INTRODUCTION

La fluorescence est un phénomène lumineux essentiel qui trouve des applications variées dans
de nombreux domaines de la science et de la technologie, notamment en électronique, en
biologie, en chimie et même en médecine. Elle repose sur l’interaction entre la lumière et la
matière, où une substance absorbant l’énergie lumineuse émet ensuite une lumière visible. Ce
processus est non seulement fondamental pour une meilleure compréhension des propriétés
optiques des matériaux, mais il est également exploité dans des technologies innovantes,
allant des lampes fluorescences aux méthodes avancées d’imagerie et de détection.
Dans ce travail, nous examinerons le principe de la fluorescence, son mécanisme, ses
applications et les implications pratiques dans divers domaines. Une compréhension
approfondie de ce phénomène est cruciale pour les étudiants en électronique et en
électrotechnique, car il illustre les concepts fondamentaux de l’électromagnétisme, de la
structure atomique et de l’optique.
1. La Fluorescence

Le phénomène d’absorption d’une onde électromagnétique par une molécule est soumis aux
règles de la mécanique quantique. Pour qu’un photon d’énergie hν soit absorbé, il faut que
cette énergie corresponde au minimum à la différence énergétique entre le niveau
électronique de plus basse énergie et un des niveaux électroniques excités de plus haute
énergie. De plus, pour que cette transition soit possible, il est nécessaire que la multiplicité
des états soit compatible à savoir une transition de type singulet – singulet (S0 Æ Sn). Après
excitation la molécule se désactive selon deux classes de processus : radiatifs et non radiatifs.

- Les processus non radiatifs correspondent aux mécanismes de relaxation non

associés à une émission de photon : relaxation vibrationnelle, conversion inter-
système singulet – triplet, transfert d’électron, séparation de charges, réaction
chimique…
- Les processus radiatifs correspondent au retour vers le niveau électronique
fondamental par émission d’un photon d’énergie égale à la différence d’énergie
entre les niveaux (du niveau excité vers le niveau fondamental après qu’il ait
relaxé par vibration).

Le mécanisme de fluorescence est un processus radiatif ; il correspond au retour vers le

niveau fondamental S0 à partir du niveau excité de même multiplicité S1. Le mécanisme de
phosphorescence correspond, quant à lui, au retour vers le niveau fondamental à partir de
l’état triplet T1. Ces phénomènes sont illustrés par le diagramme de Jablonski [1] de la
Figure 2. Les transitions électroniques entre niveaux de multiplicités différentes sont
interdites par les règles de la mécanique quantique, ce qui signifie qu’expérimentalement elles
sont très peu accessibles. Ceci a pour conséquence que les phénomènes de fluorescence sont
des mécanismes rapides (quelques picosecondes à quelques nanosecondes), tandis que la
phosphorescence est un phénomène beaucoup plus lent, (en général de l’ordre de la
microseconde à la milliseconde). Les processus de fluorescence à partir de niveaux
électroniques autres que S1 (premier niveau électronique excité) sont extrêmement rares et
donc de faible intensité. Si la molécule est excitée à un niveau électronique supérieur, elle
relaxe généralement par mode vibrationnel pour atteindre le niveau S1.
 Figure 2 : Diagramme de Jablonski

1.1. Spectres d’absorbance, d’excitation et d’émission de Fluorescence.

Une molécule fluorescente se caractérise notamment par ses spectres d’absorbance,

d’excitation et d’émission.
Le spectre d’absorbance résulte du passage d’un électron du niveau fondamental de plus
basse énergie vers un des niveaux électroniques supérieurs (transition verticale). Les électrons
se distribuent sur les différents niveaux de vibrations des états électroniques excités de la
molécule selon l’énergie de la radiation induisant la transition. Pour chaque longueur d’onde
associée au photon absorbé, il est possible de définir une probabilité de transition
électronique. A partir de celle-ci est définie une constante, le coefficient d’extinction molaire
Ελ, qui permet de relier l’énergie absorbée au nombre de molécules excitées (loi de Beer-
Lambert). Ainsi, pour une longueur d’onde donnée, il est possible de mesurer l’absorbance A
; celle-ci varie linéairement avec la concentration C suivant l’équation :
 I0 (λ)
A( )λ = log10 =ελC x
I ( )λ
Équation 1 : Loi de Beer-Lambert

Avec :

- I0 l’intensité de la lumière incidente,

- I l’intensité de la lumière transmise,
- C la concentration de la molécule absorbante,

- Ελ coefficient d’extinction molaire,

- x la longueur du trajet optique parcouru par la lumière dans la solution.

