Analyse des génomes

Méthodes d’extraction d’ADN

= techniques permettant d’isoler l’ADN à partir de cellules ou de tissus afin de l’utiliser ensuite dans
des applications de biologie moléculaire (PCR, séquençage, clonage)

es différentes étapes : 1. Lyse des cellules : mécanique (broyage)

chimiques (détergents pour déstabiliser la bicouche lipidique
et dénaturer les protéines)
2. élimination des protéines et des autres acides nucléiques
3. concentration de l’ADN
différentes méthodes :
Extraction phenol-chloroform Extraction sur colonnes de silice
 Méthodes d’extraction d’ADN
Séparation ADN génomique et ADN plasmidique

Renaturation différentielle Centrifugation isopycnique sur gradient de chlorure de césium

1) denaturation avec SDS

2) renaturation avec acetate de possaium qui precipite tout ce qui est en
contact avec le SDS. Il reste alors l’ADN plasmidique, relativement pure,
sous la forme superenroulé (bande qui migent vite) ou relâché (bande
retardé)

Bromure d’ethidium (BET) s’intercale dans l’ADN et le rend moins dense

 Méthodes d’extraction d’ADN
Concentration de l’ADN par précipitation Mesure de la concentration de l’ADN
Par spectrophotomètre UV

Précipitation éthanol ou isopropanol

1. Vérification de la pureté 2. Calcul de la concent

En fonction de la taille de l’ADN, le protocole de precipitation est modifié

ADN pur
ttps://[Link]/watch?v=MFvdrMgCnFA
si a/b = A260/A280 > 1,8
 Southern Blot
Principe

Digestion totale de l’ADNg

éparation des fragments par électrophorèse

Dénaturation de l’ADN par un bain NaOH

ransfert sur membrane de nylon ou nitrocellulose

ixation de l’ADN sur la membrane par UV

Hybridation avec une sonde marquée

ARN ou ADN simple brin)

avages +/- stringents

Révélation selon le marquage

Analyse des résultats 1 site de restriction tous les 4 000 nucléotides

 Southern Blot
arquage de la sonde : utilisation de sondes « froides »
Sonde biotinylée : incorporation de biotin-dUTP Digoxygénine : Incorporation de DIG-dUTP

Système biotine/streptavidine
 Southern Blot
Marquage de la sonde : utilisation de sondes radioactives
 Southern Blot
Marquage de la sonde en 5’
 Southern Blot
Marquage de la sonde en 3’
 Southern Blot
arquage interne ou « Random priming »
 Southern Blot
plications
-Déterminer la présence d'une séquence
(gène ou séquence x) dans un échantillon
d'ADN donné (génome ou plasmide)

-Déterminer le nombre de répétition de cette

séquence dans l'échantillon d'ADN analysé
(nombre de "copies" d'un gène)

-Déterminer la répartition de ces répétitions

dans l'échantillon d'ADN analysé ("dispersion"
ou regroupement sous forme de "cluster")

Établissement de carte de restriction

Détermination de la présence et du nombre de copies
- identification de mutations (délétion, insertion, réarrangement)
- d’une séquence d’ADN dans un génome
- cartographie RFLP (restriction fragment length polymorphism)
- d’un transgène dans des lignées transgéniques
utilisée pour : test de paternité, diagnostique pour des maladies
génétiques, identification de personne
- localisation de transgènes dans des lignées transgéniques
 Southern Blot
pplications

cartographie RFLP (restriction fragment length polymorphism)

 Southern Blot
lications
Détermination du nombre de copies d’une séquence ADN dans un génome
 Southern Blot
plications Détermination du nombre de copies d’une séquence ADN dans un génome

L’intensité du marquage ne depend pas du nombre de copie

 Southern Blot
lications Détermination du nombre de copies d’une séquence ADN dans un génome
 Les banques d’ADN génomique
tention
 Les banques d’ADN génomique
ention
Fragmentation du génome par digestion partielle : notion de smear

Le principe de la digestion partielle est d’augmenter le temps de

digestion ou la concentration en enzyme d’échantillon en échantillon :
on obtient un smear, caractéristique d’une digestion partielle
 Les banques d’ADN génomique
ention
Vecteurs de clonage

Vecteur de clonage contient : une origine de réplication

un site de clonage (sites de restriction)
un ou plusieurs gènes exprimant des marqueurs de sélection.
L’enjeu est d’avoir de long morceau pour eviter les superpositions

= hybride entre plasmide et phage λ

 Les banques d’ADN génomique
ention

Crible positif : α - complémentation

Chromosome bacterien (B-galΔα)
Operon lactose Plac

lacI
- B-galΔα = depourvu du fragment ⍺ elle est donc
inactive

Répresseur

-
LacI

Plasmide Plac
- taille : ~2 à 3 Kb
- site multiple de clonage (MCS) LacZ
- gène de résistance à un antibiotique
(Amp)
- origine de réplication
- gène lac Z (lac Z')
 Les banques d’ADN génomique
ention

Chromosome bacterien (B-galΔα)

