Ecole Nationale Supérieure de Biotechnologie
"Toufik Khaznadar"
Chapitre 3:
Spectrophotométrie UV-Visible
Présenté par:
Dr. GASMI M.
La spectroscopie est l’étude quantitative des interactions entre la matière
et la lumière.
La spectrophotométrie est la mesure de l’interaction d’une radiation avec la
substance qui l’absorbe.
Lorsque de la lumière traverse une substance, elle est en partie transmise et
en partie absorbée.
Les solutions colorées ont la propriété d’absorber un domaine de longueur
d’onde du spectre visible.
Rappel sur la lumière
La lumière est l’ensemble des ondes électromagnétiques (radiations) visibles par
l’œil humain.
Une onde électromagnétique est caractérisée par sa longueur d’onde λ(m).
La lumière visible est l’ensemble des radiations dont la longueur d’onde est
comprise entre 400 et 800 nm:
Une lumière est dite monochromatique lorsqu’elle est constituée d’une seule
radiation lumineuse (donc d’une seule longueur d’onde).
Une lumière est dite polychromatique lorsqu’elle est constituée de plusieurs
radiations lumineuses (donc de plusieurs longueurs d’ondes).
Une espèce incolore n’absorbe aucune radiation du spectre visible.
Lorsqu’une espèce chimique n’absorbe que dans un seul domaine de longueurs
d’onde du visible, sa couleur est la couleur complémentaire de celle des
radiations absorbées.
Lorsqu’une espèce chimique absorbe dans plusieurs domaines de longueur
d’onde, sa couleur résulte de la synthèse additive des couleurs
complémentaires des radiations absorbées.
Étoile chromatique
Spectrophotomètre UV-visible
Un spectrophotomètre est un appareil qui comporte :
Une source de radiations polychromatique
Un monochromateur capable d’extraire une radiation monochromatique
L’échantillon à tester
Un détecteur
L’absorbance : définition et
mesure
grandeur qui caractérise la capacité d’une solution à absorber la lumière.
On la note A et elle n’a pas d’unité.
Lorsqu’on envoie une lumière monochromatique à travers une solution,
l’absorbance est définie par :
Les appareils de mesures usuels mesurent des absorbances comprises entre 0
et 2.
La transmittance T : (souvent en pourcentage)
De quels paramètres dépend A ?
A dépend de la longueur d’onde utilisée
Pour le permanganate de potassium :
Il laisse passer le violet : A ≈ 0
Il absorbe le jaune : A > 0
A dépend de la concentration
Deux solutions contenant la même espèce
absorbante mais de concentrations différentes
A dépend du diamètre du récipient contenant la
solution
A est d’autant plus grande que le diamètre du
récipient est grand
A, absorbance, est une grandeur sans dimension
l est souvent exprimée en cm, c en mol.L-1
ε est appelé coefficient d'absorption molaire (ou d’extinction molaire)
;ce coefficient dépend, pour une substance donnée, de la température T et
de λ et il s'exprime en cm-1.mol-1.L.
ε est un paramètre caractéristique de l’espèce absorbante, qui dépend
fortement de la longueur d’onde.
Validité de la loi de Beer-Lambert
La loi de Beer-Lambert n'est valable et n’est linéaire que si la concentration de
la substance dissoute est suffisamment faible (< 0,01mol.L-1).
à trop forte concentration :
I est trop faible, et le spectrophotomètre trop peu sensible pour donner des
valeurs cohérentes de A.
Additivité des densités optiques: notion du blanc réactif
Considérons une cuve de longueur l contenant une solution renfermant n
substances colorées, chacune ayant une Ci et un εi(λ) à la longueur d’onde et à la
T° considérées.
Chaque substance a une absorbance Ai= εi(λ).ℓ.ci.
L’expérience montre que pour les solutions diluées, l’absorbance totale A(λ) de
la solution est additive :
Mesures Spectrophotométriques
Choix de la longueur d’onde de travail
• Pour augmenter la précision de l’appareil et limiter l’incertitude sur les mesures
on se place à la longueur d’onde pour laquelle le ε est maximum.
Pour repérer la longueur d’onde λmax correspondante, on peut tracer la courbe
A=f(λ) pour une solution contenant l’espèce et lire la valeur λmax sur la courbe. On
appelle cette courbe le spectre d’absorption du compose considéré.
Pour déterminer la relation entre
l’absorbance et la concentration, on utilise la
longueur d’onde la plus absorbée par la
solution.
D’après le spectre d’absorption de l’exemple ci-dessus longueur d’onde = 530
nm correspondant à l’absorption maximal A (max) = 2,5.
Déroulement de la mesure
Afin d’étudier l’absorption de la lumière par une substance colorée seule, il
faut tenir compte du fait que de la lumière est absorbée également par la
cuve et le solvant.
