S : il ne permet la croissance que des Salmonelles (Shigella s'y développe
moins vite : environ 48 à 72 heures avant d'obtenir une culture exploitable).
 milieu de Sabouraud : il permet la pousse des mycètes.
 gélose Kanamycine - Vancomycine, dite "Kana-Vanco" ou KV : elle empêche la
pousse des bactéries à Gram positif (action de la vancomycine) et de la plupart des
entérobactéries (action de la Kanamycine). Sur ce milieu, poussent préférentiellement
des bactéries anaérobies strictes.

Milieu de culture enrichi

Ils contiennent, outre les composants de base, des composants indispensables aux bactéries,
que celles-ci ne peuvent pas synthétiser. Ce sont des milieux utilisés pour l'obtention des
bactéries dites exigeantes et auxotrophes.

Par exemple : les milieux au sang frais (le sang est riche en nutriments divers): Gélose au sang
frais ou cuit. Les milieux avec du sérum, du jaune d'œuf : Gélose Baird Parker ou dite BP.

Milieu différentiel

Le milieu de culture dit différentiel ou indicateur permet de distinguer deux types de

microorganismes se développant dans un même milieu [1]. Ce type de milieu met en évidence
certaines caractéristiques biochimiques des microorganismes (principalement l'aptitude à
dégrader un substrat) en présence d'indicateur(s) de la réaction chimique : des indicateurs
colorés de pH ou d'oxydo-réduction (tel que le rouge neutre, rouge de phénol, l'éosine ou le
bleu de méthylène).

On retrouve parmi les milieux différentiels :

 les géloses CLED et BCP et qui différencient la dégradation du lactose.

Année académique 2024-2025 19

  la Gélose Éosine Bleu de Méthylène (EMB), qui différencie la fermentation du lactose
de celle du saccharose
 la gélose MacConkey (MCK), qui différencie la fermentation du lactose. De plus, cette
gélose est sélective (voir plus haut) dans la mesure où elle ne permet que la croissance
des bacilles GRAM négatif. La gélose Drigalski possède les mêmes propriétés.
 la Gélose Chapman (MSA), milieu sélectif des staphylocoques qui différencie la
fermentation du mannitol permettant une orientation entre autres vers Staphylococcus
aureus.
 la gélose Hektoën, qui différencie la fermentation de 3 glucides (lactose, saccharose et
salicine) ainsi que la production de sulfure d'hydrogène. Cette gélose est sélective des
bacilles GRAM négatif, elle est particulièrement adaptée à la recherche
d'entérobactéries pathogènes dans les selles.
 les géloses SS, XLD, DCL, TCBS sont aussi des milieux différentiels couramment
utilisés.

Milieu chromogène (ou discriminant)

Ce milieu peut être sélectif ou non. Son principe repose sur la présence d'un ou plusieurs
substrat(s) couplé(s) à une molécule chromogène. Lorsque ce substrat est métabolisé par une
enzyme bactérienne spécifique, le chromogène associé prend une couleur particulière (il
devient un chromophore) directement lisible sur la colonie. Si l'enzyme n'existe que chez une
espèce bactérienne donnée, l'identification est immédiate.

Parmi ces milieux, on trouve :

 CPS3 : milieu adapté au diagnostic des infections urinaires, par la mise en évidence
d'une activité bêta-glucuronidase, il permet une identification directe d'Escherichia
coli responsable de 70 % des cystites en France, il permet aussi la mise en évidence de
l'activité bêta glucosidase chez les entérocoques et certaines entérobactéries
(Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Citrobacter).
 SM2 : milieu sélectif des bactéries à Gram négatif qui permet la mise en évidence de
Salmonella dans les selles grâce à la révélation d'une activité estéraseque spécifique
des salmonelles.
 CAN2 : milieu sélectif des levures qui permet la mise en évidence de Candida
albicans par la mise en évidence de l'activité hexosaminidase.

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  autres milieux chromogènes : SAID pour Staphylococcus aureus, MRSA pour la
recherche des SARM, ESBL pour la recherche des BLSE, STRB pour la recherche des
streptocoques du groupe B...

