‫الجوهىريت الجسائريت الديوقراطيت الشعبيت‬

RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE

‫وزارة التعلين العبلي والبحث العلوي‬
MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
Université des Frères Mentouri Constantine1 1 ‫جبهعت األخىة هنتىري قسنطينت‬
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie ‫كليت علىم الطبيعت والحيبة‬

‫قسن الكيويبء الحيىيت والبيىلىجيب الخلىيت والجسيئيت‬

Département de Biochimie et Biologie Cellulaire et Moléculaire
Mémoire présenté en vue de l’obtention du Diplôme de Master
Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences Biologiques
Spécialité : Biochimie Appliquée

Intitulé:

Etude phytochimique et l’évaluation in vitro des

activités antioxydantes, anticholinestérase,
antidiabétique et anti-inflammatoire des extraits
d’Eriobotrya japonica

Présenté et soutenu par : BAADECHE TAKOUA BALKISS Soutenu le : 27/09/2020

BENHACINE MANEL

Jury d’évaluation :
Présidente du jury : Mr. MOKRANI (MAA - UFM Constantine1).

Rapporteur : Mme. KLIBET (MCB- UFM Constantine1).

Examinatrice : Mme. TENIOU (MAA- UFM Constantine1).

Année universitaire
2019 -2020
 Remerciements
Tout d’abord, nous remercions dieu tout puissant qui nous a donné la force et la
chance d’achever ce modeste travail.

Nous adressons nos sincères remerciements à Mme KLIBET F maitre de

conférences « B » à l’université des frères mentouri, pour sa patience, sa
disponibilité et surtout ses judicieux conseils qui ont contribué pour la réalisation
de ce mémoire.

Nous tenons à remercier Mr MOKRANI E.H maitre assistant « A » à

l’université des frères mentouri, de l’honneur que vous nous avez fait en
acceptant de présider notre jury.

Nous remercions également Mme TENIOU S maitre assistante « A » à

l’université des frères mentouri d’avoir accepter d’examiner notre travail.

Nous souhaitons présenter nos sincères remerciements à Mr HOUASSNIA

MOURAD chef du laboratoire d’électrophorèse au centre de recherche en
biotechnologie, pour tout ce qu’il nous a présenté comme soutien et conseil
précieux tout au long de notre stage

Un grand merci également a tout le personnel du laboratoire de biochimie et

d’électrophorèse : Mr BENSOUICI CHAWKI, Mme HANANE, Mme
LINDA, Mr MEHDI, Mme IBTISSEM, Mr HATEM et Mme ROKAYA.

Merci pour tous ceux qui ont participé à la réussite de ce mémoire.

 Dédicace
Je dédie ce modeste travail avec le profond remerciement, aux êtres les plus chères
à mon cœur.

A mes très chers parents

Je ne pourrai jamais assez-vous dire merci pour les conseils, le soutien, les
encouragements et pour les prières qui m’ont accompagnés tout au long de mes
études. Ce travail est le fruit de tous vos sacrifices, tous ces mots ne traduisent
pas l’amour que je ressens pour vous.
Que Dieu vous garde longtemps près de moi

A mon très cher frère Djaoued, les mots ne suffisent guère pour exprimer
l’attachement, l’amour et l’affection que je porte pour toi. Mon ange gardien et
mon fidèle compagnon dans les moments les plus délicats de cette vie mystérieuse.

A toute ma famille pour leur encouragement durant toute la réalisation de mon

mémoire surtout ma tante Meriem qui a su manifester son grand intérêt pour ce
travail

A mes très chère amies Manar et Choubeila

A ma chère binôme Takoua pour son soutien et affection durant touts ces
longues années d’études, ainsi que tout sa famille « BAADECHE »

Manel
 Dédicace
Avec l'expression de ma reconnaissance je dédie ce modeste travail :

À mes chers parents, mon précieux offre de Dieu, source de vie, d'amour et
d’affection, pour leurs sacrifices leur tendresse, leur soutien et prières, qui ont fait
de moi ce que je suis aujourd'hui.

Particulièrement à mon cher oncle Docteur Ayachi Boubakeur, source d'espoir et de

motivation ,qui n'a pas cessé de me conseiller, encourager et soutenir tout le long de
mon parcours, que Dieu Le Tout-Puissant lui préserve et lui accorde santé
et bonheur.

À ma sœur Rofeida, ma fièreté, qui a toujours été présente à mes côtés pour me
consoler quand il fallait.

À mes adorables frères Mohamed et Tedjeddine qui savaient toujours comment

procurer la joie pour toute la famille.

Sans oublier Manel, ma chère binôme pour son soutien moral, sa patience et
compréhension, ainsi que sa famille (BENHACINE).

Takoua balkiss
 Sommaire

Liste des abréviations

Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction générale ..................................................................................................1

Partie I. Etude bibliographique (Chapitre I & II)

Chapitre I. Les activités Biologiques

I.1. Les polyphénols .................................................................................................3

I.2. Les flavonoïdes....................................................................................................3
I.3. Activité antioxydants .........................................................................................4
I.4. Activité enzymatique ..........................................................................................5
I.4.1. L’activité antidiabétique .............................................................................6
[Link]é anticholinestérase ..........................................................................6
I.5. Activité anti-inflammatoire ................................................................................7
I.6. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro) .....................................9

Chapitre II. Eriobotrya japonica L

II.1. Historique ...........................................................................................................11

II.2. Noms vernaculaires de la plante .....................................................................12
II.3. Description botanique de la plante .................................................................13
II.4. Caractéristiques des différentes parties de la plante ....................................13
II.5. Classification botanique d’Eriobotrya japonica ...............................................15
II.6. Habitat de la plante ...........................................................................................16
II.7. Composition biochimique de la plante...........................................................17
II.8. Propriétés médicinales de la plante ................................................................18
II.9. Les activités biologiques ...................................................................................19
II.10. Toxicité d’Eriobotrya japonica .....................................................................21
Partie II. Etude pratique (Chapitre III & IV)

Chapitre III. Matériels et méthodes

III.1. Matériel végétal .............................................................................................22

III.2. Macération et extraction ...............................................................................22
III.2.1. Macération ...............................................................................................22
III.2.2. Extraction .................................................................................................23
III.3. Activité biologiques ......................................................................................25
III.3.1. Estimation du contenu total en polyphénols (TPC) ..........................25
III.3.2. Estimation du contenu total en flavonoïdes (TFC) ............................26
III.3.3. Activité antioxydants ..............................................................................27
III.3.3.1. Activité antiradicalaire au DPPH• ..............................................27
III.3.3.2. Activité du piégeage du cation radical ABTS•.........................29
III.3.3.3. Activité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne
(CUPRAC) ......................................................................................31
III.3.3.4. Activité du pouvoir réducteur (FRAP) ......................................32
III.3.3.5. Activité de réduction par la formation du complexe Fe+2-
phénantroline .................................................................................33
III.3.3.6. Activité Silver nanoparticle (SNP) ..............................................34
III.3.4. Activité enzymatique ..............................................................................35
III.3.4.1. Evaluation de l’activité antidiabétique .......................................35
III.3.4.2. Evaluation de l’activité anticholinestérase .................................37
III.3.5. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro) ........................39
III.4. Etude statistiques............................................................................................41

Chapitre IV. Résultats et discussion

IV.1. Détermination du contenu total en polyphénols et la teneur des

flavonoïdes ......................................................................................................42
IV.1.1. Estimation du contenu total en polyphénols (TPC) ..........................42
IV.1.2. Estimation du contenu total en flavonoïdes (TFC) ............................44
IV.2. Activité antioxydants .....................................................................................46
IV.2.1. Activité antiradicalaire au DPPH• .......................................................46
IV.2.2. Activité du piégeage du cation radical ABTS• ..................................48
 IV.2.3. Activité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne
(CUPRAC) ..................................................................................................50
IV.2.4. Activité du pouvoir réducteur (FRAP) ...............................................52
IV.2.5. Activité de réduction par la formation du complexe
Fe+2phénantrolin........................................................................................54
IV.2.6. Activité Silver nanoparticle (SNP) .......................................................57
IV.3. Activité enzymatique .....................................................................................58
IV.3.1. Evaluation de l’activité antidiabétique.................................................58
IV.3.2. Evaluation de l’activité anticholinestérase ..........................................60
IV.4. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro) ................................61

Conclusion et perspectives ......................................................................................64

Références bibliographiques ..................................................................................66

Annexes

Résumé
 Liste des abréviations
A0.5 : Concentration indiquant 0,50 d’absorbance
ABTS: Sel d’ammonium de l’acide 2,2’-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6
sulfonique)
AChE : Acétylcholinestérase
ATS : Anti-inflammatoires stéroïdiens
ATNS : Anti-inflammatoires non stéroïdiens
BChE : Butyrylcholinestérase
BHA : Butylhydroxyanisole
BHT : Butylhydroxytoluène
BPCO : Bronchopneumopathie chronique obstructive
BSA: Albumine sérique bovine
°C : Degré Celsius
CB : bronchite chronique
CI50 : Concentration d’inhibition à 50%
COX-1 : Cyclooxygénase 1
COX-2 : Cyclooxygénase 2
CUPRAC : Complexe cuivre- néocuproïne
DPPH : α, α-diphényl-β-picrylhydrazyl
DTNB : Acide 5,5´-dithio-bis (2-nitrobenzoique)
EAG : Équivalent de l’acide gallique
EAEJ : Extrait acétate d’éthyle de la plante Eriobotrya japonica L
EBEJ : Extrait butanolique de la plante Eriobotrya japonica L
EDEJ : Extrait dichlorométhane de la plante Eriobotrya japonica L
EDTA : Acide éthylènediaminetétraacétique
ELTA: Eriobotrya japonica leaf triterpene acid
EOA: Espéces oxygénées activeés
EQ : Équivalent de la quercétine
FCR : Folin-Ciocalteu
FRAP : Pouvoir réducteur
GOR : Radical Galvinoxyl
IL-1beta: Interleukine 1 beta
IL-8: Interleukine 8
LOX: Lipoxygénases
iNOS : oxyde nitrique synthase
Mg : Milligramme
NAFLD : Maladie hépatiques grasses non alcooliques
Nm : Nanomètre
NO : Nitric oxide
NP : Nanoparticle
PH: Potentiel hydrogène
PLA 2: Phospholipase A2
ppm : Partie par million
R’’: Radicaux libre
SD : Standard de déviation
SNP: Silver nanoparticle
TEAC : Capacité antioxydante équivalente Trolox
TFC : Contenu total en flavonoïdes
TNF-alpha: Tumor necrosis factors – alpha
TNB: l’acide 5-thio 2-nitrobenzoique
TPC : Contenu total en polyphénols
TR : Temps de rétention
Trolox : Acide 3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyl-2H-1-benzopyran-2-
carboxylique
 Liste des figures

Figure 1 : bibaces et oiseau des montagnes, peinture chinoise ..................................... 12

Figure 2 : les différentes parties de loquat ......................................................................... 15

Figure 3 : les fractions d’Eriobotrya japonica ...................................................................... 23

Figure 4 : Protocole de préparation des fractions d’Eriobotrya japonica......................... 24

Figure 5 : Structure de base des flavonoïdes .................................................................... 26

Figure 6 : Transformation du radical DPPH• en DPPHH ............................................... 28

Figure 7 : Formation et piégeage du radical ABTS•+ par un antioxydant donneur de

H• ............................................................................................................................................. 30

Figure 8 : Réduction du complexe chromogène de Cu+2-Nc2 ......................................... 31

Figure 9 : Mécanisme réactionnel intervenant lors du test FRAP entre le complexe

Tripyridyltriazine ferrique Fe (III)-TPTZ et un antioxidant (AH) ................................. 32

Figure 10 : Formation du complexe Fe+2-phénantroline ................................................. 34

Figure 11 : Récapitulatif des différentes solutions préparées ......................................... 37

Figure 12 : Mécanisme chimique de la méthode .............................................................. 38

Figure 13 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique ........................................................ 42

Figure 14 : Représentation graphique des teneurs en phénols totaux des extraits des
feuilles d’Eriobotrya japonica L .............................................................................................. 43

Figure 15 : Courbe d’étalonnage de la quercétine ............................................................ 44

Figure 16 : Représentation graphique des teneurs en flavonoïdes des extraits des

feuilles d’Eriobotrya japonica L .............................................................................................. 45

Figure 17 : IC50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité antiradicalaire au

DPPH de différents extraits d’Eriobotrya japonica L .......................................................... 47

Figure 18: IC50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité du piégeage du cation
radical ABTS•+ de différents extraits d’Eriobotrya japonica L ......................................... 49
Figure 19 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de Activité de réduction du
complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC) de différents extraits d’Eriobotrya
japonica .................................................................................................................................. 51

Figure 20 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité du pouvoir

réducteur de différents extraits d’Eriobotrya japonica .................................................... 53

Figure 21 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité de réduction par la

formation du complexe Fe+2- phénantroline de différents extraits d’Eriobotrya
japonica ................................................................................................................................... 56

Figure 22 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité de silver nanoparticules

(SNP) de différents extraits d’Eriobotrya japonica ........................................................... 57

Figure 23 : CI50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité inhibitrice d’alpha-

amylase de différents extraits d’Eriobotrya japonica ....................................................... 59
 Liste des tableaux

Tableau 1 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude du contenu

total en polyphénols des extraits d’Eriobotrya japonica L ................................................ 42

Tableau 2 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude du contenu

total en flavonoïdes des extraits d’Eriobotrya japonica L ................................................. 45

Tableau 3 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre d’Activité antiradicalaire

au DPPH : valeurs d’Inhibition enregistrées et IC50 calculées ...................................... 47

Tableau 4: Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’activité du piégeage

du cation radical ABTS•+: valeurs d’Inhibition enregistrées et IC50 calculées .......... 49

Tableau 5 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de Activité de réduction

du complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC) : valeurs d’absorbance enregistrées et
A0,5 calculées........................................................................................................................... 50

Tableau 6 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

du pouvoir réducteur : valeurs d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées ................ 52

Tableau 7 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

de réduction par la formation du complexe Fe+2- phénantroline : valeurs
d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées ........................................................................ 54

Tableau 8 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

silver nanoparticules (SNP) : valeurs d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées ...... 56

Tableau 9 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

inhibitrice d’alpha-amylase : pourcentage d’inhibition enregistrées et valeurs IC50
calculées .................................................................................................................................. 58

Tableau 10 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

inhibitrice de l’acétylcholinestérase : valeurs d’absorbance enregistrées ..................... 60

Tableau 11 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

inhibitrice de la butyrylcholinestérase : valeurs d’absorbance enregistrées ................ 60

Tableau 12 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

d’inhibition de la dénaturation de l'albumine sérique bovine : pourcentage
d’inhibition enregistrée ....................................................................................................... 61
Introduction
Générale
 Introduction générale

Introduction générale

La nature nous a dotés de différentes plantes médicinales, l’homme les utilise dans
la recherche des aliments, et à réussi à distinguer ceux qui ont des effets biologiques
et pharmacologiques, les connaissances acquises par l'homme vont être utilisés pour
soigner les maladies et pour développer de nouveaux médicaments à base de plante,
donc les plantes médicinales ont un rôle majeur dans la médecine moderne et
traditionnelle dans le monde. (Sandberg et al. 2001).

Les propriétés thérapeutiques des plantes sont dues à la présence de centaines,

voire des milliers de composés naturels bioactifs appelés : Les métabolites
secondaires tels que ; les terpènes, les alcaloïdes et les composés phénoliques.
(Akrout et al., 2001). Ces derniers sont utilisés comme des agents préventifs anti-
inflammatoires, antimicrobien, antiseptique, anti-carcinogène, antidiabétique et anti-
alzheimer mais essentiellement antioxydant qui défendent contre le stress oxydant.
(Bourgaud et al., 2001 ; Kar, 2007).

