COURS DE BIOLOGIE

MOLECULAIRE
S5

Pr. Mohieddine MOUMNI

Année universitaire : 2021/2022

SOMMAIRE
Chapitre I:
Introduction à l’étude et à la manipulation de
l’ADN

Chapitre II:
Réaction de la polymérisation en chaine (PCR) :
- PCR conventionnelle
- Application de la PCR dans le diagnostic des
maladies

Chapitre III:
PCR quantitative (qPCR)
- Application de la qPCR dans le diagnostic du
COVID-19

2
 Chapitre
I:

Chapitre I:

Introduction à l’étude et à la
manipulation de l’ADN

Chapitre I
1. Composition chimique de l’ADN
L’ADN est composé chimiquement par :
 Un glucide (2’-désoxyribose),
 Un acide phosphorique (H3PO4)
 Des bases azotées (puriques ou pyrimidiques)

Ribose

2’-désoxyribose

4
 Chapitre I
2. Elongation de l’ADN
Pour l’élongation de l’ADN, on a besoin de :
 L’ADN matrice
 L’amorce
 dNTP (dATP + dTTP+ dGTP + dCTP) 5’ 3’
 L’ADN polymérase
 Tampon de fonctionnement contenant
Mg++

L’enchainement de l’ADN ne concerne que les

dNTP. Ceux-ci et le brin d’ADN matrice,
constituent le substrat de l’ADN polymérase.

Schématiquement on va noter l’ADN double

brins avec 2 barres.
5’ 3’ 3’ 5’

3’ 5’

Chapitre I
2. Elongation de l’ADN

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6
 Chapitre I
3. Enzymes de restrictions
DEFINITION

Les enzymes de restriction :

Ce sont des protéines qui clivent l’ADN double brin en

des endroits spécifiques ( sites spécifiques). On les
appelle aussi des endonucléases de restriction qui se
caractérisent par un nom, un site de reconnaissance et
d’une manière de couper l’ADN double brin.

Chapitre I
3. Enzymes de restriction (exemples)
Exemples
(Extrémité 5’ sortante)

(Extrémité 3’ sortante)

Les extrémités 5’ et 3’ sortantes sont des extrémités à bouts collants ou cohésifs, ce

sont des extrémités complémentaires qui peuvent reconstituer l’ADN initial sous
l’action de l’enzyme : Ligase 8
 Chapitre I
3. Enzymes de restrictions

Enzymes de restrictions
Il existe plus d’un millier d’enzymes de restrictions. Noter que : les noms des enzymes
de restrictions, leur site de coupure et la manière de couper, ne sont pas à retenir, ce
sont des données qui sont disponibles. 9

Chapitre I
4. Enzymes de modifications

a. ADN polymérases:
On distingue les ADN polymérases I, II et III, elles catalysent la réaction de
polymérisation des nucléotides.
Elles nécessitent un brin matrice et une amorce, elles fonctionnent dans le
sens 5’ 3’.
Les ADN polymérases sont spécifiques de l’ADN.

b. ARN polymérases:
On distingue les ARN polymérases I, II et III, elles catalysent la réaction de
transcription des gènes en se fixant sur les sites spécifiques des
promoteurs.
Les ARN polymérases catalysent la réaction de polymérisation des
ribonucléotides en prenant comme matrice un brin d’ADN.
Les ARN polymérases fonctionnent dans le sens 5’ 3’

10
 Chapitre I
4. Enzymes de modifications
c. Kinases :
Elles catalysent la réaction de phosphorylation des extrémités 5’ de l’ADN.
Exemple : la polynucléotide kinase (PNK)

ADN double brins 5’ 3’

3’ 5’

ADN simple brin 3’ 5’

+ ATP + Kinase (PNK)

5’ P 3’ + ADP
3’ P 5’

3’ P 5’ + ADP

Les kinases sont spécifiques des extrémités 5’ de l’ADN 11

Chapitre I
4. Enzymes de modifications

d. Phosphatases :
Exemple: la phosphatase alcaline bactérienne (BAP) : elle catalyse la
réaction de déphosphorylation des extrémités 5’ de l’ADN (simple ou
double brins).

