Université Internationale de Libreville
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Etablissement : Institut International de Recherches Biomédicales et
Biotechnologie Carles Luce Donal KAMBANGOYE (IRBK)
THEME :
MISE AU POINT D’UNE TECHNIQUE
D’EXTRACTION DE L’ADN DE LA
MOUCHE BLANCHE
Présenté par :
OYONO Christ-Robert
OGOULA BOUKOUET
NGAGNAKA Jonny
KABA SAMOURA
MBOU BARRY
NDONG ESSONO
NIONDO BOYISSA
Sous la direction de :
Dr ZOA ASSOUMOU
INTRODUCTION
La mouche blanche (Bemisia tabaci) est un ravageur agricole majeur
et un vecteur de virus phytopathogènes, causant des pertes
économiques importantes. L’extraction d’ADN de haute qualité est
essentielle pour des analyses moléculaires telles que la PCR et le
séquençage, permettant l’identification des espèces, l’étude de la
diversité génétique et la détection de pathogènes associés [Shatters et
al., 2009]. Ce projet vise à optimiser une méthode d’extraction d’ADN
à partir de mouches blanches, adaptée aux contraintes des laboratoires
à ressources limitées, en utilisant une approche basée sur le phénol-
chloroforme (Shetty, 2020).
OBJECTIF GENERAL : obtention d'un ADN de bonne qualité et pure pour
permettre des analyses moléculaires fiable.
OBJECTIFS SPECIFIQUES :
➢ Obtention d’un ADN intact et de bonne qualité.
➢ Qui nous permettra de réaliser des analyses précises (PCR , sequenssage
etc.. ) sans interférence avec des éventuels inhibiteurs.
➢ Faciliter les applications en recherche et en diagnostic.
exemple 1 : étude génétique
exemple 2 : détection des pathogènes.
MATERIEL
• Mouche blanche (Bemisia tabaci)
• PBS (tampon de phosphate salin) ou tampon de lyse.
• Protéinase k (20mg/mL)
• SDS (sodium dodesyl sulfate) a 100%
• Phenol chloroforme
• Éthanol (70 % et 100 %)
• Acétate de sodium (3 M, pH 5.2)
• Eau pure
• Pilon et mortier
• Centrifugeuse
• Kit l’extraction
• Spectrophotomètre (ex. : NanoDrop)
PROTOCOLE
➢ Collecte des échantillons :
o Prélever 10–20 mouches blanches à l’aide d’un pinceau fin
o Conserver dans l’éthanol à 70% rincez 2 fois avec le PBS.
➢ Préparation des échantillons :
o Sécher brièvement sur papier-filtre
o Placer les insectes dans un micro tube 180uL de tampon de lyse (
SDS 1%) et 20uL de protease K(20mg/mL).
➢ Lyse
o Incuber à 56 °C pendant 1 à 2h.
o Ajouter 200mL de phénol chlorophorme., vortex pendant 30s.
➢ Purification
o Centrifugé à 12000 RPM pendant 10 min.
o Transférer délicatement la phase aqueuse dans un nouveau tube.
o Ajoutez 1/10 du volume d’acétate de sodium 3M(20mL)
➢ Precipitation de l’ADN
o Mélangez doucement et incubé à 20 °C pendant 30 min.
o Centrifuger à 14000 RPM pendant 15 min.
o Laver le culot avec 500uL d’éthanol a 70%
o Sécher à l’air 10min où sous la hote.
➢ Resuspension
o Rincer dans 50 à 10uLde tampon de TE.
Références
Shatters, R. G., et al. (2009). Reliable molecular identification of nine
tropical whitefly species. Entomologia Experimentalis et Applicata.
Manu, S., & Umapathy, G. (2023). Rapid and zero-cost DNA
extraction from soft-bodied insects for routine PCR-based
applications. PLoS ONE.
Shetty, P. J. (2020). The Evolution of DNA Extraction Methods.
American Journal of Biomedical Science & Research.
Xin, Z., et al. (2003). High-throughput DNA extraction method
suitable for PCR. BioTechniques.
Walden, C., et al. (2017). Evaluation of DNA extraction methods and
direct PCR in metabarcoding of mock and marine bacterial
communities. Frontiers in Microbiology.