Le stress oxydant est lié à de nombreuses pathologies, par exemple

l’athérosclérose, les cancers, le diabète de type 2, les maladies neurodégénératives et
rhumatismales. C’est pour cela que la recherche sur les antioxydants dans les plantes
s’est beaucoup développée ces dernières années, afin de permettre de trouver les
meilleurs antioxydants possibles dans l’espoir de protéger notre santé et même
guérir ces différentes maladies.

Actuellement, les scientifiques favorisent le développement d’une nouvelle

génération de substances antioxydantes d’origine végétale pour remplacer celles de
synthèse. De même,un certain nombre de secteurs industriels se tournent de
nouveau vers l’incorporation de ces molécules aux caractéristiques biologiques
intéressantes dans leurs formulations.
A cet effet, des études scientifiques s’intéressent à la phytochimie et aux activités
biologiques des extraits des plantes, dans le but d’élargir les perspectives de
valorisation des produits naturels (Taviano et al. 2013).
1
 Introduction générale

L’utilisation des médicaments : les anti-inflammatoires, les anti-diabétiques et les

anti-alzheimer… à long cours est souvent associé à des effets indésirables tels que ;
les ulcères gastro-intestinaux et l’insuffisance rénale…, cependant le recours aux
ressources naturelles et plus particulièrement aux plantes médicinales devient une
importante voie alternative à explorer a fin de découvrir des médicaments efficaces à
moindre effets secondaires. (Ouédraogo et al., 2012).

Dans ce cadre, l’objectif de notre travail vise à démontrer l’évaluation des activités
biologiques et l’étude phytochimique de la plante Eriobotrya japonica L.

 La première partie de ce manuscrit est consacrée à une synthèse

bibliographique, qui Comporte un premier chapitre sur les activités
biologiques ; antioxydante, anticholinestérase, antidiabétique et anti-
inflammatoire, Un deuxième chapitre généralité sur la plante Eriobotrya
japonica L.
 La seconde partie (la partie expérimentale) comportant la description du
matériel biologique, les méthodes d’extraction, et les méthodes d’évaluation in
vitro des activités antioxydante, anticholinestérase, antidiabétique et l’activité
anti-inflammatoire ainsi que les résultats obtenus et leurs discussions.
 En dernier lieu, une conclusion sera donnée pour restituer les principaux
résultats obtenus et les perspectives voulues pour pouvoir compléter et
améliorer cette étude.

2
 Etude
Bibliographique
Chapitre I
Les Activités Biologiques
Etude bibliographique Activités biologiques

I. Les activités biologiques

Les activités biologiques des plantes aromatiques et médicinales sont connues
depuis l'antiquité. Ces propriétés sont dues essentiellement à la fraction d'huile
essentielle et aux composés phénoliques contenues dans les plantes

I.1. Les polyphénols

Les composés phénoliques jouent un rôle important dans la santé humaine en
raison de leurs activités pharmacologiques diverses comme antivirales, anti-
inflammatoires, anticancéreuses, antiallergiques, antimicrobiennes, cardioprotectives
et vasodilatoires. En outre, ils peuvent prévenir la modification oxydative par
neutralisation et piégeage des radicaux libres, ou réduction des métaux par
l'intermédiaire de leurs activités antioxydantes (Ladoh et al., 2015).
Les composés phénoliques végétaux constituent l'un des principaux groupes de
composés agissant comme antioxydants primaires ou terminateurs de radicaux
libres. Les polyphénols végétaux son multifonctionnels en ce sens qu'ils peuvent agir
comme agents réducteurs, donneurs d'atomes d'hydrogène et piégeurs d'oxygènes
singlets. Certains polyphénols sont également efficaces en tant qu'antioxydants
capables de chélater les ions des métaux de transition qui, autrement pourraient
induire des réactions d'oxydation de type Fenton à l'état libre (Rice-Evans et al., 1996
; Karaman et al., 2009).

I.2. Les flavonoïdes

Les flavonoïdes constituent le groupe majeur des antioxydants phénoliques
dérivés des plantes médicinales (Ouyang et al., 2018) . Y compris ; les flavones, les
flavonols, les isoflavones, les flavonones et les chalcones, sont présents dans tous les
types de tissus végétaux supérieurs (Herrmann, 1993 ; White et Xing, 1997). Les
flavones et les flavonols sont présents dans presque toutes les plantes, en particulier
dans les feuilles et les pétales, les flavonols étant plus fréquents que les flavones
(Herrmann, 1976). Il a été signalé que les flavonoïdes peuvent agir comme
antioxydants en piégeant des radicaux tels que ; les radicaux anioniques superoxydes
(Robak et Gryglewski, 1988 ; Hu et al., 1995), les radicaux peroxydes lipidiques

3
Etude bibliographique Activités biologiques

(Takahama , 1985) et les radicaux hydroxyles (Husain et al., 1987), l'extinction de

l'oxygène singulet (Takahama ,1984), la chélation des ions métalliques (Ra-
manathan et Das 1993) et l'inhibition des lipoxygénases (Voss et al., 1992). Parmi les
flavonoïdes les plus courants, on trouve l'apigénine, la chrysine, la lutéoline, la
datiscetine, la quercétine, la myricétine, le morin et le ka-empférol. De plus, la
plupart des flavonoïdes présents dans les plantes se présentent sous forme de
glycosides (Macheix et al., 1990).

I.3. Activité antioxydante

 Radicaux libres

Les radicaux libres (R.) sont des molécules ou des atomes qui possèdent un ou

plusieurs électrons non apparient sur leur couche extrême. Ce sont des espèces
chimiques instables, tés réactives, et possèdent un temps de demi-vie extrêmement
court (10‐9 - 10-6 S), qui peuvent être formées par la perte ou le gain d’électrons a
partir d’un compose non radical. Ils peuvent aussi apparaitre au moment de la
rupture symétrique d’une liaison covalente après laquelle chaque atome conserve un
électron et devient un radical libre (Haliwell et Gutteridge, 1989).

Les origines des radicaux libres soit :

 D’origine exogène: produits des radiations (rayons X et lumiere UV),

polluants de l’air (N, NO2), solvants organiques, anesthé-siques,

pesticides, drogues, xénobiotiques et hyperoxie (Haliwell et

Gutteridge, 1989).
 D’origine endogène : ils sont produits, en majorité, au niveau des
chaines respiratoires mitochondriales des cellules des organismes
aérobies.

4
Etude bibliographique Activités biologiques

 Stress oxydant

En 1991, Sies a défini la notion de stress oxydant comme l’incapacité de

l’organisme à se défendre contre l’agression des espèces oxygénées activées, suite à
un déséquilibre lié, soit à une production accrue d’EOA ( espèces oxygénées activées
), soit à une diminution de la capacité de défense antioxydants .

 Les antioxydants

Les antioxydants sont des composés capables à ralentir ou à empêche les

processus d'oxydation qui se produisent sous l'influence d’une espèce réactive
oxygénée (Pisoschi et Negulescu, 2011). Ils préviennent l'oxydation des
macromolécules en donnant de l'hydrogène, la désactivation des radicaux par
création d’addition covalente, la réduction des métaux ou de peroxydes, la
complexation d’ions et de métaux de transition et le captage de l’oxygène singulet.

Il existe deux types d’antioxydants :

 Les antioxydants naturels : La vitamine E et l'acide ascorbique (Dugan et al.,

1979).

 Les antioxydants synthétiques : l'hydroxytoluéne butylé, l'hydroxyanisole

butylé et l’éthoxyquine (simic et karel, 1979).

I.4. Activité enzymatique

Les enzymes sont des catalyseurs biologiques qui jouent un rôle important dans
les réactions biochimiques nécessaires pour la croissance, la maturation et la
reproduction des êtres vivants. Leur quantification par mesure de l’activité
catalytique dans les échantillons biologiques est importante dans divers domaines
(Glatz, 2006).

5
Etude bibliographique Activités biologiques

I.4.1. L’activité antidiabétique

Le diabète est une maladie complexe tant par ses mécanismes
physiopathologiques que par son déterminisme génétique ainsi que la genèse de ses
complications. C’est un groupe hétérogène de maladies métaboliques dont la
caractéristique principale est une hyperglycémie résultant d’un défaut de sécrétion,
d’action de l’insuline ou de ces deux anomalies associées (Eddouks et al., 2007).
α-Amylase est une métallo-enzyme, que l'on trouve dans sérum, urine et salive
normaux de l'homme (Liang et al., 2013). En tant qu'enzyme omniprésente, elle est
produite par les animaux, les plantes et les microorganismes (Rana et al., 2013),
L'enzyme alpha-amylase catalyse l'endohydrolyse de α (1-4) glycosidique les liens
entre les polysaccharides communs (amidons) issus de l'alimentation, pour réguler la
glycémie. Pendant l'état pathologique du diabète sucré, cette enzyme peut être
préjudiciable, en raison du défaut biochimique qui entraîne une élévation du taux de
glucose dans le sang. L'inhibition de l'activité de l'enzyme réduirait l'absorption du
glucose par l'intestin grêle et contrôlerait l'élévation des niveaux de glucose. Cela
permettrait ensuite de l'amidon non digéré pour arriver au côlon (Sethi et Brahmlin,
2006).

I.4.2. Activité anticholinestérase

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative progressive.

L’atteinte précoce des neurones entraine, en premier lieu, des troubles de la mémoire.
S’y ajoutent, ensuite, une perturbation des fonctions cognitives (langage,
raisonnement, orientation,…) (Braak, 1998). Le système cholinergique est le plus
précocement atteint avec une synthèse du neurotransmetteur acétylcholine (ACh)
anormalement basse. Un des traitements de cette maladie est de pallier le déficit en
ACh en inhibant sa dégradation au niveau de la fente synaptique, c’est à dire en
inhibant l’acétylcholinestérase (Wandhammer, 2012).

Les cholinestérases sont des enzymes qui catalysent l’hydrolyse d’esters de

choline (acétylcholine, butyrylcholine, succinylcholine) en acide carboxylique et en
6
Etude bibliographique Activités biologiques

choline. Il existe deux types de cholinestérases : l’acétylcholinestérase et la

butyrylcholinestérase (Crismon, 1998).

L’acétylcholinestérase (AChE ; EC [Link]) se localise principalement au niveau des

synapses cholinergiques du système nerveux central ainsi qu’au niveau des jonctions
neuromusculaires mais également au niveau de la membrane érythrocytaire.

La butyrylcholinestérase (BChE ; EC [Link]), quant elle, est abondante au niveau

plasmatique (environ 5mg/ml) et elle est présente également dans de nombreux
tissus (foie, intestin, poumons, cœur, muscles, cerveau). Ainsi que de nombreuses
homologies avec l’AChE, notamment au niveau de sa séquence (54%), de la structure
tridimensionnelle et du mécanisme catalytique.

Dans les conditions physiologiques, l'activité du cholinestérase dans le cerveau est

principalement liée à l'AChE. Cependant, en présence de la maladie d’Alzheimer,
l'activité de l'AChE diminue progressivement dans certaines régions du cerveau,
tandis que l'activité de la BuChE augmente ; la BuChE peut alors agir comme un
mécanisme compensatoire de l'hydrolyse de l'acétylcholine (Giacobini, 2003).

I.5. Activité anti-inflammatoire

L'inflammation est un mécanisme de défense naturel qui offre une résistance

contre divers types d'agents pathogènes reconnus par le système immunitaire
(parimisetty, 2015).

Les réactions inflammatoires sont induites par les infections microbiennes et

virales; l'exposition aux allergènes, les radiations et les produits chimiques toxiques,
les maladies auto-immunes et chroniques, l'obésité, la consommation d'alcool,
l'utilisation de tabac, et l’alimentation riche en calories (Aggarwal et al., 2009;
Schetter et al., 2010). Deux stades de l'inflammation existent, aiguë et chronique.

 L'inflammation aiguë est une étape initiale de l'inflammation (de l'immunité

innée), qui est médiée par le mouvement rapide du plasma et des leucocytes

7
Etude bibliographique Activités biologiques

du sang vers le site de la blessure. Ce type d'inflammation apparaît en

quelques minutes (immédiate) et dure quelques jours (bagora, 2015).

 L'inflammation chronique correspond à la persistance de l’agent pathogène à

cause de l’échec de la réponse inflammatoire aigue, caractérisée par le
déplacement rapide et progressif des cellules au site inflammatoire, suivi par
la destruction simultanée du tissu, et peut conduire à diverses maladies
chroniques, y compris le cancer (Lin and Karin, 2007). Ce type d'inflammation
n’apparaît pas immédiatement (retardé), et peut persister des semaines, voire
des années (Feghali et Wright, 1997).

Lors de l’inflammation aiguë, une fois l’agression maîtrisée, la phase de résolution

se déclenche : libération de cytokines anti-inflammatoires, migration hors du site
inflammatoire et mort cellulaire. Par contre dans l’inflammation chronique, cette
phase de résolution est absente. L’infiltrat immunitaire persiste, ce qui contribue à
l’hyperplasie et à la destruction du tissu (Noack, 2016).

Les anti-inflammatoires sont définis comme étant des substances qui agissent sur
la douleur et le gonflement qui apparaissent suite à une agression d’un agent
pathogènes. Elles bloquent la sécrétion ou l’action de certains médiateurs chimiques
de l’inflammation (comme les prostaglandines) et donc diminuent la sensation de la
douleur mais aussi l’inflammation (Orliaguet et al., 2013 ; Hajjaj, 2017). Elles sont
utilisées lorsque la réaction inflammatoire se prolonge de façon anormale
(inflammation chronique) et entraine des dommages aux tissus. Selon le mode
d’action, il existe trois (3) catégories d’anti-inflammatoire :

 Les anti-inflammatoires stéroïdiens (A.I.S)

Les anti-inflammatoires stéroïdiens ou les corticoïdes agissent sur toutes les

composantes de l’inflammation en s’opposant à l’action de la phospholipase A2 qui
est l’enzyme catalysant la libération de l’acide arachidonique, à partir de la
membrane cellulaire. Ils bloquent la libération de l’acide arachidonique en agissant

8
Etude bibliographique Activités biologiques

sur les membranes cellulaires. En effet, l’acide arachidonique est un constituant des
membranes cellulaires qui joue un rôle majeur dans l’inflammation par la production
des leucotriènes, des prostaglandines, et du thromboxane A2 (Dolci et al., 1993).

 Les anti-inflammatoires non stéroïdiens (A.I.N.S.)

Les anti-inflammatoires non stéroïdiens sont les plus utilisés dans le monde en
raison de leurs propriétés antalgique, et antipyrétique (contre la fièvre) (Haioun et
Zohra, 2015). Ils n’agissent que sur une partie de la composante inflammatoire en
bloquant la dégradation de l’acide arachidonique par la voie de la cyclo-oxygénase.
Ils s’opposent ainsi à la production des prostaglandines et du thromboxane A2. Par
ailleurs, Ils peuvent agir sur la composante cellulaire de l’inflammation en bloquant
la mobilité de cellules notamment les macrophages (wilfried, 2020).

 Les anti-inflammatoires naturels

les composés phytochimiques issus du règne végétal et fongique sont très nombreux
avec une gamme variée d’activités biologiques. Certains parmi eux, possèdent une
activité anti-inflammatoire et ont pour cibles la COX-1 et COX -2, les lipoxygénases
(LOX), le NO, la phospholipase A2 (PLA2)…etc. Ces composés phytochimiques
présentent un intérêt grandissant car ils offrent des avantages par rapport aux anti-
inflammatoires classiques, avec moins d’effets secondaires (Dhingra et al., 2018).

Par ailleurs, au cours de ces dernières années, de nombreux composés

pharmacologiquement actifs avec une activité anti-inflammatoire ont été aussi isolés
à partir d'organismes marins (des éponges, des mollusques, des algues, des
échinodermes et des bactéries) (Mebirouk, 2017).

I.6. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro)

La dénaturation des protéines est un processus durant lequel les protéines perdent
leur structure tertiaire et secondaire par application d'un stress ou d'un composé
externe, tel qu'un acide ou une base forte, un sel inorganique concentré, un solvant

9
Etude bibliographique Activités biologiques

organique ou de son exposition à la chaleur. La plupart des protéines biologiques

perdent leur fonction biologique lorsqu'elles sont dénaturées (leelaprakash, 2011).

