IDENTIFICATION
Identification des bactéries à partir de prélèvements préalablement ayant subis l’isolement et la
purification, par l’étude des caractères biochimiques. En plus de l’étude des caractères
morphologiques et culturaux, on identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel
substrat. On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou
d'autres substrats plus complexes. En général, l'utilisation d’un substrat est révélée par le virage d'un
indicateur de pH (par exemple : un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un
produit basique, etc..) mais toujours appréciée à l’œil nu. Chaque espèce de bactéries a des
caractères propres, on peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme
l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. La combinaison de
différents résultats obtenus permet de définir le profil métabolique de la bactérie analysée ce qui
permet de l’identifier (on ne peut conclure à une identification que sur un ensemble de caractères).
Pour que les résultats de l’étude des car1. Préparation de la suspension bactérienne Les colonies (de
forme, de taille, de couleur et d’aspect variables d’une bactérie à une autre) sont par définition des
amas de bactéries toutes identiques issues d’une cellule originelle. Il arrive parfois qu’une colonie
soit mixte, formée de deux colonies différentes superposées provenant de deux cellules bactériennes
réunies au même endroit.
La purification devrait procéder toute identification bactérienne entreprise à partir d’une colonie
isolée.
La méthode de suspension directe est une méthode de remplacement pratique pour préparer
l’inoculum de certaines bactéries exigeantes ou non (ex. : streptocoques, staphylocoques dorés…
etc.). Les étapes suivantes sont alors réalisées pour préparer une suspension bactérienne : 1.
Repiquer une colonie bien isolée de la bactérie à étudier sur une gélose sang et laisser incuber 18 à
24 heures. 2. À l’aide d’une anse de platine, racler, au minimum, de 3 à 5 colonies bien isolées et
identiques de la bactérie étudiée et ensemencer dans un tube contenant de 4 à 5 ml d’un bouillon
nutritif stérile (tel que Medium Api) ou dans une solution saline stérile (utilisée surtout pour
l’ensemencement de la galerie classique d’identification). 3. Le bouillon de culture est incubé à 35°C
jusqu’à l’apparition d’une turbidité égale ou supérieure à la turbidité du tube étalon 0,5 de
McFarland (en général, délai de 2 à 6 heures) (cf. TP antibiogramme). 4. Ajuster la turbidité du
bouillon de culture en phase de croissance avec de la saline stérile (sérum physiologique) ou du
bouillon stérile pour obtenir une turbidité optiquement comparable à celle du tube étalon 0,5 de Mc
Farland (approximativement 1 à 2 X 108 UFC/ml pour E. coli par ex.). Le tube étalon est agité à l’aide
d’un agitateur électrique avant l’ajustement. Remarque : En cas d’utilisation d’une solution saline
stérile, la turbidité doit être ajustée dès le début et l’incubation est à proscrire. Pour effectuer cet
ajustement de turbidité, on peut utiliser la comparaison visuelle. La méthode visuelle consiste à
comparer visuellement le bouillon de culture en phase de croissance et le tube étalon en les plaçant
devant une série de lignes noires sur un fond blanc en présence d’une source de lumière adéquate. 5.
L’inoculum bactérien devrait être ensemencé sur les milieux d’identification au cours des 15 minutes
qui suivent l’ajustement de sa turbidité.actères biochimiques soient interprétables, certaines
conditions doivent être respectées : -La pureté de la souche doit être vérifiée : l’identification doit
être effectuée à partir d’une colonie isolée prélevée sous la loupe (possibilité d’avoir deux colonies
qui se développent l’une sur l’autre). Il faut pratiquer un nouvel isolement à partir de la suspension
bactérienne utilisée pour l’ensemencement de la galerie d’identification afin de déceler une
éventuelle contamination en cours de travail. Les repiquages fréquents et les transferts en milieux
liquides doivent être évités avant l’identification, en raison des possibilités de mutations qu’ils
entraînent
1. Préparation de la suspension bactérienne
Les colonies (de forme, de taille, de couleur et d’aspect variables d’une bactérie à une autre) sont
par définition des amas de bactéries toutes identiques issues d’une cellule originelle. Il arrive parfois
qu’une colonie soit mixte, formée de deux colonies différentes superposées provenant de deux
cellules bactériennes réunies au même endroit.
La purification devrait procéder toute identification bactérienne entreprise à partir d’une colonie
isolée.
