Spectroscopie UV-VIS
Petite longueur d’onde
Haute fréquence
Photons de haute énergie
I - Introduction
• parmi les plus anciennes spectroscopies
• essentiellement spectroscopie d’absorption
• transitions électroniques des électrons éloignés
•du noyau
• Le visible : du violet 420 nm au rouge750 nm.
• l'UV : à partir de 180 nm
grande longueur d’onde
petite fréquence
Photons de faible énergie
Absorbance et
couleur
complémentaire
Transmission et
couleur apparente
II – Les transitions électroniques
- électrons concernés : électrons les plus éloignés du noyau
- électrons de valence (couche externe)
soit électrons impliqués dans des liaisons (simples et multiples)
soit électrons non liés (paires libres)
Les différents types de transition
en spectroscopie UV-VIS
III – Allure des spectres (pour les molécules)
Molécule → modification simultanée des énergies de vibration et de
rotation
→ spectres de bandes
hn = h ( ne + n vib + n rot)
→ bandes d’absorption localisées aux fréquences des transitions
électroniques les plus élevées, “élargies“ par les énergies beaucoup plus
faibles des niveaux de vibrations et de rotations moléculaires.
Transition Détail Détails
électronique niveaux niveaux
vibrationnels rotationnels
Spectre UV : absorbance en fonction
de la longueur d’onde
IV- Les espèces absorbantes
IV-1 Absorption par les composés organiques
entre 180nm et 780 nm :
interaction des photons avec les électrons de liaison ou avec
électrons des doublets non liants
• e- des liaisons C-C ou C-H fortement liés
UV lointain : l <180 nm peu utilisé
• e- des liaisons multiples : facilement excitables = chromophores
• e- des doublets non liants : 170 nm < l < 250 nm
Tous les composés organiques
(exception alcanes) absorbent dans l’UV
Chromophore l max (nm) e max (L mol-1cm-1)
C=C alcène 173 10000
C C alcyne 178 2000
C = O cétone 290 16
CH=O (aldéhyde) 279 15
COOH (acide) 208 32
COCl (chlorure acide) 220 100
CONH2 (amide) 220 63
COOR (ester) 211 57
NO2 (nitro) 214 17
N=N (azomethane) 338 4
Présence dans une même molécule de plusieurs
chromophores
(1) simple additivité si chromophores indépendants
(2) effets bathochromes (déplacement vers les plus grandes longueurs
d'onde) si conjugaison des chromophores
(3) effets hyperchromes (augmentation du coefficient d'absorption
moléculaire) si conjugaison des chromophores.
Effet hyperchrome
Effet bathochrome
Effet hyperchrome
l(C=C alcène) : 180nm
l(C=O aldéhyde) : 280nm
Effet bathochrome
l(c=c) butène : 178 nm
Influence de la conjugaison :
effet bathochrome et hyperchrome
interactions avec le solvant
Dans l'eau, spectres très souvent sensibles au pH qui modifie
l'ionisation de certaines fonctions chimiques.
Variation de la
couleur en fonction du pH
(anthocyanes)
IV-2 Absorption par les composés inorganiques
Les ions et complexes des 2 premières séries de transition
absorbent dans le visible dans au moins un de leur état d’oxydation
(colorés)
Cu 2+ MnO4- CrO4- Cr2O72-
e < 10 000 L cm-1 mol-1
IV- 3 Absorption par transfert de charge
(groupe donneur d’e- lié à groupe accepteur)
complexes organiques et inorganiques : e > 10 000 L cm-1 mol-1
Complexe FeII O- Complexe FeIII
phénanthroline thiocyanate
V- LES APPLICATIONS
V-1 Analyse qualitative : identification
•comparaison avec spectres de référence
•identification délicate car bandes larges : nécessité de
confirmer avec autre technique
Informations GLOBALES sur la molécule, en particulier sur
l’état de conjugaison ( utile en chimie organique)
V-2 Analyse quantitative : Dosages
V-2-1 Les types de dosage : direct ou indirect
(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique :
→ dosage direct
(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique;
→ dosage indirect (transformation)
Conditions d'une bonne méthode de dosage :
-spécificité : la réaction spécifique de la substance à doser (qui doit
être seule à réagir avec les réactifs de coloration)
-solubilité : le produit obtenu doit être soluble.
-stabilité : le dérivé formé doit être stable pendant un certain temps
-proportionnalité : Absorbance proportionnelle à la quantité de
substance à doser présente →réactifs en excès (réaction totale) ET
éventuellement dilution de la solution à doser (conditions de validité de la
loi de Beer-Lambert).
-sensibilité
V-2-2 Les méthodes de détermination
a- Si on connaît e : mesurer A et calculer c
→ connaître le e de la substance à doser à la l choisie
→ application directe de la loi de Beer
b- Si on ne connaît pas e : comparaison avec un étalon unique:
- mesurer dans les mêmes conditions l'absorbance de la solution à doser et
l'absorbance A d'une solution "étalon" ou "standard"de concentration
connue
-calculer la concentration de la solution à doser.