Le spectre d’émission de fluorescence (Figure 3) rend compte du nombre de photons émis

par un fluorophore aux différentes longueurs d’onde d’observation. Ces longueurs d’onde
correspondent aux transitions électroniques de l’état S1 de plus basse énergie vers les
différents niveaux de vibration de l’état fondamental S0. En solution, les molécules du solvant
se réorganisent autour de la molécule excitée. Ainsi, l’état S1 est généralement de plus basse
énergie lorsqu’il est occupé par un électron. Le décalage, entre le maximum d’émission et le
maximum d’absorbance, est appelé déplacement de Stokes [2]. Le spectre d’émission de
fluorescence (1’, 2’, 3’, 4’ Figure 3) sera le symétrique du spectre d’absorbance (1, 2, 3, 4,
Figure 3) par rapport au point de croisement entre les spectres d’absorbance et d’émission
(transition 0-0), lequel correspond à la différence d’énergie entre les niveaux vibrationnels de
plus basse énergie des états S0 et S1.
 Figure 3 : Relation entre les niveaux électroniques et les spectres d’absorbance et
d’émission de fluorescence.

Le spectre d’excitation de fluorescence est obtenu par la mesure du nombre de photon émis
à une longueur d’onde choisie dans le spectre d’émission (de préférence au maximum
d’émission) lorsqu’on fait varier la longueur d’onde d’excitation. Ce spectre est généralement
symétrique du spectre d’absorbance de la molécule fluorescente dans le cas de molécules
simples (un seul chromophore dans la molécule) et en l’absence de processus photochimique
à l’état excité.

1.2. Rendement quantique et duré de vie de fluorescence

Si n1 est le nombre de molécules d’état excité S1, on peut écrire à partir du diagramme de
Jablonski.

La constante de temps associé à l’exponentielle, τF, caractérise la durée de vie de l’état excité.
Pour une molécule fluorescente, l’évolution du nombre de photons émis dans le temps, après
excitation, au cours de la relaxation, est proportionnelle au nombre des états excités. La
distribution de ces photons dans le temps sera identique à la décroissance exponentielle de la
population de l’état excité. Dans ce cas, τF correspond à la durée de vie de fluorescence de
l’état excité.
Le rendement quantique de fluorescence φF rend compte de la compétition entre les
différentes voies de relaxation d’une molécule excitée. Il est défini par le rapport entre
l’énergie réémise par fluorescence et l’énergie totale absorbée, soit encore, par le rapport
entre la constante de désactivation kF et la somme des constantes de tous les processus de
relaxation.
Tout processus qui modifie la durée de vie τF de l’état excité modifiera le rendement
quantique de fluorescence de la molécule.

Il est possible de définir l’intensité de fluorescence idéale IF pour laquelle ne sont pas prises
en compte les pertes provoquées par les phénomènes de réabsorption de la radiation émise.

1.3. Polarisation de fluorescence

Un fluorophore soumis à une lumière polarisée absorbe préférentiellement les ondes dont le
vecteur de polarisation est parallèle à son moment de transition dipolaire d’absorption. Ainsi
lorsqu’une molécule fluorescente est soumise à une radiation polarisée, il s’effectue une photo
sélection ; la répartition des états excités est anisotrope et de ce fait l’émission de fluorescence
également. Suite au mouvement Brownien des molécules en solution, le système retourne
progressivement vers un état d’émission isotrope (Figure 4).

Figure 4 : Effet de la diffusion rotationnelle sur la polarisation de la lumière

Si l’on observe l’émission de fluorescence à travers un polariseur, il est possible de mesurer la

quantité de molécules orientées suivant l’axe du polariseur. Une mesure de polarisation de
fluorescence consiste à exciter une molécule par une lumière polarisée et à observer
l’émission suivant les axes parallèle et perpendiculaire à la direction de polarisation de
l’excitation.
La valeur de ces rapports est intimement liée à la vitesse de réorientation des molécules dans
la solution. L’évolution dans le temps de l’intensité de fluorescence selon un axe défini de
polarisation, résultera de deux mécanismes distincts : d’une part de la disparition de l’état
excité par relaxation et, d’autre part, de la réorientation du vecteur de polarisation d’émission
par rotation de la molécule. Pour les deux orientations d’observation, parallèle et
perpendiculaire.