5’ PPP 3’ 5’ 3’
3’ PPP 5’
+ BAP 3’ 5’
+ PPP

3’ PPP 5’ + BAP 3’ 5’ + PPP

12
 Chapitre I
4. Enzymes de modifications

e. Ligases :

Exemple: la T4 DNA ligase.

C’est une enzyme extraite à
partir du phage T4, elle
catalyse la réaction de ligation
d’ADN double brin à extrémités
cohésives; ou deux extrémités
franches

NB: l’ATP va apporter le

phosphate pour établir les
liaisons phosphodiestères

13

Chapitre I
4. Enzymes de modifications

f. Transcriptase inverse ou reverse (TR) :

Elle catalyse la réaction de polymérisation des dNTP en prenant comme
matrice un brin d’ARN.
La transcriptase inverse est donc une ADN polymérase qui a besoin de
dNTP et d’une amorce.

OH 3’

14
 Chapitre I
4. Enzymes de modifications
g. Exonucléase Bal 31:
Elle ronge (mangeurs) l’ADN à partir de ses deux
extrémités
h. Exonucléase III
Elle coupe les extrémités 3’ non appariées

(b) Exonucléase III

15

Chapitre I
4. Enzymes de modifications

i. nucléase S1:
Elle coupe l’extrémité de l’ADN en forme de coude (Harpping)

3’
+ nucléase S1
5’

5’ 3’

3’ 5’

16
 Chapitre I
5. Plasmides naturels

 Petites molécules d’ADN double brins circulaires

 A localisation extra-chromosomique
 Présents chez la plupart des espèces bactériennes (quelques
levures et mycètes).

17

Chapitre I
5. Plasmides naturels

 À taille très variable (de 1Kb à 1Mb)

 Capacité de se dupliquer indépendamment du chromosome
bactérien
 À information génétique non essentielle pour l’hôte mais procurant
un avantage sélectif (caractères phénotypiques) :
1. Synthèse d’antibiotiques
2. Dégradation d’antibiotiques (résistance aux antibiotiques)
3. Dégradation de produits aromatiques
4. Synthèse de solvants
5. Métabolisme des métaux lourds

18
 Chapitre I
6. Plasmides artificiels
 Ce sont des vecteurs d’expression et de clonage utilisés en
laboratoire.
 Ils sont fabriqués par génie génétique à partir de morceaux de
plasmides naturels.
 Ils possèdent les mêmes caractéristiques que les plasmides naturels.
 Les plasmides artificiels ont des tailles variables.
 Ils se caractérisent par un nom, une taille monomérique unitaire, une
cartographie de restriction.
 Exemple 1 : pBR322 Origine de comptage

 Il y a des distances entre les sites

spécifiques des enzymes de
restriction.
 L’origine du comptage est au
niveau du site Eco RI

19

Cartographie du plasmide pBR322

Gène de résistance à
l’ampicilline
Gène de résistance à
la tétracycline

20
Cartographie détaillée du plasmide pBR322

21

Cartographie détaillée du plasmide pBR322

22
 Chapitre I
Notion de cartographie de restriction des
plasmides
 Tous les plasmides se caractérisent par une cartographie de restriction. Une
carte de restriction plasmidique renferme :
 L’origine de réplication
 Les gènes de résistance aux antibiotiques
 Les sites des enzymes de restrictions
 Pour le plasmide pBR 322, l’origine du comptage est au niveau du site Eco RI

Pour tous les plasmides (par définition)