La méthode de suspension directe est une méthode de remplacement pratique pour préparer
l’inoculum de certaines bactéries exigeantes ou non (ex. : streptocoques, staphylocoques dorés…
etc.). Les étapes suivantes sont alors réalisées pour préparer une suspension bactérienne :
1. Repiquer une colonie bien isolée de la bactérie à étudier sur une gélose sang et laisser incuber 18 à
24 heures.
2. À l’aide d’une anse de platine, racler, au minimum, de 3 à 5 colonies bien isolées et identiques de
la bactérie étudiée et ensemencer dans un tube contenant de 4 à 5 ml d’un bouillon nutritif stérile
(tel que Medium Api) ou dans une solution saline stérile (utilisée surtout pour l’ensemencement de la
galerie classique d’identification).
3. Le bouillon de culture est incubé à 35°C jusqu’à l’apparition d’une turbidité égale ou supérieure à
la turbidité du tube étalon 0,5 de McFarland (en général, délai de 2 à 6 heures) (cf. TP
antibiogramme).
4. Ajuster la turbidité du bouillon de culture en phase de croissance avec de la saline stérile (sérum
physiologique) ou du bouillon stérile pour obtenir une turbidité optiquement comparable à celle du
tube étalon 0,5 de Mc Farland (approximativement 1 à 2 X 108 UFC/ml pour E. coli par ex.). Le tube
étalon est agité à l’aide d’un agitateur électrique avant l’ajustement. Remarque : En cas d’utilisation
d’une solution saline stérile, la turbidité doit être ajustée dès le début et l’incubation est à proscrire.
Pour effectuer cet ajustement de turbidité, on peut utiliser la comparaison visuelle. La méthode
visuelle consiste à comparer visuellement le bouillon de culture en phase de croissance et le tube
étalon en les plaçant devant une série de lignes noires sur un fond blanc en présence d’une source de
lumière adéquate.
5. L’inoculum bactérien devrait être ensemencé sur les milieux d’identification au cours des 15
minutes qui suivent l’ajustement de sa turbidité.
2. Recherche de l’enzyme respiratoire
Des tests d’orientation rapides sont réalisés en fonction du Gram et des résultats des caractères
morphologiques et culturaux.
2.1 Test de catalase
C'est une enzyme décomposant l'eau oxygénée en eau et en oxygène gazeux.
H2O ½O2 + H2O La méthode consiste à prélever une colonie du germe à étudier (ex. les
staphylocoques pour les Gram + et les entérobactéries pour les Gram -) sur l'extrémité d'une anse de
platine que l'on plonge ensuite dans une goutte d'eau oxygénée (à l’aide d’une pipette Pasteur). Le
dégagement de bulles gazeuses signe la présence de l'enzyme
2.2 Test d’oxydase
Appelé aussi phénylène diamine oxydase est une enzyme intervenant dans divers couples d'oxydo-
réduction. Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram (–). Placer un disque d’oxydase
sur une lame propre et stérile. Déposer à l’aide d’une pipette Pasteur (il est strictement interdit
d’utilisé l’anse de platine pour ne pas fausser le résultat) une goutte de suspension bactérienne pure
sur " un disque oxydase", celui-ci contient de l’oxalate de diméthyl paraphénylène diamine. Les
bactéries oxydase-positives donnent rapidement une coloration violette foncée ; dans le cas
contraire, il n’ya pas de coloration
2.3 Nitrate réductaseNR
En l’absence d’oxygène, certaines bactéries peuvent obtenir leur énergie par respiration anaérobie.
Cette respiration anaérobie est liée à l’activité d’enzymes localisées dans la membrane plasmique
bactérienne. Ce test consiste à mettre en évidence les nitrites ou la disparition des nitrates initiaux.
Elle utilise deux types de réactifs (réactifs de Griess) : l’acide sulfanilique (nitrite 1) et l’α-
naphtylamine (nitrite 2) en solution (dans l’acide éthanoïque).
NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O
La recherche peut s’effectuer à partir de milieu gélosé nitraté, de bouillon nitraté ou à partir du
milieu mannitol mobilité. La coloration rouge témoigne la présence des nitrites dans le milieu (NR+).