Les paramètres βi représentent les fractions des pertes de polarisation suivant chacun des axes
de rotation. Les θi sont les temps de corrélation rotationnels associés à chacun de ces axes. Le
nombre de temps de corrélation est lié à la géométrie de la molécule émettrice. Dans le cas
des macromolécules telles que les protéines, si ces dernières sont assimilables à des sphères,
elle aura une infinité d’axe de rotations équivalents. On observera, dans ce cas, un seul temps
de corrélation. Dans le cas d’une protéine en forme d’ellipsoïde, les temps de corrélation
seront multiples. Cette propriété permet, par exemple, de mettre en évidence des changements
de conformation de protéine. De même, dans le cas d’un chromophore fixé à une
macromolécule, l’anisotropie globale observée pourra être décomposée selon deux
contributions correspondant à la rotation du chromophore et à la rotation de la
macromolécule.

L’analyse du temps de corrélation est soumise à des contraintes liées à la durée de vie de
fluorescence et à la taille de la molécule. Si l’on veut être capable d’observer une
dépolarisation, il faut que durant l’émission la molécule se réoriente de façon significative. Si
le mouvement est trop lent, la fluorescence se désactivera totalement avant que la molécule ne
se réoriente ; en revanche, si le mouvement est trop rapide, la dépolarisation sera immédiate et
le milieu apparaîtra comme s’il était isotrope. On peut obtenir, pour les protéines, une
approximation du temps de corrélation rotationnel à partir de sa masse molaire M. En prenant
pour hypothèse que le volume hydraté spécifique d’une protéine est de l’ordre 1 cm3 g-1
(valeur couramment obtenue pour une protéine), et dans des conditions expérimentales
Classiques.
En 1979, Ph. Wahl avait montré que la fenêtre temporelle pour laquelle il était possible de
déterminer le temps de corrélation devait se situer dans la gamme. Depuis, eu égard au
développement des méthodes de calcul et à la création de nouveaux modèles théoriques, il est
possible de déterminer des temps de corrélation jusqu’à 25 fois plus longs que la durée de vie
de fluorescence.

1.4. Effet de l’environnement local sur la fluorescence

Les propriétés de fluorescence d’une molécule excitée dépendent étroitement de son

microenvironnement. La fluorescence étant liée aux caractéristiques des niveaux
électroniques de la molécule, toute interaction physique qui influera sur les transitions
électroniques aura un effet sur celles-ci : variation du pH, de la polarité du solvant, ou
d’interactions intermoléculaires. Du point de vue de l’anisotropie, d’autres paramètres tels
que la viscosité et la température auront également une influence. Ces propriétés font de la
fluorescence une technique de choix en biologie pour l’étude des structures et pour la
compréhension des mécanismes au niveau cellulaire. La mesure du temps de corrélation est
utilisée pour déterminer par exemple la viscosité intracellulaire. Les techniques de
fluorescence sont aussi utilisées en chimie pour étudier le confinement des chromophores
dans des structures poreuses et comprendre les interactions entre molécules.

1.5. Extinction de fluorescence

On utilise le terme « extinction de fluorescence » ou « quenching » pour tous les phénomènes

tendant à diminuer l’intensité de fluorescence. Cette extinction peut avoir plusieurs origines.
Elle peut être d’ordre :
- Cinétique (ou dynamique) ; une des constantes de vitesse du modèle cinétique de
relaxation de l’état excité (Figure 2) est modifiée, ou encore une voie
supplémentaire de désactivation apparaît (séparation de charges par exemple).
Dans ce cas, le rendement quantique de fluorescence et la durée de vie de
fluorescence diminuent. Ce phénomène est observé, par exemple, pour certains
fluorophores mis en contact avec une molécule comme l’oxygène [20]. Ici, le
quenching est fonction de la probabilité de collision entre l’oxygène et le
fluorophore. Un autre exemple est le transfert d’énergie de fluorescence non
radiatif. Ce processus est couramment utilisé pour des études en FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfert).
- Non cinétique (ou statique) ; l’extinction de fluorescence résulte d’une
diminution du nombre de molécules émettrices. Ceci se traduit expérimentalement
 par une diminution du rendement quantique de fluorescence, mais les constantes
cinétiques de relaxation de l’état excité ne sont pas modifiées. Dans ce cas, la
durée de vie de fluorescence reste inchangée. Ce phénomène est observé lors de la
formation d’un complexe non fluorescent, comme par exemple, entre une
molécule de tryptophane et certains dérivés de rhodamine ou de fluorescéine.

