Dr. BOUCHEKRIT M.
Méthodes chromatographiques
1. DEFINITION et PRINCIPE
La chromatographie, procédée d’analyse immédiate, sert à séparer des constituants
d’un échantillon. Elle est utilisée en analyse pour quantifier et identifier des molécules dans
un mélange. Le principe de base de tout système chromatographique est la répartition ou la
distribution des composés d’un échantillon (analyte) entre deux phases non miscibles. L’une
de ces phase, appelée phase stationnaire immobile (solide ou liquide), est emprisonnée dans
une colonne ou fixée sur un support, l’autre appelée phase mobile (liquide, gaz ou fluide
supercritique) est en contact étroit avec la première. Si plusieurs molécules sont présentes
dans l’échantillon, chacune d’elle est soumise à une force de rétention exercée par la phase
fixe (affinité de la molécule pour cette phase), et à une force de mobilité exercée par la phase
mobile (l’entrainement dépend principalement de la solubilité du soluté dans la phase
mobile). Le résultat de la séparation est en fonction du coefficient de partage du soluté K
entre les deux phases, dont les molécules retenues par la phase fixe migrent lentement par
rapport la phase mobile, cependant celles solubles dans cette dernière migrent plus
rapidement mais leurs vitesses de déplacement ne dépassent jamais celle de la phase mobile.
Cette différence de déplacement provoque la séparation des molécules de l’échantillon en
spots.
Le coefficient de partage, de partition ou de distribution est le paramètre physico-
chimique de base en chromatographie qui peut calculer le rapport de concentration du soluté
entre les deux phases :
Concentration de l′ analytedans la phase stationaire
K= Concentration de l′ analytedans la phase mobile
2. CLASSIFICATION des METHODES
CHROMATOGRAPHIQUES
Les méthodes chromatographiques peuvent être classées selon trois manières :
- La nature physique des phases : Dans cette classification, la phase stationnaire est un
solide ou un liquide immobile fixé sur un support, alors que la phase mobile est un fluide
qui peut être soit liquide soit gaz.
- Le principe du phénomène mis en jeu dans la séparation : adsorption, affinité,
partage, d’exclusion, échangeurs d’ions.
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- La méthode mise en œuvre (support de la phase stationnaire) : colonne ou papier
(couche mince).
3. CHROMATOGRAPHIE de PARTAGE
3.1. Principe
La chromatographie de partage est une chromatographie liquide-liquide basée sur les
différences de solubilité des solutés à séparer entre deux phases liquides non miscibles, une
mobile et autre stationnaire (liquide immobilisé sur un support inerte). Le principal facteur
intervenant dans cette séparation est le coefficient de partage (K) des molécules entre les
deux phases. Les molécules ayant des coefficients de partage différents se séparent
facilement, et plus que le coefficient de partage est faible, plus que le soluté est moins retenu.
A l’équilibre et à une concentration donnée des molécules, le coefficient de partage peut-
être définit comme étant le rapport des concentrations de la molécule dans les deux phases:
𝐶𝑠
K = 𝐶𝑚
Dont : Cs et Cm représentent la concentration des molécules dans la phase stationnaire
et mobile, respectivement.
Plus que le coefficient de partage, la polarité des phases est un autre facteur qui
intervient dans la séparation des molécules, et selon lequel on distingue deux modes de
chromatographie, mode normale et inversé.
3.2. Appareillage
3.2.1. Supports
Les supports sont des solides inertes vis-à-vis la phase stationnaire et mobile et qui, de
plus, doivent être très finement divisés et présentent une très grande surface sur laquelle est
fixée une grande quantité du liquide comme la poudre du cellulose et le gel de silice..
3.2.2. Solvants
Le partage d’un soluté est effectué entre deux solvants de développement non-
miscibles et de polarités différentes, l’un fixe sur le support et l’autre mobile.
3.2.3. Phase stationnaire
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Selon la préparation de la phase stationnaire, on distingue deux type de
chromatographie : chromatographie liquide-liquide (fixation du liquide par adsorption
physique sur la surface du support) et chromatographie liquide-phase greffée (fixation du
liquide par vraie liaison chimique sur le support).