Selon Mizushima. (6611) la dénaturation des protéines est bien corrélée à la

survenue de la réponse inflammatoire. Les lésions tissulaires pourraient être liées à la
dénaturation des constituants protéiques des cellules ou de la substance
intercellulaire. Par conséquent, la capacité d'une substance à inhiber la dénaturation
des protéines signifie un potentiel apparent d'activité anti-inflammatoire (Opie,
1962).

10
 Chapitre II
Eriobotrya japonica L
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

II. Eriobotrya japonica

Eriobotrya japonica a été utilisée comme plante médicinale traditionnelle (Kim et al.,
2011). De nombreuses parties de la nèfle ont été utilisées pour le traitement de
plusieurs maladies.

II.1. Historique

L’origine de loquat a toujours fait l’objet d’un désaccord dans la communauté

scientifique. Thunberg a décrit pour la première fois le loquat en 1784 et l'a placé
dans le genre Mespilus. En 1822, le botaniste anglais John Lindley a révisé le genre
Mespilus, et a établi le loquat dans un nouveau genre, Eriobotrya (Condit, 1915 ;
Huxley, 1992). Il est largement rapporté que loquat cultivé au japon a été importé de
chine (Popenoe, 1920 ; Shaw, 1980 ; Campbell et Malo, 1986 ; Morton, 1987 ; Zhang,
1990 ; Ichinose, 1995). Cette hypothèse a été réfutée par des chercheurs japonais qui
ont confirmé la présence de certaines espèces primitives dans plusieurs régions du
japon (Fujisaki, 1994 ; Ichinose, 1995).

Depuis lors, sa cultivation s'est répandue dans le monde entier : d’abord les pays
méditerranéens (Algérie, Tunisie, Italie, Espagne, Malte, Chypre, Grèce, Turquie et
Égypte), puis les États-Unis d'Amérique, ainsi que certains pays d'Amérique latine
(Antilles, Porto Rico, Cuba) (Demir, 1983 ; Morton, 1987).

11
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

Figure 1 : bibaces et oiseau des montagnes,peinture chinoise (Dynastiedes Song,

XII-XIII siècles

[Link] vernaculaires de la plante

Les principaux noms vernaculaires de l’espèce (Lin et al., 1999) :

Anglais: loquat
Espagnol: nisperojapones
Français: neflier du Japon ; bibasse
Japon : bipa; biwa
Chinois: biba; luju; pi ba
Italie : nisperojapones
Arabe : Zaroure

12
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

II.3. Description botanique de l’espèce Eriobotrya japonica

Eriobotrya japonica est un petit arbre, de 5 à 8 m de haut, avec une couronne

arrondie un tronc droit et ramifié à une très faible hauteur, une écorce rugueuse et
grise qui se décolle chaque année.

Feuilles persistantes, dont la face supérieure est généralement brillante, tandis que
la face inférieure est souvent pubescence (Yu, 1979)

Ces fleurs donnent naissance à un fruit orange très juteux au goût quelque peu
acide (ferreres et al., 2009). Ce fruit subtropical est consommé frais ou préparé en
conserves, confitures, jellie, jus et nectars après enlèvement des semences (Ibarz et
al., 1995) (voir figure 1).

Le cycle annuel comprend trois saisons de croissance: pousses de printemps, d'été

et d'automne. La différenciation des boutons floraux a lieu en juillet-août, la
formation des boutons floraux se produit en septembre-octobre, la saison de
floraison s'étend de novembre à février, selon le cultivar, et la saison de récolte
s'étend de mars à juin (données relatives à l'hémisphère Nord).

II.4. Caractéristiques des différentes parties de la plante

 Les feuilles : la couleur en face supérieure rugueuse et verte, la face inférieure

est semblable à du coton et gris, la largeur entre 3-9 cm, la longueur entre 12-
30 cm sous forme lancéolée ou elliptique (en forme de lance). Elles sont
simples, alternes, à bords dentelés, coriaces ; pétiole court, nerf central
prononcé (voir la figure 2) (Yu, 1979 ; Huxley, 1992 ; Lin et al., 1999)

 Les fleurs de couleur blanches ou jaunâtres, la taille entre 1,2 à 2 cm et la

longueur entre 10-19 cm (Yu, 1979 ; Jonathan et al., 2006 ; Janick et Paull,

13
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

2008 ) Elles sont petites, blanches ou jaunâtres parfumées. Habituellement, il y

a 60 à 70 fleurs par grappe. (Jonathan et al., 2006). Elles sont bisexuelles avec
une panicule terminale souvent poilue et elles ont un tube calice en forme de
coupe ou de turbinaison ; cinq sépales persistants ; cinq pétales obovales ou
orbiculaires, glabres ou poilus ; une forme hélicoïdale ou bourgeon imbriqué ;
10 à 40 étamines ; deux à cinq styles qui sont fondamentalement connus et
souvent glabres ; un ovaire inférieur, c'est-à-dire connu et comportant deux à
cinq pièces avec deux ovules par locule ; un endocarpe membraneux ; et une
ou plusieurs grosse(s) graine(s) (voir la figure 2) (Huxley, 1992 ; Lin et
al.,1999 ; Janick et Paull, 2008).

 Les fruits de couleurs jaune-orange, en forme ronde ou ovale, leurs taille de 2

a 5 cm, et le poids entre 30 a 40 g (Yu, 1979 ; Ibarz et al., 1995 ; Jonathan et al.,
2006 ; Janick et Paull, 2008 ) Le fruit loquat est un type à pépins ; le nombre de

pépins varie entre un et huit, mais le plus souvent de trois a quatre

regroupées au centre du fruit. Elles sont séparées de la chair par un tégument
très fin. (Janick et Paull, 2008). L'épicarpe, l'épiderme ou la peau rugueuse est
aussi épaisse que celle d'une pêche mais légèrement plus dure. La couleur de
la chair juteuse ou le mésocarpe varie du blanc jaunâtre à l'orange foncé et
son goût a été décrit comme doux, subacide ( légèrement acide( et proche de
celui de la pomme (voir la figure 2) (Frijehlich et Schreier, 1990).

 Les graines de couleur brun foncé, Poids entre 1,1-3,6 g (Yu, 1979 ; Jonathan
et al., 2006 ; Janick et Paull, 2008 ) Le loquat a des graines relativement
grosses comprennent environ 20 à 30 % du poids du fruit (Yu, 1979 ; Demir,
1987). Les amandes sont recouvertes d’une peau brune, lisse et fibreuse (voir
la figure 2).

14
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

Fleurs de loquat Feuille de loquat

Fruits de loquat Grain de loquat

Figure 2 : les différentes parties de loquat

II.5. Classification botanique d’Eriobotrya japonica

Le loquat est un fruit comestible (Eriobotrya japonica Lindl.) appartenant à la famille

des Rosacées (Badenes et al., 2000 ; Kalkman, 2004).

15
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

Les Rosaceae sont une famille de 92 genres et de 2 805 espèces d'herbes, d'arbustes
et d'arbres, répartis dans le monde entier mais particulièrement diversifiés dans
l'hémisphère nord (Stevens, 2019).

Environ 800 cultivars d'E. japonica ont été développés. En fonction de leur origine,
on peut distinguer deux groupes : le premier groupe chinois avec de gros fruits
piriformes de couleur orange foncé et le deuxième groupe japonais avec de petits
fruits minces de couleur claire (Orwa et al., 2009).

Règne : végétal
Classe : Dicotylédones (Tonellie et Gallouin, 2013)
Ordre : pomée (Tonellie et Gallouin, 2013)
Famille : Rosaceae (Ferreres et al., 2009)
Sous-famille : Maloideae (pareek et al., 2014)
Genre : Eriobotrya (Lin et al., 1999)
Espèce : Eriobotrya japonica

II.6. Habitat de la plante

Le loquat s'est bien adapté au climat méditerranéen et produit dans les mêmes
régions où les agrumes prospèrent (Demir, 1987 ; Lin et al., 1999 ; Badenes et al.,
2000 ; Jonathan et al., 2006 ). L'arbre pousse bien dans presque tous les sols qui ont
un bon drainage et dans les sols acides et alcalins. Les arbres bien établis peuvent
tolérer une baisse de température jusqu'à 12 °C (Demir, 1987), des températures
supérieures à 35 ° C peuvent avoir un effet négatif sur la croissance des arbres
(Jonathan et al., 2006).
Loquat a formé une variété de types écologiques dans différentes zones. En
général, ils se trouvent dans les climats maritimes entre les latitudes 20 ° et 35 °nord
et sud (Vilanova et al., 2001) mais peut être cultivé à la latitude 45 °(Lin, 2007 ; Lin et
al., 2007 ; Polat et Caliskan, 2007).

16
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

Dans son aire de répartition naturelle, E. japonica pousse dans les vallées et les
forêts (Flora of China, 2016). En Australie, on la trouve dans les zones côtières, dans
les forêts sclérophylles sèches et le long des cours d'eau (Weeds of Australia, 2016).
À Hawaï, on la trouve naturalisée dans les zones humides et mouillées, dans les
forêts mésiques mixtes, les forêts tropicales et le long des routes (Lorence et al., 1995
; Pier, 2016).En Nouvelle-Zélande, cette espèce peut être trouvée naturalisée dans des
forêts et des arbustes perturbés, sur les flancs des collines et près des sites de culture
(Webb et al., 1988 ; Weeds of New Zealand, 2016).

II.7. Composition chimique de la plante

Selon le département de nutrition de l'Institut central chinois de recherche sur la

santé, les composants nutritionnels de 100 g de pulpe de loquat contiennent 0,4 g de
protéines, 1 g de graisses, 7 g glucides, 0,8 g de fibres alimentaires, 0,5 g de cendres,
22 mg de calcium, 32 mg de phosphore, 1,33 mg caroténoïdes, et 3mg de vitamine C.
Par conséquent, le loquat est un excellent fruit nutritionnel (Li et al., 2016).

Le profil phénolique de l'arbre du loquat varie en fonction de la croissance, de la

maturation, les facteurs génétiques de chaque cultivar, les conditions
environnementales et les méthodes d'extraction.

La composition phytonutritionnelle des extraits de différents organes varie

considérablement :

 Feuilles et fleurs : Sont riches en composés phénoliques ; en triterpènes tels

que ; les acides ursolique , oléanolique et les glycosides de sesquiterpène (Xu
et Chen, 2011 ; Fu et al., 2012 ; Zhang et al., 2015).
 Les fruits : riches en sucres, en acides organiques, en caroténoïdes, en
flavonoïdes, en acides phénoliques et en vitamines A et B (Fu et al., 2012 ;
Zhang et al., 2015).

17
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

 Les graines : sont une bonne source de protéines, d'amidon, de tanins et de

minéraux (Fu et al., 2012 ; Zhang et al., 2015) et riche en amygdaline (Li et al.,
2016).

II.8. Propriétés médicinales de la plante

 Usages traditionnels

Le loquat est également une plante à haute valeur médicinale, et différents organes
de la plante sont utilisés depuis des milliers d'années comme médicaments
populaires (Li et al., 2016).

En 1874, Philibert Dabry de Thiersant écrit dans « La matière médicale chez les
Chinois » : « sa feuille amère dissout les inflammations, arrête la toux et la soif,
apaise la mélancolie et renforce l’estomac »

 Potentiels thérapeutiques confirmés

Des études pharmacologiques récentes ont montré que Eriobotrya japonica

possédait plusieurs activités, telles que ; des effets antidiabétiques (Chen et al., 2008 ;
Lü et al., 2009), des effets anti-tumoraux et anti-inflammatoires (Huang et al., 2009),
des effets antioxydants (Huang et al., 2006), et un effet bénéfique sur les maladies
hépatiques grasses non alcooliques (NAFLD) (Jian et al., 2017 ; Jian et al., 2018).

En tant que médicament traditionnel chinois, la feuille de loquat (Eriobotrya

japonicaLindl) a été largement utilisée depuis des siècles dans le traitement des
maladies respiratoires, telles que ; la pharyngolaryngitie, bronchite, bronchite
chronique (BC), toux et bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO)
(matalkaet al., 2016).

L’extrait des feuilles de nèfle a également montré d'autres bioactivités, en

particulier l'effet sur les troubles métaboliques, hypolipidémiques, anti-obésité (
shihet al., 2013 ; Liu et al., 2016) les maladies des poumons, d'estomac, l'asthme

18
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

(Alshaker et al., 2011), l'amélioration de la fonction hépatique (Nishioka et al.,

2002), activité gastroprotectrice (Yokota et al., 2008), effet anti-vieillissement
(Muramoto et al., 2011) , et l'activité antiallergique (Kim et al., 2009).

II.9. Les activités biologiques d’Eriobotrya japonica

 Activité antioxydante : En utilisant de multiples méthodes de dosage des

antioxydants, diverses études ont démontré la forte capacité antioxydante des
extraits de loquat in vitro et in vivo. Les composés phénoliques et les acides
triterpéniques peuvent tous les deux contribuer à cette activité dans différents
tissus de la nèfle (Liu et al., 2016).

À tel point qu’en 2010, une étude chinoise de Song et al. (2010) a classé le néflier
du Japon en seconde position sur 56 plantes antioxydantes utilisées en médecine
traditionnelle.

 Activité anti-inflammatoire : Dans la médecine populaire chinoise, la feuille de

loquat est utilisée depuis l'Antiquité pour traiter les maladies inflammatoires
telles que ; la toux, bronchite chronique (BC) et l'asthme (Li, 1578). Des études
scientifiques modernes utilisant différents modèles expérimentaux ont prouvé la
capacité anti-inflammatoire de différents tissus du néflier comme la feuille
(Banno et al., 2005 ; Huang et al., 2005 ; Choi et al., 2011 ; Kim et al., 2012), la
graine (Tukuma et al., 2008 ; Sun et al., 2010) et le fruit (Lin et al ., 2008).

À ce titre, il a été rapporté que des extraits de feuilles de cet arbre inhibent, de
manière dose-dépendante, la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-
alpha, IL-1beta, et IL-8) (Lee et al., 2008 ; Cha et al., 2011).

De manière intéressante une étude tunisienne, a montré qu’une fraction enrichie

en flavonoïdes extraite de feuilles d’Eriobotrya japonica exerce une action inhibitrice
sur l’enzyme pro-inflammatoire humaine, phospholipase A2 (Maher et al., 2015).

19
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

 Activité antidiabétique : E. japonica présentait un grand potentiel anti-diabète.

Des recherches récentes ont montré que les extraits de la feuille ou la graine de
loquat sont utiles dans la prévention et le contrôle du diabète de type 1 et de
type 2 (Sakuramata et al., 2004 ; Li et al., 2007).

Une étude italienne Tommasi et al., (1991) a mis en évidence l’effet

hypoglycémiant d’un extrait alcoolique d’Eriobotrya japonica contenant des
sesquiterpènes glycosidés ainsi que de triterpénoïdes isolés sur des rats normaux et
diabétiques.
De manière similaire, il a été démontré, par des chercheurs chinois Chen et al.
(2008), qu’un sesquiterpène glycosidé naturel isolé des feuilles d’Eriobotrya
japonica permet de réduire significativement les niveaux de glucose sanguins de
souris diabétiques.

 Activité anticancéreuse : Des études de Komiya et al., (1998) et Kim et al.,

(2011) ont démontré au niveau de la protéine et au niveau des gènes que les
extraits de loquat peuvent supprimer la cancérogenèse cellulaire à différents
stades de progression (l’initiation, la prolifération et les métastases).

Une étude publiée par des chercheurs coréens Kang et al., (2006) conclut que la
nèfle réduit la prolifération de différentes lignées des cellules cancéreuses Des
résultats similaires ont également été observés sur des lignées cancéreuses de la
leucémie (kikuchi et al., 2011 ; zar et al., 2014). Ils indiquent notamment que la
plante stimule l'apoptose de ces cellules cancéreuses, par un dérivé de l’acide
tormentique, composé triterpène présent dans la feuille du néflier du Japon.