 Pour toute enzyme de restriction qui est représentée une seule fois sur le plasmide,
cette dernière coupe une seule fois (elle possède un seul site de restriction sur le
plasmide).
 Les enzymes coupent autant de fois qu’elles sont représentées sur le plasmide.
 Si une enzyme n’est pas représentée sur le plasmide, alors : soit qu’elle ne coupe pas
ce plasmide, soit alors qu’elle coupe plusieurs fois et dans ce cas, on ne la représente
pas.
 Les gènes de résistances aux antibiotiques doivent être représentés sur la carte du
plasmide.
La cartographie de restriction des plasmides est une donnée, elle n’est pas à retenir par cœur 23

Chapitre I
6. Plasmides artificiels

 Exemple 2 : les plasmides de la série des pUC

24
 Chapitre I
7. Transformation bactérienne

La transformation bactérienne est la pénétration d’un plasmide à

l’intérieur d’une cellule (bactérie) sous l’effet d’un choc thermique ou
électrique.

Choc thermique ou
électrique

25

Chapitre I
8. Insertion d’ADN étranger dans un plasmide

Exemple : insertion d’ADN étranger dans le site Pst I

Etapes :
a. Ouverture du plasmide par Pst I
b. Traitement de l’ADN étranger par Pst I
c. Incubation du plasmide ouvert et l’ADN traité par Pst I en
présence de la ligase.

Plasmide sans ADN inséré = plasmide natif

Plasmide + ADN inséré = plasmide recombinant
L’ADN étranger inséré = ADN insert

26
 Chapitre I
9. Electrophorèse sur gel

Pst I Puits 1 Puits 2

PSTI
4362pb
Pst I

Plasmide Plasmide Digestion

recombinant natif par Pst I

Puits 1 : plasmide recombinant après digestion par Pst I

Puits 2: plasmide natif après digestion par Pst I

27

Chapitre I
10. Clonage

a. Définition
Un clone : est un ensemble d’individus génétiquement semblables
provenant d’un organisme unique par reproduction asexuée.
b. Etapes de clonage:
On se propose de réaliser le clonage d’un ADN étranger dans le pBR 322
au niveau du site Pst I:
1. Ouverture du plasmide pBR 322 par Pst I.
2. Traitement de l’ADN étranger par Pst I.
3. Incubation du plasmide ouvert avec l’ADN traité par la Pst I en
présence de la ligase ( cette opération permet l’insertion de l’ADN
dans le plasmide).
4. Transformation bactérienne.
5. Étalement du milieu de transformation sur milieu gélosé contenant
la tétracycline.

28
 Chapitre I
10. Clonage
Les molécules capables de transformer une bactérie sont les molécules
fermées : il s’agit des plasmides recombinants et natifs, ils sont tous les
deux capables de transformer une bactérie. On prend individuellement
chacune des colonies dans un tube, on fait une culture, on incube
chacune des colonies sur un milieu contenant l’ampicilline, celles qui ne
poussent pas sur ce milieu sont les colonies recombinantes. Pour
sélectionner les colonies recombinantes, on peut faire une extraction du
plasmide, le traiter par Pst I et faire une électrophorèse.
1 2 3 4 5 6 7

Les colonies 2, 4 et 6 sont recombinantes; chaque colonie est clone

29

Chapitre I
11. Transfert des bandes d’acides nucléiques vers
les membranes

 Le mouvement ascendant du
tampon permet de faire passer les
bandes de l’ADN vert la membrane
de Nylon.
 C’est la technique du transfert de
l’ADN du gel vert un support solide
(membrane de nylon ou de
nitrocellulose).
 Cette technique s’appelle SOUTHERN.
 La membrane possède le nom de blot
 On appelle la technique « SOUTHERN BLOT ».
 Le transfert de l’ARN du gel vert un support solide s’appelle
« NORTHERN BLOT ».
 Et pour les protéines, s’appelle « WESTERN BLOT ».
30
 COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
S5
Chapitre II
Réaction de la polymérisation en
chaine (PCR)
Pr. Mohieddine MOUMNI
Année universitaire : 2021/2022

31

Chapitre II: Réaction de la polymérisation en chaine (PCR)

DEFINITION

La PCR: La PCR, Polymerase Chain Reaction ou

réaction de polymérisation en chaîne, est une
technique d'amplification enzymatique permettant
d'obtenir un grand nombre de copies identiques d'un
fragment d'ADN. Elle permet ainsi d'obtenir plusieurs
centaines de microgrammes d'ADN à partir de moins
de 1 pictogramme d'un gène, soit une amplification de
l'ordre du milliard..