- suppose mais ne vérifie pas la linéarité
c) Si on ne connaît pas e Méthode avec une gamme d'étalonnage
- préparer une gamme étalon
- mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons
tracer la courbe d'étalonnage A = f(c)
- mesurer l'absorbance de la solution à doser
-reporter sur la courbe d'étalonnage (la gamme doit encadrer la valeur
probable de la solution à doser)
- → permet de vérifier la linéarité, et tient compte des éventuelles
erreurs de manipulation (tracé d'une droite statistique).
V-3 Analyse quantitative : titrages
-Au moins un des produits de la réactions absorbant (ou indicateur)
-Représentation A=f(volume de réactif de titrage)
-Courbes de titrage : 2 parties linéaires avant et après PE
-PE = intersection des parties linéaires par extrapolation
PE Volume réactif titrant
Allure des courbes de titrage spectrophotométrique
es=0 es=0 es>0
eP=0 eT=0 eP=0
Absorbance
eT>0 eP>0 PE eT=0
PE PE
Volume réactif T
es>eT>0 eT>eP>0 eP>eT>0
eP=0 es=0 es=0
Absorbance
PE
PE
PE
Volume réactif T
S:substrat, P: produit, T agent titrant
VI - Applications quantitatives
Vaste champ d’application : dosage direct ou après transformation chimique
90% analyses médicales
•Grande sensibilité ( 10-4 10-7 mol L-1) (beaucoup plus que les spectroscopies
vibrationnelles, rotationnelles et de spin)
•bonne précision (1 à 5%)
•Simplicité de mise en œuvre
•Utilisé comme mode de détection dans des appareillages traitant de très
faibles quantités de produit (détecteur de chromatographie par exemple)
Fluorescence moléculaire
1 – PRINCIPE GENERAL
1 – excitation des molécules par absorption d'une radiation
électromagnétique
2- retour à l’ état fondamental → libération d'énergie sous forme de
photons : spectrométrie d’EMISSION
2. THEORIE DE LA FLUORESCENCE MOLECULAIRE
Diagramme énergétique de Jablonski
2 types de relaxation : - relaxation non radiative
- fluorescence
•relaxation non radiative : collisions entre les molécules excitées et les
molécules de solvant
•Relaxation radiative : durée vie de état vibrationnel excité de 10-15s retour au
fondamental avec émission de photon
3 - Intensité de fluorescence : If
If = K (I0 - I)
I0 intensité du faisceau incident, I intensité du faisceau émergeant
Avec absorbance A reliée à I0 et I selon A= -log (I/Io)
If = K I0 (1 - 10-A)
Cas d’une solution diluée : (A <0,05) qd A 0 alors (1 - 10-A) A
If = K I 0 A = K I 0 e l C
Si absorbance trop importante : perte de la linéarité due à
- la forme de l'équation en 10-A
- au « self-quenching » (absorption de la radiation de fluorescence émise par
d'autres molécules)
4. APPAREILLAGE DE FLUORESCENCE MOLECULAIRE
Le spectrofluorimètre possède deux monochromateurs permettant d'obtenir
des spectres d'émission et d'excitation.
Dans un spectre d'émission, on fixe la longueur d'onde de la radiation
excitatrice, et on mesure l'intensité émise aux différentes longueurs d'onde.
Dans un spectre d'excitation, on fixe la longueur d'onde d'observation, et on
mesure l'intensité émise pour différentes longueurs d'onde excitatrices.
5 - Les espèces fluorescentes
-espèce fluorescente si la vitesse de relaxation radiative (rf) est plus
rapide que la vitesse de relaxation non radiative (rnr)
-Rendement quantique : =rf/(rf+ rnr)
Fluorescence et structure :
-Composés avec noyaux aromatiques ( augmente avec le nbre de noyaux)
-Système de doubles liaisons conjuguées
-Effet de la rigidité structurale : augmente avec rigidité
-Effet de température : diminue qd T augmente (collisions augmentent)
6- APPLICATIONS
Sensibilité : de 10 à 1000 fois +sensible que pour l’absorption
• Espèces inorganiques :
a) « analyte +chélatant » = complexe fluorescent (méthode directe)
b) « désactivation de fluorescence » : méthode indirecte
réactif l absorption(nm) l émission Sensibilité
(µg/mL)
Al 3+ Rouge 470 500 0.007
alizarine R
F- Désactivation 470 500 0.001
du complexe
d’Al avec R
Li+ Hydroxy 8 370 580 0.2
quinoleine
Sn 4+ Flavanol 400 470 0.1
Zn 2+ Benzoine -- vert 10
b) Espèces organiques
- Bcp de substances organiques dt 50 pdts médicaux
-Substances végétales
-Essentiellement domaine alimentaire, pharmaceutique et produits naturels,
environnement
