MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET
DE LA RECHECHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE AHMED ZABANA «
RELIZANE »
Département des sciences écologique et
environnement
Spécialité écologie
Introduction :
Comprendre la composition biochimique des végétaux
permet d’appréhender leur fonctionnement interne, leur
vitalité et leur capacité d’adaptation face aux conditions
environnementales. Les pigments photosynthétiques, en
particulier les chlorophylles A et B ainsi que les
caroténoïdes, sont au cœur de ce processus. Ils assurent la
capture de la lumière indispensable à la photosynthèse et
jouent un rôle clé dans la défense contre le stress oxydatif.
Leur mesure constitue un indicateur pertinent de l’activité
photosynthétique et de l’état physiologique des plantes.
Par ailleurs, l’analyse des sucres, tels que le glucose et les
sucres solubles totaux, renseigne sur l’activité métabolique
de la plante, ces molécules représentant des produits
primaires de la photosynthèse et remplissant diverses
fonctions biologiques. Pour ce faire, des méthodes
spectrophotométriques comme celle de Dubois pour les
sucres totaux, ou les techniques enzymatiques pour le
glucose, sont couramment utilisées en raison de leur
fiabilité et de leur précision.
Ce travail expérimental a pour objectif d’appliquer ces
méthodes analytiques afin de déterminer la teneur en
pigments et en sucres d’extraits végétaux, et d’interpréter
les résultats obtenus dans une perspective physiologique.
Dosage de la chlorophylle a, de la
chlorophylle b et des caroténoïdes
selon la méthode de Lichtenthaler
Matériel utilisé :
Balance de précision
Tubes en verre (15 à 20 ml)
Acétone à 95 % (solvant)
Feuilles fraîches de caroubier (Ceratonia
siliqua)
Réfrigérateur réglé à 4 °C
Papier aluminium ou boîte opaque
Filtre (papier filtre ou gaze)
Pipette graduée ou micropipette
Cuvettes compatibles avec le
spectrophotomètre
Spectrophotomètre UV-Visible
Protocole expérimental :
1. Préparation de l’échantillon
Prélever 100 mg de feuilles fraîches de
caroubier et les découper en petits fragments
afin de faciliter l’extraction des pigments.
Introduire ensuite ces fragments dans un tube
en verre propre.
2. Extraction des pigments
Ajouter 10 ml d’acétone à 95 % dans le tube,
bien le refermer, puis le placer au réfrigérateur
à l’obscurité (enveloppé dans du papier
aluminium ou placé dans une boîte opaque)
pendant 48 heures.
3. Filtration de l’extrait
Après incubation, filtrer le contenu du tube afin
de séparer l’extrait pigmentaire de la matière
végétale solide.
4. Mesures spectrophotométriques
Transférer l’extrait filtré dans une cuvette, puis
mesurer l’absorbance aux longueurs d’onde
suivantes :
663 nm pour la chlorophylle a
647 nm pour la chlorophylle b
470 nm pour les caroténoïdes
Formules de calcul (Lichtenthaler, 1987) :
Chlorophylle a (Ca, g/ml) = (12,25 × DO663) –
(2,79 × DO647)
Chlorophylle b (Cb, g/ml) = (21,50 × DO647) –
(5,10 × DO663)
Caroténoïdes totaux (g/ml) = [(1000 × DO470)
– (1,82 × Ca) – (85,02 × Cb)] / 198
Résultats obtenus :
DO663 = 0,634
DO647 = 0,240
DO470 = 0,744
Après application des formules, les
concentrations en pigments sont les
suivantes :
Chlorophylle a : 7,207 g/ml
Chlorophylle b : 1,926 g/ml
Caroténoïdes totaux : 2,864 g/ml
Analyse des résultats :
○ Le rapport Chlorophylle a / Chlorophylle
b est de 3,74, traduisant une nette
dominance de la chlorophylle a, typique
d’un bon fonctionnement
photosynthétique.
○ Le rapport (Chl a + Chl b) / caroténoïdes
est de 3,19, ce qui reflète un équilibre
physiologique favorable entre les
pigments chlorophylliens et les
caroténoïdes, ces derniers jouant
également un rôle protecteur contre le
stress oxydatif.
○Ces résultats indiquent que la plante
analysée se trouve dans un bon état
physiologique, avec une activité
photosynthétique efficace et une bonne
adaptation à la lumière.