20
Etude bibliographique Eriobotrya japonica

II.10. Toxicité d’Eriobotrya japonica

Dans les études de toxicité aiguë (0,30, 0,65, 1,39 et 3,00 g-kg-1 de poids corporel)
et subaiguë (150, 300 et 600 mg-kg-1 de poids corporel), les triterpenes des feuilles
d’Eriobotrya japonica n'a produit aucune mortalité et aucune toxicité des principaux
organes chez les souris mâles et femelles. Les résultats de la présente étude
indiquent qu’Eriobotrya japonica leaf triterpene acid (ELTA) administrée par voie
orale pourrait avoir une grande marge de sécurité pour l'homme (Li et al., 2017).

21
Etude Pratique
Chapitre III
Matériels et Méthodes
Partie pratique Matériels et méthodes

La présente étude vise à évaluer les activités biologiques de l’extrait de feuilles

d‘Eriobotrya japonica. La partie expérimentale a été réalisée au sein du centre de
Recherche en Biotechnologie CRBt. Constantine.

III. Matériels et méthodes

III.1. Matériel végétal

Les feuilles d’Eriobotrya japonica utilisées dans cette étude ont été récoltées en
février 2020 à Ain smara, Wilaya de Constantine. Elles ont été lavées soigneusement
à l’eau courante, conservées à température ambiante et à l’abri de l’humidité pendant
une semaine, puis séchées dans une étuve à 40°C pendant 24 heures. Une fois
séchées, elles ont été broyées à l’aide d’un broyeur électrique. Jusqu’à l’obtention
d’une poudre fine

III.2. Macération et extraction

Pour l’évaluation de l’activité in vitro de l’extrait de feuilles d’Eriobotrya japonica,
différents procédés d’extraction ont été réalisés.

III.2.1. Macération

La macération est une opération qui consiste à laisser la poudre du matériel

végétal en contact prolongé avec un solvant pour extraire des principaux actifs.

Une quantité du matériel végétal (100 g) a été mise a macération dans un système
hydrométhanolique (MeOH/H2O 85 V:V). Après 24 heures de contact, le mélange a
été filtré à l’aide d’un papier whatman et d’un entonnoir puis concentré en utilisant
un rotavap de marque BUCHI. Cette opération a été répétée trois fois. L’extrait brut
obtenu a été ensuite dilué dans un volume de 250 ml d’eau distillée puis filtré. A la
fin de cette étape, une fraction hydrométhanolique a été obtenue.

22
Partie pratique Matériels et méthodes

III.2.2. Extraction

Le produit obtenu après filtration a subi une série de procèdes d’extraction

liquide-liquide dans une ampoule à décanter en utilisant des solvants organiques à
polarité croissante : chloroforme, acétate d’éthyle et n-Butanol. Pour chaque solvant
d’extraction, la décantation a été répétée trois fois; au bout de la troisième
décantation, la phase organique a été concentrée au rotavap à 40°C pour le
fractionnement, tandis que, la phase aqueuse a été utilisée pour une autre extraction
avec un solvant de polarité supérieure.

A la fin de cette étape, trois fractions ont été obtenues : fraction chloroformique,
fraction acétate d’éthyle et fraction butanolique (voir figures 3 et 4).

Figure 3 : les fractions d’Eriobotrya japonica (a) : fraction chloroformique, (b):

fraction acétate d’éthyle, (c) : fraction butanolique.

23
Partie pratique Matériels et méthodes

Matériel végétal m=100g

 Macération
 Hydrométhanolique
(MeOH/H2O 85 :15 V : V)
Débris

Filtrat

 Concentration à sec au rotavap à 40°C

trat  Dilution dans 250 ml d’eau distillée
 Filtration

Fraction
hydrométhanolique Phase aqueuse

 Extraction avec le dichlorométhane (3 fois)

 Décantation

Phase organique Phase aqueuse

 Concentration au  Extraction avec l’acétate d’éthyle

(3 fois)
rotavap à 40 °C
 Décantation

Fraction
dichlorométhane Phase organique Phase aqueuse

 Concentration au  Extraction avec le

rotavap à 40°C butanol (3 fois)
 Décantation
Fraction acétate
d’éthyle

Phase organique Phase aqueuse

résiduelle
 Concentration au
rotavap à 40 °C

Fraction
butanolique

Figure 4 : Protocole de préparation des fractions d’Eriobotrya japonica

24
Partie pratique Matériels et méthodes

III.3. Activité biologiques

Les mesures des absorbances ont été faites à l’aide d’un lecteur de microplaques à
96 puits de marque Perkin Elmer (USA) avec son logiciel EnSpire au niveau du
laboratoire de Biochimie au CRBt de Constantine.

III.3.1. Estimation du contenu total en polyphénols (TPC)

 Principe

Le contenu phénolique total des extraits a été estimé à l'aide de la méthode Folin-
Ciocalteu, qui repose sur le transfert d'électrons des composés phénoliques au FCR
en milieu alcalin, et qui est une méthode simple et largement utilisée (Singleton et
Rossi, 1965 ; Cai et al., 2004 ; Song et al., 2010). Le FCR ou réactif phénolique de
Folin ou réactif Folin-Denis, utilisé pour le dosage colorimétrique des antioxydants
phénoliques et polyphénoliques (Singleton et al., 1999). Il fonctionne en mesurant la
quantité de substance à tester nécessaire pour inhiber l'oxydation du réactif (Vin- son
et al., 2005). Il est réduit, en présence de polyphénols en un mélange bleu d'oxydes
de tungstène et de molybdène. L’absorbance du mélange obtenu est mesurée à 765
nm. Une augmentation de l’absorbance corresponde à l’augmentation de la quantité
de polyphénols présents dans les extraits végétaux (Macheix et al., 2005).

 Mode opératoire

Le contenu phénolique total est détecté en utilisant le réactif de Folin Ciocalteu

(FCR) (Singleton et Rossi, 1965) par la méthode de dosage sur microplaque de 96
puits décrite par Muller et al., (2010). Un volume de 20 μl d’extrait de plante (1 mg
d’extrait dissout dans 1 ml de méthanol) est ajouté à 100 μl de FCR dilué (1:10).
Ensuite un volume de 75 μl de carbonate de sodium (7,5%) est additionné.

25
Partie pratique Matériels et méthodes

Le mélange est laissé à l’obscurité pendant 2 heures à température ambiante.

L’absorbance de différentes intensités de la couleur bleue résultante est déterminée à
765 nm.
Un blanc est préparé de la même manière en remplaçant l’extrait par le solvant
utilisé (Méthanol). L’acide gallique (10%) est utilisé comme contrôle positif, à partir
de lequel une courbe d’étalonnage a été établie.

III.3.2. Estimation du contenu total en flavonoïdes (TFC)

 Le principe
La méthode utilisée pour estimer les taux en flavonoïdes, est celle décrite par
Topçu et al., (2007) avec quelques modifications.
Le principe de cette méthode repose sur le dosage direct par le chlorure de
l’aluminium. En effet, les flavonoïdes possèdent un groupement hydroxyle libre en
positon 5 susceptible de donner en présence de chlorure d’aluminium, un complexe
jaunâtre par chélation de l’ion Al3+. La coloration jaune produite est proportionnelle à
la quantité de flavonoïdes présente dans l’extrait (Ribéreau-Gayon, 1968).

3'
2' 4'
B
8
HO O 5'
7 2 1'
6'
A C
3
6
5 4 OH

OH O

Figure 5 : Structure de base des flavonoïdes (Lin et al., 2015)

26
Partie pratique Matériels et méthodes

 Le mode opératoire

Le dosage des flavonoïdes dans les extraits est basé sur la formation d’un
complexe entre les ions Al+3 et les flavonoïdes. La méthode décrite par Topçu et al.,
(2007) est utilisée et adaptée avec quelques modifications pour une détermination sur
microplaque à 96 puits.

Un volume de 50 µl de l’extrait est mélangé avec : 130 µl de méthanol, 10 µl

d’acétate de potassium (1M) et 10 µl de nitrate d’aluminium (10%). Le mélange est
ensuite maintenu à la température ambiante pendant 40 min puis une lecture
d’absorbance est réalisée à 415 nm. La quercétine (20%) est utilisée comme contrôle
positif, à partir de la quelle une courbe d’étalonnage a été établie.

III.3.3. activité antioxydants

III.3.3.1. Activité antiradicalaire au DPPH•

 Le principe
La DPPH est l'une des techniques les plus anciennes et les plus populaires utilisées
pour mesurer l'activité antioxydante d'un composé. Cette méthode a été décrite pour
la première fois par Blois. (1958) et modifiée par la suite par de nombreux
chercheurs. Cette méthode mesure la capacité réductrice des antioxydants à DPPH▪.
L'effet antioxydant est proportionnel à la disparition de DPPH▪ dans une solution
méthanolique. La solution de DPPH étant violette, est réduit en recevant un atome
d'hydrogène des antioxydants à l'hydrazine correspondante et se décolore donc en
jaune (Contrerasguzman et Strong, 1982). Cette transformation peut être suivie par
spectrophotométrie, en mesurant la diminution de l’absorbance à 517nm (Molyneux,
2004).

27
Partie pratique Matériels et méthodes

N N

N NH
+ RH + R
O2N NO2 O2 N NO2

NO2 NO2

Transformation du radical DPPHo en DPPHH

Figure 6 : Transformation du radical DPPH• en DPPHH. (Blois, 1958)

 Le mode opératoire

L'activité de piégeage de radical DPPH• a été élaboré selon la méthode décrite par
Blois. (1958). Sur une microplaque à 96 puits, une solution de 160 μL de DPPH• (6%)
est additionnée à 40 μL de solution d'extraits préparé à plusieurs concentrations. La
conservation du mélange à été faite a une température ambiante pendant 30 minutes,
en utilisant de méthanol à 95 % comme blanc.

 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 517 nm.

 L’activité antiradicalaire au DPPH•a été exprimée en équivalents de BHA et
le BHT (50%) comme standards.
 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 Les pourcentages d'inhibition de DPPH des échantillons étaient calculés :

Où est l'absorbance du contrôle négatif, et est l'absorbance de

l'extrait/standard.

28
Partie pratique Matériels et méthodes

III.3.3.2. Activité du piégeage du cation radical ABTS•+

 Le principe
L'essai ABTS est une méthode spectrophotométrique qui mesure la capacité d'un
antioxydant à de récupérer un cation de radical libre ABTS▪+. Cette méthode a été
développée par Miller et al., (1993) et adaptée par Re et al., (1999). Pour générer
directement le radical ABTS▪+ par une réaction entre la solution ABTS avec
persulfate de potassium dans l'eau. Le mélange réactionnel, que l'on laisse reposer à
température ambiante pendant 12-16 h avant l'utilisation, produit une solution bleu
foncé. Ainsi, le mélange est dilué avec de l'éthanol ou une solution saline tamponnée
au phosphate (pH 7,4) jusqu'à une absorbance de 645 nm à 734 nm (longueur d'onde
la plus utilisée) et 37 °C. Le principe de cette méthode est basé sur la mesure de la
consommation du radical ABTSH•+ suite à l’addition d’un échantillon antioxydant.
Ce dernier réagit avec ABTS•+ (en excès) par transfert d’électrons pour redonner
l’ABTS incolore (Roginsky et Lissi, 2005).

29
Partie pratique Matériels et méthodes

-
O3S SO3-
S S

N N

N N

C2H5 C2H5
ABTS

K2S2O8

+
-
O3S SO3-
S S

N N

N N

C2H5 C2H5

•+
ABTS
CH3

HO

COOH

H3C O CH3

CH3
(ou antioxydant à tester donneur de H•)

CH3
-
- SO3- O
O3S S S
N N + COOH
H N
N
H3C O CH3
C2H5 C2H5
CH3
ABTSH•+

Figure 7 : Formation et piégeage du radical ABTS•+ par un antioxydant donneur

de H• (Re, 1999)

 Mode opératoire

L’activité ABTS est déterminée par la méthode de Re et al., (1999). Sur une
microplaque à 96 puits, une solution de 160 μl d’ABTS •+ (7 mM) a été embrouille
avec 40 μl de l’extrait dilué dans le méthanol à plusieurs concentrations. Ce dernier a
été conservé à l'obscurité et à température ambiante pendent 10 min.

 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 734 nm.

 Activité du piégeage du cation radical ABTS•+ a été exprimée en équivalents de

BHA et le BHT (50%) comme standards.

 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 Le pourcentage d'inhibition d’ABTS a été calculé selon l’équation suivante:

30
Partie pratique Matériels et méthodes

III.3.3.3. Activité de réduction du complex cuivre-néocuproïne (CUPRAC)

 Le principe

Ce dosage est basé sur la réduction du Cu (II) en Cu (I) par les antioxydants
présents dans l'échantillon. Le Cu (I) forme un complexe avec la néocuproine (2,9-
diméthyl-1,10-phénanthroline) cuivre-néocuproïne [Cu2+-Nc2]. Ce dernier est réduit
produisant ainsi un complexe chromogène de Cu+-Nc , cette réaction est quantifiée
spectrophotométriquement à une longueur d’onde de 450 nm (Apak et al., 2004).

2+
+
Produit
AOX
AOX oxydé
N N
H3C CH3 N N
Cu H3C CH3 +H+
H3C CH3 Cu
N N H3C CH3
N N

Réactif CUPRAC
couleur Bleu Produit jaune-orangé

Figure 8 : Réduction du complexe chromogène de Cu+2-Nc2 (Özyürek et al., 2011)

 Mode opératoire

La capacité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC) a été

déterminée selon la méthode d’Apak et al., (2004). Des mélanges réactionnels
contenant 60 µl d’acétate d’ammonium (7,7%), 50 µl de chlorure de cuivre (0,1%), 50

31
Partie pratique Matériels et méthodes

µl de néocuproïne (0,1%) et 40 μl d’extrait dilué dans le méthanol ont été préparés

dans une microplaque à 96 puits, pour arriver à un volume total de 200 µl, Après une
heure d’incubation.

 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 450 nm.

 L’activité de réduction du complex cuivre-néocuproïne (CUPRAC) a été exprimée

en équivalents de BHA et le BHT (50%) comme standards.

 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 Les résultats ont été calculés à titre de A0,50 (μg/ml) correspondant à la
concentration indiquant 0,50 d’absorbance.

III.3.3.4. Activité du pouvoir réducteur (FRAP)

 Le principe

L'activité réductrice d'un extrait est évaluée par la réaction oxydoréduction entre
l'extrait et les ions métalliques de transition ; notamment le fer, le ferricyanure de
potassium [K3Fe(CN) 6] fournit le fer ferrique (Fe3+) qui sera réduit en fer ferreux
(Fe2+) par les antioxydants présents dans l'extrait végétal (Khadhri et al., 2013). La
forme réduite de ce complexe donne une coloration bleu verte, qui absorbe à 700 nm.

Figure 9 : Mécanisme réactionnel intervenant lors du test FRAP entre le complexe

Tripyridyltriazine ferrique Fe (III)-TPTZ et un antioxidant (AH) (Prior et al., 2005)

32
Partie pratique Matériels et méthodes

 Le mode opératoire

Le pouvoir réducteur des extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica est déterminé par
la méthode d’ Oyaizu. (1986) avec quelques modifications. Un volume de 10 μl de
l’extrait à différentes concentrations est additionné à 40 µl d’une solution tampon
phosphate (pH 6,6) et à 50 µl d’une solution de ferrycianide de potassium (1%).
L’ensemble est incubé à l’étuve à 50°C pendant 20 min. Ensuite, 50 µl d’acide tri-
chloroacétique (10%) sont ajoutés pour stopper la réaction. Enfin, un volume de 40 µl
d’eau distillée et 10 µl d’une solution de chlorure de fer anhydre (0,1%) sont ajoutés.

