CHIEDJE POUOMEGNE
Vendredi le 09 Février 2024
Lesline Claudia
21TAM-0450
ESS/UCAC
TMS 3
COMPTE RENDU DU TRAVAUX PRATIQUE DE
BIOCHIMIE
A. Première manipulation
1. TITRE
DOSAGE DU GLUCOSE PLASMATIQUE PAR SPECTROPHOTOMETRIE
2. BUT
Déterminer les concentrations des solutions de glucose inconnues grâce à une méthode
colorimétrique utilisant le 4-Aminoantipyrine (méthode GOD-PAP) dans les échantillons E1 et
E2. Le ph réactionnel est égal à 7,5.
3. PRINCIPE
Le glucose en présence du glucose oxydase donne de l’acide gluconique +H202.
2H202+4aminophenazone+phénol en présence de la peroxydase donne du
quinoneimine+4H202 pour former un complexe coloré dont l’absorbance proportionnelle à la
concentration en glucose dans l’échantillon est mesurée au spectrophotomètre à 500 nm.
4. MATERIELS ET APPAREILS
o Centrifugeuse
o Spectrophotomètre
o Vortex
o Micropipettes réglables de 1000 µL et 10µL
o Portoirs des tubes
o Cônes
o Gants des soins
o Tubes à hémolyse (06)
o Cupules (06)
o Solution de décontamination (eau de javel)
5. REACTIFS
a. Réactif du contrôle normal : sérum humain lyophilisé. Additifs et agents
bactériostatiques
b. Réactif de contrôle pathologique : sérum humain lyophilisé. Additifs et agents
bactériostatiques
c. Réactif du dosage du glucose :
Composition
o Buffer de phosphate (ph=7.5)
o 4-Aminoantipyrine
o Phénol
o Glucose oxydase
o Peroxydase
o Mutarotase
o Azide de sodium
Conservation de tous les réactifs
o Le réactif reconstitué reste stable 30 jours à température de 2 à 8°C en l’absence de
contamination et à l’ abri de la lumière.
o A 15-25oC il est stable pendant 2 semaines.
6. ECHANTILLON
o Pour notre analyse, nous avons utilisé le plasma obtenu dans un tube à anticoagulant après
centrifugation : tube à fluorure. En outre, le sérum peut également être utilisé ; dans le
cas du tube sec, il est important de séparer le sérum dans les 30 minutes qui suivent après
coagulation et l’aliquoter
o L’échantillon ne doit pas être ictérique ou hémolysé
7. PROCEDURE
- Réception des échantillons prélevés dans un tube à Fluorure,
- Centrifuger des tubes pour l’obtention du plasma,
- Numéroter des tubes : E1 et E2
- Décanter le plasma
- Sur un portoir pour tubes préparer les tubes à hémolyse et les positionner comme
suite :
o Blanc (B) : pour remettre la machine à zéro.