Richesse du milieu
Les micro-organismes ont besoin :
 D'une source d'énergie.
- Pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés chimiques (par
exemple du glucose).
- Pour les phototrophes, de la lumière.
 D'une source de carbone
- Pour les autotrophes, il suffit de CO2 atmosphérique (carbone minéral).
- Pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques
 De macroéléments (Ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu de culture)
C, H, O, N, S, Na, Mg, P, K
Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents aux proportions 100/10/1 pour
un milieu correct.
 De microéléments
Cu, Co, Zn, Cl, Fe...
 D'une source d'azote d'origine minérale (sel d'ammonium)
 De facteurs de croissance
Vitamines, acides aminés
 De dioxygène ou oxygène moléculaire
Pour les aérobies strictes — ou —
En absence du dioxygène (ou oxygène moléculaire) anaérobies stricts; pour ces
microorganismes, le peroxyde d'oxygène (H2O2) formé par la réaction entre l'O et l’H 2O, les
empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase dégradant H2O2 ;

à l'inverse des individus aérobies

Il existe également des micro-organismes aérobies facultatifs capables de se multiplier en
présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des
bactéries microaérophiles qui ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène.
 De facteurs physico-chimiques:

Année académique 2024-2025 21

 - Température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur optimum
de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les
thermophiles à 65 °C. Il faut descendre au-delà de -18 °C pour arrêter toute croissance
microbienne. À 3 °C il y a peu de risques lié aux bactéries pathogènes (mésophiles,
donc virulentes à la température du corps) ou toxinogènes, seules quelques bactéries
vivant à ces températures peuvent être dangereuses (listéria).
- pH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les bactéries
lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide. (pH=5)

Chapitre 5 : IDENTIFICATION DES MICROBES

I- Les bactéries

L'identification des bactéries se fait suivant une clé dichotomique qui va des caractères les
plus vastes aux plus pointus pour aboutir à une espèce bactérienne donnée.

Critères morphologiques

Année académique 2024-2025 22

L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un laboratoire de
diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet
une orientation préliminaire du diagnostic. Elle peut être macroscopique

Macroscopique

À l'œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie :

 La forme du relief
 La taille
 La couleur
 L'aspect (collant, filamenteux...)
 L'odeur
 La transparence
 L'allure des contours

Il existe trois grands types de colonies:

 colonies de TYPE S (Smooth=lisse): contours lisse et réguliers, semi-bombée, surface

brillantes, crémeuses.
 colonies de TYPE M (Muqueux): contours lisse et réguliers, très bombées, surface
très brillantes, filantes.
 colonies de TYPE R (Rough=rugueux) : contours irréguliers, plates rugueuses et
mates, sèches.

Microscopique

Les techniques de coloration

coloration (toutes les bactéries se colorent, sans distinction),

différentiation (seules certaines bactéries restent colorées),

contre-coloration (les bactéries dont la coloration a disparu sont colorées par un autre
colorant assurant une vision contrastée).

Coloration de Gram

On utilise la coloration de Gram selon Hucker.

COLORATION : Recouvrir l'étalement fixé de cristal violet oxalaté (réactif prêt à l'emploi).
Laisser agir une minute. Rejeter le violet.
Recouvrir alors l'étalement de lugol (réactif prêt à l'emploi). Laisser 15 à 20 secondes. Rejeter

Année académique 2024-2025 23

et remplacer par la même solution (deux fois et pendant 20 secondes à chaque fois).
Laver à l'eau.

DIFFÉRENTIATION : Décolorer par l'alcool-acétone, en le versant goutte à goutte sur la

lame inclinée obliquement. Surveiller la décoloration (5 à 10 secondes).
Laver immédiatement à l'eau.

CONTRE COLORATION :Recolorer par une solution de safranine (réactif prêt à l'emploi).
Laisser agir 30 secondes.
Laver à l'eau.
Sécher la préparation entre deux feuilles de papier filtre. Examiner au microscope à
l'immersion (x 1000). Les bactéries à Gram positif sont colorées en violet, les bactéries à
Gram négatif sont colorés en rose.

Références : (+) Staphylococcus ; (-) Escherichia coli

Coloration de Gram.

Flore buccale. On voit des bactéries à Gram positif (cocci à Gram positif)
et des bactéries à Gram négatif (longs bacilles flexueux

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Coloration de Ziehl (technique classique et passablement historique servant uniquement
de référence)

Il s'agit de la coloration par de la fuchsine phéniquée à chaud avec décoloration par l'acide
nitrique puis par l'alcool et recoloration par le bleu de méthylène.

COLORATION : Mettre la lame sur une platine chauffante et recouvrir le frottis de fuchsine
phéniquée de Ziehl. Laisser en contact 10 minutes, en ajoutant de temps en temps de la
fuchsine pour éviter la dessication.

DIFFÉRENTIATION : Laver à l'eau.