La phase stationnaire modernes et la plus utilisée grâce à sa grande stabilité est celle
en phase greffée, dont les liaisons chimiques les plus employées sont de nature aliphatique.
On distingue :
- Chromatographie en phase normale : la phase stationnaire hydrophile (polaire) est
greffée sur la silice alors que la phase mobile est hydrophobe (apolaire).
- Chromatographie en phase inversée : la phase stationnaire est hydrophobe alors que
celle mobile est hydrophile.
3.2.4. Phase mobile
La phase mobile ou l’éluant doit posséder un pouvoir solvant et une inertie chimique
vis-à-vis les mélanges à analyser. Il doit être aussi inerte chimiquement et insoluble
(immiscible) vis-à-vis la phase fixe. La polarité de la phase mobile influe grandement sur le
coefficient de partage des substances et donc leur élution. Au cours de la chromatographie,
on distingue de régimes de la phase mobile, le régime isocratique avec une seule composition
et le régime en gradient avec une composition variable.
4. CHROMATOGRAPHIE d’ADSORPTION
4.1. Principe
La méthode est basée sur la répartition des molécules entre l’adsorbant fixé sur un
support inerte (phase stationnaire) et l’éluant (phase mobile). Chacune des molécules est
soumise à deux différentes forces, une force de rétention exercée par l’adsorbant et la force
d’entrainement exercée par l’éluant (Fig. 01). La migration différentielle des molécules du
mélange à analyser permet leur séparation.
L’adsorption est la fixation des particules d’un échantillon par la phase stationnaire.
Cette interaction est mise en place grâce à l’établissement de liaisons en surface, entre
l’adsorbant et les particules adsorbées, de type dipôle-dipôle, dipôle-ion ou liaison Van der
Waals. La désorption est la mise en solution des molécules adsorbées par coupure des
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liaisons précédentes. Les sites actifs de l’adsorbant peuvent être liés avec les particules du
soluté ou la phase mobile.
Figure 01 : Interactions entre le soluté, l’adsorbant et l’éluant
4.2. Elément de la chromatographie d’adsorption
4.2.1. Adsorbant
Il doit être poreux, finement broyé et réduit en particule de faible diamètre. Il existe
plusieurs types d’adsorbants comme l’alumine Al2O3 et la silice SiO2.
La qualité d’un adsorbant dépend de son homogénéité, sa surface, sa teneur en eau et
sa pureté. Il est caractérisé par :
La capacité d’adsorption : il existe deux types d’adsorbants, forts adsorbants comme
le gel de silice ou d’alumine active (capacité élevée d’adsorption) et faibles adsorbants
comme l’insuline, le talc ou le carbonate de sodium (capacité faible d’adsorption).
La polarité : certains adsorbants présentent une faible polarité tels que le charbon
actif, cependant certains d’autres ont une forte polarité tels que le gel de silice ou l’alumine.
La granulométrie : les adsorbants sont commercialisés sous forme de granules, plus
que les grains sont fins plus que la séparation est bonne mais plus lente.
4.2.2. Solvants
Il doit être inerte vis-à-vis la molécule adsorbée et l’adsorbant. Dans chaque système
chromatographique, on choisit le solvant de fixation et celui d’élution en fonction de la
nature des molécules à séparer (la polarité). Lorsque l’adsorbant est apolaire, le solvant de
fixation doit être le plus polaire possible. L’élution est débutée avec un solvant moins polaire
puis poursuivie avec des solvants de plus en plus moins polaires jusqu’au solvant apolaire
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qui a, dans ce cas-là, un pouvoir éluotropique le plus élevé, et vis vers ça pour les adsorbants
polaires.
4.3. Techniques expérimentales
4.3.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
La CCM également connue sous le nom Chromtographie Planaire (CP), est une
méthode qualitative, sensible, de faible coût et capable de réaliser plusieurs séparations en
parallèle. Elle utilise une phase stationnaire plane préparée avec l’acétate la cellulose ou de
silice (le plus répondu). Ce dernier doit être fixé sur un support plat en verre ou aluminium.
4.3.1.1. Appareillage et Principe
- La cuve chromatographique : enceinte habituellement en verre, de forme variable et
close pour maintenir une atmosphère saturée en eau ou en solvant organique (Fig. 02).