o Standard (Std) : pour calibrer la machine
o Control sérum normal (CSN) : pour permettre la validation technique des
résultats obtenus compris dans la marge normale
o Control sérum pathologique (CSP) : pour permettre la validation technique
des résultats obtenus pathologiques
o Pipeter les solutions à l’aide des micropipettes réglables et les introduire
dans chaque tubes à hémolyse comme suite :
Désignation Blanc Standard CSN CSP E1 E2
RGT 1000uL 1000uL 1000uL 1000uL 1000uL 1000uL
Eau distillée 10Ul
Standard 10uL
Control sérum normal 10uL
Control sérum pathologique 10uL
Sérum du patient E1 10uL
Sérum du patient E2 10uL
- Mixer à l’aide du vortex et incuber 10 mn à la température ambiante,
- Mesurer l’absorbance de chaque tube au spectrophotomètre à 500 nm selon
l’ordre des tubes tout en les transvasant à chaque test dans des cupules. Les
cupules ont été placées de façon à ce que la source lumineuse traverse le coté ne
contenant pas de bandes parallèles (coté lisse). Pour ce qui est de la solution du
blanc, il n’a pas été nécessaire de la passer car la marque de spectrophotomètre
que nous avons utilisé le fait automatiquement grâce à une simple touche
blanc/zéro,
- Lire les différentes absorbances obtenues
8. CALCUL DES CONCENTRATIONS
Apres avoir obtenues les absorbances de nos différents tests, nous avons procédé au calcul
des concentrations proprement dit grâce à la formule dérivée de celle de la loi de Beer
Lambert dans laquelle ressortait la relation qui existe entre les absorbances mesurées et les
concentrations cherchées. La formule est la suivante :
Abs (échantillon) x 100
Concentration = mg/dl
Abs (standard)
9. RESULTATS
Les différentes absorbances obtenues sont: AStd=0.598 ; ASCN=0.733 ; ASCP=1.498 ;
AE1=0.918 ; AE2=0.77
Ainsi, après utilisation de la formule, nous avons obtenus les concentrations suivantes :
CCSN= (0.733*100) / 0.598=122.58 mg/dl [86.7-117.3 mg/dl]
CCSP= (1.498*100) / 0.598=250.5 mg/dl [217-293 mg/dl]
CE1= (0.918*100) / 0.598=153.51 mg/dl [75-115 mg/dl]
CE2= (0.776*100) / 0.598=129.77 mg/dl
10. INTERPRETATIONS
D’après les résultats, nous remarquons que le control sérum normal est supérieur à la valeur de
référence du control normal du glucose ; le control sérum pathologique est dans la plage
normale définie ; les échantillons E1 et E2 sont au-dessus de la valeur normale de référence. Il
se pourrait à base de ces 2 résultats que nos 2 patients E1 et E2 soient en hyperglycémies.
11. CONCLUSION
Parvenu à la fin de ce dosage, nous avons pu déterminer les concentrations de glucose dans les
solutions. On constate donc que ces concentrations déterminées ne sont pas proches de celles
attendues théoriquement (dans la plage normale du glucose), ce qui n’induit pas pour autant à
un rejet des résultats. En effet, le CSP testé plus haut était compris dans la marge normale de
contrôle pathologique du glucose, ce qui permet donc d’effectuer uniquement la validation
technique de tous les échantillons testés comme pathologiques dans notre analyse. Il n’est donc
pas nécessaire de refaire une vérification pour les tests pathologiques. En revanche, si nous
avions eu des résultats de glucose normaux dans notre analyse, nous ne les validerons pas car
le control normal ici n’a pas donné des résultats fiables ; il n’y a pas eu de spécificité dans ce
cas.
B. 2e manipulation
1- TITRE
DOSAGE DE L’UREE SANGUIN PAR SPECTROPHOTOMETRIE
2- BUT
Déterminer les concentrations inconnues d’urée contenue dans un échantillon par la méthode
colorimétrique de Berthelot.
3- PRINCIPE
L’hydrolyse de l’Urée en présence d’eau et d’uréase produit des ions ammonium et du dioxyde
de carbone. Les ions ammonium réagissent ensuite avec le salicylate et l’hypochlorite pour
former un dérivé coloré vert dont l’absorbance mesuré à 546 nm ou 578 nm est proportionnelle
à la concentration d’urée dans l’échantillon.
4- MATERIELS ET APPAREILS
o Centrifugeuse
o Spectrophotomètre
o Vortex
o Micropipettes réglables de 1000 µL et 10µL
o Portoirs des tubes
o Cônes
o Gants des soins
o Tubes à hémolyse (06)
o Cupules (06)
o Solution de décontamination (eau de javel)
5- REACTIFS
a. Réactif du contrôle normal : sérum humain lyophilisé. Additifs et agents
bactériostatiques
b. Réactif de contrôle pathologique : sérum humain lyophilisé. Additifs et
agents bactériostatiques
c. Réactif du dosage de l’urée :
Composition
o Réactif 1 : buffer de phosphate (ph=7) ; salicylate de sodium ;
nitroprusside de sodium ; EDTA.
o Réactif 2 : buffer de phosphate (ph<13) ; hypochlorite
o Standard : urée ; azide de sodium
Conservation
Les réactifs déjà prêt à l’emploi, sont conservés à 2-8oC après ouverture pendant 6 semaines ou
à 15-25oC pendant 2 semaines ; éviter les contaminations.