32
Chapitre II: Réaction de la polymérisation en chaine (PCR)
Mécanisme d’amplification par PCR

a. Principe de la PCR
 La PCR est une amplification de l’ADN qui utilise une ADN polymérase
thermostable qui s’appelle la Taq polymérase (enzyme qui garde une
activité biologique à haute température avoisinant 100°C).
 La réaction de la PCR est réalisée dans un appareil qui coordonne les
changement brusque de la température.
b. Réaction d’amplification:
L’amplification de l’ADN se produit selon différents cycles. Un cycle de
PCR referme 3 étapes:
 La dénaturation de l’ADN à 95°C et dure environ 1min.
 La baisse rapide de la température vers 50 55°C, ceci permet la
fixation des amorces, cette étape dure 1min30.
 L’augmentation rapide de la température jusqu’à 75°C , cette
température permet à la Taq polymérase de synthétiser le brin
complémentaire. Cette étape dure 2 min.
33

Step 1 of PCR cycle

100 Melting
94 oC

50

0
T i m e

3’ 5’

3’
5’
5’
3’
Melting Heat
3’

34
 100 Melting PCR
94 oC
Annealing
Primers
50 50 oC

0
T i m e

3’ 5’
Primer forward 5’
Primer reverse

5’
3’

Step 2 of PCR cycle

35

100 Melting
94 oC
Annealing Extension
----------------

Primers 72 oC
50 50 oC

PCR cycle
0
T i m e
3’ 5’
5’

5’
5’ 3’

Step 3 of PCR cycle: elongation

5’

36
 Beginning of cycle 2: step 1
100 Melting Melting 2x
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’
5’ 3’

Heat
5’

5’

Heat
5’

37

Beginning of cycle 2: step 2

100 Melting Melting 2x
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
3’
5’
5’ T i m e
5’
5’ 5’
5’ 3’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 38
 Finishing of cycle 2: step 3
100 Melting Melting 2x
94 oC 94 oC
Annealing Extension
Primers 72 oC
50 50 oC

0
T i m e
3’ 5’
5’

5’
5’

5’
5’

5’
5’ 3’
39

Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

ADN double
brin

Cycle# 1 : Etape 1 Dénaturation = 95°C

ADN simple brin

Rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent l’ADN double brin

=> passage à l’ADN sousla forme simple brin
40
 Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 1 : Etape 2 Hybridation des amorces = 50-60°C

Amorce R
Amorce F

Hybridation desamorces sens(forward, F) et anti-sens (reverse, R)

sur chacundesbrins de l’ADN matriciel simple brin
à une température (Ta, annealing) compatible avec le Tmdes2 amorces

41

Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 1 : Etape 3 Elongation = 72°C

Amorce R
Amorce F

Réaction de polymérisation (addition séquentielle de dNTP)

catalysée, par exemple, par l’enzyme thermostable TaqADN polymérase
à 72°C, à partir de l’extrémité 3’ OH libre desamorcessens(F) et anti-sens (R).
Lesensde synthèse du brin complémentaire est toujours du 5’ vers 3’.

42
 Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 1 : Etape 3 Elongation = 72°C

Amorce R
Amorce F

Réaction de polymérisation (addition séquentielle de dNTP)

catalysée, par exemple, par l’enzyme thermostable TaqADN polymérase
à 72°C, à partir de l’extrémité 3’ OH libre desamorcessens(F) et anti-sens (R).
Lesensde synthèse du brin complémentaire est toujours du 5’ vers 3’.