- L’échantillon (analyte) : mélange de molécules à séparer (entre 0.5 et 10 µl) déposé
en un point fixe au bas de la plaque (la surface).
- La phase stationnaire (les plaques ou adsorbants) : une couche fine de l’ordre de 0.2
mm mélangée avec un liant et uniformément étalée sur un support comme : le Gel de silice,
l’alumine, la célite et la Poudre de cellulose. L’homogénéité et la granulométrie déterminent
l’efficacité d’une CCM.
- La phase mobile (éluant) : un solvant pur ou un mélange de solvants de basse polarité
qui se déplace lentement le long de la plaque en entrainant les particules de l’échantillon. Le
choix de l'éluant est déterminé par le procédé de sorption utilisé et par la nature des
composants de l'échantillon.
4.3.1.2. Dépôt de l’échantillon
L’échantillon est dissout dans un solvant volatile, peu polaire et qui n’est pas
forcément le même que l’éluant. Il doit être appliqué sur la plaque CCM avec un soin
extrême soit manuellement via un tube capillaire, soit avec une micropipette ou une
microseringue en verre calibrée de telle sorte que la goutte émergente touche juste la surface
de la plaque (juste un point) (Fig. 02). On peut effectuer plusieurs dépôts successifs du même
analyte (0.4 - 0.5 mm3) au même point pour le concentrer, mais chaque dépôt doit être séché
avant l’application d’un autre.
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Figure 02: Différents constituants d’un montage CCM
4.3.1.3. Développement de la plaque
Une fois que la plaque chromatographique est préparée et que les échantillons y sont
appliqués, elle est placée dans la cuve en immergeant le bord inférieur dans l'éluant à une
profondeur de 0,5 à 1 cm. Ainsi, il est important de maintenir l'atmosphère dans la cuve
saturée en vapeur de la phase mobile, pour cela, un papier filtre imbibé du solvant doit être
placé contre ses parois.
Le flux de solvant est forcé de s'arrêter lorsque le front atteint la ligne d'arrêt créée près
du haut de la plaque avec un crayon pointu (Fig. 02). Cependant, la plaque ne doit pas être
laissée debout dans la cuve pendant une longue période après que le front a atteint la ligne
d'arrêt.
4.3.1.4. Révélation des substances séparées
La révélation des spots est mise en place en utilisant différentes méthodes. Les
substances colorées sont bien sûr visibles sous forme de taches séparées à la fin de l'analyse,
cependant, celles incolores nécessitent une détection chimique ou physique (Fig. 02).
Les méthodes chimiques de détection utilisent des réactifs de localisation, ou réactifs
chromogènes, sur la plaque CCM. La plaque de CCM est pulvérisée avec le mélange
réactif/solvant approprié, et donc un dérivé coloré est produit qui rend les spots invisibles
visibles. Le chromatogramme peut être pulvérisé avec le réactif ou complètement plongé
dans une solution de réactif chromogène, mais cette dernière risque de perdre quelques
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particules de la plaque ou un étalement des taches. Pour les méthodes physiques, il existe
plusieurs procédés parmi lesquels les rayons ultraviolet.
4.3.1.5. Etude théorique
Le rapport de la distance de migration de l’analyte sur celle de l’éluant correspond au
facteur de retardement Rf (Rate of Flow), dont la valeur est comprise entre 0 et 1. Rf est
constant pour un analyte donné mais varie selon les conditions expérimentales telles que la
nature de la phase stationnaire et de l’éluant, la température, l’humidité, etc.
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑐𝑜𝑢𝑟𝑢𝑒 𝑝𝑎𝑟 𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒
Rf = 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑐𝑜𝑢𝑟𝑢𝑒 𝑝𝑎𝑟 𝑙𝑒 𝑓𝑟𝑜𝑛𝑡 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑎𝑛𝑡
4.3.1.6. Applications de la CCM
La CCM est une simple méthode dont les applications sont nombreuses dans différents
domaines, analyses agroalimentaires, pharmaceutiques, toxicologiques, biologiques,
environnementales, etc. Citons quelques exemples :
- La recherche d’impureté ou substance apparentées aux principes actifs dans ces
matières premières (pharmacie) comme : la benzophénone impureté de la phénytoïne (254
nm) et 4-biphényl-ol impureté du diflunisal (254 nm).
