I- Introduction :

Les infections fongiques profondes, souvent difficiles à diagnostiquer, constituent un défi de santé
publique croissant, en particulier chez les patients immunodéprimés. Dans ce contexte, les méthodes
sérologiques, reposant sur la détection d'antigènes ou d'anticorps spécifiques, se révèlent être des outils
essentiels pour un diagnostic rapide et précis. Ces techniques offrent une alternative moins invasive
comparée à d'autres méthodes traditionnelles, telles que l'examen direct ou la culture. Ce TP vise à
explorer les principes fondamentaux, des approches sérologiques en mycologie.
Objectifs :
Cette séance de travaux pratiques en mycologie a pour objectifs de :
– Familiariser les participants avec les principes fondamentaux des techniques sérologiques
utilisées en mycologie.
– Démontrer la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) comme exemple
représentatif des techniques sérologiques.

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II- Matériel nécessaire :
1- Equipement :
- Incubateur à 37°C
- Micropipette de 1000 μm
- Micropipette de 100 μm

2- Réactifs :
Coffret ELISA pour un diagnostic biologique
1. Plaque ELISA : Une plaque à 96 puits, souvent recouverte d'un antigène ou d'un anticorps
spécifique selon le type de test (direct, indirect ou sandwich).
2. Contrôles : Échantillons positifs et négatifs pour garantir la validité du test.
3. Conjugué enzymatique : Un anticorps ou un antigène couplé à une enzyme (par exemple, la
peroxydase de raifort ou l'AP – phosphatase alcaline).
4. Substrat enzymatique : Une solution contenant le substrat spécifique de l'enzyme utilisée
(souvent le TMB pour la peroxydase) qui produit un changement de couleur.
5. Tampons : Différentes solutions, notamment :
o Tampon de lavage pour éliminer les composants non liés.
o Tampon de dilution pour préparer les échantillons et diluer les réactifs.

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III- Sécurité au laboratoire :
• Considérer tous les échantillons biologiques comme potentiellement infectieux.
• Manipuler les réactifs avec précaution, notamment ceux contenant des substrats chimiques, des
tampons ou des enzymes.
• Éviter tout contact direct avec la peau ou les muqueuses.
• Manipuler les micropipettes avec soin pour éviter les erreurs techniques ou les blessures

IV- Principe :
Technique à la recherche simultanée d’un antigène Ag 1 et
d’anticorps anti- Ag 2 et Ag 3 d’un agent infectieux
La phase solide est préparée avec :
Des anticorps monoclonaux dirigés contre l’Ag 1
Des antigènes purifiés (Ag 2 + Ag 3) présentant des épitopes spécifiques d’un agent infectieux.
Les conjugués sont préparés avec
– Conjugué 1 : anticorps polyclonaux biotinylés contre l’antigène (Ag 1) recherché
– Conjugué 2 : streptavidine marquée à la péroxydase + Antigènes (Ag 2 + Ag 3) marqués à la
peroxydase
Après distribution des sérums :
– Les antigènes éventuellement présents se fixent sur les anticorps monoclonaux de la phase
solide et forment des complexes avec les anticorps biotinylés du conjugué 1
– Si des anticorps anti- Ag 2 et/ou Ag 3 sont présents, ils se lient aux antigènes fixés sur la phase
solide.
Après incubation à 37°C, puis lavage, le conjugué 2 est distribué :
– La streptavidine réagit avec les complexes Ac-Ag-Ac biotinylés éventuellement fixés sur la
phase solide.

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 – Les antigènes Ag 2et Ag 3 purifiés, marqués à la peroxydase se lient à leur tour aux IgG et/ou
IgM et/ou IgA, retenus par la phase solide.

Après incubation à température ambiante (18-30°C) la fraction de conjugué 2 restée libre est
éliminée par lavage.
Après une nouvelle incubation à température ambiante (18-30°C) la présence de l’enzyme
immobilisée sur les complexes est révélée par la modification de la coloration du substrat
(Tetramethyl-benzidine (TMB) dans le dimethyl sulfoxide DMSO).
Après arrêt de la réaction, la lecture s’effectue au spectrophotomètre à 450/620-700 nm.
L’absorbance observée pour un échantillon permet de conclure quant à la présence ou l’absence
d'antigène Ag 1 et/ou d’anticorps anti- Ag 2 et/ou Ag 3.

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V- Etapes de l’examen sérologique (technique ELISA)
Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement :
– 25 μl de conjugué 1 (R6) dans chaque cupule
– 75 μl de sérum (ou contrôle) dans les puits
– Le contrôle négatif est distribué dans 3 puits (C1, D1 et E1)

Homogénéiser, couvrir avec un film adhésif puis incuber pendant 1 heure à 37°C

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– Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets
contaminés
– Ajouter dans chacune d’elles un minimum de 370 μl de solution de lavage.
– Respecter un temps de trempage minimum de 30 secondes.
– Aspirer de nouveau.
– Répéter le lavage au moins 2 fois (soit un minimum de 3 lavages au total).

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Distribuer rapidement 100 μl de la solution de conjugué 2 (R7a + R7b) dans toutes les
cupules.

Homogénéiser, couvrir avec un film adhésif puis incuber pendant 30 minutes à 37°C

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– Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets
contaminés
– Ajouter dans chacune d’elles un minimum de 370 μl de solution de lavage.
– Respecter un temps de trempage minimum de 30 secondes.
– Aspirer de nouveau.
– Répéter le lavage au moins 4 fois (soit un minimum de 5 lavages au total).

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– Préparer la solution de révélation (réactif R8 + R9).
– Distribuer rapidement dans toutes les cupules 80 μl de la solution de révélation

– Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 30 minutes à

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– Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt, et, dans
les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique (DO) à
l'aide d'un lecteur de plaques (450/620-700 nm).

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Interprétation des résultats :
– DO du contrôle négatif doit être toujours inférieur à 0,150
– DO (Contrôle Négatif) = DO C1 + DO D1 + DO E1 /3
– Valeur seuil = DO (Contrôle Négatif) + 0,200.
– Pour chaque échantillon, le Ratio = DO échantillon/Valeur Seuil
– DO échantillon ˃ Valeur Seuil (Ratio ˃ 1) sont considérés positifs
– DO échantillon ˂ Valeur Seuil (Ratio ˂1) sont considérés négatifs

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