Si le milieu reste inchangé : on ajoute alors de la poudre de zinc qui joue le même rôle que le nitrate
réductase vis à vis des nitrates. Présence de coloration rouge : on a donc eu transformation des
nitrates en nitrites par le zinc. La bactérie ne possédait pas cette enzyme. Résultat NR-. Pas de
coloration : les nitrates ont été transformés par la bactérie au delà des nitrites. La bactérie possède
cette enzyme. Résultat NR+ au stade azote
3. Galeries de tests biochimiques miniaturisés (galerie Api)
Là où les techniques classiques nécessitaient une à trois semaines, les gammes miniaturisées
permettent l’obtention des résultats sous 18 à 72 heures (rapide). Elles permettent, en outre,
l’identification d’environ 700 bactéries et levures, ce qui couvre pratiquement une bonne partie des
micro-organismes pathogènes et près de 1000 tests biochimiques différents d’usage courant. Les
galeries Api (analytical profile index) sont aussi de réalisation facile et de haute performance (résultat
fiable). Elles se présentent sous la forme d’une série de petits tubes, nommés tubules, correspondant
chacun à un test biochimique spécifique. Chaque tubule est ouvert à son extrémité supérieure par
une cupule pouvant être remplie, ou non, de liquide afin de placer le tube dans des conditions
particulières. Chaque tube contient un substrat défini (ONPG, ADH, GEL...) et avec lequel les micro-
organismes réagissent différemment
Lorsqu’une suspension bactérienne de densité convenable est répartie dans les différentes alvéoles
qui composent la microgalerie (contenant de substrats déshydratés), les métabolites produits durant
la période d’incubation se traduisent par des changements de couleur spontanés ou révélés par
addition de réactifs. Elle comprend généralement 20 tests biochimiques. La première galerie qui a
été utilisée est la galerie Api 20 E , destinée à l’identification des entérobactéries. Actuellement dans
le laboratoire de bactériologie médicale de l’Institut des Sciences Vétérinaires, seules les galeries Api
20 E, Api 20 NE, Api Staph et Api 20 Strep sont disponibles.
3 . Lecture et interprétation des résultats
Pour la lecture, il convient de regarder si la réaction est positive ou négative séparément pour chacun
des tests. La révélation est permise par la présence d’indicateurs colorés dans les substrats. Un
changement de couleur du milieu dans le tube, signifie généralement que le test est positif. Il faut
tout de même ne pas oublier que certains tests nécessitent l’addition de réactifs. Un tableau des
caractères à vérifier pour chaque milieu est fourni par le fabriquant afin de permettre l’interprétation
des résultats. Concernant l’interprétation des résultats, les tests sont regroupés par triplet de gauche
à droite. Un test négatif vaut toujours 0. La valeur des tests positifs, quant à elle, est différente selon
la position du test dans le triplet. Dans chacun d’eux, si le premier test est positif, il vaut 1, si c’est le
deuxième, 2, et si c’est le troisième, 4. Il faut ensuite additionner les trois valeurs obtenues pour
obtenir le code du triplet (seules huit valeurs, de 0 à 7, sont possibles). Un code à sept chiffres est
obtenu par lecture des codes des triplets de gauche à droite. Ce code, comparé à ceux référencés
dans la base de données gérée par le fabricant, permet l’identification de la bactérie
ANTIBIOGRAMME
L’antibiogramme a pour but de mettre en évidence les effets des antibiotiques sur les bactéries
isolées au niveau du laboratoire. Elle permettra de répondre aux hypothèses suivantes :
-Les antibiotiques agissent de manière inégale sur un même type de bactérie.