Dosage du glucose par
spectrophotométrie
Matériel utilisé :
Glucose pur (sous forme de poudre)
Balance de précision
Fiole jaugée de 100 mL
Béchers
Pipettes graduées ou micropipettes
Eau distillée
Tubes à essai ou fioles de 10 mL
Spectrophotomètre (réglé à 485 nm)
Cuvettes (en plastique ou en quartz)
Équipements de protection individuelle :
blouse, gants, lunettes
Support de prise de notes
Protocole expérimental :
1. Préparation de la solution mère
(concentration : 10 mg/mL)
○Prélever 1 g de glucose pur à l’aide de la
balance de précision.
○Le dissoudre dans un volume approprié
d’eau distillée dans un bécher.
○Transférer la solution dans une fiole
jaugée de 100 mL, puis compléter
jusqu’au trait avec de l’eau distillée.
○Homogénéiser soigneusement la
solution obtenue.
Préparation de la gamme étalon :
À partir de la solution mère, préparer les dilutions suivantes,
chacune ayant un volume final de 10 mL.
1. Mesure de l’absorbance :
○Régler le spectrophotomètre à une longueur d’onde de 485 nm.
○Employer le tube n°11 (contenant uniquement de l’eau distillée)
comme blanc de référence.
○Relever l’absorbance (DO) de chaque solution testée.
2. Établissement de la courbe d’étalonnage :
Représenter graphiquement l’absorbance (DO) en fonction des
concentrations (mg/ml).
Si la relation observée est linéaire, appliquer une droite de
régression.
3. Analyse de l’échantillon inconnu :
Mesurer l’absorbance de l’échantillon inconnu.
Estimer sa concentration à partir de la courbe d’étalonnage.
Résultats dcourbe d’étalonnage
Équation de la droite de régression :
Y = 0,0097x – 0,0168
Y : Absorbance mesurée
X : Concentration en glucose (mg/ml)
0,0097 : Coefficient directeur indiquant l’augmentation de
l’absorbance pour chaque mg/ml de glucose ajouté
-0,0168 : Ordonnée à l’origine, correspondant à l’absorbance
théorique en l’absence de glucose
Coefficient de détermination :
R² = 0,6327, ce qui signifie que 63,27 % de la variation de
l’absorbance est attribuable à la variation de la concentration en
glucose.
Un R² proche de 1 indique une relation linéaire forte.
Ici, R² = 0,63 suggère une corrélation modérée : la tendance est
globalement linéaire, mais des imprécisions sont possibles.
Causes possibles d’imperfections :
Éventuelles erreurs expérimentales
Conditions de mesure peu constantes
Utilisation de l’équation :
Cette équation peut servir à estimer la concentration d’un
échantillon inconnu, mais avec une précision limitée.
Dosage des sucres solubles totaux (méthode de
Dubois et al., 1956)
Matériel requis :
Balance, tubes à essai, pipettes graduées
Bain-marie (80 °C), agitateur vortex
Spectrophotomètre (485 nm)
Éthanol 80 %, eau distillée
Phénol 5 %, acide sulfurique concentré
Étapes du protocole :
Extraction :
Réduire en poudre 100 mg de matière végétale sèche
Ajouter 3,4 ml d’éthanol 80 %, laisser 48 h à l’abri de la lumière
Évaporation :
Chauffer au bain-marie pour éliminer l’éthanol
Ajouter 20 ml d’eau distillée pour solubiliser les sucres
Réaction colorimétrique :
Prélever 2 ml d’extrait, ajouter 1 ml de phénol 5 %
Ajouter 5 ml d’acide sulfurique concentré lentement
Homogénéiser avec vortex (apparition d’une coloration jaune-
orangée)
Mesure :
Laisser reposer 15–20 min
Lire l’absorbance à 485 nm
Principe :
L’intensité de la couleur formée est proportionnelle à la quantité de
sucres solubles présents.
Conclusion :
Les travaux pratiques réalisés ont mis en évidence l’utilité des
dosages biochimiques pour mieux comprendre les fonctions
physiologiques des plantes. L’analyse des pigments
chlorophylliens (chlorophylle A, B et caroténoïdes) a permis
d’observer des variations de teneurs, reflétant l’intensité de
l’activité photosynthétique et l’adaptation des tissus végétaux à
leur environnement. Par ailleurs, le dosage du glucose et des sucres
solubles totaux a permis d’estimer les réserves énergétiques,
directement liées à la photosynthèse.
Les techniques spectrophotométriques utilisées se sont révélées
simples, sensibles et adaptées à l’étude des composés organiques
végétaux. Elles représentent des outils indispensables en
physiologie végétale, en agronomie et en écologie, en fournissant
des indicateurs pertinents de l’état biochimique des plantes.