43

Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 2 : Etape 1 Dénaturation = 95°C

44
 Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 2 : Etape 2 Hybridation des amorces = 50-60°C

Amorce R
Amorce F

Amorce R
Amorce F

45

Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 2 : Etape 3 Elongation = 72°C

Amorce R
Amorce F

Amorce R
Amorce F

46
 Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

Cycle# 2 : Etape 3 Elongation = 72°C

Amorce R
Amorce F

Amorce R
Amorce F

47

DNA (between the primers) doubles with each thermal cycle

If we start from an initial number of copies of template DNA equal to "n", after 40 PCR
cycles, the number of synthesized copies is:
X = n x 240
Number
1 2 4 8 16 32 64

0 1 2 3 4 5 6
Cycles
48
 Lesdifférentes étapes de la réaction de PCR

N (30) cycles

……….
Ne cycle

Thermocycleur

49

Chapitre II: Réaction de la polymérisation en chaine (PCR)

Application de la PCR en diagnostic
On se propose d’amplifier un fragment de 700pb d’un gène spécifique (le
gène du peptide C de l’insuline).
Le gène est enfoui dans le chromosome

Région à amplifier (700pb)

1

Après 25 à 40 cycles de PCR, le Fragment

produit d’amplification est déposé de 700pb
sur gel d’agarose

50
Chapitre III: Réaction de la polymérisation en chaine (PCR)
Mécanisme d’amplification par PCR

51
---------------------

5’ 3’
---------------------

5’

3’ 5’ 5’

Size of amplified final fragment

Taille du fragment final amplifié

52
 Standard PCR Protocol

1X Buffer 94°C 3 min

0.1 mM dNTPs
94°C 1 min
1.5 mM MgCl2
45°C 1 min 40 cycles
10 pmoles of Forward primer
10 pmoles of Reverse primer 65°C 8 min
1 Unit of Taq DNA polymerase
50 μl 65°C 16 min
Template DNA
QSF 25l of H2O

Buffer : Tampon
Primer : Amorce
Template : matrice

53

Analyse des produits de PCR

Migration sur un gel d’agarose

en présence de bromure d’éthidium (BET)

1
Dépôt des Échantillons
dans les puits d’un gel
d’agarose (1,5%)
(Bromure d’Ethidium)

54
 Analyse des produits de PCR

Migration sur un gel d’agarose

en présence de bromure d’éthidium (BET)

1
Dépôt des Échantillons
dans les puits d’un gel -
d’agarose (1,5%)
(Bromure d’Ethidium) +
2 Migration des échantillons
dans une cuve d’électrophorèse
=> Séparation des produits de PCR en
fonction de leur taille

55

Analyse des produits de PCR

Migration sur un gel d’agarose

en présence de bromure d’éthidium (BET)

1
Dépôt des Échantillons
dans les puits d’un gel
d’agarose (1,5%)
(Bromure d’Ethidium) -
+
2 Migration des échantillons
dans une cuve d’électrophorèse
=> Séparation des produits de PCR en
fonction de leur taille

3 Observation des produits de PCR

sur une table UV

56
COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
S5
Chapitre III

PCR quantitative ou qPCR

Application de la qPCR dans le diagnostic du
COVID-19

Pr. Mohieddine MOUMNI

Année universitaire : 2021/2022

57

Traçabilité des molécules

58
 Traçabilité des molécules
1. Marquage de l’ADN en 5’

Le marquage de l’ADN simple brin suit le même principe

59

Traçabilité des molécules

1. Marquage de l’ADN en 5’

1 2 1 2

Southern blot
+
autoradiographie

Image autoradiographique

 Dans le puits N°1 on met l’ADN non marqué.

 Dans le puits N°2 on met l’ADN marqué en position 5’ par le ³²P.
 On fait un southern blot.
 Après le southern blot, on applique un film d’autoradiographie, on
développe le film et on analyse les résultats.