 La lecture de l’absorbance du milieu réactionnel se fait à 700 nm contre un

blanc semblablement préparé, en remplaçant l’extrait par le méthanol.
 L’activité du pouvoir réducteur (FRAP) a été exprimée en équivalents de deux

solutions d’antioxydants standards, l’acide ascorbique et l’α-tocophérol

(400%).
 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 Les résultats ont été calculés à titre de A0,50 (μg/ml) correspondant à la
concentration indiquant 0,50 d’absorbance.

III.3.3.5 Activité de réduction par la formation du complexe Fe+2 phénantroline

 Le Principe
Le complexe rouge Fe(II)-phénanthroline (Phen) est largement utilisé dans la
méthode spectrophotométrique classique pour la détermination du fer
(Szydlowskaczerniak et al., 2008). Cette technique est basée sur la formation du
complexe Fe+2-phénantroline rouge-orangé suite à une réaction d’oxydoréduction.
Ce complexe est soluble à pH basique et peut être mesuré à une absorbance de 510
nm (Adhikamsetty et al., 2008).

33
Partie pratique Matériels et méthodes

N N
Fe2+ +3
Fe2+
N
N
N N
N
1,10 o-phenanthroline

Figure 10 : Formation du complexe Fe+2-phénantroline (Apak et al., 2007)

 Le mode opératoire
L’activité de phénantroline est décrite par la méthode de Szydłowska-Czerniak et
al., (2008). Un volume de 10 µl de l’extrait à différentes concentrations est déposé
avec 50 µl de chlorure de fer anhydre (0,2%), 30 µl de phénantroline (0,5%) et 110 µl
de méthanol. Le mélange obtenu est incubé dans l’étuve à 30°C pendant 20 min.
 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 510 nm.

 L’activité de réduction par la formation du complexe Fe+2 phénantroline a été

exprimée en équivalents de BHA et le BHT (50%) comme standards.
 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 Les résultats ont été calculés à titre de A0,50 (μg/ml) correspondant à la
concentration indiquant 0,50 d’absorbance.

III.3.3.6. Activité Silver nanoparticle (SNP)

 Le principe
Les SNP ont des propriétés et des applications diverses, comme les conductivités,
stabilité chimique, catalytique et antibactérienne, le séquençage de l'ADN (Cao et al.,
2002 ; Fratini et al., 2005). Les agents réducteurs couramment utilisés pour
production de SNP stables sous forme de dispersions colloïdales 9 sont le sodium

34
Partie pratique Matériels et méthodes

borohydrure, citrate de sodium, acide ascorbique, et élémentaire hydrogène (Fratini

et al., 2005). Dans un premier temps, la réduction de diverses espèces d'Ag+ conduit
à la formation des atomes d'argent (Ag0), qui est suivie par l'agglomération en amas
oligomères. Ces amas conduisent finalement à la formation de particules colloïdales
d'Ag (Kappor et al., 1994). Outre, les agents réducteurs classiques, divers extraits
végétaux et biologiques ont été utilisés comme réducteurs pour la synthèse des SNP
(Forough et al., 2010).

 Le mode opératoire

L’activité Métal Chélate a été étudiée par la méthode d’Ozyurek et al., (2012). On
a administré 20 µl de l’extrait à différentes concentrations avec 130 µL (solution SNP)
(Annexe II), 50 µl H2O. Le mélange acquis est incubé dans l’étuve à 25°C pendant
30 min.

 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 423 nm.

 L’activité Silver nanoparticle (SNP) a été exprimée en équivalents de Trolox

comme standard.

 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.

 Le pourcentage d'inhibition d’SNP a été calculé selon l’équation suivante:

[ ]

III.3.4. Activité enzymatique

III.3.4.1. Evaluation de l’activité antidiabétique

L’activité antidiabétique de différents extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica a été
évaluée en utilisant la méthode d’inhibition de l’enzyme l’alpha-amylase.

35
Partie pratique Matériels et méthodes

 Le principe
Dans le milieu réactionnel, lorsque l’enzyme α-amylase est active, l’amidon (le
substrat de l’enzyme) est hydrolysé en libérant des unités de maltose et de glucose.
Le test d'inhibition de α-amylase est basé sur la colorimétrie à base de solution
d'iode pour déterminer la quantité d'amidon hydrolysé (Yang et al., 2012).

 Le mode opératoire
L'activité inhibitrice de l'alpha-amylase a été déterminée par la méthode de
Zengin et al., (2014) avec quelques modifications.

Des mélanges de α-amylase (50 µl) (1U) avec des solutions d’extrait de différentes
concentrations (25 µl) ont été préparés dans une Microplaque à 96 puits, puis incubés
pendant 10 min à 37°C. La réaction a été ensuite initiée en ajoutant une solution
d'amidon (50 µL, 0.1%). Les mélanges réactionnels ont de nouveau été incubés
pendant 10 minutes à 37°C. La réaction a ensuite été arrêtée en ajoutant 25 µl d’acide
chlorhydrique (HCl, 1 M), et 100 µl d'iodure de potassium (KI) (Annexe VI).

En parallèle à cela, des blancs à base de solutions d’extrait de différentes

concentrations ont également été préparés (un blanc est constitué d’une solution
d’extrait d’une concentration donnée, d’amidon, d’acide chlorhydrique, et d’iodure
de potassium).

 La lecture de l’absorbance de l'échantillon et du blanc a été réalisée à 630 nm.

 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 L'activité inhibitrice de α-amylase a été exprimée en équivalents d'acarbose
(400%) (voir figure 11).
 Le pourcentage d’inhibition de α-amylase a été calculé avec la formule suivante :

[ ]

36
Partie pratique Matériels et méthodes

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
B As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
C As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
D As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
E As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
F As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
G As1 As1 As1 Ab1 As2 As2 As2 Ab2 As As As Ab
H Ae Ae Ae Ae Ae Ae Ac Ac Ac Ac Ac Ac

Figure 11 : Récapitulatif des différentes solutions préparées.

Ac=Absorbance [Amidon + KI + HCl + solvant d’extrait + tampon Enzyme]

Ae=Absorbance [Enzyme + Amidon + KI + HCl + solvant d’extrait]
As=Absorbance [Enzyme + Extrait + Amidon + KI + HCl]
Ab=Absorbance [Extrait + KI + tampon].

III.3.4.2. Evaluation de l’activité anticholinestérase

L’activité anticholinestérase des divers extraits de la plante Eriobotrya japonica
est réalisée par la méthode d’inhibition des deux enzymes butyrylcholinestérase et
Acetylcholinesterase.

 Le principe

Cette méthode est basée sur la mesure du taux de production de la thiocholine

résultante de l'hydrolyse de l'acétylthiocholine ou de la butyrylcholine.

Sachant que la réaction de la thiocholine avec le dithiobisnitrobenzoate (DTNB)

conduit à la formation de l’acide 5-thio 2-nitrobenzoique (TNB), de couleur jaune, et
d’un mélange disulphide, il suffit donc de mesurer le taux de production de l’acide 5

37
Partie pratique Matériels et méthodes

thio 2-nitrobenzoique en utilisant un photomètre (la coloration jaune est lisible a

412nm) pour remonter au taux de production de la thiocholine.

O CH3 H3C O
AChE SH2
+ +
H3C S N CH3 N +
I- H3C OH
H3C
CH3 CH3

Acetylthiocholine(ATCI) Thiocholine Acide

acétique

HOOC COOH

O2N S S NO2

DTNB

HOOC CH3 COOH

O2N S N+
CH3 + HS NO2
S
CH3

Mélange disulphide Jaune acide-5-thio 2-nitrobenzoique (TNB)

Figure 12 : Mécanisme chimique de la méthode d’Ellman et al., (1961)

 Le mode opératoire
L'activité inhibitrice de la butyrylcholinestérase (BChE) et de
l’Acetylcholinesterase (AChE) de différents extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica a
été évaluée en utilisant la méthode de spectrophotométrie développée par Ellman et
al. ( 1961).

38
Partie pratique Matériels et méthodes

En utilisant une microplaque à 96 puits, des solutions à base de 150 μl de tampon

phosphate de sodium (100 mM ; pH= 8), de 10 μl d'une solution d’extrait d’une
concentration donnée, et de 20 μl de BChE (6,85 x10-3 U) ou de AChE (5.32 x10-3 U)
ont été préparées. Après 15 min d’incubation à 25◦C, un volume de 10 μl de DTNB
(acide 5,5´-dithio-bis (2-nitrobenzoique) (0,5 mM) a été ajouté. La réaction a été
ensuite initiée en ajoutant 20 μl d'acétylcholine iodure (0.71 mM) (ou butyrylcholine
iodure) (0.2 mM). Parallèlement à cela, des blancs ont également été préparés (les
blancs ne contiennent pas de solution enzymatique (AChE ou BChE).

 La réaction d’hydrolyse a été contrôlée par spectrophotométrie à 412 nm.

 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 L'activité inhibitrice du cholinestérase a été exprimée en équivalents de
galanthamine (400%).
 Le pourcentage d'inhibition d’AChE ou BChE a été déterminé en utilisant la
formule suivante :

‘E’ est l'activité de l'enzyme sans extrait.

’S’ est l'activité de l'enzyme avec l’extrait.

III.3.5. Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro)

L’activité anti-inflammatoire de divers extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica a

été étudiée en utilisant la méthode d’inhibition de la dénaturation des protéines.

 Le principe d’inhibition de la dénaturation de l'albumine sérique bovine

(BSA)

Le principe consiste à l’inhibition de dénaturation du BSA provoquée par la

chaleur (72°C) par les extraits.

39
Partie pratique Matériels et méthodes

L’albumine est la protéine du plasma la plus abondante chez l'homme et d'autres

mammifères. L'albumine est essentielle pour maintenir la pression colloïdale
osmotique requise pour la distribution appropriée des fluides corporels entre les
compartiments intravasculaires et les tissus. La BSA est généralement employée
comme une protéine modèle dans plusieurs domaines de recherche comme, entre
autres, la biologie moléculaire, la médicine, l’agro-alimentaire et l’environnement
(Rojas, 2009).

 Le mode opératoire
L'activité inhibitrice de la dénaturation de l'albumine sérique bovine (BSA) a été
étudiée par la méthode de Kandikattu. (2013), avec quelques modifications. Dans un
tube à essai, un volume de 500 μl d'une solution d’extrait de concentration donnée a
été mélangé avec 500 μl de solution de BSA (0.2%), Pour chaque concentration
d’extrait, un blanc constitué de 500 μl d’extrait et de 500 μl de Tris-Hcl (0,6%) a été
préparé (Ce blanc a pour but de soustraire l’absorbance de l’extrait et de Tris-Hcl des
résultats obtenus). De même, un control a été préparé en ajoutant un volume de 500
μl de solution de BSA (0.2%) à 500 μl du solvant utilisé dans la préparation des
extraits (le résultat obtenu correspond à la dénaturation totale du BSA en absence de
substance inhibitrice). Apres incubation à 37°C pendant 15 min, les tubes à essai ont
été chauffés dans un bain marie à 72ºC pendant 5 minutes puis refroidis pendant 10
minutes. Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires.

 L'absorption de ces solutions a été déterminée à une longueur d'onde de 660 nm.
 L'absorbance du blanc a été soustraite de celle de l'échantillon.
 L'activité inhibitrice de la dénaturation de l'albumine sérique bovine (BSA) a été
exprimée en équivalents de Diclofénac (500 ppm).
 Le pourcentage d'inhibition de la dénaturation de l'albumine sérique bovine
(BSA) a été déterminé en utilisant la formule suivante :

40
Partie pratique Matériels et méthodes

Ac absorbance de control
Ae absorbance des extraits

III.4. Etude statistiques

Les courbes de variation de l’absorbance en fonction de la concentration ont été
générées en utilisant le pourcentage d'inhibition des différentes concentrations
étudiées.
 Trois mesures ont été réalisées pour chaque échantillon analysé et les résultats
ont été exprimés sous la forme : moyenne ± écartype (SD).
 Les valeurs de CI50 (Concentration d’inhibition à 50%) et de A0,50 (la
concentration indiquant 0,50 d’absorbance) sont calculées par la méthode de
régression linéaire à partir de deux courbes : [% inhibition = f (concentrations)]
pour la CI50 et [Absorbance= f (concentrations)] pour la A0.50.

41
 Chapitre IV
Résultats et Discussion
Partie pratique Résultats et discussion

IV.1 Détermination du contenu total en polyphénols et la teneur des flavonoïdes

IV.1.1 Détermination du contenu total en polyphénols

Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 13,14 et le tableau 1.
L’acide gallique a été utilisé comme standard et la courbe d’étalonnage ayant
l’équation suivante :

La quantité des polyphénols a été rapportée en microgramme d’équivalent de

l’acide gallique par milligramme du poids de l’extrait (µg EAG / mg d’extrait).

0,90
0,80 y = 0,0034x + 0,1044
R² = 0,9972
0,70
0,60
Absorbance à 765nm

0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0 50 100 150 200 250
concentration (µg/ml)

Figure 13 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique

Tableau 1 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude du contenu

total en polyphénols des extraits d’Eriobotrya japonica L

Contenu total de composés phénoliques (µg EAG/ mg

Extraits
d’extrait)
EAEJ 124±2,94
EDEJ 67,82±4,73
EBEJ 106,79±3,08

42
Partie pratique Résultats et discussion

140

120
EBEJ
absorbance à 765nm

100 EDEJ

80 EAEJ

60 124
106,79
40
67,82
20

0
extraits

Figure 14 : Représentation graphique des teneurs en phénols totaux des extraits

des feuilles d’Eriobotrya japonica L
d’Eriobotrya japonica L

D’après les résultats obtenus, on remarque que l’extrait EAEJ est le solvant qui a
pu d’extraire le maximum de polyphénols avec un taux de 124±2,94 µg EAG/ mg
d’extrait, suivi par les extraits EBEJ et EDEJ avec un taux de 106,79±3,08 et 67,82±4,73
µg EAG/ mg d’extrait respectivement. Ces derniers sont plus pauvres en
polyphénols.

La différence de la teneur en polyphénols des extraits bruts et de leurs fractions

résulte de la différence de polarité des solvants organiques, le temps et la
température d'extraction, le rapport solide-liquide d’extraction ainsi que la nature
chimique et les caractéristiques physiques des échantillons (Dai et Mumper, 2010).

Nous remarquons que l’extrait EAEJ qui a révélé la teneur la plus élevé en
phénols totaux avec un taux de124±2,94 µg EAG/ mg d’extrait, cela explique que les
polyphénols sont des composés très polaire étant donné leur richesse en
groupements hydroxyles, donc ils se solubilisent dans les solvants polaires.

Cependant, la faible teneur en phénols totaux enregistrée dans l’extrait EDEJ

pourrait s’expliquer par le fait il contient beaucoup de composés phytochimiques

43
Partie pratique Résultats et discussion

qui engendre un encombrement stérique ce qui empêcherait la révélation des

phénols totaux par le réactif de folin-ciocalteu (Garcia et al., 2004).
Selon Hong et al., (2008), l’extrait des feuilles d’Eriobotrya japonica.L a laissé
apparaitre une teneur en phénols totaux de 54,9±2,4 mg équivalent acide gallique/ g
d’extrait.
Une teneur en polyphénoles de 71,94±11,93 mg EAG/g d’extrait méthanolique
d’Eriobotrya japonica.L à été trouvé par Uysal et ces collaborateurs (2016) qui est
supérieure de celle de l’extrait dichlorométhane de notre plante (67,82±4,73 µg
EAG/mg d’extrait ).

IV.1.2 Détermination de la teneur des flavonoïdes

Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 15,16 et le tableau 2, La
quercétine a été utilisée comme standard et la courbe d’étalonnage ayant l’équation
suivante :

La teneur des flavonoïdes a été rapportée en microgramme d’équivalent de la

quercétine par milligramme du poids de l’extrait (µg EQ / mg d’extrait).