6- ECHANTILLONS
Dans le cadre de notre analyse, nous avons utilisés du sérum obtenu dans un tube sec après
coagulation du sang et centrifugation de ce dernier. Par ailleurs, nous pouvions aussi utiliser du
plasma excepté du plasma hépariné. Le plasma lipemique ne peut pas être utilisé ; le
sérum/plasma peut être conservé 3 jours à 4oC et à -20oC pour des longues périodes.
7- PROCEDURE
- Centrifuger des tubes pour l’obtention du sérum,
- Numéroter des tubes : E1 et E2
- Décanter le sérum
- Sur un portoir pour tubes préparer les tubes à hémolyse et les positionner comme
suite : Blanc (B) ; Standard (Std) ; Control sérum normal (CSN) ; Control sérum
pathologique (CSP)
- Pipeter les solutions à l’aide des micropipettes réglables et les introduire dans
chaque tubes à hémolyse comme suite :
Blanc Standard SCN SCP Echantillons
Echantillons / 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl
réactif R1 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl
- Mixer et incuber à température ambiante pendant 5 min
Réactif R2 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl
- Mixer et incuber à température ambiante pendant 10 min
- Mesurer l’absorbance de chaque tube au spectrophotomètre à 540 nm selon
l’ordre des tubes tout en les transvasant à chaque test dans des cupules. Les
cupules ont été placées de façon à ce que la source lumineuse traverse le coté ne
contenant pas de bandes parallèles (coté lisse). Pour ce qui est de la solution du
blanc, il n’a pas été nécessaire de la passer car la marque de spectrophotomètre
que nous avons utilisé le fait automatiquement grâce à une simple touche
blanc/zéro,
- Lire les différentes absorbances obtenues
8- CALCUL DES CONCENTRATIONS
Apres avoir obtenues les absorbances de nos différents tests, nous avons procédé au calcul des
concentrations proprement dit grâce à la formule :
Abs (échantillon) x 80
Concentration = mg/dl
8880100
Abs (standard)
9- RESULTATS
Les différentes absorbances obtenues sont: AStd=0.597 ; ASCN=0.575 ; ASCP=0.590 ;
AE1=0.516 ; AE2=0.582
Ainsi, après utilisation de la formule, nous avons obtenus les concentrations suivantes :
CCSN= (0.575*80) / 0.597=77.05 mg/dl [32.5-43.9 mg/dl]
CCSP= (0.590*80) / 0.597=79.06 mg/dl [111-149 mg/dl]
CE1= (0.516*80) / 0.597=69.14 mg/dl [10-50 mg/dl]
CE2= (0.582*80) / 0.597=77.99 mg/dl
10- INTERPTRETATIONS
D’après les résultats, nous remarquons que tous les 02 contrôles (CSR et CSP) ne sont pas dans
les normes de références pour contrôles. De même, les résultats des tests des patients ne sont
pas dans la norme ; ils sont supérieurs à la valeur de référence.
11- CONCLUSION
Arrivé au terme de notre analyse, nous remarquons qu’aucun des tests ni même des contrôles
ne se trouvent dans les plages définies, ce qui est un véritable problème pour la sortie des
résultats. Il se pourrait alors que ces contrôles ne soient pas fiables d’où notre blocage pour
procéder à la validation technique des résultats des tests des patients ; ainsi donc, nous ne
pouvons pas considérer les résultats de tests pathologiques à cause de non sensibilité du contrôle
pathologique de l’urée. Il faut donc contrôler si l’instrument de mesure, les réactifs, et le calibreur ne
présentent pas d’anomalies.