- La recherche des molécules toxiques notamment les antidépresseurs, neuroleptiques,
hypnotiques, anxiolytiques, antalgiques, etc.
- La CCM indique le nombre des analytes dans un échantillon
- Une CCM réalisée avec plusieurs éluant et adsorbant révèle la présence d’un seul
composée, on peut le considérer comme pur.
4.3.2. Chromatographie sur Colonne
4.3.2.1 Principe et description
Cette méthode est fondée essentiellement sur les phénomènes d’adsorptions. Une
colonne de différentes dimensions est remplit de la phase fixe (alumine ou silice),
l’échantillon, mis au sommeille de la colonne, est entrainé à l’intérieur grâce à l’écoulement
de l’éluant le long de la colonne en résultant, ainsi, la séparation des particules. Le
déplacement de l’éluant (un seul solvants ou mélange) est effectué par gravité ou sous
l’influence d’une faible pression externe. Les particules se répartissent dans la colonne selon
leur affinité pour la phase fixe et leur solubilité dans la phase mobile. Chaque particule
sortante doit être recueillit.
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4.3.2.2. Facteurs influant la séparation
Les quatre paramètres intervenant dans la séparation et l’isolement des particules sont :
l’adsorbant, l’éluant, les dimensions de la colonne et la vitesse d’élution.
a. Adsorbant : les adsorbants les plus utilisés pour préparer la phase stationnaire sont
le gel de silice (SiO2) et l’alumine (Al2O3).
- Alumine : puissant, utilisé pour l’adsorption des composés organique stables, à
savoir : les hydrocarbures aromatiques et insaturés, les caroténoïdes, les stéroïdes, les
alcaloïdes et les acides aminés. Il représente quelques inconvénients qui expliquent en
grande partie l'utilisation préférée du gel de silice.
- Gel de silice : une poudre blanche utilisée principalement pour séparer les composés
organiques instable ou possèdent une stabilité insuffisante pour être adsorbés sur alumine.
b. Eluant : doit être soluble et interagir avec les particules de l’échantillon et non pas
avec l’adsorbant. Il est souvent un mélange de solvant (polarité accroitre au cours de
l’opération) qui se déplace le long de la colonne en entrainant avec lui les particules de
l’échantillon.
c. Dimension de la colonne : la colonne est le support de l’adsorbant et à travers
laquelle l’éluant passe (verre, plastique ou inox). Généralement, les colonnes préparées pour
cet usage ont à leur base une plaque de verre fritté qui permet l’élution de la phase mobile
tout en empêchant le passage de la phase stationnaire. (Fig. 03).
Figure 03: Colonne classique
d. Vitesse d’élution : doit être plus constante possible. Pour une bonne séparation, les
particules à séparer doit être plus près de l’équilibre (en équilibre) entre les deux phases et
donc la vitesse doit être suffisamment lente. Elle ne doit pas trop lente ou trop rapide.
4.3.2.3. Remplissage de la colonne
Le remplissage de la colonne doit être effectué avec soin et la phase stationnaire doit
totalement tasser et dépourvu des bulles d’air ou fissures. Les deux surfaces de l’adsorbant
doivent être parfaitement uniformes et horizontales.
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4.3.2.4. Introduction de l'échantillon
Les échantillons sont mis au sommeille de la colonne tel quel, alors que ceux solides
doivent dissoudre dans un petit volume du solvant le moins polaire de deux solvants. Il doit
être coulé soigneusement au sommeille, en une seule fois pour éviter toute turbulence et
former une couche cylindrique, fine et uniforme (robinet fermé). Ensuite, le robinet est
ouvert un court temps pour que l’échantillon puisse pénétrer dans l’adsorbant.
4.3.2.5. Développement ou élution
L’alimentation en solvant est faite manuellement ou avec une ampoule de coulée. Au
cours de la chromatographie, la surface de l’adsorbant ne doit être jamais en contact avec
l’air, et on doit s’assurer que le débit de l’alimentation en solvant est le même que celui de
l’élution (Fig. 04). On recueillit les fractions séparées dans des flacons et les conservées pour
l’analyse.
Figure 04: Schéma d’une colonne chromatographique classique