-Touts les antibiotiques ne fonctionnent pas sur toutes les bactéries. Il est fondamental de mesurer
l’activité des antibiotiques :
- pour sélectionner, in vitro, le ou les antibiotiques actifs sur une bactérie identifiée ou non ;
- Pour agir vite et éviter la prolifération microbienne et la septicémie
1. Définition
L’antibiogramme standard est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou plusieurs
antibiotiques. L’identification bactérienne devra donc souvent être complétée par l’antibiogramme
(standard). En effet, l'antibiogramme vise à trouver l'antibiotique le plus efficace sur les bactéries
prélevées en cas d’infection bactérienne, d’exploitées les données pour la surveillance des
résistances bactériennes aux antibiotiques (échange de données par le logiciel WHONET fourni par
l’OMS) et une indication supplémentaire pour l’identification du germe par la mise en évidence de
résistances naturelles. L’antibiogramme d’une souche peut être déterminé en milieu liquide par la
méthode de la CMI (concentration minimale inhibitrice) ou par la technique des disques. Il existe
aussi des galeries d’antibiogramme qui permettent la catégorisation de la souche bactérienne à
tester par rapport à plusieurs antibiotiques sur les CMI déjà fixées. Des méthodes dites automatisées
permettant l’obtention rapide des résultats et la reproductibilité des tests ont été récemment
développées. Les automates fonctionnent de la même manière que les galeries mais permettent de
tester plusieurs concentrations d’antibiotiques. Un antibiogramme doit obligatoirement être effectué
sur une culture pure et identifiée. Cela permet d'ajuster la densité de l'inoculum, de choisir
judicieusement les antibiotiques à tester, et de pratiquer une lecture interprétative
1.1 Limites de l’antibiogramme
L’antibiogramme est réalisé in vitro, tandis qu’une infection bactérienne à plusieurs composantes
qui varient avec le temps : la localisation de l’infection, l’animale, les concentrations d’antibiotiques
et les bactéries. Ainsi, l’antibiogramme ne peut pas prédire le comportement des antibiotiques in
vivo : -Diffusion au site de l’infection ;
-Choix de posologie ;
-Pénétration dans les cellules ;
-Influence des facteurs physiologiques ou pathologiques ;
-Transformation de la molécule d’antibiotique in vivo ;
-Emergence d'une résistance au cours du traitement ;
-Etat physiologique de la bactérie au sein du foyer infectieux (les bactéries «au repos» sont
insensibles aux antibiotiques qui interfèrent avec la biosynthèse du peptidoglycane et de même pour
les mutants dépourvus de paroi)
2. Antibiogramme par dilution
Dans la pratique courante, les méthodes de dilution sont de mises en œuvre délicates et/ou
coûteuses et elles sont réservées à des laboratoires spécialisés. Elle est souvent effectuée sur milieu
de culture liquide. Elle consiste à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de
concentrations croissantes d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2
2.1 Choix du milieu
Détermination de la CMI en milieu liquide doit se faire sur milieu liquide (bouillon). On utilise le
bouillon Mueller-Hinton (MH) ou le bouillon MH au sang de cheval et additionné de β-NAD (bouillon
MH-F). Le bouillon MH est employé lors de la méthode de dilution en milieu liquide pour les
bactéries autres que celles à croissance lente (bactéries non exigeantes). Le bouillon MH-F est un
bouillon MH additionné de 5% de sang de cheval lysé et de 20 mg/L β-NAD, est employé pour les
bactéries exigeantes et/ou à croissance lente (ex. Streptococcus spp., dont Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus spp., Pasteurella multocida, et autres...).
3. Choix des disques d’antibiotiques
Les antibiotiques sont sous forme de disques de papier imprégnés avec une concentration
déterminée d’agent antimicrobien. Ils sont clairement identifiés par un sigle, comportant 1 à 3
lettres, imprimé de chaque côté du disque.
Les disques sont présentés en cartouche de 50 disques conditionnés en containers étanches
contenant un dessicant (agent desséchant). La date de péremption et le numéro de lot figurent sur
chaque conditionnement (cartouche et container). Le choix des antibiotiques dépend de la souche
bactérienne à tester tout en tenant compte des résistances naturelles Ainsi pour les Aminosides par
exemple, l’existence de nombreuses transférases différentes capables d’inhiber seulement quelques
antibiotiques de la famille, impose de tester plusieurs antibiotiques. Pour les Macrolides, il faut
toujours employer 2 disques de Macrolides, dont l’un doit impérativement être l’Erythromycine pour
apprécier la résistance MLS (Macrolides, Lincosamides et Streptogramines) chez des bactéries de
type staphylocoques et streptocoques. De plus, la résistance étant inductible, il faut par conséquence
lire l’antibiogramme au bout de 24 heures car à 18 heures, la bactérie peut apparaitre faussement
sensible. Pour les Bêtalactamines, le choix de l’Amplcilline intéressant pour les bactéries Gram
négatif, est inutile et même nuisible pour les staphylocoques, car l’Ampicilline est un moins bon
inducteur des β-lactamases que la pénicilline elle-même. Pour les staphylocoques, il faut tester la
Méthicilline