1,20
y = 0,0071x+ 0,0274
1,00 R² = 0,9985
Absorbance à 415nm

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0 50 100 150 200 250
Concentration (µg/ml)

Figure 15 : Courbe d’étalonnage de la quercétine

44
Partie pratique Résultats et discussion

90
80 EBEJ
Absorbance à 415nm 70 EDEJ
60 EAEJ
50
40 76,87
30
20 37,70 35,10
10
0
extraits

Figure 16 : Représentation graphique des teneurs en flavonoïdes des extraits des

feuilles d’Eriobotrya japonica L

Tableau 2 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude du contenu

total en flavonoïdes des extraits d’Eriobotrya japonica L

Flavonoïdes content (µg EAG/ mg d’extrait)

Extraits

EAEJ 37,70±2,65
EDEJ 76,87±2,65
EBEJ 35,10±1,39

Les résultats obtenus montrent que les taux en flavonoïdes sont appréciables et
c’est l’extrait EDEJ qui a donné la teneur la plus élevé (76, 87±2,65µg EAG/ mg
d’extrait), étant donné que les flavonoïdes constituent de petites molécules riche en
groupements hydroxyles donc ils sont très polaires, ils se solubilisent dans les
solvants polaires (Siddhuraju et Becker, 2007) .
Il est à noter que la faible quantité en flavonoïdes de l’extrait EBEJ, peut être dû a
la présence de plusieurs composés phytochimiques qui empêchent la formation du

45
Partie pratique Résultats et discussion

complexe flavonoïdes- chlorure d’aluminium, ce qui restreindre la révélation des

flavonoïdes (Garcia et al., 2004).
Une teneur en flavonoïde de 31,94±0,08 mg /g d’extrait méthanolique a été
trouvée par Uysal et ces collaborateurs. (2016) qui est proche de celle de l’extrait
EBEJ (35,10±1,39 µg EAG/ mg d’extrait) et l’extrait EAEJ (37,70±2,65 µg EAG/ mg
d’extrait) de notre plante.

IV.2 Activité antioxydante

L’évaluation de l’activité antioxydante des extraits : dichlorométhane (EDEJ),
acétate d’éthyle (EAEJ) et butanolique (EBEJ) d’Eriobotrya japonica L, a été réalisée
par l’utilisation de six méthodes.

IV.2.1 Activité antiradicalaire au DPPH

Dans cette étude, l’activité antiradicalaire d’extraits d’Eriobotrya japonica L a été
évalué par la mesure des concentrations inhibitrices à 50 % (CI50) ; en se basant sur la
capacité d’une substance à réduire le radical DPPH ; par rapport à un antioxydant
standard (BHA et BHT). Les résultats sont présentés dans le tableau 3 et la figure 17
au dessous :

46
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 3 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre d’Activité antiradicalaire

au DPPH : valeurs d’Inhibition enregistrées et CI50 calculées

% Inhibition
Concentration
(µg/ml)

Extraits
0,78125 µg 1,5625 µg 3,125 µg 6,25µg 12,5µg 25µg 50µg CI50(µg/ml)
et standards

EAEJ 0 0 3,79±2,61 35,05±1,57 77,03±0,84 78,00±1,47 77,20±1,65 8,78±0,17

EDEJ 0 0 0 0 2,58±0,73 30,22±0,61 69,86±0,78 38,11±0,35

EBEJ 0 0 8,46±0,61 11,20±4,33 58,82±3,91 78,89±0,14 77,92±0,37 14,68±0,45

BHT 28,52±1,67 31,30±1,37 37,71±3,01 47,54±0,13 62,16±2,11 77,60±0,83 88,33±0,38 6,55±0,59

BHA 0,09±2,33 3,97±1,92 12,94±4,21 26,68±0,18 47,12±2,95 68,69±1,17 83,69±0,54 15,74 ±0,47

45
40 BHA
35 BHT
30 EBEJ
EDEJ
CI50 (µg/ml)

25
20 EAEJ
38,11
15
10
14,68 15,74
5 8,78 6,55
0
extraits et standards

Figure 17 : CI50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité antiradicalaire au

DPPH de différents extraits d’Eriobotrya japonica L

Les résultats obtenus montrent que l’extrait EAEJ (CI50= 8,78±0,17 μg/ml)
possède une excellente activité antiradicalaire par rapport au standard BHT (CI50=
6,55±0,59 μg/ml) et deux fois plus faible que celle du BHA (CI50=15,74 ±0,47 μg/ml),
et cette activité est mois efficace pour les extrait EBEJ (CI50=14,68±0,45 μg/ml) et

47
Partie pratique Résultats et discussion

EDEJ (CI50=38,11±0,35 μg/ml). Cependant, EBEJ a manifesté une forte activité par
rapport au standard BHA.

On constate que c’est l’extrait d’acétate d’éthyle qui a donné une meilleure activité
inhibitrice du radical DPPH comparativement aux deux autres extraits et cela serait
dû à sa richesse en phénols totaux.

L’étude de Maher et al. (2015), montre que l’extrait des feuilles d’Eriobotrya
japonica L a donné un CI50=12 µg /ml. Ce résultat montre qu'il existe une corrélation
entre la richesse en composés phénoliques et des flavonoïdes et l'activité
antiradicalaire.
En outre, Uysal et ses collaborateurs. (2016), ont montré que les extraits des
feuilles d’Eriobotrya japonica L ont exhibé une inhibition positive du radical DPPH
(10.61±1.16 mg /g).

IV.2.2 Activité du piégeage du cation radical ABTS•+

La détermination de la concentration inhibitrice des différents extraits en
comparant avec les standards BHA et BHT sont illustrés dans le tableau 4 et la figure
18 ci-dessous :

48
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 4 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’activité du piégeage

du cation radical ABTS•+: valeurs d’Inhibition enregistrées et CI50 calculées

% Inhibition
Concentration
(µg/ml)

Extraits
et standards 1.5625 µg 3.125 µg 6.25 µg 12.5 µg 25 µg 50 µg 100 µg CI50 (µg/ml)

EAEJ 0,14±1,42 23,92±1,33 53,29±1,50 82,67±2,65 89,12±0,27 89,97±0,00 89,97±0,23 5.91±0,13

EDEJ 0 0 0 14,98±1,52 43,11±5,04 76,76±2,78 88,58±0,84 29,71± 3,02

EBEJ 0 10,32±0,59 33,63±2,22 67,67±1,64 88,96±0,49 88,50±2,36 89,97±0,00 9,25±0,36

BHT 49.22±0.75 59.22±0.59 78.55±3.43 90.36±0.00 92.18±1.27 93.37±0.86 94.87±0.87 1.59±0,03

BHA 83.42±4.09 93.52±0.09 93.58±0.09 93.63±0.16 93.63±0.95 94.20±0.90 95.39±2.62 1.03±0,00

35

30

25
BHA
CI50 ( µg / ml )

20
BHT
15 29,71 EBEJ
EDEJ
10
EAEJ
5 9,25
5,91
1,59 1,03
0
extraits et standards

Figure 18 : CI50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité du piégeage du

cation radical ABTS•+ de différents extraits d’Eriobotrya japonica L

49
Partie pratique Résultats et discussion

D’après les résultats obtenus, on constante que la capacité de piégeage du radical

ABTS●+ présentée par l’EAEJ (CI50=5.91±0.13 μg/ml) est cinq fois plus faible que le
standard BHA (CI50=1.03±0.00 μg/ml) et BHT (CI50=1.59±0.03 μg/ml), et deux fois
plus fort que l’extrait EBEJ (CI50=9,25±0,36 μg/ml), cette capacité est suivie par
l’extrait EDEJ (CI50=29,71± 3,02 μg/ml).

Ceci étant dû à sa richesse en composés phénoliques (phénols totaux, flavonoïdes)

qui sont des molécules riches en groupements hydroxyles donneur d’hydrogènes et
d’électrons (Jayaprakasha et al., 2008).

L’étude de Xu et Chen. (2011) a indiquée que l'activité de piégeage des radicaux

ABTS de la plante d d’Eriobotrya japonica L s’échelonnait de 1,32 à 3,30 mol TE/g.

IV.2.3 Activité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC)

C’est une réaction de réduction du complexe cuivre-néocuproïne [Nc2-Cu2+], le
dosage de cette réaction est mesuré a titre de valeurs A0,50 des extraits d’Eriobotrya
japonica L et des standards BHA et BHT mentionnées dans le tableau 5 et la figure 19.

50
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 5 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’activité de réduction du

complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC) : valeurs d’absorbance enregistrées et A0,5
calculées

Concentration Absorbance
(µg/ml)

Extraits A0.5 (µg/ml)

et standards 1.5625 µg 3.125 µg 6.25 µg 12.5 µg 25 µg 50 µg 100 µg

EAEJ 0,27±0,14 0,43±0,02 0,56±0,02 0,57±0,34 1,04±0,20 1,86±0,07 2,95±0,10 4,93±0,49

EDEJ 0,33±0,01 0,34±0,01 0,40±0,00 0,42±0,02 0,54±0,06 0,68±0,18 1,20±0,03 24,93±10,53

EBEJ 0,37±0,04 0,41±0,03 0,50±0,03 0,69±0,01 0,91±0,16 1,33±0,51 2,48±0,16 6,29±0,73

BHT 0.11±0.04 0.19±0.01 0.33±0.04 0.66±0.07 1.03±0.07 1.48±0.09 2.04±0.14 9.62±0,87

BHA 0.23±0.07 0.46±0.00 0.78±0.01 1.34±0.08 2.36±0.17 3.45±0.02 3.76±0.03 3.64±0,19

40

35 BHA

30 BHT
EBEJ
25
A0,5 (µg/ml)

EDEJ
20
EAEJ
15
24,93
10

5 9,62
4,93 6,29
3,64
0
extraits et standards

Figure 19 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de Activité de réduction du

complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC) de différents extraits d’Eriobotrya
japonica

51
Partie pratique Résultats et discussion

La présente étude a montré que l’extrait EAEJ (A0,50=4,93±0,49 μg/ml) possède

une excellente activité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne par rapport au
standard BHA (A0,50=3.64±0.19 μg/ml) et meilleure que celle du BHT(A0,50=9.62±0.87
μg/ml), cet extrait est six fois plus actif que celui d’EDEJ (A0,50=24,93±10,53 μg/ml),
cette capacité est suivie par l’extrait EBEJ (A0,50= 6,29±0,73 μg/ml) par rapport au
standard BHA et BHT.

Cette étude nous a permis de confirmer la forte activité de la plante dans laquelle
l’extrait acétate d’éthyle a donné une excellente réduction du complexe cuivre-
néocuproïne par rapport au standard BHA.

Cette différence d’activité vis-à-vis le complexe cuivre-néocuproïne est due aux

plusieurs critères des polyphénols, tels que ; le nombre et la position (positions 3’, 4’
et 5’) de groupes d'hydroxyle aussi bien que le degré de conjugaison de la molécule
entière (double liaison C2-C3), le groupe carbonyle en position 4 (oxo) et la structure
ortho-dihydroxy sur le cycle B (groupement catéchol), qui sont importants pour le
transfert facile d'électrons (Apak et al., 2004).
Selon Uysal et ses collaborateurs. (2016), l’absorbance de l’activité de réduction
du complexe cuivre-néocuproïne de l’extrait de la plante d’Eriobotrya japonica L et
entre (0,126 ±0,001 et 0,685± 0,007 mg/g).

IV.2.4 Activité du pouvoir réducteur (FRAP)

Les valeurs A0,50 ont été calculées puis comparées à celles des standards ( acide
ascorbique et α-tocophérol).

52
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 6 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

du pouvoir réducteur : valeurs d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées

Absorbance
Concentration
(µg/ml)

Extraits 3,125 µg 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg A0.5 (µg/ml)

et standards

EAEJ 0,10±0,01 0,18±0,04 0,29±0,03 0,58±0,06 0,80±0,15 0,96±0,23 1,18±0,07 21,55±2,53

EDEJ 0,09±0,01 0,10±0,01 0,18±0,02 0,26±0,04 0,44±0,02 0,63±0,01 0,84±0,11 65,32±8,09

EBEJ 0,11±0,01 0,18±0,04 0,27±0,06 0,46±0,07 0,73±0,13 0,98±0,17 0,92±0,20 31,38±8,20

Acide ascorbique 0,35±0,05 0,46±0,03 0,84±0,12 0,93±0,30 1,18±0,34 1,37±0,20 1,44±0,21 6,77±1,15

α-Tocophérol 0,11±0,00 0,16±0,00 0,21±0,03 0,35±0,03 0,73±0,03 1,37±0,08 1,81±0,09 34,93±2,38

α-Tocophérol
80 Acide ascorbique

70 EBEJ
EDEJ
60
EAEJ
50
A0,50 )ug/ml)

40
65,32
30

20
31,38 34,93
10 21,55
6,77
0
extraits et standards

Figure 20 : A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité du pouvoir

réducteur de différents extraits d’Eriobotrya japonica

53
Partie pratique Résultats et discussion

A partir du tableau 6 et de la figure 20, on peut déduire que l’extrait EAEJ présente
le meilleur pouvoir réducteur dont la valeur A0,50 calculée est de (21,55±2,53 μg/ml) ;
cette valeur signifie que l’extrait EAEJ a un pouvoir réducteur bien meilleur que celui
de l’α-tocophérol, mais qui reste trois fois plus faible que celui de l’acide ascorbique.

L’extrait EBEJ présente un pouvoir réducteur (A0,50=31,38±8,20 μg/ml) proche de

celui de l’α-tocophérol, tandis que, l’extrait EDEJ présente un pouvoir réducteur très
faible (A0,50=65,32±8,09μg/ml).

La présence des réducteurs dans les extraits de la plante a permis de réduire le fer
ferrique (Fe+3) présent dans le ferricyanure de potassium en fer ferreux (Fe+2).

Bien que, nos extraits soient riches en flavonoïdes, nous constatons qu’il n’y a pas
de corrélation entre les teneurs en flavonoïdes et le pouvoir réducteur ; le pouvoir
réducteur est probablement dû à la présence des polyphénols contenant des
groupements hydroxyles (donneur d’électron) (Siddhuraju et Becker, 2007) .

le travail effectué par Uysal et al ., (2016) sur l’extrait de la plante Eriobotrya

japonica) récoltés en Méditerranée région de Turquie a donné la valeur de
(158.90 ;mg/g d’extrait), cette valeur est faible par rapport à nos résultats.

IV.2.5 Activité de réduction par la formation du complexe Fe+2-phénantroline

Suite à une réaction d’oxydoréduction, un complexe stable rouge-orangé de Fe+2
coordonné par trois ligands de phénanthroline est formé. Cette réduction est évaluée
en mesurant les valeurs A0,50 des extraits de la plante et celles des standards BHA et
BHT.

54
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 7 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

de réduction par la formation du complexe Fe+2- phénantroline : valeurs
d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées

Concentration Absorbance
(µg/ml)

Extraits
et standards 3,125 µg 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg A0.5 (µg/ml)

EAEJ 0,39±0,02 0,51±0,01 0,76±0,13 1,22±0,12 2,54±0,37 3,63±0,36 3,84±0,35 6,13±0,68

EDEJ 0,39±0,04 0,44±0,03 0,58±0,02 0,79±0,04 1,24±0,09 1,66±0,14 3,19±0,43 8,68±0,95

EBEJ 0,44±0,01 0,55±0,03 0,82±0,02 1,24±0,06 2,01±0,07 3,48±0,19 4,07±0,04 4,81±0,29

0.78125 1.5625 3.125 µg 6.25 µg 12.5 µg 25 µg 50 µg A0.5 (µg/ml)

BHA 0,49±0,01 0,59±0,01 0,73±0,02 0,93±0,01 1,25±0,04 2,10±0,05 4,89±0,06 0,93±0,07

BHT 0,47±0,01 0,47±0,01 0,53±0,03 1,23±0,02 1,84±0,01 3,48±0,03 4,84±0,01 2,24±0,17

55
Partie pratique Résultats et discussion

12
BHT
10 BHA
EBEJ
8
EDEJ
A0,50 )ug/ml)

6 EAEJ

4 8,68
6,13
4,81
2
2,24
0,93
0
extraits et standards

Figure 21: A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité de réduction par la
formation du complexe Fe+2- phénantroline de différents extraits d’Eriobotrya
japonica

Les résultats obtenus montrent que les trois extraits sont capables de réduire le fer
et de former un complexe Fe+2 -phénantroline. A partir du tableau 7 et de la figure 21,
on peut déduire que l’extrait EBEJ présente le pouvoir réducteur le plus important
(A0,50=4,81±0,29 μg/ml), suivie par l’extrait EAEJ (A0.50= 6,13±0,68μg/ml), tandis que,
l’extrait EDEJ arrive en troisième position avec A0.50=8,68±0,95μg/ml.