60
 Traçabilité des molécules
1. Marquage de l’ADN en 5’

Remarque:
le film d’autoradiographie est sensible aux rayons radioactifs.
lorsqu’un rayon radioactif tombe sur le film, il provoque une tache noire.

Composition de la réaction de marquage de l’ADN en 5’.

 L’ADN à marquer
 (δ³²P)ATP
 Tampon
 Enzyme : polynuclétide kinase

61

Traçabilité des molécules

2. Marquage de l’ADN en cours de synthèse

 On ajoute de petites séquences d’ADN

formées de 6 nucléotides
(hexanucléotides).
 Ce sont des séquences aléatoires qui vont
se fixer de manière aléatoire sur chacun
des deux brins de l’ADN matrice.
 On marque les dNTP en un seul (dCTP).
On va le marquer en position α.

Composition de la réaction de marquage.

 L’ADN matrice
 Les hexanucléotides
 Les dNTP avec (α³²P)dCTP
 Tampon
 ADN polymérase I
62
 Traçabilité des molécules
2. Marquage de l’ADN en cours de synthèse

Remarque:
 Cette technique de marquage s’appelle: le marquage de l’ADN par
amorçage aléatoire.
 Cette méthode est utilisée à chaque fois qu’on dispose d’un ADN à
marquer ayant une taille supérieur à 150 bp
 Si l’ADN à marquer a une taille inférieur à 150 pb, on utilise le marquage
en 5’.

63

Technique de la PCR en temps réel

Technique de la PCR en temps réel

La PCR en temps réel (qPCR) est une technique permettant la

visualisation, en temps réel, de l'amplification progressive
d'une réaction de PCR

La PCR en temps réel nous permet de mesurer de petites

quantités de séquences d'ADN contenues dans un échantillon

64
PCR conventionnelle VS PCR en temps réel (qPCR)
PCR CLASSIQUE qPCR

 Permet d'analyser une courte  permet la détection, la

séquence d'ADN en amplifiant un caractérisation et la quantification
segment sélectionné. d'acides nucléiques
 Technique qualitative.  Technique quantitative
 Produit détecté par  Produit détecté dans chaque cycle
électrophorèse sur gel d'agarose. VS d'amplification
 Données collectées à la fin de la  Données collectées pendant la
réaction phase exponentielle de la réaction
 Prend plus de temps.  Prend moins de temps

65

PCR en temps réel (qPCR)

66
TECHNIQUE

Principe de la Technique Sybr Green

67

TECHNIQUE

Principe de la Technique Sybr Green

68
 Real-Time PCR
• Mesure en temps réel de la quantité de produits amplifiés (à chaque cycle)
• Détection des produits de PCR via la production d’un signal fluorescent

SYBRGreen (Molecular Probe)

• Marqueur fluorogénique
•Emission d’un fort signal fluorescent quand
liaison à l’ADN double brin après excitation

dsDNA

• Limite : Liaison à tout ADN double brin (pas

de spécificité)

69

TECHNIQUE

Le SYBR Green est un composé

organique aromatique de formule
chimique C32H37N4S faisant
partie des cyanines asymétriques
(fluorophores).

Formule chimique
70
 TECHNIQUE

Principe de la Technique TaqMan

Sonde TaqMan

GCACTACATC
5’ 3’

71

TECHNIQUE

Principe de Technique TaqMan

Etape 1 Dénaturation

5 3
GCACTACAT ’T A G C A C T A C A T C A C T A G C A T C T A C C T A T C A C C T A G C T A G ’
GCACTACAT
GCACTACAT ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5

72
 Principe de Technique TaqMan
Etape 2 Hybridation

5 3
’T A G C A C T A C A T C A C T A G C A T C T A C C T A T C A C C T A G C T A G ’

TAGTGGATC 5
ATCTACCTAT
5 TAGCACTAC

ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5

73

Principe de Technique TaqMan

Etape 3 Polymérisation

5
’T A G C A C T A C CAT CTACCT
TCACTA
A A
ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5