Operon lactose Plac

lacI + B-galΔα
IPTG
Répresseur
LacI inhibé

Plasmide
+Plac analogue du lactose non hydrolysable par la β-glactosidase,
plus manipulable que le lactose qui a la meme fonction mais
est hydrolysable
- taille : ~2 à 3 Kb
- site multiple de clonage (MCS) LacZ
- gène de résistance à un antibiotique
(Amp)
- origine de réplication
- gène lac Z (lac Z')
 Les banques d’ADN génomique
ention

Chromosome bacterien (B-galΔα)

Operon lactose Plac

lacI + B-galΔα
B-galΔα
Xgal
B-gal

Plasmide
+Plac
- taille : ~2 à 3 Kb α Précipi
- site multiple de clonage (MCS) LacZ
- gène de résistance à un antibiotique α - complémentation
(Amp)
- origine de réplication
- gène lac Z (lac Z') Les bactéries contenant un plasmide vide sont résistantes à l’ampicilline et ble
et sont blanches
 Les banques d’ADN génomique
ention

Chromosome bacterien (B-galΔα)

Operon lactose Plac

lacI + B-galΔα
B-galΔα
Xgal
B-galΔα

Plasmide
+Plac
- taille : ~2 à 3 Kb
- site multiple de clonage (MCS) Insert dans LacZ
- gène de résistance à un antibiotique α - complémentation
(Amp)
- origine de réplication
- gène lac Z (lac Z') Les bactéries contenant un plasmide recombinant sont résistantes à l’ampicilline et blan
 Les banques d’ADN génomique
ention

Vecteur d’expression eucaryote

Ces vecteurs sont constitués :

• d’un promoteur eucaryote (SV40, CMV)

• d’un site de polyadénylation (SV40)
• d'un gène de sélection eucaryote
• d'une origine de réplication procaryote
• d'éléments nécessaires à la sélection des
recombinants chez les bactéries
 Les banques d’ADN génomique
ention

Vecteur d’expression eucaryote

Ces vecteurs sont constitués :

• d’un promoteur eucaryote (SV40, CMV)

• d’un site de polyadénylation (SV40)
• d'un gène de sélection eucaryote
• d'une origine de réplication eucaryote
• d'éléments nécessaires à la sélection des
recombinants chez les bactéries
 Les banques d’ADN génomique
ention

: 48kb

Texte

Genome d’ADN lineaire capable de se circulariser

car il a des long bouts collants à 12b capable de se
coller l’un à l’autre.
 Les banques d’ADN génomique
ention
Cycle lytique / lysogénique du Phage λ

Présence des phages visualisée par

des "plages de lyse"
Lytique = dev circulaire puis transcription en protéine viral (lineaire)
Lysogenie = l’ADN viral integre le genome de la bacterie
 Les banques d’ADN génomique
ention

Peuvent passe de linaire à circulaire et inversement Il a la spécificité d’avoir une ARS = origine de replication de levure
Ajout extrémité Cos du virus qui permet d’intégrer de Ainsi que des télomères et un centromère
long fragment génomique
 Les banques d’ADN génomique
ention
Clonage dans des vecteurs

Clivage par enzyme de restriction qui génère

des bouts collants dont au moins un est
compatible avec une séquences du vecteur
 Les banques d’ADN génomique
ention
Criblage de la banque
Objectif : isoler et amplifier un fragment d’ADN d’intérêt

le nombre de colonie est très diversifié

les bactéries s’accrochent au filtre, on obtient une empreinte de

l’ensemble de bactéries sur le filtre

On se retrouve avec 40 000 de colonies → il faut cribler

Séquençage
 Séquençage
On utilise le ddNTP où le 3’OH est retiré, il peut donc intégrer la sequence mais dès son intégration la

Méthode de Sanger séquence ne peut plus s’allonger car l’extrémité 3’ est dépourvue de OH : c’est un nucléotide terminateur

1 4
 Séquençage
Méthode de Sanger

Concentration en ddNTP (fluorescent) plus forte que en dNTP puis de moins en moins
concentré afin de reconstituer la séquence de 5’ à 3’

Détection / Lecture

dNTP
ADN polymérase fidèle
3’
Matrice ADN
5’ 3’
3’

3’ 5’

Tube 1

Tube 2

Brins synthétisés
Tube 3

Tube 4 5’
 Séquençage
quençage haut débit
Principe
 Séquençage
quençage haut débit

le greffage des dNTP au niveau de a puce est extrêmement precise de par les spots
 Séquençage
quençage haut débit
Séquençage par synthèse
Incorporer nucléotique et detection laser sur du nucléotide
intégré au fur et à mesure

séquençage

Incorporation du
premier nucléotide

Lecture laser

Incorporation du
second nucléotide

Lecture laser

Ajout de T chromophore , il s’hybride aux nucléotides complémentaires, le laser détecte tous les
T hybridés grâce au chromophore. Ensuite des enzymes enlèvent les chromophores, puis on
ajoute un autre nucléotide ainsi de suite…

temps
 Séquençage
res méthodes de séquençage haut débit
 Séquençage
paraison séquençage Sanger et haut débit (NGS)

BILAN :
- On travaille sur des bandes
d’ADN génomique ou ADNc

- Fractionnement générant des

petits fragments qu’on lient avec
des oligoN de sorte a avoir un
primer permettant de sequencer
tous les fragments

- Utilisation d’une technique de

séquençage