La photo dégradation de l’échantillon, ou encore sa photo saturation, ont également pour

conséquence la diminution de la fluorescence observée. Toutefois, ces phénomènes ne
peuvent pas être considérés comme une véritable extinction de fluorescence.

1.6. Conclusion

Les études de fluorescence présentent l’avantage d’être très sensibles ; elles permettent
d’effectuer des expériences à des concentrations faibles de l’ordre du nanomolaire. Les
propriétés de fluorescence d’une molécule varient avec le milieu (polarité, pH, viscosité…) ;
leurs modifications peuvent traduire des changements de conformation, des interactions intra
ou extra moléculaires. La polarisation de fluorescence permet, outre d’étudier le mouvement
de rotation d’une molécule, d’observer des modifications de structure comme dans le cas
d’une protéine.

1. Principe de la fluorescence
La fluorescence se produit lorsque certaines substances, appelées fluorophores, absorbent des
photons d’une source d’énergie généralement dans le domaine de l’ultraviolet et réémettent
une lumière à une longueur d’onde plus longue, correspondant à l’énergie excédentaire. Ce
transfert d’énergie est rendu possible grâce aux transitions électroniques au sein des
molécules.
 Energie d’absorption
Lorsqu’une molécule absorbe un photon, un électron passe à un état d’excitation. Ce
processus est caractérisé par une longueur d’onde spécifique, déterminée par la structure
électronique de la molécule.
 Etat excité
L’électron excité peut rester dans cet état pendant un court laps de temps. Pendant cette
période, il peut perdre une partie de son énergie sous forme de chaleur.
  Emission
Finalement, l’électron retourne à son état fondamental, émettant un photon dans le processus.
Ce photon a une énergie et donc une longueur d’onde plus faible que celle du photon absorbé,
ce qui explique pourquoi la lumière émise est souvent visible comme une couleur différente.
 Migration de l’énergie
L’énergie absorbée peut être dissipée par diverses voies, comme la chaleur, mais dans le cas
de la fluorescence, elle se traduit par l’émission de lumière.

2. Mécanisme de la fluorescence
Le mécanisme général de la fluorescence peut être décomposé en plusieurs étapes :
 Excitation électronique
Les électrons dans les niveaux d’énergie de la molécule absorbent un photon et passent à un
état excité. Cela se produit presque instantanément.
 Etat de triplet
Les molécules peuvent subir une transition intersystémique pour adopter un état de triplet, qui
est un état de plus longue durée. Le temps de retour à l’état fondamental en fluorescence est
généralement très court, de l’ordre de quelques nanosecondes, alors que le retour d’un état de
triplet peut être plus long.
 Emission de lumière
En revenant à l’état fondamental, la molécule émet un photon, redonnant une énergie
équivalente à celle qui a été absorbée, mais souvent à une longueur d’onde plus longue,
donnant ainsi lieu au phénomène de fluorescence.

3. Caractéristiques de la fluorescence

 Spectre d’émission
Le spectre de fluorescence d’une substance est unique et distinctif, permettant l’identification
et l’analyse de différents composés.
 Quenching
Divers facteurs peuvent réduire l’intensité de la fluorescence, comme la température, la
concentration de la substance ou la présence de certains ions.
 Durée de vie de fluorescence
Elle est extrêmement brève. Cela permet des applications en imagerie ultrarapide, où des
processus biomoléculaires peuvent être visualisés en temps réel.
 4. Applications de la fluorescence
La fluorescence possède une multitude d’applications pratiques, notamment :
 Microscopie à fluorescence
Utilisée pour observer les cellules et les tissus. Permet de visualiser des structures spécifiques
à l’aide de colorants fluorescents.
 Eclairage fluorescent
Les lampes fluorescentes, largement utilisées pour l’éclairage public et domestique,
fonctionnent grâce à la fluorescence dans un tube rempli de gaz.
 Analyse chimique
Les méthodes fluorescentes permettent de détecter et de quantifier des substances dans des
échantillons, pouvant être cruciales pour les tests environnementaux et médicaux.
 Détection de drogues et de contaminants
En médecine légale et en biologie, la fluorescence peut aider à identifier des composés
spécifiques dans des échantillons complexes.
 Biotechnologie et diagnostic médical
Utilisation de réactifs fluorescents pour le marquage et l’identification d’ADN, d’ARN et de
protéines.
CONCLUSION