74
 Principe de Technique TaqMan
Etape 4 : Emission de fluorescence

5
’T A G C A C T A C A T C A C T A
CC
AA A TC AT C
TC A C TAAT T
G
ATCGTGATGTAGTGATCGTAGATGGATAGTGGATCGATC
3 5

75

Real-Time RT-PCR
• Mesure en temps réel de la quantité de produits amplifiés (à chaque cycle)
• Détection des produits de PCR via la production d’un signal fluorescent

TaqMan (Applied Biosystems)

• Utilisation d’une sonde d’hybridation (Probe) :
> en 5’ un fluorochrome émetteur (Reporter)
(ex. FAM, 6-carboxy fluorocéine)

> en 3’ un fluorochrome suppresseur (Quencher)

(ex. TAMRA, 6 carboxy tetramethyl rhodamine)

• Lors de de l’étape d’élongation,

la Taq polymérase hydrolyse la sonde hybridée
du fait de son activité 5’ exonucléase.

• Le Reporter est libéré de l’environnement

suppresseur du Quencher.

=> Emissionde fluorescence directement

proportionnelle à la quantité de produit de PCR

76
 TECHNIQUES

Principe de la Technique TaqMan

Liste des Fluorophores

 

 

 

 



 


77

TECHNIQUES

Ct = nombre de cycles à partir duquel le produit devient

détectable

Cette quantification n’étudie donc pas la fin de la PCR et n’est donc pas affectée par les éléments
limitants identifiés lors de la phase du plateau. Ce concept de Ct est à la base de la précision et de
la reproductibilité de la technique.

78
 CONCLUSION

Taq Man
Avantages de TaqMan :
• Une hybridation spécifique entre la sonde et la cible est nécessaire
pour générer un signal fluorescent
• Les sondes peuvent être marquées avec différents colorants
rapporteurs distincts, ce qui permet l'amplification et la détection de
deux séquences distinctes dans un tube à réaction
• Le traitement post-PCR est éliminé, ce qui réduit les coûts de la main-
d'œuvre et des matériaux

Inconvénients de TaqMan :
• Le principal inconvénient est que la synthèse de différentes sondes est
nécessaire pour différentes séquences.

79

CONCLUSION

SYBR Green
Avantages de la méthode SYBR Green :

•Il peut être utilisé pour surveiller l’amplification de toute séquence d’ADN double
brin.
•Aucune sonde n'est requise, ce qui peut réduire les coûts de configuration et
d'exploitation du test, à condition que les amorces PCR soient bien conçues et que
la réaction soit bien caractérisée.

Inconvénient de la méthode SYBR Green :

Le principal inconvénient est qu’elle peut générer de faux signaux positifs; En

d'autres termes, étant donné que le colorant SYBR se lie à un ADN double brin, il
peut également se lier à des séquences d'ADN double brins non spécifiques.

Par conséquent, il est extrêmement important d'avoir des amorces bien

conçues qui n'amplifient pas les séquences non cibles et d'effectuer une analyse
par courbe de fusion. 80
 Par la chimie de Par la chimie de
détection « TaqMan » détection « Sybr Green »

 Eau
 MgCl₂  Eau
 Tampon  MgCl₂
 dNTP  Tampon
 Amorces  dNTP
 Sonde TaqMan  Amorces
 Taq polymérase  Sybr Green Dye
 ADN matrice  Taq polymérase
 ADN matrice

81

Application de la qPCR dans le

diagnostic du COVID-19

82
 Phylogénie et structure du SARS-CoV2
A. Structure virale :
le SARS-CoV-2 forme une particule sphérique d’un diamètre de 100-160 nm
composés d’ARN simple brin polarisé positivement et de cinq protéines de
structures: la protéine Spike sous forme trimérique qui se lie au récepteur
cellulaire, trois autres protéines transmembranaires (la glycoprotéine d’enveloppe
[E], de membrane [M] et l’Hémagglutinine-Esterase [HE]) et la protéine de
capside (N). La nucléocapside formée de l’ARN viral complexé à la protéine N
est enchâssée à l’intérieur de l’enveloppe. Génome viral: le gène réplicase (orf1a
et orf1b) code pour deux larges polyprotéines (pp1a et pp1b) clivées en seize
protéines non structurales incluant deux protéases et une ARN-polymerase ARN-
dépendante. Le reste du génome code pour les protéines de structures et de
multiples ORF via la transcription en ARN sous-génomiques.