Il faut alors ≪ faire le blanc ≫.
zéro électrique de l’appareil, on ramenant l’absorbance à zéro.
zéro optique de l’appareil en introduisant le blanc et on ramenant l’absorbance
à zéro.
Principe de calcul
Méthode algébrique: Connaissant l'absorbance du corps dissous, Ax ,on déduit
sa concentration de l'équation
Ax
Cx xCetalon
Aetalon
Aétalon est déterminé une fois pour toutes dans des conditions strictement
identiques sur une solution de concentration connue (Cétalon) placée dans la même
cuve ou dans une cuve identique.
Méthode graphique
On établit une courbe d’étalonnage avec plusieurs solutions étalons de
concentration connues et recouvrant la zone de la concentration voulue.
La concentration inconnue est déterminer par projection sur la courbe d’étalonnage.
Types d’étalonnage
Etalonnage processus qui relie le signal analytique mesuré à la concentration
de l’analyte.
Choix d’un procédé d’étalonnage tenir compte d’un « effet de matrice »
potentiel du milieu à doser.
Trois méthodes d'étalonnage;
Étalonnage externe
Méthode des additions connues
Méthode de l'étalon interne
Étalonnage externe
Si le milieu à doser ne modifie pas le signal mesuré étalonnage simple ou
externe.
Pour établir la courbe d'étalonnage, plusieurs étalons contenant des
concentrations de l'analyte connues avec précision sont introduits dans l'appareil
dont la réponse est enregistrée.
On corrige cette réponse à partir des résultats obtenus pour le blanc.
La réponse corrigée de l'appareil est alors portée en graphique en fonction de la
concentration de l'analyte Réponse = f (concentration).
La méthode des additions connues
utilisée lorsqu’il n’est pas possible de préparer un blanc adéquat Les éléments
du milieu modifiant le signal sont inconnus
Elle consiste à ajouter des quantités connues d’une solution étalon de l’analyte
(orange) à des prises de volume identique de l’échantillon (jaune)
Chaque volume est ensuite porté à un volume connu avant d’effectuer la
mesure.
Supposons que plusieurs prises de volume Vx de la solution inconnue de
concentration Cx soient transférées dans des fioles jaugées de volume Vt
A chacun de ces récipients, on ajoute un volume variable Vs d’une solution étalon
de l’analyte de concentration Cs.
On ajoute alors les réactifs et on complète alors au même volume total Vt avec
le même solvant que celui utilisé pour préparer la solution étalon.
La mesure instrumentale de chaque solution est alors effectuée; l’appareil
fournit un réponse S.
Si celle-ci est proportionnelle à la concentration, on peut écrire :
k est facteur constant
Le graphique S = f (Vs) est une droite d’équation S= m. Vs + b
m: la pente
b: ordonnée à l’origine
Méthode de l'étalon interne
Lors d’un étalonnage, il arrive fréquemment que la réponse du détecteur ne soit
pas parfaitement proportionnelle à la concentration de l’analyte cible, sur la
gamme de concentration choisie réponse non linéaire
Dans ce cas il faut utiliser un étalon interne substance dont on ajoute la
même quantité à tous les échantillons, aux blancs et aux étalons
L’étalon interne doit présenter les propriétés
suivantes :
Ne pas se trouver dans l’échantillon le
signal émis doit avoir comme origine seule la
quantité ajoutée.
Être distinguable des analytes cible.
Avoir des propriétés physiques et chimiques
proches de l’analyte.
L'étalonnage implique alors de porter en graphique le rapport du signal de
l'analyte à celui de l'étalon interne en fonction de la concentration de l'analyte
dans les solutions étalons.
On utilise alors ce rapport pour obtenir la concentration de l'analyte à partir
de la courbe d'étalonnage.
TEST DE REJET – QUOTIENT « Q » ou TEST DE DIXON
Il peut arriver qu’une valeur dans un ensemble semble aberrante On peut
être tenté de la rejeter.
Une mesure ne soit aberrante qu’en référence à une loi de probabilité donnée.
Il existe un critère statistique simple pour conserver ou rejeter cette valeur
« hors-la-loi ».
On fait le test de Dixon qui consiste à calculer le rapport suivant (à condition
qu’il y ait au moins 3 mesures) :
On compare Q ainsi calculé à une table des valeurs critiques de Q en fonction
du nombre de données. Si Q calculé est supérieur à Q critique, la donnée peut
être rejetée
Applications de la spectrophotométrie
Domaines d’utilisation: pharmaceutique, agroalimentaire, environnement.
vérification de la pureté des matières premières destinées à l’industrie,
la détermination de la teneur en un composé dans un aliment donné.
Les méthodes spectroscopiques sont utilisées pour analyser les macromolécules
parce que ce sont des techniques d'analyse non destructrices.