Immerger la lame pendant 2 minutes dans une solution d'acide nitrique dilué au tiers.
Laver à l'eau.
Immerger la lame pendant 5 minutes dans l'alcool à 90°.
Laver à l'eau.

CONTRE COLORATION : Recouvrir l'étalement de bleu de méthylène (30 secondes).

Laver à l'eau.
Sécher.

Les bacilles à coloration acido-alcoolo-résistante restent colorés en rouge.

Exemples :

Coloration de Ziehl à la fuschine : les

mycobactéries sont colorées en rouge, les autres bactéries sont colorées en bleu

Ici crachat. grossissement 1000 fois

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Actuellement l'utilisation de colorants fluorescents remplace la fuschine et les
mycobactéries sont colorées vivement, les autres bactéries restent non colorées
et n'apparaissent pas.

Coloration de Ziehl. Culture. grossissement 400 fois. Les mycobactéries sont fluorescentes.
Il s'agit ici d'une coloration de Ziehl à l'acridine orange

Forme

La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries
dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui peuvent être très polymorphes, la diversité est
relativement restreinte pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on
distingue principalement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées
(spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnante ou filamenteuse.

Mode de groupement

Elles peuvent se regrouper en chaînes (Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus...), en amas

asymétriques ou grappes (Staphylococcus), en amas cubiques réguliers (sarcines), en
palissades ou en paquets d’épingles (Corynebacterium)... Le mode de groupement, à
condition de l’apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de tenir compte de
l’aspect prédominant, est également un élément important pour orienter l'identification.

Taille

Les plus petites bactéries ont une taille de 0,1 à 0,2 micromètre (Chlamydia) alors que
certaines ont un diamètre supérieur à 10 micromètres. La plus grande bactérie connue
(Thiomargaritanamibiensis) peut atteindre un diamètre de 750 micromètres.
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Présence de spore

Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. La totalité des bacilles à Gram +
sporulent en situation de stress. Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il
suffit de les colorer au vertdemalachite ou à l'encre de chine. Mais on peut les deviner à la
coloration de Gram (absence de coloration). Les spores sont présentes chez les Bacillus.

Mobilité

Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle(s) leur permettant de se
déplacer. Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La
bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se
rapprocher de sa "nourriture"

Capsule

La capsule est formée de polymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches à la

périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie d'adhérer aux surfaces (coloniser les
surfaces) et d'échapper au systèmeimmunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par
la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathogène).

Critères biochimiques

On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en
contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus
complexes. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage (changement de couleur) d'un
indicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit
basique, etc.

Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler facilement
avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la
réduction des nitrates, etc. Ensuite, on dispose de galeriesd'identificationsbiochimiques qui
sont parfois vendues par des sociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, de un à deux
jours.

Critères génétiques

On peut citer des techniques de génie génétique comme:

 la PCR (PolymeraseChainReaction) pour cibler un gène présent uniquement chez une

famille ou un genre bactérien par réhybridation spécifique de courtes séquences
d'ADN (oligonucléotides amorces) synthétiques précises.
 les pucesàADN qui utilisent le même principe mais ayant une précision allant jusqu'à
la souche même.

Systématique bactérienne

La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents

examens et à l'utilisation de milieux de culture spécifiques.

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La colorationdeGram et les tests de la catalase et de l'oxydase permettent de déterminer la
famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre et à l'espèce. Des
examens supplémentaires tels que le sérogroupage peuvent être utilisés dans certains cas.

Coques à Gram positif et catalase positive

 Famille des Micrococcaceae

o Genre Micrococcus
o Genre Staphylococcus

Coque à Gram positif et catalase négative

 Famille des Streptococcaceae

o Streptocoques des groupes Lancefield A, B, C, D (Enterococcus), F & G

Coque à Gram négatif

Gram négatif regroupe les bactéries à paroi fine qui ne retienne pas le bleu de gentiane/cristal
elle apparaisse au microscope optique en rose après que l'on ajoute de la fushine (genre
neisseria, par exemple).

Bacille à Gram positif

 Genre Bacillus
 Genre Listeria
 Genre Clostridium

Bacille à Gram négatif

Oxydase négative

Famille des Enterobacteriaceae :

 Genre des Salmonella

 Genre des Escherichia
o Sérogroupage des EscherichiaeColi
o Sérogroupage des autres Escherichia
 Genre Shigella
 Genre Klebsiella
 Genre Enterobacter
 Genre Serratia
 Genre Proteus
 Genre Morganella
 Genre Providencia
 Genre Hafnia

Oxydase positive

 Pseudomonas
 Vibrio
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 Aeromonas

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