Ces résultats montrent aussi que le pouvoir réducteur des ces extraits reste
relativement faible par rapport à celui des standards BHT et BHA (A0,50=0,93±0,07 et
2,24±0,17 μg/ml respectivement).

Cette différence de pouvoir réducteur est liée à la capacité réductrice des

polyphénols qui dépend du degré d'hydroxylation et du degré de conjugaison des
composés phénoliques. Spécifiquement pour les flavonoïdes, il a été reporté que la
capacité d'élimination des radicaux libres augmente en cas de présence de : une
structure 3',4'-dihydroxy dans le cycle B, une double liaison (C2-C3) en conjonction
avec le groupe 4-oxo dans l'hétérocycle, des groupes 3- et 5-hydroxyle dans le cycle A
avec une fonction 4-oxo dans les cycles A et C (Pulido et al., 2000).
56
Partie pratique Résultats et discussion

IV.2.6 Activité silver nanoparticule (SNP)

Les analyses des résultats ont permis de remonter les valeurs A0,50 des différents
extraits. Le Trolox a été utilise comme standard.

Tableau 8 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

silver nanoparticules (SNP) : valeurs d’absorbance enregistrées et A0,5 calculées

Concentration Absorbance
(µg/ml)

Extraits
et standards 0,781µg 1,562 µg 3,125 µg 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg A0.5 (µg/ml)

EAEJ 0,08±0,00 0,09±0,00 0,11±0,00 0,15±0.10 0,25±0,02 0,38±0,01 0,62±0,01 37,82±0,58

EDEJ 0,08±0,01 0,08±0,00 0,09±0,00 0,11±0,01 0,14±0,01 0,21±0,01 0,40±0,04 70,72±6,30

EBEJ 0,08±0,00 0,09±0,00 0,12±0,01 0,17±0,00 0,26±0,01 0,38±0,03 0,57±0,05 43,13±2,56

1.5625µg 3.125µg 6.25µg 12.5µg 25µg 50µg 100µg A0.5 (µg/ml)

Trolox 0.17±0.00 0.20±0.01 0.23±0.00 0.30±0.01 0.43±0.01 0.64±0.03 1.04±0.01 34.17±1,23

90 Trolox

80 EBEJ
EDEJ
70
EAEJ
60

50
A0,50 )ug/ml)

40
70,72
30

20 43,13
37,82 34,17
10

0
extraits et standards

Figure 22: A0,5 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité de silver

nanoparticules (SNP) de différents extraits d’Eriobotrya japonica

57
Partie pratique Résultats et discussion

Les résultats obtenus montrent que tous les extraits sont capables de réduire l’Ag+
en Ag0. A partir du tableau 8 et de la figure 22, on peut déduire que l’extrait EAEJ
présente le pouvoir réducteur le plus élevé (A0,50=37,82±0,58μg/ml), proche de celui
du standard trolox (A0,50=34.17±1.23μg/ml), suivie par l’extrait EBEJ dont la valeur
A0,50= 43,13±2,56μg/ml. Tandis que, l’extrait EDEJ présente le pouvoir réducteur le
plus faible (70,72±6,30μg/ml), deux fois plus faible que celui du standard.

L’efficacité de cette réduction dépend du nombre et de la position des groupes

phénoliques -OH, ainsi que du niveau de conjugaison global de la molécule
polyphénolique. (O zyu rek et al., 2011).

IV.3 Activité enzymatique

IV.3.1 Evaluation de l’activité antidiabétique

L’activité antidiabétique des différentes fractions d’extraits d'Eriobotrya japonica a
été évaluée en mesurant leurs capacité à inhiber l’enzyme alpha-amylase.
Dans cette étude, l’activité inhibitrice de l’enzyme alpha-amylase des différents
extraits d'Eriobotrya japonica a été évaluée en comparant les concentrations inhibitrices
CI50 des différents extraits à celle du standard « l’acarbose ».

58
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 9 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité

inhibitrice d’alpha-amylase : pourcentage d’inhibition enregistrées et valeurs IC50
calculées

Concentration % d’inhibition
(µg/ml)

Extraits
et standards 6,25 µg 12,5 µg 25 µg 50 µg 100 µg 200 µg 400 µg IC50 (µg/ml)

EAEJ 33,47±0,00 34,06±0,00 38,94±8,46 54,54±1,50 57,56±5,54 65,15±0,00 70,38±0,56 39,92±8,84

EDEJ 47,97±0,00 53,82±2,10 54,16±3,56 60,39±2,38 65,69±3,01 68,34±8,03 75,11±4,83 8,59±0,71

EBEJ - - - - - - - -

62,5 µg 125 µg 250 µg 500 µg 1000 µg 2000 µg 4000 µg IC50 (µg/ml)

Acarbose 7,76±0,17 8,08±0,30 9,46±0,11 10,70±0,96 31,81±2,89 37,21±3,54 53,05±1,59 3650,93±10,70

Acarbose
4000
EDEJ
3500 EAEJ

3000

2500
A0,50 )ug/ml)

2000
3650,93
1500

1000

500
39,92 8,59
0
extraits et standards

Figure 23 : CI50 obtenues dans le cadre de l’étude de l’activité inhibitrice d’alpha-

amylase de différents extraits d’Eriobotrya japonica

59
Partie pratique Résultats et discussion

Comme illustré dans (le tableau 9 et la figure 23), l’activité inhibitrice d’alpha
amylase est seulement enregistrée dans deux extraits (EDEJ et EAEJ).

L’activité de l'extrait EDEJ (CI50=8,59±0,71µg/ml) est extrainement plus élevé que

celle de l'extrait EAEJ (CI50=39,92±8,84µg/ml). Cette activité est largement supérieure
à celle du standard (Acarbose : CI50=3650,93±10,70 µg/ml).

L’excellente capacité inhibitrice des extraits (EDEJ et EAEJ) est probablement due
à leur richesse en composées phénoliques, notamment les flavonoïdes et les tanins.
Ces derniers contiennent des molécules inhibitrices non spécifiques de diverses
enzymes hydrolytiques, telles que ; les α-amylases, les α-glucosidases et les lipases.
Cette inhibition est peut-être associée à leur capacité à se lier fortement aux protéines
et aux glucides dont l'interaction entre les tanins et les protéines est le résultat de
multiples liaisons hydrogènes. En conséquence de cette interaction, les sites
catalytiques des enzymes sont bloqués et leur activité est donc inhibée (Yan et al.,
2019).

L’étude réalisée par Fu et al., (2019) sur l’extrait pectic-polysaccharides des feuilles
d'Eriobotrya japonica a présenté un effet inhibiteur in vitro de l'α-amylase avec CI50
entre (15a 88 µg/ml), l’activité est faible par rapport à nos résultats.

IV.3.2 Evaluation de l’activité anticholinestérase

L’activité anticholinestérase de différents extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica a
été évaluée en utilisant la méthode d’inhibition des deux enzymes
butyrylcholinestérase et Acetylcholinesterase.
Il est à noter que l’activité anticholinestérase d’extraits d’Eriobotrya japonica n’a
jamais été étudiée in vitro.
Les résultats obtenus sont présentés/résumés dans les tableaux 10 et 11. Ces
résultats montrent qu’aucun des trois extraits n’a une activité inhibitrice de la AChE
ni de la BChE.

60
Partie pratique Résultats et discussion

Tableau 10: Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de l’activité
inhibitrice de l’acétylcholinestérase : valeurs d’absorbance enregistrées

1 2 3 4 5 6 7 8 9
EAEJ 5,31 6,43 EDEJ 48,01 40,03 EBEJ 36,21 1,99
EAEJ 8,81 4,24 EDEJ 46,06 44,48 EBEJ 20,54 3,80
EAEJ 0,73 12,72 EDEJ 43,76 47,37 EBEJ -48,02 21,11
EAEJ 5,04 6,69 EDEJ 4,18 12,33 EBEJ 1,05 7,26
EAEJ 0,23 11,27 EDEJ -24,20 29,49 EBEJ -4,62 22,78
EAEJ -14,29 43,09 EDEJ -36,86 36,07 EBEJ 17,20 70,04
EAEJ -25,49 11,96 EDEJ -28,74 20,58 EBEJ -29,05 7,25
Control -17,42 18,24 Control -42,62 6,12 Control -39,96 7,54

Tableau 11 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de

l’activité inhibitrice de la butyrylcholinestérase : valeurs d’absorbance enregistrées

1 2 3 4 5 6 7 8 9
EAEJ 7,69 23,29 EDEJ -19,26 4,32 EBEJ 27,93 13,65
EAEJ 8,24 4,72 EDEJ -19,63 16,73 EBEJ -19,45 8,18
EAEJ -3,74 4,01 EDEJ -2,47 22,39 EBEJ -19,81 15,97
EAEJ -17,63 5,36 EDEJ -43,32 27,58 EBEJ -35,06 56,69
EAEJ -21,62 11,85 EDEJ -40,96 11,71 EBEJ -51,03 12,92
EAEJ -16,00 20,48 EDEJ -36,96 27,00 EBEJ -65,19 16,22
EAEJ -6,83 4,95 EDEJ -42,23 34,53 EBEJ -61,92 7,10
Control 9,05 16,56 Control -60,20 1,50 Control -48,85 14,47

IV.4 Evaluation de l’activité anti-inflammatoire (in vitro)

L’activité anti-inflammatoire de divers extraits de feuilles d’Eriobotrya japonica a

été étudiée en utilisant la méthode d’inhibition de la dénaturation des protéines.

La dénaturation des protéines est décrite comme un processus pathologique qui

implique la perte de configuration et, par conséquent, la perte de fonctionnalité. Cela
rend la réduction de la dénaturation des protéines et par extension, le test de
61
Partie pratique Résultats et discussion

dénaturation des protéines BSA, idéal pour la détermination du potentiel anti

inflammatoire (sridevi et al., 2015).

Les pourcentages d’inhibition de la dénaturation de BSA des différents extraits ont

été calculés puis comparées à celle du standard « Voltarène ». Les résultats de l’effet
protecteur des extraits d’Eriobotrya japonica contre la dénaturation protéique causée
par la chaleur sont représentés ci dessous :

Tableau 12 : Récapitulatif des résultats obtenus dans le cadre de l’étude de

l’activité d’inhibition de la dénaturation de l'albumine sérique bovine :
pourcentage d’inhibition enregistrée

Concentration
% d’inhibition
(µg/ml)

Extraits 15,625
31,25 µg/ml 62,5 µg/ml 125 µg/ml 250µg/ml
et standards µg/ml

EAEJ 45,47±1,60 52,49±3,00 61,46±0,80 69,96±3,29 -

EDEJ - 11,97±6,17 17,68±0,00 26,23±5,35 58,66±6,17

EBEJ - 33,77±5,95 37,77±8,44 55,63±8,29 58,87±6,55

Voltarène - 34,11±0,50 51,37±0,91 76,87±1,24 99,23±0,41

Les extraits d'Eriobotrya japonica ont montré une capacité, dose-dépendante, à

inhiber la dénaturation des protéines induite thermiquement.

Les résultats obtenus (Tableau 12) montrent que tous les extraits d’Eriobotrya
japonica, ont une activité inhibitrice de la dénaturation de BSA.

D’après le tableau de pourcentage d’inhibition de la dénaturation de BSA, l’extrait

EAEJ présente une activité d'inhibition maximale avec un pourcentage de 69,96 % à
125 µg/ml proche de celui du standard Voltarène 76,87% dans la même
concentration. Cette activité est suivie par l’extrait EDEJ et EBEJ avec une inhibition
maximale de 58,87 %, 58,66 % respectivement.

62
Partie pratique Résultats et discussion

La dénaturation des protéines est une cause d'inflammation bien documentée, ce

mécanisme probablement implique une altération des liaisons électrostatique,
hydrogène, hydrophobe et disulfure qui maintiennent la structure tridimensionnelle
des protéines (mizushima, 1968).

L’activité inhibitrice de la dénaturation de BSA d’extraits de feuilles d'Eriobotrya

japonica n’a jamais été démontrée auparavant.

une étude sur l'activité anti-inflammatoire in vitro de l'acide tormentique des

cellules en suspension d'Eriobotrya Japonica a révélé après un teste de Western blot
que l'acide tormentique diminuait les expressions inductibles induites par l'oxyde
nitrique synthase (iNOS) et la cyclooxygénase-2 (COX-2) (changa et al., 2011).

Les extraits d'Eriobotrya japonica sont capables de contrôler la production d’auto-

antigène par l’inhibition de la dénaturation des protéines. L’activité inhibitrice de la
dénaturation de BSA est probablement due à la présence de différents composés
bioactifs tels que ; les flavonoïdes et les tannins dans les extraits (Padmanabhan et
Jangle, 2012).

63
Conclusion
et
Perspectives
 Conclusion et perspectives

Conclusion et perspectives

L’Eriobotrya japonica L est l’une des plantes médicinales qui contienne une variété
de métabolites secondaires, y compris les composés phénoliques qui sont caractérisés
par des propriétés biologiques importantes, ce qui justifie leur utilisation dans
plusieurs domaines.

Dans le cadre de notre étude, nous nous sommes intéressés à l’extraction des
composés phénoliques des feuilles d’Eriobotrya japonica L par macération, puis à
l’évaluation in-vitro de quelques activités biologiques (antioxydantes,
anticholinestérases, antidiabétique et anti-inflammatoires) des extraits obtenus.

La première partie de cette étude concerne l’extraction des composés phénoliques

des feuilles d’Eriobotrya japonica L, essentiellement kes polyphénols totaux et les
flavonoïdes.

 L’extrait EAEJ présente la teneur en polyphénols la plus élevé

 L’extrait EDEJ présente la teneur en flavonoïdes la plus élevé

La deuxième partie consiste à évaluer certaines activités biologiques des différents

extraits d’Eriobotrya japonica , les résultats obtenus ont montré:

 Un potentiel antioxydant très intéressant ; la meilleure capacité antioxydante

a été observée dans le cas de l’extrait EAEJ.
 Une activité antidiabétique remarquable ; l’extrait EDEJ présente la meilleure
capacité inhibitrice de l’enzyme alpha-amylase.
 Une activité anti-inflammation " moyenne " ; les résultats ont montré que
l'extrait EAEJ présente une activité anti inflammatoire considérable in vitro
 Une absence de l’activité anticholinestérase.

Ces activités biologiques sont probablement liées à la richesse de l’espèce en

métabolites secondaires, notamment en flavonoïdes.

64
 Conclusion et perspectives

Ce travail pourrait se poursuivre dans plusieurs directions :

 S’investir dans d’autres parties de la plante, à savoir, les fruits, les fleurs et les
graines.
 L’étude in vivo de l’effet de cette plante sur le stress oxydant en mesurant
l’activité des enzymes antioxydantes (Catalase, Superoxyde dismutase …).
 L’utilisation d’autres techniques d’extraction afin d’optimiser le rendement
ainsi que la qualité des composés phénoliques.
 La quantification et la caractérisation des métabolites secondaires de cette
plante.
 L’évaluation d’autres activités biologiques telles que les activités
antimicrobiennes, anticancéreuse, antitumorale, analgésiques, anti-
carcinogènes…
 La validation de nos résultats in vitro par des tests in vivo.