B. Phylogénie simplifiée des coronavirus humains (HCoV).

Les HCoV faiblement pathogènes sont représentés en bleu et les HCoV
fortement pathogènes en rouge.

83

Pénétration et cycle virale du SARS-CoV2

84
 Pénétration et cycle virale du SARS-CoV2

C. Représentation de l’entrée du SARS-CoV-2 dans la cellule (principalement

le pneumocyte de type 2), et de son cycle de réplication.
Après fixation de la protéine S sur le récepteur ACE2 et activation par clivage de S par la
protéase membranaire TMPRSS2 (1), le complexe viral est endocyté. La fusion
membranaire libère la nucléocapside dans le cytosol (2) où le gène réplicase (orf1a et orf1b)
de l’ARN viral est traduit en polyprotéines pp1a et pp1ab (3). La protéolyse de ces
polyprotéines par la protéase encodée par orf1a (4) donnera les protéines formant un vaste
complexe de transcription et de réplication (5). Ce complexe protéique permet de reproduire
l’ARN génomique et, via la synthèse d’ARN sous-génomique, de former les protéines de
structures virales (6). Les nouvelles particules virales sont assemblées à partir de l’ARN
génomique, de la protéine de capside et des glycoprotéines d’enveloppe (7). La diminution
de l’expression membranaire d’ACE2 résultant de l’endocytose du complexe viral pourrait
activer localement le système rénine-angiotensine-aldostérone et aggraver les lésions
pulmonaires. Abréviations: ORF opening reading frame; TMPRSS2 Transmembrane
protease serine 2; ACE Enzyme de conversion de l’angiotensine; IEC inhibiteur de
l’enzyme de conversion; ARA2 inhibiteur du récepteur à l’angiotensine 2.

85

Diagnostic du COVID-19 par la

technique de qPCR

86
 Les étapes du diagnostic du
COVID-19
- Prélèvement d’un échantillon de la muqueuse nasale ou
buccale,

- Extraction des ARN totaux,

- Réaction de réverse transcription suivie d’une réaction

de qPCR au sein du même appareil,

- Interprétation des résultats.

87

Réaction de Réverse Transcription (RT) :

principe général à partir de l’ARNm

Etape 1 : Reverse Transcription (RT) ou Transcription inverse

Synthèsed’unADN complémentaire (ADNc) à partir de l’ARNm
catalysée par une reverse transcriptase, polymérase de l'ADN ARN-dépendante

Utilisation d’une amorce, ici primer Oligod(T)

AAAAA 3’ Oligo dT primer is

RT TTTTT 5’ bound to mRNA

AAAAA Reverse transcriptase (RT)

RT copies first cDNA strand
TTTTT

88
 RT-PCR
Etape 1 : Reverse Transcription (RT) ou Transcription inverse

• Utilisation d’une amorce :

- OligodT
- hexamère aléatoire (random)
- spécifique du transcrit

89

Gènes cibles pour le diagnostic du

coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

90
 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

91

Gènes cibles pour le diagnostic du

coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

92
 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

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Gènes cibles pour le diagnostic du

coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

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 Gènes cibles pour le diagnostic du
coronavirus (SARS-CoV-2) par PCR en temps réel

Le gène RdRp : gène RNA dependent RNA polymerase. Il se trouve dans la

région du cadre de lecture ouvert ORF1ab.

Le gène E : gène de la protéine de l'enveloppe.

Le gène N : gène de la protéine nucléocapside.

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