65
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83
Annexes
 Annexes

Annexes

Annexe I : matériels et instruments utilisés

1. Matériel du laboratoire

Ampoule à décanter, tubes eppendorf, micropipettes de volumes différents,

microplaques, ballons, béchers, erlenmeyers, éprouvettes, flacons, spatules, portoirs,
verres de montre.

2. Instruments

-Rotavap (BUCHI).
- Balance de précision (KERN).
-Lecteur de microplaque (PerkinElmer).
-Etuve (Memmert).
- pH mètre (METTLER TOLEDO).

Annexe II : Réactifs des activités antioxydantes

Réactifs Compostions Quantités

DPPH 6 mg
DPPH•
Méthanol 100 ml
ABTS 19,2 mg
H2O 5 ml
ABTS•+ (7 mM)
K2S2O8 (2.45 mM) 3,3 mg
H2O 5 ml
Néocuproïne 0,039 g
Néocuproïne
Ethanol 25 ml
1,10- Phénantroline monohydraté 0,05g
Phénantroline (0.5%)
Méthanol q.s. P10 ml
Ag NO3 50 ml
SNP
Trisodium citrate 5 ml
 Annexes

Annexe III : Réactifs des activités enzymatiques et substrats

Solutions Compostions Quantités

Enzyme α-amylase 1 mg
Enzyme α-amylase (1U)
Tampon phosphate (pH 6,9) 9ml
Amidon 0,1 g
Amidon (0.1%)
H2O q.s. P100ml
BChE 1 mg
BChE
Tampon phosphate (pH 8) 22,6 ml
Chlorure de butyrylthiocholine 4 mg
Chlorure de butyrylthiocholine
H2O 4 ml
(0,2 mM)
Tampon phosphate (pH 8) 4 ml
AChE 1 mg
AChE
Tampon phosphate (pH 8) 22,6 ml
Chlorure d’acétylthiocholine
Chlorure d’acétylthiocholine 4 mg
H2O
(0,2 mM) 4ml
Tampon phosphate (pH 8)
4ml

Annexe IV : Réactifs de l’activité anti-inflammatoire

Réactifs Compostions Quantités

Tris
1,2144 mg
Tampon Tris-Hcl (PH 6,6) H2O
200 ml
Hcl
BSA BSA 0,2 g
Tris-Hcl 100 ml
 Annexes

Annexe V : Standards

standards Compostions Quantités

Acide gallique 0,5 mg

Acide gallique
Méthanol 5 ml

Quercétine 1 mg
Quercétine
Méthanol 5 ml

BHA 0,5 mg
BHA
Méthanol 1 ml

BHT 0,5 mg
BHT
Méthanol 1 ml

Acide Ascorbique 4 mg
Acide ascorbique
Méthanol 1 ml

α-Tocophérol 4 mg
α-Tocophérol
Méthanol 1 ml

Acarbose 4 mg
Acarbose
Méthanol 1 ml

Galantamine 4 mg
Galantamine
Méthanol 1 ml
 Annexes

Annexe VI : Solutions chimiques

Solutions chimiques Compostions Quantités

Réactif de Folin-Ciocalteu dilué 10 fois FCR concentré (2M) 1ml
H2O q.s. P10 ml

Carbonate de sodium anhydre (7,5%) Na2CO3 7,5 g

H2O q.s. P100 ml
Acétate de potassium (1M) CH3COOK 9,80 g
H2O 100 ml
Nitrate d’aluminium Al(NO3)3, 9H2O 10g
H2O 100ml
Acétate d’ammonium CH3COONH4 1,927 g
H2O 25 ml
Chlorure de cuivre II dihydraté CuCl2, 2H2O 0,042625 g
H2O 25 ml
Tampon phosphate pH 6,6 NaH2PO4 62,5 ml
Na2HPO4 37,5 ml
Ferrycianide de potassium (1%) K3Fe(CN)6 1g
H2O q.s. P100 ml
Acide trichloracétique (10%) TCA 1g
H2O q.s. P10 ml
Chlorure de fer III anhydre (0.1%) FeCl3 0,1 g
H2O q.s. P100 ml
Chlorure de fer III anhydre (0.2%) FeCl3 0,02g
H2O q.s. P10 ml
Chlorure de fer III tetrahydraté (0,2 mM) FeCl2, 4H2O 4 mg
H2O 100 ml
Tampon phosphate (pH 6.9) (0.2 M) NaH2PO4 51 ml
Na2HPO4 49 ml
Acide hydrochlorique (1M) HCl 4.17 ml
H2O 45.83 ml
KI 3g
Iodure de potassium iode (IKI) H2O 100 ml
Iodine (5mM) 127 mg
Tampon phosphate (pH 8) (100 mM) NaH2PO4 5,3
Na2HPO4 94,5
DTNB 16 mg
DTNB Tampon phosphate (pH 7) 4 ml
NaHCO3 7,5 mg
Tampon phosphate (pH 8) 4 ml
Tampon phosphate (pH 7)
NaH2PO4 39 ml
Na2HPO4 61 ml
 Annexes

Figure A : Appareils de broyage

Figure B : Rotavap de marque BUCHI

 Annexes

Figure C : Bain-marie marque MEMMERT

Figure D : les tubes à essais de l’activité anti - inflammatoire

 Annexes

Figure E : L’extrait brut de la plante

Figure F : Extraction par solvant chloroformique

 Annexes

Figure G : Extraction par le solvant d’acétate d’éthyle

Figure H : Extraction par le solvant butanolique

Résumé
 Résumé

Résumé

Dans le cadre de la recherche de nouveaux composés naturels à partir de sources

naturelles, le présent travail s’intéresse à l’étude phytochimique et biologique de la
plante Eriobotrya japonica L qui est une plante médicinale appartient à la famille des
Rosacées.

La première partie de cette étude concerne la macération des feuilles d’Eriobotrya

japonica L, l’extraction des polyphénols totaux et des flavonoïdes, les résultats
obtenus montrent que la teneur en polyphénols la plus importante est obtenue par
l’extrait d’acétate d’éthyle avec un taux de (124±2,94 µg EAG/ mg d’extrait). La
détermination quantitative des flavonoïdes révèle que l’extrait butanolique présente
la teneur la plus élevé (76, 87±2,65µg EAG/ mg d’extrait).

La deuxième partie consiste à étudier certaines activités biologiques, en

commençant par l’activité antioxydante, où six tests ont été réalisé ; à savoir, l’activité
antiradicalaire au DPPH, l’activité du piégeage du cation radical ABTS•+, l’activité
de réduction du complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC), l’activité du pouvoir
réducteur (FRAP), l’activité de réduction par la formation du complexe Fe+2-
phénantroline et l’activité silver nanoparticule (SNP) indiquent que les extraits des
feuilles d’Eriobotrya japonica ont exhibé une importante activité.

En outre, l’activité antidiabétique montre que l’extrait dichlorométhane présente la

meilleure capacité inhibitrice de l’enzyme alpha-amylase avec CI50=8,59±0,71µg/ml.
Concernant l’activité anti-inflammatoire, l’extrait d’acétate d’éthyle a montré une
excellente activité inhibitrice de la dénaturation de BSA (CI50=26,765±5,774µg/ml), il
est a noté que notre plante n’a pas une activité anticholinestérase.

On conclues, d’après les résultats obtenu que notre plante est très riche en
composé phénolique, ce qui explique d’ailleurs leur pouvoir antidiabétique, anti-
inflammatoire et notamment le excellent pouvoir antioxydant de notre plante.

Mots clés : Antioxydante ; Anti-inflammatoire ; Anticholinestérases; Antidiabétique;

Composés phénoliques ; Eriobotrya japonica ; Plante médicinale.
 Abstract

Abstract

As part of the search for new natural compounds from natural sources, the
present work focuses on the phytochemical and biological study of the plant
Eriobotrya japonica L which is a medicinal plant belonging to the Rosaceae family.

The first part of this study concerns the maceration of the leaves of Eriobotrya
japonica L, the extraction of total polyphenols and flavonoids, the most important
polyphenol content is obtained by ethyl acetate extract with a rate of (124±2.94 µg
EAG/ mg extract). The quantitative determination of flavonoids reveals that the
butanolic extract has the highest content (76, 87±2.65µg EAG/ mg extract).

The second part consists of studying certain biological activities, starting with
antioxidant activity, where six tests were performed ; namely, DPPH antiradical
activity, ABTS-+ radical cation scavenging activity, copper-neocuproin complex
reduction activity (CUPRAC), reducing power activity (FRAP), reducing activity
through the formation of the Fe+2-phenantroline complex and silver nanoparticle
activity (SNP) indicate that the extracts from the leaves of Eriobotrya japonica
exhibited significant activity.

In addition, the antidiabetic activity shows that the dichloromethane extract

shows the best inhibitory capacity of the alpha-amylase enzyme with
CI50=8.59±0.71µg/ml. Concerning the anti-inflammatory activity, the ethyl acetate
extract showed an excellent inhibitory activity of BSA denaturation
(IC50=26.765±5.774µg/ml), it is noted that our plant does not have an
anticholinesterase activity.

It was concluded, from the results obtained, that our plant is rich in phenolic
compounds, which explains their biological effect in several activities (antioxidant,
antidiabetic, anticholinesterases and anti-inflammatory). And it has been confirmed
that the antioxidant activity is the best among the others.

Keywords: Antioxidant; Anti-inflammatory; Anticholinesterases; Antidiabetic;

Phenolic compounds; Eriobotrya japonica; Medicinal plant.
 ‫الملخص‬

‫الملخص‬

‫كجزء من البحث عن مركبات طبٌعٌة جدٌدة من مصادر طبٌعٌة ‪ٌ ،‬هتم العمل الحالً بالدراسة الكٌمٌائٌة النباتٌة‬
‫والبٌولوجٌة للنبات زعرور الیابان وهو نبات طبً ٌنتمً إلى عائلة ‪.Rosaceae‬‬

‫ٌتعلق الجزء األول من هذه الدراسة بنقع أوراق نبات زعرور الیابان ‪ ،‬واستخراج البولٌفٌنول والفالفونوٌد‪،‬‬
‫أظهرت النتائج التً تم الحصول علٌها أن أعلى محتوى من مادة البولٌفٌنول تم الحصول علٌه من مستخلص أسٌتات‬
‫اإلٌثٌل بمعدل (‪ 2961 ± 421‬مٌكروغرام ‪ /‬ملغ من المستخلص)‪ٌ .‬كشف التحدٌد الكمً لمركبات الفالفونوٌد أن مستخلص‬
‫البٌوتانول ٌحتوي على أعلى محتوى ( ‪ 2932 ± 43954‬مٌكروغرام من مستخلص ‪ / EAG‬ملغ )‪.‬‬

‫الجزء الثانً ٌتكون من دراسة بعض األنشطة البٌولوجٌة ‪ ،‬بدءا من النشاط المضاد لألكسدة ‪ ،‬حٌث تم إجراء‬
‫ستة اختبارات ؛ النشاط المضاد للجذور الحرة ‪ ، DPPH‬نشاط تنظٌف الكاتٌون الجذري ‪ ، ABTS‬تقلٌل نشاط مركب‬
‫النحاس‪-‬النٌوكوبروٌن (‪ ، )CUPRAC‬نشاط الطاقة المختزلة (‪ ، )FRAP‬نشاط االختزال عن طرٌق تكوٌن مركب‬
‫‪ Fe+ 2-phenanthroline‬ونشاط جسٌمات الفضة النانوٌة (‪ ، )SNP‬أشارت إلى أن مستخلصات أوراق نبات‬
‫ً‬
‫نشاطا كبٌرً ا‪.‬‬ ‫زعرور الیابان أظهرت‬

‫باإلضافة إلى ذلك ‪ٌُ ،‬ظهر النشاط المضاد لمرض السكري أن مستخلص ثنائً كلورو مٌثان ٌُظهر أفضل قدرة‬
‫مثبطة ألنزٌم ألفا أمٌلٌز ب )‪ IC50 = 8.59 ± 0.71‬مٌكروغرام ‪ /‬مل( ‪ .‬فٌما ٌتعلق بالنشاط المضاد لاللتهابات ‪ ،‬أظهر‬
‫ً‬
‫ممتازا ل َتغَ ٌُّر طبٌعة ‪ IC50 = 26.765 ± 5.774 ) BSA‬مٌكروغرام ‪ /‬مل( ‪،‬‬ ‫ً‬
‫مثبطا‬ ‫ً‬
‫نشاطا‬ ‫مستخلص أسٌتات اإلٌثٌل‬
‫لوحظ أن نباتنا ال ٌحتوي على نشاط مضادات الكولٌن‪.‬‬

‫استنتجنا من النتائج التً تم الحصول علٌها أن نباتنا غنً بالمركبات الفٌنولٌة ‪ ،‬وهو ما ٌفسر أٌ ً‬
‫ضا قوتها‬
‫المضادة للسكري وااللتهابات وخاصة القوة الممتازة المضادة لألكسدة‪.‬‬

‫الكلمات الرئٌسٌة‪ :‬مضادات األكسدة ؛ مضاد التهاب؛ مضادات الكولٌن‪ .‬مضاد لمرض السكر‪ .‬مركبات فٌنولٌه؛ زعرور‬
‫الیابان؛ نبات طبً‪.‬‬
 Année universitaire : 2019/2020 Présenté par : BENHACINE Manel
BAADECHE Takoua Balkiss

Etude phytochimique et l’évaluation in vitro des activités antioxydantes,

anticholinestérase, antidiabétique et anti-inflammatoire des extraits
d’Eriobotrya japonica

Mémoire de fin de cycle pour l’obtention du diplôme de Master en Biochimie moléculaire et santé.
Résumé

Dans le cadre de la recherche de nouveaux composés naturels à partir de sources naturelles, le présent travail
s’intéresse à l’étude phytochimique et biologique de la plante Eriobotrya japonica L qui est une plante médicinale
appartient à la famille des Rosacées.
La première partie de cette étude concerne la macération des feuilles d’Eriobotrya japonica L, l’extraction des
polyphénols totaux et des flavonoïdes, les résultats obtenus montrent que la teneur en polyphénols la plus
importante est obtenue par l’extrait d’acétate d’éthyle avec un taux de (124±2, 94 µg EAG/ mg d’extrait). La
détermination quantitative des flavonoïdes révèle que l’extrait butanolique présente la teneur la plus élevé (76,
87±2, 65µg EAG/ mg d’extrait).
La deuxième partie consiste à étudier certaines activités biologiques, en commençant par l’activité
antioxydante, où six tests ont été réalisé ; à savoir, l’activité antiradicalaire au DPPH, l’activité du piégeage du
cation radical ABTS•+, l’activité de réduction du complexe cuivre-néocuproïne (CUPRAC), l’activité du pouvoir
réducteur (FRAP), l’activité de réduction par la formation du complexe Fe+2-phénantroline et l’activité silver
nanoparticule (SNP) indiquent que les extraits des feuilles d’Eriobotrya japonica ont exhibé une importante
activité.
En outre, l’activité antidiabétique montre que l’extrait dichlorométhane présente la meilleure capacité
inhibitrice de l’enzyme alpha-amylase avec CI50=8, 59±0, 71µg/ml. Concernant l’activité anti-inflammatoire,
l’extrait d’acétate d’éthyle a montré une excellente activité inhibitrice de la dénaturation de BSA
(CI50=26,765±5,774µg/ml), il est a noté que notre plante n’a pas une activité anticholinestérase.
On conclues, d’après les résultats obtenu que notre plante est très riche en composé phénolique, ce qui explique
d’ailleurs leur pouvoir antidiabétique, anti-inflammatoire et notamment l’excellent pouvoir antioxydant de notre
plante.

Mots clés : Antioxydante ; Anti-inflammatoire ; Anticholinestérases; Antidiabétique; Composés phénoliques ;

Eriobotrya japonica ; Plante médicinale.

Jury d’évaluation :
Présidente du jury : MOKRANI E. (MAA- UFM Constantine).

Rapporteur : KLIBET F. (MCB- UFM Constantine).

Examinatrice : TENIOU S. (MAA- UFM Constantine).

Date de soutenance : 27/09/2020